1901 inspizierte Kelling aus Dresden laparoskopisch die Bauchhöhle eines Hundes. Er verwendete ein Pneumoperitoneum, welches mit gefilterter Luft aufgebaut wurde. Am Menschen führte 1910 der Schwede Jacobaeus die erste Laparoskopie mit einem Luft-Pneumoperitoneum durch. Lange Zeit blieb die Laparoskopie ein unzulängliches Verfahren in Diagnostik und Therapie und einer kleinen Gruppe von Chirurgen vorbehalten. Weiterentwicklungen von Optik und Operationsinstrumenten wie z. B. Schräg- oder Kaltlichtoptik haben daran bis zum Beginn der achtziger Jahre nichts geändert.

Der Kieler Gynäkologe Semm hat die Entwicklung entscheidend vorangetrieben. Er entwickelte die kontrollierte und automatische Gasinsufflation, die für einen konstanten Druck sorgte, sowie geeignete Operationsinstrumente wie Nadelhalter und atraumatische Klemmen. 1982 führte er die erste laparoskopische Appendektomie durch. 1985 absolvierte Mühe aus Böblingen die erste laparoskopische Cholezystektomie. Rasch folgten andere Operationen wie Hernioplastik, Hysterektomie und Vagotomie. Je mehr sich Vorteile und Durchführbarkeit zeigten, desto mehr fand die Laparoskopie weite Verbreitung und Akzeptanz. (Nezhat 1998).

Heute gehören laparoskopische Appendektomie, Hernioplastik, Splenektomie, Adrenalektomie u.a. zu den Standardoperationen, ebenso Eingriffe an Kolon und Rektum bei gutartigen Erkrankungen. Die laparoskopische Cholezystektomie hat sich bei symptomatischer Gallensteinerkrankung zum Verfahren der Wahl entwickelt. Umstritten ist der Einsatz minimal invasiver Techniken noch immer in der Tumorchirurgie (Whelan 2001).

Weiterentwicklungen der minimal invasiven Chirurgie fanden u.a. im Bereich der Roboter- und Telechirurgie statt. So können Operationsroboter wie z.B. Da Vinci oder Zeus nicht nur die Kameraführung übernehmen, sondern – gesteuert durch einen Chirurgen – auch die Führung der Instrumente (Ballantyne 2002). Für das manuelle Training in dieser anspruchsvollen chirurgischen Disziplin wurden außerdem Operationssimulatoren entwickelt, so dass die Ausbildung neben der Weitergabe von Wissen und Erfahrung durch erfahrenere Chirurgen durch virtuelle Realität und interaktive Simulation unterstützt werden kann (Hyltander 2002).

Die apparative Grundausstattung zur operativen Laparoskopie besteht aus einem CO₂ -Insufflator, einer Kamera mit Videogerät und Monitor, einer Thermo- und Elektrokoagulationseinheit, einer Lichtquelle für die Optik und einer Saugspüleinrichtung. Die Funktionen der Instrumente entsprechen weitgehend denen der konventionellen offenen Chirurgie, Aufbau und Handhabung unterscheiden sich jedoch aufgrund des veränderten Zugangs zum Operationsfelds zum Teil erheblich. Generell weisen sie einen geringeren Durchmesser auf und sind wesentlich länger. Neben derart modifizierten Nadelhaltern, Klemmen und Fasszangen etc. stehen auch Kombinationsinstrumente wie z. B. Koagulationshaken mit Sauger zur Verfügung (Kremer, Platzer, Schreiber, Steichen 2001).

Die Anlage des Pneumoperitoneums erfolgt unter Verwendung einer Veress-Nadel oder in offener Technik. Nach einer Hautinzision meist unterhalb des Nabels wird entweder die Bauchhöhle durch eine Veress-Nadel punktiert, deren sichere intraabdominale Lage geprüft, Gas insuffliert und die Nadel durch einen Trokar ausgetauscht; alternativ wird die Faszie freipräpariert, angeklemmt und inzidiert, um stumpf einen Trokar in die Bauchhöhle einzubringen, durch den die Insufflation von ca. 3-5 l CO₂ bis ein intraabdomineller Druck von 12-15 mm Hg erreicht ist. Nach Aufbau des Pneumoperitoneums wird eine Optik eingebracht und unter Sicht folgt das Einbringen weiterer Trokare und Instrumente, deren Lokalisation und Anzahl von der entsprechenden Operation abhängen. (Berci 1995, Kirk 1997).

Bei einer Vielzahl von Operationen gleichen sich die weiteren Operationsschritte laparoskopischer und konventioneller Technik, wie z.B. die Darstellung des Calot´schen Dreiecks zur Durchführung einer Cholezystektomie. Dagegen werden z.B. bei der Hernienreparatur unterschiedliche Prinzipien verfolgt: laparoskopisch erfolgt der Bruchpfortenverschluss hier nicht durch Fasziennaht wie beim klassischen konventionellen Vorgehen nach Shouldice oder Bassini, sondern durch Vorlegen eines Kunststoffnetzes, wobei im Gegensatz zum offenen Verfahren in Abhängigkeit von der Lokalisation des Netzes eventuell die Peritonealhöhle eröffnet wird. Einige Eingriffe lassen sich nicht ausschließlich minimal invasiv durchführen. So kann für die Entfernung größerer Resektate oder das Anlegen einer Darmanastomose bei Koloneingriffen eine Minilaparotomie notwendig werden (Rittmann/Koller 1994).

