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5  Diskussion

Auf dem Forschungsgebiet der Lymphomerkrankungen allgemein und der kutanen B-Zell-Lymphome im besonderen, wurden in den letzten Jahren große Fortschritte erzielt, um der immer noch weitestgehend unklaren Pathogenese ein Stück näher zu kommen und für die Behandlung eine einheitliche Strategie zu entwickeln.

Mit der Entwicklung und Anwendung molekularbiologischer Techniken in der Medizin und deren Gebrauch in der Routinediagnostik konnte ein großer Beitrag geleistet werden, diese Erkrankungsgruppe besser zu differenzieren und eindeutigere Aussagen über Diagnose, Therapie und Prognose machen zu können.

Das Merkmal der genetischen Klonalität einer Lymphozytenpopulation läßt maligne Entartungen exakt von reaktiven, gutartigen Tumoren unterscheiden.

Die Unterscheidung „Pseudolymphom“ oder malignes B-Zell-Lymphom wurde früher häufig diskutiert (11), ersteres kann heute eindeutig einem reaktiven, polyklonalen Prozeß (lymphoide Hyperplasie) und letzteres einer malignen Neoplasie zugeordnet werden (19).

Um den bisher sichersten Diagnoseparameter für das Vorhandensein eines malignen Lymphoms, die Klonalität einer Lymphozytenpopulation, nachzuweisen, wurden seit Ende der 70er Jahre verschiedene Verfahren entwickelt.

Das sogenannte Southern-Blotverfahren (Blot-Verfahren nach Southern) fand aufgrund des intensiven Arbeitsaufwandes und des hohen Anspruchs an Quantität und Qualität der aus einem lymphozytären Tumor extrahierten DNA keine Anwendung in der Routinediagnostik.

Mit der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) verfügt man über eine Methode, die einen exakten, raschen und nicht radioaktiven Nachweis klonaler Zellpopulationen liefern kann (61). Mit der Einzel-Zell-PCR-Technik kommt die Möglichkeit hinzu, in einem Infiltrat die rearrangierten Immunglobulingene nicht mehr nur qualitativ, sondern individuell von einzelner B-Zelle zu B-Zelle genau zu bestimmen und geringste Sequenzunterschiede hervorzuheben.

Kleinste B-Zell-Klone können so nachgewiesen werden (mit Populationsanalysen nicht möglich), und das Aufzeigen von intraklonaler Diversität ist mit dieser eleganten Technik optimal zu untersuchen.

Weitere Einsatzmöglichkeiten der Polymerase-Ketten-Reaktion könnten neben einer präzisen Diagnostik auch eine Therapiesteuerung sowie ein patientenspezifisches Monitoring sein, das [Seite 57↓]frühzeitig den Nachweis von Rezidiven aufzeigen und Hinweise auf eine Progression des Tumorgewebes geben könnte (13).

Kutane B-Zell-Lymphome sind maligne Entartungen der B-Lymphozyten in der Haut.

Da B-Lymphozyten primär in der Haut nicht vorhanden sind (62), wurde früher an einen reaktiven Vorgang oder an eine Absiedlung im Rahmen von systemischen Lymphomen gedacht.

Der eher gutartige Verlauf der PKBZL, im Gegensatz zu den nodalen Non-Hodgkin-Lymphomen (NHL), prägte vor der Entwicklung von Immunhistochemie und Molekularbiologie den Begriff Pseudolymphom. Mit der Anerkennung als eigene Krankheitsgruppe wurden viele Versuche unternommen, eine Klassifikation zu finden (Kiel-Klassifikation, REAL) (5;63).

Das Modell der Cutaneous lymphoma studie group der EORTC basiert auf dem aktuellsten Wissenstand und grenzt die primär kutanen B-Zell-Lymphome eindeutig von den nodalen NHL ab (12).

Die Untersuchung der Immunglobulingene sowie die Analyse der Mutationsrate und Mutationsmuster der variablen Regionen der Immunglobulingene können Rückschlüsse auf das Entwicklungsstadium geben, in dem sich die B-Zelle zum Zeitpunkt ihrer Entartung befand. Daraus ergab sich eine Einordnung der B-Zell-Malignitäten auf molekularbiologischer Grundlage.

Physiologischerweise führt die Expression von Immunglobulinen auf der Oberfläche von B-Lymphozyten und der anschließende Kontakt mit einem Antigen durch B-Zell-Stimulation und spezifische T-Zell-Hilfe zur humoralen Immunantwort. In vitro können Wechselwirkungen zwischen naiven antigenbindenden B-Zellen und spezifischen T-Helfer-Zellen zur Produktion von Antikörpern führen. Die so erreichte B-Zellproliferation und Differenzierung (einschließlich Klassenwechsel; Isotyp) weist jedoch erhebliche Unterschiede zu der Antikörperreaktion in vivo auf. Insbesondere die somatische Hypermutation als Antwort auf ein, die Immunantwort induzierendes Antigen, benötigt die Eigenschaften des lymphatischen Gewebes. Die sich daraus ergebende Affinitätsreifung setzt sich zusammen aus der somatischen Hypermutation der Immunglobulingene und der Selektion von B-Zellen mit hochaffinen Oberflächenimmunglobulinen (64).

Das spezialisierte Mikromilieu der Keimzentren in den sekundär lymphatischen Organen, welche ca. 1 Woche nach Antigenstimulierung gebildet werden, ist Ort der induzierten B-Zellproliferation. Von T-Helfer-Zellen aktivierte B-Zellen entwickeln sich entweder zu [Seite 58↓]kurzlebigen Plasmazellen, die IgM oder IgG sezernieren und für die Antikörperproduktion in der Frühphase der Immunantwort verantwortlich sind oder sie wandern in die Primärfollikel, um Keimzentren auszubilden. Die in den Primärfollikeln vorhandenen B-Zellen befinden sich angelagert an follikulär dendritische Zellen (FDC). Diese verzweigten Zellen liefern vermutlich einen zentralen Beitrag zu den selektiven Vorgängen der Antikörperantwort (65).

Sie besitzen u.a. die Fähigkeit, intakte Antigene längere Zeit auf ihrer Oberfläche zu binden. Die aktivierten B-Zellen dringen in die Primärfollikel ein und beginnen mit der raschen Teilung, um Keimzentren auszubilden. Ein Proliferationszyklus dauert zwischen 3h und 6h (16;66). Die nun als Zentroblasten bezeichneten Zellen bilden in wenigen Tagen die dunkle Zone des Keimzentrums und entwickeln sich zu den Zentrozyten, die in der hellen Zone in das Netz der FDC eindringen und die Fähigkeit zur Zellteilung verloren haben. Die restlichen nicht antigenspezifischen B-Zellen werden nach außen gedrückt und bilden die Mantelzone. Während der schnellen Proliferation der Zentroblasten, die als Keimzentrumsreaktion bezeichnet wird, entstehen durch somatische Mutationen sowie Proliferations- und Selektionszyklen eine große Anzahl affiner bindender Subklone. Die Zentrozyten werden aufgrund der Präsentation eines mutierten Rezeptors auf der Oberfläche durch die FDC selektioniert (66).

Der Hypermutationsprozeß findet also in den Zentroblasten während der Keimzentrumsreaktion statt (67). Es wird dort eine Mutationsrate von einem Basenpaar pro 103 pro Zellteilung erreicht (68). Andere somatische Zellen weisen in ihrer DNA lediglich eine Mutationsrate von einem Basenpaar pro 1010 pro Zellteilung auf (69). Da der in einer B-Zelle für die variable Region der schweren und der leichten Kette kodierende Bereich ca. 360 bp lang ist und etwa drei von vier Basenaustauschvorgängen zu einer veränderten Aminosäure führen, kann man davon ausgehen, daß bei jeder Teilung jede zweite Zelle in ihrem Rezeptor eine Mutation aufweist.

Gen-Sequenzanalysen wurden u.a. bei MALT-B-Zell-Lymphomen durchgeführt. Die Zellen wiesen hypermutierte Immunglobulingene mit Bevorzugung der Punktmutationen in den antigenbindenden Bereichen auf. Die Häufung der Mutationen in den CDR-Bereichen spricht für eine antigengetriebene Selektion der Lymphomzellen bzw. ihrer Vorläufer. Intraklonale Diversität der VH-Gensequenzen konnte bei den MALT-Lymphomen (mucosa- associated lymphoid tissue) u.a. von Du et al. gefunden werden, was die Tatsache einer Antigenstimulation, im Zusammenhang mit der klonalen Expansion, vermuten läßt (70;71).

Die Parallelen zwischen den Maltomen des Magens und den primär kutanen B-Zell-Lymphomen prägten den Begriff SALT (skin-associated lymphoid tissue) (20;72). SALT beschreibt eine [Seite 59↓]weitere extranodale Lokalisation von B-Zell lymphatischem Gewebe aufgrund stimulierender pathogenetischer Faktoren, wie z.B. eine chronische Borrelia burgdorferi Infektion (18). Dieses in der Haut erworbene Gewebe wir als Ausgangspunkt der primär kutanen B-Zell-Lymphome vermutet.

Hypermutierte Nachkeimzentrumszellen (post-germinal center cells) wurden ebenfalls im Multiplen Myelom (73), im nodalen monozytoiden B-Zell-Lymphom (74) und im Burkitt-Lymphom (75) gefunden. Auch das primär kutane immunoblastische B-Zell-Lymphom (großzelliges B-Zell-Lymphom der unteren Extremität) wurde in unserer Forschergruppe als Nachkeimzentrumszell-Lymphom charakterisiert (76).

Im Gegensatz dazu stehen die weniger differenzierten unmutierten Vorkeimzentrumszellen (pre-germinal center cells), die in B-Zell-Lymphomen, z.B. bei der chronisch lymphatischen Leukämie (48) und dem Mantelzell-Lymphom (77) zu finden sind.

Die Keimzentrumszell-Lymphome, auch germinal center cell lymphomas genannt, weisen das Kennzeichen der Keimzentrumsreaktion auf, die intraklonale Diversität. Zu dieser Kategorie gehört u.a. das Hodgkin-Lymphom (78) und das differenzierte großzellige B-Zell-Lymphom (79). Die Zellen sind wie ihre physiologischen Gegenstücke hypermutiert und weisen intraklonale Sequenzunterschiede auf. Eine klonale Entwicklung wurde in Veröffentlichungen über die nodalen Keimzentrumszell-Lymphome beschrieben (80;81).

Die ähnliche Anzahl von Mutationen in Keimzentrumszellen am Ende der Keimzentrumszellreaktion und den Nachkeimzentrumszellen erschwert die Unterscheidung sowie die Zuordnung der untersuchten Zellen erheblich. B-Zell-Tumoren mit typischer Verteilung und Anzahl gefundener Mutationen wurden von einigen Autoren als post-germinal center cell-Lymphome gewertet, da intraklonal divergierende Sequenzen nicht gefunden wurden (74;76;79).

Das fehlende Aufzeigen von intraklonalen Diversitäten bedeutet dennoch nicht, daß die Zellen in jedem Fall von Nachkeimzentrumszellen abstammen. Es ist vorstellbar, daß sie aufgrund der Methode unentdeckt blieben. Die Analyse von Tumorzellen, bzw. deren DNA, geschah bisher zumeist aus lediglich einer einzigen Biopsie. Die Ergebnisse wurden repräsentativ für das gesamte Tumorgewebe gewertet. Jedoch kann die Entnahme nur einer Biopsie nicht beweisen, daß alle Zellen des Tumors klonal identisch sind bzw. auszuschließen ist, daß an anderer Stelle des Tumors klonal divergierende Sequenzen zu finden wären.


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Unsere These:

Die Untersuchung von entfernt lokalisiertem Biopsiematerial kann Sequenzunterschiede aufzeigen und somit einen Beweis für intraklonale Diversität erbringen. Die Folge ist, daß die Tumorzellen nicht von Nachkeimzentrumszellen abstammen, sondern eher den Keimzentrumszellen zu zuordnen wären.

Hinweise, ob die Hypermutationsmaschinerie noch aktiv ist oder ob eventuell Nachkeimzentrumszellen wieder in die Keimzentrumsreaktion eingetreten sind (82), können Analysen von räumlich getrennten Biopsien nicht geben. Um diese Fragen zu beantworten, müßte chronologisch Gewebematerial entnommen und in Abhängigkeit von der Zeit untersucht werden (83). Das Vorliegen von intraklonaler Diversität bedeutet, daß sich ein Mutationsprozeß (auch zum Zeitpunkt der Entartung) ereignet hat und schließt nicht zwangsläufig mit ein, daß andauernde Mutationen (ongoing mutations) noch stattfinden.

So wird von Aarts et al. (84) berichtet, andauernde Mutationen in VH-Genen bei primär kutanen B-Zell-Lymphomen ( 1 Keimzentrumszell-Lymphom und 3 Immunozytome) gefunden zu haben. Allerdings ist eine chronologische Entnahme der untersuchten Proben aus dem Dargestellten nicht ersichtlich und die exakte Beurteilung, aufgrund der durchgeführten Populationsanalysen (PCR), schwierig (siehe Methode 5.3). Aus molekularbiologischer Sicht müßte der Terminus intraklonale Diversität gewählt werden.