Für den Operateur bedeutet minimal invasives Operieren zunächst, ein unterschiedliches Instrumentarium zu verwenden und den Umgang damit zu erlernen. Weiterhin verliert der Chirurg die Möglichkeit, seinen Tastsinn als diagnostisches Instrument einzusetzen, das Erkennen bzw. Beurteilen einzelner Strukturen ist somit erschwert. Der Blick des Operateurs ist während laparoskopischen Operierens nicht direkt auf den Operationssitus und seine Hände, sondern auf einen Bildschirm gerichtet, dieser gewährt außerdem nur ein zweidimensionales Bild der Anatomie. Ein Vorteil der minimal invasiven Chirurgie ist die Möglichkeit, das gesamte Abdomen zu überblicken. So bietet z.B. ein Wechselschnitt zur konventionell durchgeführten Appendektomie im Gegensatz zum laparoskopischen Vorgehen weniger Möglichkeiten, weitere Differentialdiagnosen durch Exploration der Bauchhöhle auszuschließen.

Spezifische Komplikationen der Laparoskopie sind Organverletzung beim Einbringen der Trokare, Entstehung von Pneumothorax, Mediastinal- und Hautemphysemen sowie postoperativer Schulterschmerz. Die Morbidität dieser Komplikationen liegt bei ca. 2 % in Abhängigkeit von der Erfahrung des Operateurs, dem Alter der Patienten und der Indikation (Sarli 2000, Murdock 2000). In 2 % der Laparoskopien erzwingen starke Adhäsionen bzw. intraoperative Komplikationen wie z.B. starke Blutungen ein Umsteigen auf das konventionelle Verfahren (Gebhard 2001).

Die Anlage eines Pneumoperitoneums mit Verwendung von Gasen und einem erhöhten intraabdominellen Druck hat einen direkten Einfluss auf verschiedene Organsysteme sowie auf bereits bestehende Erkrankungen. Viele Arbeiten unterstreichen den minimal invasiven Charakter der Laparoskopie und belegen in experimentellen und klinischen Studien die Vorteile dieser Operationstechnik hinsichtlich klinischer und immunologischer Parameter im postoperativen Verlauf. Trotzdem gibt es Publikationen, in denen negative Aspekte des Pneumoperitoneums mit Insufflation von Kohlendioxid gefunden wurden.

In klinischen Studien zu den Auswirkungen des Pneumoperitoneums auf das hämodynamische System konnte im Vergleich zur konventionellen Technik eine Verminderung der kardialen Aufwurfleistung, eine Erhöhung des arteriellen Mitteldrucks sowie eine Erhöhung der Herzfrequenz gezeigt werden (Galizia 2001, Dexter 1999, Cunningham 1994). Die Veränderungen werden auf den erhöhten intraabdominellen Druck und eine dadurch verminderte Vorlast sowie eine Aktivierung des neurohumeralen vasoaktiven Systems zurückgeführt. In Übereinstimmung damit wurde ein deutlich geringeres Ausmaß dieser Effekte bei einem niedrigeren Insufflationsdruck festgestellt (Dexter 1999). Bei jüngeren, gesunden Patienten mit den ASA-Klassen 1 oder 2 erwiesen sich kardiozirkulatorische Veränderungen nach Desufflation als schnell und komplett reversibel und führten im Allgemeinen nicht zu einer Erhöhung der Morbidität oder Mortalität (Galizia 2001, Johannsen 1989, Volpino 1998). Patienten der ASA Klassen 3 oder 4 könnten jedoch einem erhöhten Risiko kardiovaskulärer Komplikationen ausgesetzt sein, insbesondere dann, wenn ein hoher Insufflationsdruck verwendet wird und präoperativ keine gesteigerte Volumenzufuhr erfolgt (Schulte-Steinberg 1996, Stuttmann 1995).

Die Anlage eines Pneumoperitoneum führt zu signifikanten respiratorischen Veränderungen. So zeigten prospektive randomisierte Studien, dass während laparoskopischer Cholezystektomien eine Hyperkapnie besteht und der arterielle pH-Wert sinkt, der Lungenbeatmungsdruck ansteigt und die Compliance der Lunge abnimmt (Volpino 1998, Chmielnicki 1994). Die Veränderungen der Compliance und des Beatmungsdruckes sind insufflationsdruckabhängig (Wallace 1997). Zur Vermeidung minderbelüfteter Areale und Bildung von Atelektasen ist der Einsatz einer Beatmung mit positivem endexperatorischen Druck erforderlich, der jedoch bei COPD – Patienten zur Überblähung der Lunge führen kann. Einer Hyperkapnie durch resorbiertes CO2 mit arterieller Azidose sollte bei beatmeten Patienten durch eine situationsadaptierte Hyperventilation begegnet werden (Wurst 1996 ). Insgesamt scheinen die Veränderungen bei lungengesunden Patienten von geringer klinischer Relevanz zu sein. Hinsichtlich der postoperativen Lungenfunktion konnte in einer Studie von Schwenk et al. sogar ein Vorteil der laparoskopischen gegenüber der konventionellen Technik gezeigt werden (Schwenk 1999).

Tierexperimentelle Studien belegen, dass die Erhöhung des intraabdominellen Drucks auch zu Veränderungen der kardiovaskulären Parameter und der Durchblutung intraabdomineller Organe führt. Unklar ist jedoch, inwieweit diese klinisch relevant sind. So zeigte Eleftheriadis in einer klinischen, prospektiv vergleichenden Studie zwischen laparoskopischer und konventioneller Cholezystektomie, dass bei laparoskopisch operierten Patienten die hepatische Mikrozirkulation und der pH der Magenschleimhaut signifikant vermindert sind (Eleftheriaids 1996). Iwase et al. verglichen in einer ähnlichen Studie den effektiven renalen Plasmafluss und die glomeruläre Filtrationsrate (Iwase 1993). Auch hierbei konnte jeweils eine Reduktion der glomerulären Filtrationsrate in der minimal invasiv behandelten Gruppe festgestellt werden. In beiden Studien zeigte sich allerdings direkt nach Desufflation eine vollständige Kompensation auf die Ausgangswerte. In keiner Studie wurden bisher ein Einfluss dieser Veränderungen auf den weiteren klinischen Verlauf geschildert. In einer prospektiven randomisierten Studie von Böhm et al. konnte kein Unterschied postoperativer Leber- und Nierenfunktion nach laparoskopischen und konventionellen kolorektalen Resektionen festgestellt werden (Böhm 1999a).