Ein weiterer in Betracht zu ziehender Aspekt dieser Studie ist, daß sich drei von den sieben untersuchten Fällen (Keimzentrumszell-Lymphome) als monoklonal erwiesen (84). Auch hier wäre es vorstellbar, durch die Analyse von räumlich getrenntem Biopsiematerial evtl. Sequenzunterschiede aufzeigen zu können.

Die Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit topographisch verschiedene Stellen eines primär kutanen B-Zell-Lymphoms mittels Einzel-Zell-PCR-Technik zu untersuchen, um präzise Aussagen über die Biologie der PKBZL treffen zu können.

Durch Klonierungstechniken können intraklonale Sequenzunterschiede aufgrund der hohen Fehlerquote der Taq-DNA-Polymerase und der Formation von PCR-Hybriden (41) nicht zuverlässig interpretiert werden.

Die hier verwendete Einzel-Zell-PCR-Technik wurde mehrfach etabliert (76;85;86). Sie ist die Methode der Wahl, um Immunglobulingene in unmittelbar benachtbarten bzw. räumlich getrennten B-Zellen zu analysieren und Aussagen über intraklonale Diversität zu treffen.


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Kutane maligne Lymphome sind Gegenstand unserer Forschungsgruppe. Für den Einsatz und die Evaluierung der Einzel-Zell-PCR-Technik stellen sie eine methodisch leicht zugängliche, maligne B-Zell-Lymphomerkrankung dar. Es ist möglich räumlich getrennte Biopsien eines Tumors, mit einem definiertem Abstand, zu entnehmen und die variablen Genabschnitte der Immunglobulingene, in Abhängigkeit von der Lage, zu analysieren.

5.1 Intraklonale Diversität

In der vorliegenden Arbeit wurden von zwei Patienten mit kutanen B-Zell-Lymphomen entfernt lokalisierte Gewebeproben entnommen und mittels Einzel-Zell-PCR- und Sequenziertechnik die Nukleotidsequenzen der variablen Immunglobulin-Genabschnitte vornehmlich auf intraklonale Diversität analysiert.

Bei Patient WS, wo drei Biopsien (I,II,III) entnommen wurden, konnten in insgesamt 100 mikromanipulierten Zellen 24 gegenüber dem Keimbahngen mutierte, klonal verwandte VJ-Rearrangements der Vκ3´-Familie gefunden werden.

Die Nukleotidsequenzen des Tumorklons zeigten sich intraklonal divers. Vier verschiedene Subklone mit Unterschieden vor allem in der CDR 1, konnten identifiziert werden (WSVκ3 A-D, Abbildung 21). Tatsächlich ist eine räumliche Abhängigkeit der jeweils identischen Sequenzen zu ihrer Entnahmestelle festzustellen. Sequenz WSVκ3C ist in 12 Zellen gefunden worden, die alle aus Biopsie I stammen. Die beiden Subklone WSVκ3A und WSVκ3B (Sequenz wurde 3x bzw. 5x gefunden) stammen aus Zellen der Biopsie II, wohingegen die viermal vorliegende Sequenz WSVκ3D nur in Biopsie III zu finden war. Es kann hier von einer Entwicklung aus einer gemeinsamen Vorläuferzelle ausgegangen werden. Die putative Vorläuferzelle X, aus der sich alle vier gefundenen Subklone entwickelt haben könnten, ist in Abbildung 22dargestellt. Der Subklon WSVκ3B (insgesamt 14 Mutationen) weist in der CDR 1 eine zusätzliche Austauschmutation auf und könnte sich, bei ansonstem identischen Verteilungsmuster der Mutationen, aus Subklon WSVκ3A (13 Mutationen) entwickelt haben. Sequenz WSVκ3D (13 Mutationen) fehlt an Nukleinsäureposition 32 eine Austauschmutation, sie ist dort mit dem Keimbahngen identisch, aber außerdem an Position 31a stumm mutiert, was einen getrennten Entwicklungsweg vermuten läßt. Die eigenständige Entwicklung trifft ebenfalls für den Subklon WSVκ3C (16 Mutationen) zu, der mit zwei zusätzlichen Austauschmutationen in der CDR 1 und stummen Mutationen in FR 2 ausgestattet ist. Die Unterschiede im Mutationsmuster der vier verschiedenen Sequenzen beschränken sich auf ein bis zwei Austauschmutationen in der CDR 1 sowie einige stumme Mutationen. Die Differenz der absolut [Seite 62↓]gefundenen Mutationen in den Subklonen (16-13=3) ist gering. Da die verschiedenen Austauschmutationen in jeweils mehreren Zellen und aus unabhängigen PCR-Ansätzen (hier nicht dargestellt) stammen, sprechen die Ergebnisse eher für die Genauigkeit der Methode, als für einen PCR- bzw. Sequenzierfehler. Ob die Tumorzellen zum Entnahmezeitpunkt noch an der Keimzentrumsreaktion beteiligt waren, läßt sich anhand der gefundenen Daten nicht verifizieren. Der Fund von intraklonaler Diversität an räumlich differenten Stellen des Tumors erlaubt es, aus molekularbiologischer Sicht, die Lymphomzellen den Keimzentrumszellen zu zuordnen.

Eine mögliche Entwicklung der vier Subklone aus einer gemeinsamen Vorläuferzelle X in Abhängigkeit von der Lokalisation im Tumor zeigen die Abbildungen 21, 22.

Molekularbiologisch gelang der Nachweis einer klonalen B-Zell-Expansion für die schwere Kette der Immunglobulingene bei Patient WS nicht. Es kann sich hier um eine Deletion des VH-Segmentes handeln oder um eine Mutation, die das Binden der von uns verwendeten Primer verhinderte. Die Existenz eines noch unbekannten VH-Gens ist kaum vorstellbar, da der gesamte Genlocus der VH-Gene bekannt ist (57;87).

Die immunhistochemisch nachgewiesene Expression des Apoptose-Proteins bcl-2 gilt von einigen Autoren als Hinweis auf einen systemischen Prozeß (4), ist aber in Keimzentrumszell-Lymphomen nicht zwingend an eine t(18;14) Translokation gebunden (88).

Die weiterführende Diagnostik (CT-Abdomen, Becken, Halsbereich) zum Entnahmezeitpunkt der Biopsien ergab verdächtige Areale in der Leber und Lymphknotenmanifestationen links iliakal und interaortokaval. Diese Befunde konnten in Form einer Biopsie, aufgrund einer Ablehnung durch den Patienten, nicht gesichert werden.

Es soll hier nicht weiter darauf eingegangen werden, ob es sich bei diesen Befunden primär um einen systemischen Prozeß oder um Absiedlungen im Rahmen eines primär kutanen B-Zell-Lymphom handelt. In dieser Arbeit steht die Evaluierung der Methode, hinsichtlich der Möglichkeit intraklonale Diversität aufzuzeigen, im Vordergrund.

Entscheidend ist, daß zum Zeitpunkt der Erstdiagnose 1996 (ein Jahr zuvor) keine extrakutane Beteiligung nachweisbar war. Laut Definition wird von einem primär kutanen B-Zell-Lymphom gesprochen, wenn zum Zeitpunkt der Diagnose keine Manifestationen außerhalb der Haut gefunden worden sind. Die Abwesenheit extrakutaner Beteiligung ist für einen Zeitraum von mindestens 6 Monaten veranschlagt (12). Ein Parameter, der stark von der compliance des Patienten abhängt und gerade für retrospektive Studien schwierig zu beweisen ist.


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Abbildung 21: Die Anzahl der gefundenen Subklone A-D in bezug auf ihre Lokalisation im Tumorexzisat. I-III kennzeichnen die Entnahmestellen der untersuchten Biopsien

Abbildung 22: Tumorklonentwicklung in den Lymphomzellen bei Patient WS

Dargestellt ist eine putative Vorläuferzelle X mit den Mutationen, die in allen vier Subklonen (A-D) gemeinsam vorkommen. Eine mögliche Tumorklonentwicklung mit Kennzeichnung aller hinzugekommenen Mutationen, einschließlich ihrer Position, schließt sich auf der rechten Seite an.


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Die Lymphomzellanalyse des Patienten LB bezog sich auf 126 Lymphomzellen, die aus insgesamt 8 Biopsien (I-VIII) mikromanipuliert wurden. Hier gelang es, sowohl für die schwere als auch für die leichte Kette der Immunglobulingene, klonal verwandte Rearrangements zu detektieren. Für die schwere Kette konnten 46 VHDJH-Rearrangements der VH4 Familie gefunden und die Sequenzen auf intraklonale Diversität überprüft werden. In allen acht Biopsien konnte in 44 Zellen eine identische Sequenz ermittelt werden (LBVH4A), die mehrfach in den entfernt lokalisierten Gewebeproben vorlag. Die gefundenen Tumorzell-Sequenzen erwiesen sich als monoklonal. Die im Vergleich zum Keimbahngen mutierte Sequenz scheint, bei alleiniger Betrachtung der schweren Kette, von Nachkeimzentrumszellen abzustammen. Es ist zu erwähnen, daß in zwei Zellen klonale Unterschiede in Form einer einzigen Austauschmutation in FR 3 bzw. einer stummen Mutation ebenfalls in FR 3 entdeckt wurden (Sequenzen nicht dargestellt). Da es sich bei den beiden Sequenzen, die beide aus der Biopsie III stammen, um einmalige Funde handelt und sich das Ergebnis in keiner weiteren Biopsie bzw. Einzelzelle bestätigen ließ, haben wir die Ergebnisse in der Auswertung nicht in Betracht gezogen. Grundsatz für die Zuverlässigkeit jeder Methode ist die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Bei der Einzel-Zell-PCR-Technik, vor allem bei der Frage „intraklonale Diversität ja oder nein“, kann das nur in der Form geschehen, daß Sequenzen aus verschiedenen Einzelzellen und damit unabhängigen PCR-Reaktionen wiederholt gefunden werden. Bei einmaligen Ergebnissen kann ein Fehler, z.B. der Taq-DNA-Polymerase in der ersten Runde, nicht ganz ausgeschlossen werden, obwohl die Wahrscheinlichkeit äußerst gering ist.

Für die leichte Kette der Immunglobulingene der Lymphomzellen ergab sich ein ähnliches Bild.

Die 34 analysierten VJ-Rearrangements erwiesen sich als der Vλ3b-Familie zugehörig und im Vergleich zum am meisten homologen Keimbahngen als stark mutiert (siehe Mutationsanalysen 5.2). In drei der acht Biopsien konnte kein Produkt erhalten werden. So konnten für die leichte Kette nur fünf getrennt lokalisierte Gewebeproben Berücksichtigung finden. In allen fünf Biopsien lag mehrfach eine identische Sequenz vor (LBVλ3ba). Der Tumorklon konnte in insgesamt 28 Einzelzellen gefunden werden. Eine weitere Sequenz (LBVλ3bd) konnte in drei Biopsien (V,VI,VIII) je einmal analysiert werden. Die intraklonale Diversität zu Sequenz LBVλ3ba beschränkt sich auf eine stumme Mutation im Bereich der CDR 1 (Position 34). Da sie in drei Fällen unabhängig voneinander gefunden wurde, gilt das Ergebnis als bestätigt. Für die molekularbiologische Aussage ist eine einzige zusätzliche stumme Mutation von nicht allzu großer Bedeutung. Aber auch hier spricht es für die Methode, selbst geringfügige Unterschiede verläßlich aufzeigen zu können.


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Drei weitere Sequenzen wurden nur einmalig gefunden und deshalb nicht in die sich anschließende Mutationsanalyse einbezogen.

Betrachtet man die Ergebnisse für die schwere und die leichte Kette zusammen, ist zu erwähnen, daß in 24 Zellen beide Rearrangements analysiert werden konnten. Der Tumorsequenz LBVH4A konnte kombiniert mit LBVλ3ba und LBVλ3bd gefunden werden. Die theoretisch denkbare Möglichkeit, daß die Rearrangements der schweren bzw. der leichten Kette aus zwei unabhängig voneinander entarteten Zellen stammen, ist folglich nicht gegeben.

In einer einzigen Zelle die variablen Abschnitte der Immunglobulingene für die schwere und leichte Kette zu identifizieren und deren Nukleotidsequenzen mit großer Zuverlässigkeit zu analysieren, ist eine einzigartige Leistung der Einzel-Zell-PCR-Technik.

Trotz des relativ großen Aufwandes, acht getrennt lokalisierte Gewebeproben zu untersuchen, konnten keine funktionellen, d.h. die Aminosäuresequenz verändernden, intraklonalen Unterschiede ausgemacht werden. Eine Teilnahme der Zellen an aktiven Mutationsvorgängen des Keimzentrums ist deshalb mit großer Wahrscheinlichkeit auszuschließen. Molekularbiologisch stammen die hypermutierten Zellen von Nachkommen der Keimzentrumszellen ab. Die Möglichkeit, eine klonale Entwicklung der Lymphomzellen aufzuzeigen, ist hier nicht gegeben, da intraklonale Unterschiede zu gering sind.