Ein steigender intraabdomineller Druck während laparoskopischer Operationen führt zu einem verminderten venösen Rückfluss von der Peripherie zum Herzen. Theoretischerweise könnte es durch die dadurch verursachte Blutstase zu einem Anstieg thrombembolischer Komplikationen kommen. In einem Review mit Ergebnissen von 50427 Laparoskopien traten tiefe Beinvenenthrombosen und Lungenembolien mit einer Inzidenz von 0,2 % auf. Im Vergleich dazu wurde die Inzidenz fataler Lungenembolien in einer Übersichtsarbeit zur Häufigkeit von thrombembolischen Komplikationen nach konventionellen Operationen mit 0,8 % angegeben (Collins 1988). In einer nicht – randomisierten Studie fanden Lord et al. keinen Unterschied bei der Häufigkeit der Beinvenenthrombose zwischen konventionellem und laparoskopischem Verfahren (Lord 1998). Bei Durchführung einer standardisierten Thromboseprophylaxe erscheint die Inzidenz der thrombembolischen Komplikationen unabhängig vom Operationsverfahren zu sein. Abgesehen davon bietet sich zur Verminderung der Blutstase in den unteren Extremitäten der Einsatz der intermittierenden pneumatischen Kompression an.

Der Organismus reagiert auf Verletzung oder Operation systemisch mit einer neuroendokrinen Stressreaktion, die zu einer katabolen Stoffwechsellage und Immunsuppression führt, über deren Ausmaß u.a. Veränderungen von Immun­parametern wie IL-6, CRP, Leukozyten oder Makrophagenaktivität Rückschlüsse erlauben. Die Ergebnisse tierexperimenteller Studien weisen auf eine verminderte systemische Inflammation und geringere Suppression der Immunantwort nach einer Laparoskopie im Vergleich zur Laparotomie hin (Allendorf 1996, Jacobi 1998a). Eine Vielzahl von klinischen Studien u. a. bezüglich der Cholezystektomie, der Fundoplikatio und kolorektaler Resektionen bestätigen diese Ergebnisse (Karaviannakis 1997, Ordemann 2001, Perttila 1999). Allerdings liegen auch Ergebnisse vor, die im randomisierten Vergleich keinen Unterschied zwischen beiden Operationstechniken nachweisen konnten (McMahon 1993, Ortega 1996) oder sogar eine stärkere Immunsuppression durch die Laparoskopie implizierten (Stage 1997). Keine der genannten Studien konnte eine Korrelation zwischen immunologischen Veränderungen und postoperativem Verlauf nachweisen, womit die Frage nach der klinischen Relevanz der Ergebnisse weiterhin unbeantwortet bleibt.

Im postoperativen Verlauf laparoskopischer Operationen konnten in verschiedenen Publikationen im Vergleich zu konventionellen offenen Verfahren eine geringerer Analgetikaverbrauch, eine verkürzte Rekonvaleszenzzeit, eine verminderte Rate an Wundkomplikationen und frühere Entlassung aus dem Krankenhaus nachgewiesen werden (Milsom 1998, Nilsson 2000, Squirrel 1998). Diese Vorteile werden auf die geringere Traumatisierung, bedingt durch die fehlende Laparotomienarbe und das gewebeschonende minimal invasive Operieren zurückgeführt. Es liegen jedoch auch prospektiv randomisierte Studien vor, in denen kein Unterschied im postoperativen Schmerzmittelverbrauch nachgewiesen wurde, und die Rekonvaleszenz unabhängig von der angewendeten Technik war (Tate 1993, Majeed 1996). Hierbei ist zu berücksichtigen, dass die Ergebnisse von sehr verschiedenen Eingriffen wie Cholezystektomie, Appendektomie, Fundoplikatio und kolorektalen Eingriffen stammen und neben dem Bauchwandtrauma zumindest auch das intraabdominelle Trauma und die – bei laparoskopischen Operationen längere – Operationszeit zu beachten sind.

Zusammenfassend ist zu sagen, dass die laparoskopische Technik bessere kosmetische Ergebnisse erzielt, bislang jedoch mit höheren Kosten verbunden ist. Negative intraoperative pulmonale und hämodynamische Veränderungen sind reversibel und gehen – außer bei schweren Vorerkrankungen – nicht mit erhöhten Risiken für die Patienten einher. Im postoperativen Verlauf scheinen die Immunsuppression geringer, die Rekonvaleszenzzeit kürzer sowie der Analgetikaverbrauch vermindert zu sein.

Als Insufflationsgas wird fast ausschließlich CO₂ eingesetzt. Es ist farb- und geruchlos, nicht brennbar, preiswert und wird rasch über die Lunge ausgeschieden. Aufgrund hämodynamischer und pulmonaler Nebenwirkungen sowie im Rahmen der Kontroverse über der Einsatz der Laparoskopie in der Tumorchirurgie wurden Alternativen zum CO₂-Pneumoperitoneum entwickelt. Für die Etablierung eines Pneumoperitoneums kommen aber grundsätzlich auch Edelgase wie Helium oder Argon in Betracht, mit entsprechenden Hilfsmitteln kann eine Laparoskopie auch gaslos durchgeführt werden. (Neuhaus 2001)