Die Klassifikation betrachtend, könnte der Tumor ein Marginalzonen B-Zell-Lymphom sein, welches mit den MALT-Lymphomen häufig verglichen worden ist (8;89).

5.2 Statistische Mutationsanalysen

Mutationsanalysen lassen eine Aussage darüber zu, in welchem Entwicklungsstadium sich die physiologische B-Zelle zum Zeitpunkt der Untersuchung bzw. die Tumor-B-Zelle zum Zeitpunkt ihrer Entartung befand und geben einen Hinweis, ob eine antigengetriebene Selektion stattgefunden haben könnte.

Unreife B-Zellen haben eine relativ geringe Mutationsfrequenz in den Bereichen der Antigenbindung (0,3%) (90) im Gegensatz zu B-Zellen, die mit dem Antigen in Kontakt (Affinitätsreifung) gestanden haben (B-Gedächtniszellen 4%.) (91).

Die Tumorsequenzen des untersuchten Vκ-Gens des Patienten WS wiesen Mutationsraten von 5,04 - 6,2% auf und liegen damit nur geringfügig über denen von Gedächtniszellen. Es handelt [Seite 66↓]sich bei den Tumorzellen vermutlich um Keimzentrumszellen, die somit an der Keimzentrumsreaktion teilgenommen haben.

Das Lymphom VH-Gen des Patienten LB liegt mit einer Mutationsrate von 13,4% deutlich über den für humane VH-Gene typischen Werten. Auch die Mutationsfrequenz des rearrangierten Vλ-Gens (10,7-11,1%) ist eindeutig höher. Hier ist davon auszugehen, daß die Tumorzellen länger als üblich an der Keimzentrumsreaktion teilgenommen haben, da im Gegensatz zu Schafen beim Menschen keine antigen- und keimzentrumsunabhängige Hypermutation beschrieben wurde (92). Wann das transformierende Ereignis stattfand, ist aus der Betrachtung der Mutationszahlen allein nicht ersichtlich.

Selektionierte B-Zell-Klone weisen eine typische Mutationsverteilung mit Bevorzugung der die Proteinstruktur verändernden Austauschmutationen (replacement) in den CDRs und einer Anhäufung von stummen (silent) Mutationen in den strukturbewahrenden Bereichen (FRs) auf.

Nach der Annahme von Jukes & King (93) treten nicht selektionierte Mutationen folglich zufällig über das gesamte Gen verteilt auf, ohne besondere Abschnitte des Gens zu bevorzugen. Aus den 61 aminosäurekodierenden Triplets errechneten sie alle Mutationsmöglichkeiten für stumme als auch für Auschtauschmutationen. Für nicht selektionierte, also zufällig auftretende, Mutationen ergab sich eine R/S-Ratio von 2,9. Liegt nun das Verhältnis der Austausch- zu den stummen Mutationen in einem Genabschnitt, insbesondere in den CDRs, über diesem Wert, kann von einem selektionierten Vorgang ausgegangen werden. Werte unter 2,9 sprechen eher für einen Erhalt der Proteinstruktur.

Chang & Casali (95) ergänzten diese Theorie, da sie feststellten, daß vornehmlich in der CDR1 aminosäurekodierende Triplets anzutreffen sind, die überdurchschnittlich häufig zu einer Austauschmutation führen. Deshalb wird der Vergleich der R/S-Ratios der mutierten Immunglobulingene mit der intrinsischen R/S-Ratio der entsprechenden Keimbahnsequenz vorgezogen, die sich aus der Addition der Wahrscheinlichkeiten für jedes vorkommende Triplet ergibt (siehe Ergebnisse).

Shlomchik et al. (94) entwickelten daraus eine Formel mit der die Wahrscheinlichkeit (q), daß eine R-Mutation in den CDRs zufällig auftritt, für das vorliegende Gen berechnet werden kann. Man multipliziert den statistischen Anteil der Austauschmutationen (Rf) an allen möglichen Mutationen mit der relativen Größe der CDRs (rel. Gr.CDR) zum gesamten Gen und den insgesamt tatsächlich aufgetretenen Mutationen (n). Daraus ergibt sich die erwartete Anzahl an R-Mutationen in den CDRs. Diese kann mit den beobachteten verglichen werden. Liegt der [Seite 67↓]beobachtete Wert oberhalb des erwarteten, kann von einer positiven Selektion gesprochen werden (Tabellen 17, 18). Zusätzlich kann eine eventuelle Gegenselektionierung in den FRs in Betracht gezogen werden. Hier können Werte den Beweis einer Selektion unterstützen, wenn die tatsächlich beobachteten R-Mutationen unter den berechneten liegen. Eine Zusammenfassung der Mutationsanalyse für beide untersuchten Patienten zeigen die Tabellen 17 und 18.

Die jeweils letzte Spalte der Tabellen zeigt eine zusätzlich erarbeitete Formel (binominal probability model), die angibt, wie hoch die Wahrscheinlichkeit (p) ist, daß die beobachtete Verteilung der R-Mutationen ohne Selektionsdruck, also zufällig entstanden ist. Hohe Werte sprechen eher für einen unselektionierten Vorgang, kleine Werte für eine selektionierte Mutationsverteilung (94).

Für den Patienten WS zeigt die Auswertung der absoluten R/S-Ratios in den CDRs der Vκ-Gene aller gefundenen Subklone Werte im Bereich zwischen 1 - 2,7. Diese liegen unterhalb der intrinsischen R/S-Ratio des am meisten homologen Keimbahngens (R/SCDR 3,37). Mit alleiniger Betrachtung dieser Werte könnte ein selektionierter Mutationsvorgang nicht bestätigt werden. Die Notwendigkeit, andere Auswertungsmethoden zur Analyse der somatischen Hypermutation hinzuzuziehen, ist hier gegeben. Es besteht die Möglichkeit, daß der Tumor von Zellen abstammt, die sich am Anfang der Keimzentrumsreaktion befanden. Das Fehlen von R-Mutationen in den FRs und die sich somit ergebenen R/S-Ratios von 0, die deutlich unter dem intrinsischen Wert liegen, deuten auf einen die Struktur konservierenden Vorgang hin. Es ist zu erwähnen, daß die errechneten intrinsischen Werte für die FRs tendenziell zu hoch angesetzt werden, da nach Shlomchik et al. (94) ca. die Hälfte der theoretisch möglichen R-Mutationen strukturell nicht akzeptabel wären.

Vergleicht man nun die beobachteten R-Mutationen in den CDRs mit den errechneten, erwarteten R-Mutationen in diesen Bereichen, kann man eine überdurchschnittliche Anhäufung von R-Mutationen ausmachen. Statistisch erwartet wurden, in Abhängigkeit vom Subklon, 3 - 4 Austauschmutationen. Die tatsächlich beobachtete Anzahl von 5, 6, 7 bzw. 8 R-Mutationen liegt jeweils über der errechneten. Die mit dem binominal probability model errechnete Wahrscheinlichkeit (p), daß von insgesamt 13 Mutationen die 6 R-Mutationen in den CDRs zufällig entstanden sind, beträgt bei der Sequenz WSVκ3A lediglich 0,043. Das bedeutet, die vorliegende Verteilung fände in 4 von 100 Fällen zufällig statt. Bei den Sequenzen WSVκ3B und C liegt die Wahrscheinlichkeit der zufälligen Verteilung nur bei 1-2%, bei Sequenz WSVκ3D bei 10%.


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Die gegenüber dem erwarteten Wert erhöhte Anzahl von R-Mutationen in den CDRs sowie die, zumindest in drei von vier Fällen, sehr geringe Wahrscheinlichkeit einer zufälligen Verteilung und die nicht vorhandenen Austauschmutationen in den FRs sprechen, zusammenfassend betrachtet, für eine selektionierte Mutationsverteilung. Eine antigengetriebene Entstehung der hier vorliegenden intraklonalen Diversität ist folglich denkbar. Da der Nachweis von sogenannten andauernden Mutationen (ongoing mutations) mit der Entnahme von Biopsien zu ein und demselben Zeitpunkt nicht möglich ist, kann keine Aussage darüber getroffen werden, ob der Hypermutationsprozeß am Tag der Untersuchung noch aktiv war.

In Zusammenhang mit der Analyse von somatischen Punktmutationen soll ein interessanter Aspekt in bezug auf Änderungen in der Proteinsequenz erwähnt werden. Die Austauschmutationen bei Patient WS konzentrieren sich bevorzugt auf den Bereich der CDR 1. Betrachtet man an zwei speziellen Stellen die entsprechende Änderung der Aminosäuresequenz, fällt auf, daß in Subklon WSVκ3B durch den Nukleotidaustausch an Position 28 (AGT Þ CGT) die Aminosäure Arginin anstatt Serin kodiert wird. Derselbe Aminosäureaustausch (Serin mit Arginin) ist in Subklon WSVκ3C (AGC Þ AGA) an Position 31 zu finden. Die beiden Austauschmutationen haben eine Schlüsselrolle, weil sie zur intraklonalen Diversität beitragen.

Bei der Untersuchung von Autoantikörpern (u. a. von Patienten mit Systemischem Lupus Erythematodes) konnte, vor allem in den CDR-Bereichen, eine Bevorzugung der Aminosäuren Asparagin und Arginin in Austauschmutationen gefunden werden (96). Es wurde festgestellt, daß diese Aminosäuren entscheidend sind für Wechselwirkung und Bindung an DNA-Molekülen (94).

Das Auftreten in den Subklonen bei Patient WS bzw. in den die intraklonale Diversität bedingenden Austauschmutationen könnte einen Hinweis geben, daß DNA als Autoantigen möglicherweise eine antigene Determinante darstellt. Auch die Lokalisation in der CDR 1 unterstützt die These einer antigengetriebenen Selektion, der Tumorklonentwicklung bei Patient WS.

Betrachtet man die Ergebnisse der Mutationsanalyse der Schwer- und Leichtkettengene für Patient LB auf die gleiche Weise, ist zu sehen, daß die R/S-Ratio der Sequenz LBVH4A in den CDRs (⇒ 2,25) ebenfalls unter der intrinsischen R/S-Ratio des Keimbahngens (⇒ 4,61) liegt. Die Anzahl der beobachteten R-Mutationen (⇒ 9) ist geringfügig höher als die der erwarteten (⇒ 7). Auch die Wahrscheinlichkeit einer zufälligen Verteilung von über 10% läßt keine statistisch signifikante Aussage über einen antigen-selektionierten Mutationsprozeß zu.


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Für die leichte Kette der Immunglobulingene ergibt sich folgendes Mutationsmuster. Für Sequenz LBVλ3ba sind die beobachteten R-Mutationen (⇒ 10) ebenfalls höher als die theoretisch erwarteten (⇒ 7). Hier liegt auch die tatsächliche R/S-Ratio der CDRs (⇒ 10) deutlich über der intrinsischen des Keimbahngens (⇒ 4,34). Die Wahrscheinlichkeit der Zufälligkeit, 10 R-Mutationen von insgesamt 27 Mutationen in den CDRs zu finden, liegt bei 0,072. Analysiert man Sequenz LBVλ3bd ergibt sich ein ähnliches Bild. Auffällig ist, daß die R/S-Ratio dieser Sequenz nur 5 beträgt und die Ursache eine einzige zusätzliche stumme Mutation ist. Es soll hier auf die Problematik der statistischen Betrachtungsweise von Mutationsmustern hingewiesen werden.

Durch die alleinige R/S-Ratio-Analyse kann keine eindeutige Aussage getroffen werden, da es sich hier um statistisch sehr kleine Zahlen handelt. Wie das zuletzt beschriebene Beispiel zeigt, kann eine einzige stumme Mutation den Quotienten erheblich verändern und aus einem vermeintlich selektioniertem Wert von 10/1 ergibt sich ein unselektionierter von 10/2=5.

Zu beachten ist weiterhin die Tatsache, daß es durchaus unterschiedliche Auffassungen gibt, welche Aminosäuren an der Antigenbindung beteiligt sind, u.a. MacCallum et al. (97) veröffentlichte die sogenannte contact definition = CD, bei der die antigenbindenden Regionen nicht mit der Einteilung von Kabat et al.(28) übereinstimmen. Eine abweichende Betrachtung der antigenbindenden Bereiche kann zwangsläufig eine nicht unerhebliche Änderung der statistisch errechneten Werte und deren Aussage zur Folge haben.

Auch ist nicht genau geklärt, welche Mutationen die Affinität zum Antigen tatsächlich erhöhen. Es ist vorstellbar, daß auch Austauschmutationen in den FRs durch eine Strukturänderung eine bessere Antigen-Bindung bewirken können, bzw. daß eine einzige Mutation in den CDRs ausreicht, um einen optimal passenden Antikörper zu produzieren. Nachweislich vermögen auch Antikörper in Keimbahnkonfiguration Antigene hoch-affin zu binden (98).

Statistische Mutationsanalysen der variablen Abschnitte der Immunglobulingene können folglich einen selektionierten Mutationsprozeß nicht beweisen, aber bei ganzheitlicher Betrachtung Hinweise geben und so einen Anreiz darstellen, eine Antigen-Stimulation als Auslöser bei primär kutanen Lymphomen in Erwägung zu ziehen bzw. zu untersuchen.