Das Edelgas Helium ist chemisch inert und schlechter wasserlöslich als CO₂. Daher wurde angenommen, dass die Verwendung von Helium als Insufflationsgas geringere kardiorespiratorische Nebenwirkungen verursacht. Jacobi et al. zeigten anhand eines Tiermodels am Schwein, dass die Verwendung von Helium im Gegensatz zu CO₂ keine wesentlichen respiratorischen Veränderungen (z.B. Hyperkapnie und PH-Werterniedrigung) verursacht, und die kardialen Auswirkungen eines Helium-Pneumoperitoneums (z.B. Erhöhung des arteriellen Mitteldrucks)(1.1.3) denen des Kapnoperitoneums gleichen (Jacobi 2000a). Klinische Studien konnten die tierexperimentellen Daten bestätigen (Fernandez-Cruz 1998, McMahon 1994). Die geringere Löslichkeit von Helium könnte sich jedoch auch nachteilig auswirken. So besteht die Befürchtung, bei akzidenteller Insufflation in Gefäße, Haut oder Thorax könnten entstehende Helium-Gasembolien, Emphyseme bzw. Pneumothoraces schwerwiegendere Folgen haben als unter Verwendung von CO₂. Die direkte Injektion von Helium oder CO₂ in die Femoralvene bei Schweinen führte zu Todesfällen durch Helium, während die Kohlendioxidinjektion von allen Tieren überlebt wurde (Roberts 1997). Dieses Szenario wäre jedoch nur bei Punktion eines Gefäßes beim Einbringen der Veress-Nadel denkbar. Der klinischen Situation eher entsprechend wurde in dem oben genannten Experiment von Jacobi et al. im Verlauf bei einem Druck von 15 mm Hg die Vena cava um ca. 1 cm eröffnet. Dabei kam es weder bei CO₂ noch bei Helium zu einer Gasembolie. Klinische Daten hierzu liegen nicht vor (Jacobi 2000a).

Um die kardiopulmonalen Nebenwirkungen der minimal invasiven Technik zu vermeiden und gleichzeitig die Vorteile des weniger invasiven Operationszugangs zu erhalten, wurden die Bauchdecke anhebende Instrumente entwickelt, um Laparoskopien gaslos zu ermöglichen. Außerdem kann diese Technik mit einem Niedrigdruckpneumoperitoneum kombiniert werden. Unter Verwendung verschiedener Systeme ist so die technische Durchführbarkeit von gaslos laparoskopischen Cholezystektomien bis hin zu kolorektalen Eingriffen gezeigt worden (Schulze 1999). Hinsichtlich der negativen kardiorespiratorischen Effekte des Kapnoperitoneums konnten randomisierte klinische Studien belegen, dass intraoperativ die negativen Auswirkungen auf kardiopulmonale Faktoren wie Erhöhung der Herzfrequenz und des mittleren arteriellen Drucks, Verringerung der Compliance sowie Erhöhung des Beatmungsdrucks bei gaslos durchgeführten Operationen in signifikant geringerem Maße bzw. nicht auftraten (Galizia 2001, Koivusalo 1998, Ogihara 1999). Untersuchungen von Kim et al. hinsichtlich immunologischer Parameter wie Leukozytenanzahl, IL 6 und TNF α bei konventionellen oder gaslosen laparoskopischen Cholezystektomien ergaben keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Gruppen; ebenso konnten Larsen et al. keine wesentlichen Differenzen bei postoperativen Schmerzen und postoperativer Rekonvaleszenz zeigen (Kim 2002, Larsen 2001). Mehrere Autoren berichteten jedoch, dass sich die Operationszeit bei gaslosen Eingriffen verlängerte (Larsen 2001, Johnson 1997, Galizia 2001). Dies wurde u.a. auf die aufwendigere Technik der Hebesysteme und die eingeschränkte Exposition des Operationsfeldes zurückgeführt. Besonders bei ausgedehnteren und technisch aufwendigeren Operationen könnte ein erhöhtes Gewebetrauma die Folge sein.

Die Verwendung von Helium und gasloser Laparoskopie stellen grundsätzlich Alternativen zum Kapnoperitoneum dar, insbesondere bei Vorliegen respiratorischer bzw. kardialer Vorerkrankungen. Beide Verfahren spielen jedoch wegen der geringen klinischen Erfahrung und mangelnder klinischer Studien eine untergeordnete Rolle. Bei Helium sind außerdem die höheren Kosten sowie die Gefahr einer Gasembolie zu erwähnen, im Falle der gaslosen Laparoskopie der höhere technische Aufwand, die längere Operationszeit sowie die eingeschränkte Sicht in den Operationssitus.

Auf Überlegungen und experimentelle Daten hinsichtlich der Frage, inwieweit Helium-Pneumoperitoneum oder gaslose Laparoskopie in der Tumorchirurgie eine Alternative zum Kapnoperitoneum darstellen, wird im Kapitel 1.2.2 eingegangen.

Mit der Einführung minimal invasiver Operationsverfahren in die Abdominalchirurgie wurden auch laparoskopische Techniken zur radikalen Resektion maligner Tumore, z.B. kolorektaler Karzinome entwickelt. In diesem Zusammenhang wäre es nicht akzeptabel, dass mit einer neuen Operationstechnik möglicherweise die etablierten Prinzipien der Tumorchirurgie preisgegeben werden. Weiterhin muss evaluiert werden, inwieweit das neue Verfahren für den Patienten Vorteile in der postoperativen Phase bietet oder ob es spezifische Gefahren bedeutet. Letztendlich sollten Langzeitergebnisse untersucht werden, um sicherzustellen, dass die Prognosen der laparoskopische operierten Patienten besser oder gleichwertig gegenüber der Prognosen konventionell Operierten ist.

In verschiedenen Studien ist gezeigt worden, dass laparoskopisch radikale Resektionen von kolorektalen malignen Tumoren möglich sind. Die Untersuchung der Parameter R0-Resektion, Abstand der Resektionsränder vom Primärtumor und Anzahl der entnommenen Lymphknoten zeigten keine wesentlichen Unterschiede zwischen konventionellen und laparoskopischen Resektionen (Franklin 1996, Milsom 1998, Fleshman 1999).

Zur Beurteilung der postoperativen Phase wurden eine Reihe vergleichender Studien durchgeführt (Lacy 1995, Milsom 1998, Schwenk 1998). Hierbei wurden postoperative Vorteile im kurzfristigen Verlauf belegt: bessere Lungenfunktion, weniger Schmerzen, kürzere Dauer der Darmatonie und schnellere Rekonvaleszenz. Von besonderem Interesse sind diese Daten, da eine schnellere Rekonvaleszenz und ein besser erhaltenes Immunsystem des Patienten die Absiedlung verbliebener Tumorzellen verhindern, bzw. einen früheren Einsatz adjuvanter Chemo- oder Immuntherapien ermöglichen könnte (Whelan 2001).

Ergebnisse aus prospektiv randomisierten Studien zur Bewertung der Langzeit­ergebnisse (Rezidive und Überlebenszeit) liegen zum jetzigen Zeitpunkt nicht vor. Bisherige Daten aus prospektiven Kohortenstudien dokumentieren, dass die Prognose nach minimal-invasiven Eingriffen ungefähr denen nach konventionellen Resektionen entsprechen (Poulin 1999, Lechaux 2002, Fleshman 1999, Franklin 2000).

Bedenken gegenüber dem Einsatz minimal invasiver Verfahren in der onkologischen Chirurgie entstanden durch die zahlreichen Berichte über Trokarmetastasen nach laparoskopischen Eingriffen (Schaeff 1998b). Klinisch fallen diese Inzisionsmetastasen als schmerzhafte Vorwölbung im Bereich einer Narbe auf. Prinzipiell können sie nach Punktionen, Biopsieentnahmen oder Operationen vorkommen. Im Zusammenhang mit laparoskopischen Prozeduren wurden Fälle von Trokarmetastasen bei Kolon-, Ovarial-, Magen- und okkultem Gallenblasenkarzinomen beschrieben sowie nach diagnostischen Laparoskopien (Berends 1994, Schaeff 1998b). In den ersten Publikationen über laparoskopische Resektionen wurde die Rate von Implantationsmetastasen mit bis zu 20 % angegeben (Wexner 1995). Daten neuerer Studien zeigten jedoch durchschnittlich niedrigere Inzidenzen dieser Metastasen von ca. 0,7 – 1,5 % (Schiedeck 2000, Curet 2000, Hartley 2000), vergleichbar also mit der Rate bei konventionellen Eingriffen (ca. 0,6 – 1,6 %) (Reilly 1996). Die Ätiologie der Inzisionsmetastasen ist bisher ungeklärt. Ergebnisse experimenteller und klinischer Studien deuten daraufhin, dass die intraoperative Manipulation am tumortragenden Organ die Hauptursache dieses Phänomens ist. Es stellt sich jedoch die Frage, ob auch die spezifischen Bedingungen des Pneumoperitoneums einen Einfluss auf die Metastasierung haben. Hierauf wird näher im nächsten Kapitel (1.2.2) eingegangen.

Maligne Tumore können also unter Zuhilfenahme minimal invasiver Techniken radikal reseziert werden, dabei könnten sich immunologische postoperative Vorteile auch positiv auf die Prognose auswirken (Whelan 2001). Langzeitergebnisse hierzu liegen jedoch noch nicht vor. Weiterhin muss noch die Ursache der im Zusammenhang mit der laparoskopischen Technik aufgetretenen Trokarmetastasen erforscht werden.

Das Peritoneum kleidet die Bauchhöhle aus. Es setzt sich aus einem einschichtigen Epithel, einer Basallamina und dem submesothelialen Bindegewebe zusammen (Dizerega/Rodgers 1992).

An der peritonealen Oberfläche fanden sich bei elektronenmikroskopischen Studien des Bauchfells von Kleinnagern kubische oder flache mesotheliale Zellen. Das viszerale Peritoneum bestand hauptsächlich aus kubischem Mesothel, das Peritoneum der parietalen Bauchwand dagegen größtenteils aus flachen Zellen. Kubische Mesothelzellen besaßen eine abgerundete apikale Zellkontur und einen dichten Mikrovillisaum. Tiefe Furchen kennzeichneten die Zellgrenzen. Desmosomen und Tight Junctions bildeten die interzellulären Verbindungen. Zellorganellen waren gut entwickelt und in hoher Anzahl vorhanden. Die flachen Mesothelzellen waren ebenfalls im Besitz eines Mikrovillibesatzes und die Art der interzellulären Verbindungen entsprach dem des kubischen Mesothels. Die Zellgrenzen hingegen waren nur schwer oder gar nicht erkennbar. Die Zellen besaßen außerdem ovale, längliche Kerne, wenig Zytoplasma und eine geringe Menge an Zellorganellen. (Barberini 1977, Michailova 1999)

Jonecko untersuchte Biopsate humanen Peritoneums, die während abdomineller Eingriffe gewonnen worden waren, und beschrieb zwei Formen von Mesothelzellen: „...große flache Mesothelien von etwa hexagonaler Gestalt, und kleinzellige Mesothelien, von sphäroider Form...“ (Jonecko 1990). Es überwogen die flachen Mesothelzellen, die sphäroiden Zellen waren darin felderförmig eingebettet. Ultrastrukturelle Unterschiede wurden nicht benannt, eine Zuordnung zu parietalem oder viszeralem Peritoneum erfolgte nicht. Es ließen sich alle bekannten Zellorganellen nachzuweisen, aber in geringerer Anzahl und dürftigerer Ausprägung. Die Oberfläche des humanen Peritoneums kennzeichnete ein variabler Mikrovillibesatz. Zellgrenzen waren in rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen schwer auszumachen. Untersuchungen von Henderson ergaben, dass Mesothelzellen von apikal nach distal durch Tight Junctions, Desmosomen und Interdigitationen der Zellmembran miteinander verbunden bzw. verwoben waren (Henderson 1987). Dobbie beschrieb die Aufsicht auf das menschliche Peritoneum als Mosaik polygonaler Zellen. Nach licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen bezeichnete er die Form des Mesothels als flach; kubische Zellen deutete er als Hinweis auf pathologische Veränderungen. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen dokumentierten einen gut entwickelten Zellorganellapparat (Dobbie 1989).