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Tabelle 17: Statistische Mutationsanalysen der Tumorgensequenzen von Patient WS

(Zeichenerklärung: s. Tabelle 18)


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Tabelle 18: Statistische Mutationsanalysen der Tumorgensequenzen von Patient LB für die schwere und leichte Kette

n: Gesamtzahl der Mutationen
rel. Gr.: relative Größe
Rf o. Sf: statistischer Anteil der R- oder S-Mutationen an allen möglichen Mutationen in den CDRs bzw. FRs
k: Anzahl beobachteter R-Mutationen in den CDRs
q: Wahrscheinlichkeit, daß eine Mutation als R-Mutation in den CDRs auftritt; q = rel. Gr. x Rf
p: Wahrscheinlichkeit, daß die vorliegenden R-Mutationen in den CDRs zufällig so verteilt sind (binominales Wahrscheinlichkeitsmodell) (94)


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5.3  Methode

Die Molekularbiologie und Genetik halten immer mehr Einzug in die medizinische Forschung, um Zusammenhänge und Ursachen von Krankheitsentstehung aufzuzeigen, Behandlungsmethoden zu entwickeln und eine effiziente Diagnostik zu ermöglichen. Die angewendeten Verfahren erfuhren in den letzten Jahrzehnten enorme Entwicklungsschritte, und so ist es heute möglich geworden, Analysen auf DNA-Ebene durchzuführen.

Mit der Entdeckung der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), also der Amplifikation von DNA-Molekülen durch wiederholte Polymerisationszyklen mit Hilfe von Oligonukleotiden und einer DNA-Polymerase (49;52), ergab sich eine Möglichkeit, die kleinste Baueinheit von Lebewesen zu erforschen. Die in vitro Vervielfältigung und Analyse von DNA aus Einzelzellen (Spermien) gelang erstmalig durch Li et al. (50). Die Entwicklung der Mikromanipulation von Zellpopulationen aus einem histologischen Gewebeverband mit sich anschließender PCR (67) mündete in die heutige Möglichkeit, sogar Einzelzellen aus ihrem histologischen Kontext zu isolieren und deren DNA mittels PCR und Direktsequenzierung zu untersuchen (99).

In der Lymphomdiagnostik werden die physiologisch variablen Genabschnitte der rearrangierten Immunglobuline analysiert und anhand eines Monoklonalitätsnachweises als maligne eingestuft.

Untersuchungen auf Einzelzellniveau haben entscheidende Vorteile gegenüber den häufig praktizierten Populationsanalysen.

Die Einzel-Zell-PCR-Technik erlaubt es, nicht mehr nur qualitativ, die Monoklonalität einer Lymphozytenpopulation nachzuweisen, sondern quantitativ, in enger Korrelation mit Zytologie und Lage im Tumorgewebe, exakte Aussagen über spezifische Zellen machen zu können. Andere Methoden, wie z.B. die Southern-Blot-Hybridisierung, bei der DNA aus den zu untersuchenden Zellen präpariert sowie mit Restriktionsendonukleasen verdaut wird und anschließend die elektrophoretisch aufgetrennten DNA-Fragmente nach einem Transfer auf eine Nylonmembran mittels Hybridisierung mit markierten Gensonden sichtbar gemacht werden (1), erwies sich als ein technisch aufwendiges Verfahren. Ein weiterer Nachteil ist der relativ große Bedarf (μg-Bereich) an gut erhaltener DNA bei relativ geringer Sensitivität.

Auch bei der in der Routinediagnostik eingesetzten PCR von Zellpopulationen aus dem Blut oder aus Biopsiematerial (also einem DNA-Gemisch) stellte sich der Monoklonalitätsnachweis als problematisch heraus, vor allem wenn der Anteil der tumorspezifischen an der Gesamt-DNA sehr gering ist. Bei beiden Verfahren müssen ca. 1%-5% klonale Zellen vorhanden sein, um die [Seite 73↓]Nachweisgrenze zu überschreiten (43). Ein Grund dafür ist, daß DNA aus gleichzeitig vorhandenen reaktiven Lymphozyten ebenfalls mit den verwendeten Oligonukleotiden hybridisieren und amplifiziert werden kann, so daß das monoklonale PCR-Produkt in der Elektrophorese nicht erkannt wird. Auch die artifizielle Hybridbildung, die auftreten kann, wenn beim Amplifikationsprozeß ähnliche Moleküle (wie z.B. rearrangierte Immunglobulingene) in einem Reaktionsgefäß vorliegen, ist ein Nachteil zur Beurteilung intraklonal diverser Gene. Hybride Moleküle können sich aus verschiedenen, die V-Region kodierenden Genen oder aus Mutationsvarianten gleicher Gene zusammensetzen und machen eine zuverlässige Sequenzanalyse nicht mehr möglich, weil sie häufig schwer zu identifizieren sind (41;43).

Einzelzell-Produkte können direkt, ohne Klonierung in Plasmiden, sequenziert werden, da sie ein individuelles Rearrangement repräsentieren, das nur in einer Kopie vorliegt. Sequenzartefakte, die auf Fehlern der Taq-DNA-Polymerase bei PCR-Produkten, die vor der Sequenzierung kloniert werden, beruhen und so die Identifikation von Punktmutationen in rearrangierten V-Genen erschweren, sind bei der Direktsequenzierung einer Einzelzelle vernachlässigbar (44).

Mit Hilfe der Einzel-Zell-PCR-Technik lassen sich die untersuchten Lymphomzellen nicht nur bezüglich der Lage im Gewebeverband definieren, sondern es kann auch eine zuverlässige Aussage über intraklonale Diversität getroffen werden.

Für die Analyse von antigen-selektionierten Hypermutationen ist es ebenfalls von großer Bedeutung, daß in ein und derselben Zelle die Sequenzen für die schwere und die leichte Kette des Antikörpers amplifiziert und analysiert werden können (45). Nur so kann bewiesen werden, daß die Klone für die schwere und leichte Kette der Ig-Gene aus einer gemeinsamen Zellpopulation stammen.

Die Sensitivität der Methode bei der Diagnostik von B-Zell-Lymphomen liegt zwischen 70% und 90% und ist abhängig von den Bindungsstellen der verwendeten Primer (100). Jedoch beziehen sich die Daten auf Untersuchungen, bei denen die Lymphozytenpopulationen zuvor durch Southern-Blot-Hybridisierung als monoklonal bestätigt worden sind. An der Dermatologischen Universitätsklinik der Charité Berlin können bei klinisch, immunhistochemisch und histologisch gesichertem Verdacht auf ein kutanes B-Zell-Lymphom, ca. 50% der Tumoren durch die PCR-Routine-Diagnostik als monoklonal identifiziert werden.