Die Untersuchungen zeigen, dass die Morphologie des menschlichen Peritoneums der parietalen Bauchwand trotz einiger Abweichungen im Wesentlichen mit der der Ratte übereinstimmt. Das Mesothel des parietalen Peritoneums ist größtenteils ein einschichtiges Plattenepithel, das eine kontinuierliche Schicht bildet. In der Aufsicht erkennt man ein Mosaik polygonaler Zellen. Die peritonealen Deckzellen sind von Mikrovilli bedeckt. Die Zellgrenzen lassen sich nur schwer festlegen. Die interzellulären Verbindungen bestehen aus Tight Junctions und Desmosomen. Das sich der Basallamina anschließende submesotheliale Bindegewebe setzt sich aus Kollagenfasern, Fibroblasten und freien Zellen (Makrophagen, Mastzellen und Granulozyten) zusammen. Es enthält Lymph- und Blutgefäße. Stomata sind runde oder ovale Öffnungen der Mesothelzellschicht, die eine Verbindung zwischen den Lymphabflusswegen des Peritoneums und der Bauchhöhle herstellen. Mesothel und Endothel stoßen hier aneinander und besitzen die gleiche Basalmembran. Teilweise werden die Stomata von Mesothelzellen überlappt oder von Zelltrümmern ausgefüllt. Sie dienen dem Transport von Flüssigkeiten und zellulärem Material. (Michailova 1999, Jonecko 1990)

Im Rahmen der Erforschung von Barium-induzierter oder bakterieller Peritonitis, Peritonealdialyse, Implantation von Kathetern zur intraperitonealen Chemotherapie und Peritonealkarzinomatose wurden in der Vergangenheit Untersuchungen der Morphologie des Peritoneums und seiner Veränderungen unter pathologischen Bedingungen unternommen.

Watters und Buck entfernten bei Ratten mechanisch das Mesothel des parietalen Peritoneums und beobachteten rasterelektronenmikroskopisch die Regenerations­vorgänge. Die nun freiliegende Basalmembran war innerhalb von acht Stunden von Rundzellen bedeckt. Es kam zu einer starken mitotischen Aktivität des umliegenden Mesothels. Neugebildete Mesothelzellen ersetzten die temporäre Zelldecke aus Rundzellen nach 3-5 Tagen (Watters/Buck 1972). Haney wies nach, dass es sich bei diesen Rundzellen um Makrophagen handelte (Haney 2000, Raz 1976). Er verletzte das Peritoneum von Mäusen mit einem Skalpell und injizierte ihnen intraabdominell Polystyrolkugeln, um anhand von transmissionselektronen­mikroskopischen Aufnahmen Makrophagen am Ort der Verletzung eindeutig nachweisen zu können. Nach 24 Stunden waren an der Oberfläche der traumatisierten Stelle ausschließlich Makrophagen nachweisbar. Zwei Tage später beobachtete er dort auch Mesothelzellen. Guo et al. implantierten Ratten Fremdkörper aus Silikon oder Gummi in das untere Abdomen und entnahmen im Verlauf von vier Stunden bis 21 Tagen Biopsien des parietalen Peritoneums zur histologischen und elektronenmikroskopischen Untersuchung. Sie beschrieben Separation und Ablösung von Mesothelzellen, Leukozyteninfiltration und Ödem des submesothelialen Bindegewebes sowie Fibrinbeläge und Monozyten auf der freigelegten Basalmembran innerhalb der ersten vier Tage. Nach 21 Tagen war die normale histologische Architektur wiederhergestellt (Guo 1993).

Die Kontamination der Bauchhöhle mit Stärke verursachte bei Ratten innerhalb von vier Stunden eine Abkugelung und Separation der Mesothelzellen, dabei verblieben einige Zellbrücken. Zwischen den Zellen war die Basallamina deutlich sichtbar. Nach vier Tagen wurde wieder ein intaktes Mesothel vorgefunden. Auf der Oberfläche und zwischen den Deckzellen zeigten sich Makrophagen, neutrophile Granulozyten und Lymphozyten, die auch in der Peritonealflüssigkeit nachgewiesen wurden, die Alterationen der Mesothelzellen führte der Autor auf eine aktive Zellkontraktion zurück (Kaufman 1982). Henrich provozierte eine Bariumperitonitis bei Ratten und beschrieb anhand von elektronenmikroskopischen Bildern Mesothelzellseparation mit Freilegung der Basalmembran und großflächige Fibrinauflagerungen des Peritoneums in Form von dicken, durchlöcherten Platten oder dreidimensional aufgespannte spinnengewebsartige Fibrinfäden (Henrich 1986).

Kimura et al. injizierten Ratten den Überstand zentrifugierten kanzerösen Aszites (zellfrei) in die Bauchhöhle und betrachteten nach 24 Stunden entnommene Proben des Peritoneums mit einem Rasterelektronenmikroskop. Die Mesothelzellen waren abgerundet und vollständig voneinander getrennt. Die Anzahl der Mikrovilli war verringert und ihre Länge verkürzt. Außerdem wurde eine massive Zellproliferation festgestellt (Kimura 1985). Lethola et al. verursachten eine hämorrhagische Pankreatitis bei Schweinen und applizierten deren Aszites weiteren Tieren. Eine, drei und fünf Stunden später wurden Biopsate des Peritoneums gewonnen und untersucht. Lichtmikroskopisch imponierten Vaskularisation, Ödem und schwere Leukozyteninfiltration des subserösen Bindegewebes. Das Mesothel wurde von einer Schicht aus Fibrin und Entzündungszellen bedeckt. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten sowohl eine Verringerung und Verformung der Mikrovilli als auch eine Separation und Ablösung der Deckzellen, die zur Freilegung der Basallamina führten (Lethola 1986).

In einem in vitro Versuch ergaben sich durch Zugabe von aktivierten neutrophilen Granulozyten innerhalb von fünf Stunden Retraktion und Separation von kultivierten humanen Mesothelzellen (Andreoli 1994). Ebenso verhielten sich die peritonealen Deckzellen von Ratten, denen Buck Tumorzellen intraperitoneal injizierte. In den ersten drei Tagen konnten keine Veränderungen am Mesothel festgestellt werden, am vierten und fünften Tag kam es dann zur Abrundung und Separation der Mesothelzellen (Buck 1973). Ein ähnlicher Versuch von Birbeck et al. führte bei Mäusen am siebten Tag zu Abrundung und Separation der Deckzellen. Einen Tag darauf hafteten Tumorzellen auf der freiliegenden Basalmembran und drangen am neunten Tag in diese ein. Noch vor der Reaktion des Mesothels zeigte sich in histologischen Präparaten Leukozyteninfiltration und Ödem des submesothelialen Gewebes (Birbeck/Wheatley 1965).

In der Arbeit von Kaufman war eine bakterielle Peritonitis außer durch eine Separation und Abkugelung der Mesothelzellen zusätzlich durch Vaskularisation, schwere Infiltration mit neutrophilen Granulozyten und Ödem des submesothelialen Gewebes gekennzeichnet. Charakteristisch für die bakterielle Infektion war weiterhin ein auf den Deckzellen gelegenes Fibrinnetzwerk. In den Spalten zwischen den Zellen lagerten Entzündungszellen. Am vierten Tag war kein intaktes Mesothel mehr zu erkennen (Kaufman 1982). Die gleichen Ergebnisse dokumentierten Verger et al. Außerdem beschrieben sie zum einen den Erhalt von Interzellularbrücken bei der Separation des Mesothels und zum anderen dessen Ablösung als Folge einer bakteriellen Infektion (Verger 1983). Bloechle zeigte, dass aus einer perforationsinduzierten Peritonitis bei Ratten innerhalb von zwölf Stunden neben Veränderungen des Mesothels zusätzlich eine Verringerung und Deformation der Mikrovilli sowie eine Öffnung der peritonealen Stomata resultierte (Bloechle 1999).

Im Rahmen der Peritonealdialyse und Peritonitisbehandlung entstanden Arbeiten zu morphologisch fassbaren entzündlichen Veränderungen des menschlichen Peritoneums. Die morphologischen Befunde waren mit den im Tierversuch provozierten Veränderungen identisch (Jonecko 1990, Dobbie 1989, Henderson 1987). Jonecko unterschied in diesem Zusammenhang einen Reizzustand des Peritoneums mit Abkugelung und unvollständiger Separation des Mesothelzellen von der eigentlichen Peritonitis, die durch Zerstörung des Mesothels, einer massiven Leukozytenmigration und schwammartigen Fibrinbelägen charakterisiert war. Eine Vermehrung der Mesothel­zellen pro Flächeneinheit, eine Fibrose des submesothelialen Gewebes und eine Verringerung der Anzahl der Mikrovilli galten Dobbie als Kennzeichen einer chronischen Schädigung.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass die Morphologie des Peritoneum sich nach Einwirkung physikalischer, chemischer, immunologischer oder bakterieller Noxen im Sinne einer Entzündungsreaktion verändert. Diese Reaktionsmuster scheinen von der Art der Noxe unabhängig zu sein (Lierse 1985, Kaufman 1982, Jonecko 1990). Insbesondere finden sich Alterationen der Deckzellen, Fibrinbeläge auf dem Mesothel, Infiltration des Peritoneums durch Entzündungszellen sowie Vaskularisation und Ödem des subserösen Bindegewebes. Erste morphologische Veränderungen der Oberfläche wie Retraktion und Abkugelung der Mesothelzellen sind dabei schon innerhalb der ersten Stunden nach Applikation der Noxe zu beobachten und erreichen ihren Höhepunkt etwa nach 24h. Eine leukozytäre Infiltration des Peritoneums wurde nach etwa 6-12h beschrieben und erreichte nach ca. 24-48h ihr maximales Ausmaß. Die Regeneration des Peritoneums nahm mindestens 4-5 Tage in Anspruch.

Abbildung 2: Entzündliche Veränderungen des Peritoneums

Zu diesem Zeitpunkt liegen eine Reihe von tierexperimentellen und klinischen Studien vor, die sich mit den Zusammenhängen von Pneumoperitoneum und Tumorwachstum befassen (1.2.2). Darunter befinden sich auch einzelne, die sich mit den Auswirkungen der Operationstechnik auf die Morphologie des Peritoneums beschäftigen.

Anhand von rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen dokumentierten Volz et al eine deutlich erkennbare Entzündung des Peritoneums von Mäusen als Folge eines CO₂-Pneumoperitoneums und die nachfolgende Regeneration (Volz 1999a). Nach zwei Stunden waren Retraktion und Separation des Mesothels zu erkennen, Makrophagen erschienen auf der freigelegten Basalmembran. Die Alterationen des Mesothels und dessen Infiltration durch Makrophagen und Lymphozyten erreichten ihr größtes Ausmaß nach 12 bis 24 Stunden; daraufhin zeigten sich Zeichen einer Regeneration, die nach 96 Stunden abgeschlossen war. In einem weiteren Versuch wurden zusätzlich maligne Zellen intraperitoneal eingebracht. Es kam bei der Kombination von Pneumoperitoneum und Tumorzellinjektion innerhalb der ersten zwei Tage zu den erwähnten entzündlichen Veränderungen und danach zu einer diffusen Peritonealkarzinomatose, während eine alleinige Applikation der Zellen ohne CO₂-Pneumoperitoneum ein knotenförmiges Tumorwachstum auf der Mesotheloberfläche verursachte (Volz 1999b). Die Befunde zeigten sich bei allen Tieren und betrafen das ganze Peritoneum. Eine Kontrollgruppe bzw. eine Laparotomiegruppe wurde allerdings nicht untersucht.