Bei den von uns untersuchten DNA-Abschnitten handelt es sich in der Regel um hypermutierte Regionen. Es ist vorstellbar, daß die verwendeten Oligonukleotidprimer, die anhand der unmutierten Keimbahngene entwickelt wurden, aufgrund von Mutationen in den [Seite 74↓]komplementären Bereichen nicht binden können. Keine Rolle spielt dabei, ob es sich um eine die Aminosäuresequenz verändernde Mutation handelt oder nicht. So liegt die Sensitivität der Methode für den Nachweis von unmutierten B-Zellen der CLL bei nahezu 100%, für die Keimzentrumszell-Lymphome nur bei bis zu 70% (100). Der fehlende Nachweis des Gen-Rearrangements für die schwere Kette bei Patient WS könnte in dieser Ursache begründet sein.

Dennoch ist die Sensitivität der Polymerase-Ketten-Reaktion in Abhängigkeit von der Anzahl der Zielmoleküle sehr hoch (51). Ein einziges Molekül ist ebenfalls nachweisbar, bedarf aber genau abgestimmter Reaktionsbedingungen. Die gewählte Temperatur der Zyklen und die Salzkonzentration sind entscheidende Parameter für den Erfolg und eine hohe Spezifität der Produkte (51). Die Temperatur zum Binden der Primer an den Zielmolekülen sollte möglichst hoch gewählt werden, da die Interaktion bei Zimmertemperatur ungenau ist und die bei dieser Temperatur aktive Polymerase unspezifische Produkte amplifizieren könnte. Sind diese kleiner als das Ziel, werden sie effizienter produziert.

Die Anzahl falsch eingebauter Nukleotide während der PCR hängt nicht allein von Fehlern der DNA-Polymerase ab, sondern in erheblichem Maße von der gewählten dNTP-Konzentration. Im allgemeinen gilt für optimale PCR Bedingungen der Grundsatz, die annealing- und Extensionszeit zu minimieren, die Bindungstemperatur der Primer zu maximieren und eine kleinstmögliche Menge an dNTP und MgCl2 zu verwenden. Die Steigerung der Genauigkeit der Reaktionsbedingungen geht mit Einbußen in der Effizienz einher.

Die Korrektheit der Taq-DNA-Polymerase ist erstaunlich hoch, die Fehlerrate bei der PCR liegt bei ca. 5x10-6 pro Zyklus, so haben lediglich 3% der Moleküle mit einer Länge von ca. 200 bp nach 30 Zyklen eine falsch eingebaute Base (51). Bei der Einzel-Zell-PCR-Technik mit anschließender Direktsequenzierung führt der Einbau einer fehlerhaften Base, selbst in der ersten Runde der PCR, lediglich zu einer Überlagerung im Elektropherogramm, anders als bei Klonierungen, wo auch die Fehlerrate kombiniert mit der PCR erheblich höher ist (1,5x10-3).

Es besteht die Möglichkeit, daß die bei Patient LB einmalig gefundenen Sequenzen mit lediglich einem unterschiedlichen Basenaustausch auf einen Polymerasefehler zurückzuführen sind oder das Elektropherogramm falsch interpretiert wurde. Aus dieser Beobachtung ergibt sich ein erheblicher Nachteil der verwendeten Methode. Die Ergebnisse sind nicht unmittelbar reproduzierbar. Ein einmalig gefundener Basenaustausch kann nicht bestätigt werden. Nur wenn sich das Ergebnis in zwei verschiedenen Zellen in unabhängigen PCR-Reaktionen wiederholt, ist die Zufälligkeit äußerst gering, und der Austausch kann als erwiesen gelten.


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Kontaminationen von vorangegangenen Experimenten (PCR-Reaktionen oder Klonierungen) stellen das größte Problem dar. Ein verschwindend kleiner Anteil kontaminierender monoklonaler DNA kann das Amplifizieren des gewünschten Produktes verhindern. Es ist daher notwendig, die Mikromanipulation der Zellen und die erste Runde der PCR in einem anderen Raum durchzuführen, als die 2. Runde der PCR und die Analyse der Produkte. In dem Mikromanipulationsraum wurden nur der Zellkern und die Chemikalien für die 1. und 2. Runde pipettiert. Reaktionsgefäße mit amplifizierter DNA wurden nur in dem Raum geöffnet, in welchem die zweite Runde und die Sequenzierung erfolgte. Das Mitführen von Negativkontrollen ist unerläßlich, um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu beurteilen. Eine Sequenzdatenbank, die alle in unserem Labor amplifizierten Sequenzen enthält, half Kontaminationen größtenteils zu identifizieren. Bei den vorliegenden Ergebnissen enthielt keine der Negativkontrollen ein Produkt.

Die Effizienz der durchgeführten Einzelzellanalysen lag bei durchschnittlich 30% (WSκ 24%, LBλ 27%, LBH 36,5%) und entspricht den veröffentlichten Ergebnissen für reife mutierte B-Zellen (Keimzentrums- oder Nachkeimzentrumszellen) (99). Die vielfachen Bearbeitungsschritte, von der Mikromanipulation bis zur Sequenzanalyse, bieten viele Möglichkeiten für den Verlust des Produktes. Es wurden bereits die Gefahren der Kontamination und Bindungsschwierigkeiten der Oligonukleotide erwähnt. Weitere Ursachen können auch eine mechanische Degradierung der DNA bei der Mikromanipulation oder der vollständige Verlust beim Pipettieren, sowie mögliche Doppelstrangbrüche durch hohe Temperaturen sein.

Die Verknüpfung von Mikromanipulation, Einzel-Zell-PCR und anschließender Direktsequenzierung ist, trotz nicht unerheblichem Arbeits- und Kostenaufwand, eine Methode, die neue Dimensionen in der molekulargenetischen Forschung eröffnet.

Um Entwicklungsprozesse von B-Vorläuferzellen zu studieren, die klonale Beziehung von B- Lymphozyten in den peripher lymphatischen Organen zu bestimmen sowie den B-Lymphozytenursprung von Tumorzellen zu identifizieren, ist es von großem Wert, Einzelzellen zu isolieren und ihre Immunglobulingene zu charakterisieren.

Die Einzel-Zell-PCR-Technik liefert einen weiteren Baustein für den Erkenntnisgewinn in der Medizin zur Beantwortung von Fragestellungen, wie z.B. nach der Pathogenese von primär

kutanen B-Zell-Lymphomen.


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22.02.2005