Suematsu et al. untersuchten ebenfalls rasterelektronenmikroskopisch die Auswir­kungen des Pneumoperitoneums auf das Bauchfell von Mäusen (Suematsu 2001). Sie verwendeten Luft, CO₂ und Helium als Gase und verglichen die Ergebnisse mit denen der Laparotomie. Infolge der Laparoskopie traten nach CO₂-Pneumoperitoneum eine Retraktion der Mesothelzellen, nach Helium-Pneumoperitoneum eine Separation der Mesothelzellen und nach der Laparotomie eine Ablösung der Deckzellen auf. Suematsu et al. bezeichneten die Veränderungen nach Laparoskopie und Laparotomie als morphologisch „unterschiedlich“ und vermuteten unterschiedliche pathophysiologische Folgen der verschiedenen Operationstechniken bzw. Gase als Ursache dieser Differenzen.

In einer Studie von Bloechle et al. führte eine Peritonitis innerhalb von zwölf Stunden zu deutlichen entzündlichen Veränderungen des Peritoneums von Ratten (Bloechle 1999). Durch Applikation eines Pneumoperitoneums wurde die Peritonitis weiter verstärkt. Es kam zur Ablösung der Mesothelien, Adhäsion von Makrophagen und Deformation der Mikrovilli. Die ausschließliche Applikation eines Pneumoperitoneums resultierte lediglich in Aufrichtung der Mikrovilli und Faltenbildung des intakten Mesothels.

Den Einfluss von Temperatur und Wassergehalt des Insufflationsgases auf die Bauchfellmorphologie betrachteten Hazebroek et al. rasterelektronenmikroskopisch bei Ratten (Hazebroek 2002). Das Peritoneum aller Tiere zeigte unabhängig von Temperatur und Insufflationsgasfeuchtigkeit Alterationen: Im Verlauf von 24h nach Applikation des Pneumoperitoneums kugelten sich die Mesothelzellen ab und die Basallamina wurde sichtbar. Diese Veränderungen traten allerdings auch in der Gruppe auf, die einer gaslosen Laparoskopie unterzogen wurde.

Die einzige Arbeit, die Veränderungen des menschlichen Bauchfells beschreibt, stammt von Schaeff et al. (Schaeff 1998a) Separation und Retraktion des Mesothels, Leukozyteninfiltration und Ödem des submesothelialen Bindegewebes finden sich im Verlauf der ersten Stunden laparoskopischer Operationen. In Proben von Patienten, die laparotomiert oder mittels gasloser Laparoskopie operiert wurden, konnten diese Befunde „nicht regelhaft und in dieser Ausprägung beobachtet werden“ (Schaeff 1998a). Die Ergebnisse der Studie sind jedoch eher kritisch zu betrachten, da die Biopsien nicht standardisiert entnommen wurden und weiterhin nicht deutlich wird, wie viele Patienten untersucht wurden, Schaeff et al berichteten lediglich, sie hätten insgesamt 36 Biopsate untersucht.

In den vorliegenden Studien fanden sich sowohl nach Laparotomie als auch nach Laparoskopie morphologische Veränderungen des Peritoneums. Die Arbeiten von Volz, Schaeff und Suematsu zeigen Veränderungen des Mesothels infolge eines Pneumoperitoneums im Sinne einer Peritonitis. Bloechle beschreibt hingegen nach Applikation eines Pneumoperitoneums lediglich Veränderungen der Mikrovilli. In den Untersuchungen von Suematsu und Schaeff nach Laparotomien ergaben sich morphologische Veränderungen des Peritoneums, die im Vergleich bei der Laparotomie als geringfügiger eingestuft wurden.

In der vorliegenden Studie wurde als Tierart eine BD IX Ratte (Charles River, Deutschland) und als Tumorzelllinie ein Adenokarzinom des Kolons DHD/K12/TRb (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, England) verwendet. Diese Kombination hat den Vorteil, dass Ratte und Tumorzelllinie den gleichen MHC- Haptotyp tragen und dadurch eine Abstoßung der allogenen malignen Zellen verhindert wird. Dieses Tumormodell wurde in der Vergangenheit problemlos und erfolgreich von verschiedenen Arbeitsgruppen zur Untersuchung der Zusammenhänge zwischen Laparoskopie und Tumorabsiedlung eingesetzt (Jacobi 1998a, Jacobi 1999a, McCourt 2000). Außerdem entspricht die Morphologie des Peritoneums der Ratte weitestgehend der des menschlichen Peritoneums (1.3.1).

Die BD IX Ratten wurden eigens für Tierversuche gezüchtet. Alle Tiere waren männlich und wogen zum Zeitpunkt des Experiments 250-300g. Zwischen Lieferung und Experiment vergingen mindestens 10 Tage, um die Tiere zu beobachten und an die Umgebung zu gewöhnen. Die Tiere wurden unter Standardlaborbedingungen gehalten. Vor und nach der Untersuchung hatten sie freien Zugang zu Wasser und Nahrung.

Die Karzinomzellen wurden als Zellsuspension in tiefgefrorenem Zustand geliefert. Die Zellen wurden in einem Wasserbad bei 37° C aufgetaut. Nach Überführung in das Nährmedium (1:1 Dulbeccos mem und Hams F 10 Medium, beide Biochrom, Deutschland) erfolgte die Vitalitätsprüfung mittels Acridine-Orange-Färbung und Fluoreszenzmikroskopie. Danach wurde die Zellsuspension fünf Minuten mit 200 g zentrifugiert und in das Medium resuspendiert. Die Inkubation der Zellen erfolgte im Brutschrank in einer Kulturflasche (75cm²/ 250ml) bei 37°C und einer CO₂ Konzentration von 5%. Dem Nährmedium wurden vorher 10% fetales Rinderserum, 1000 IU/l Penicillin/Streptomycin (beides Gibco BRL, Deutschland) und 2 mmol/l Glutamin (Biochrom, Deutschland) zugesetzt.

Nach Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen subkultiviert. Hierzu wurden die Zellen zunächst mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, anschließend 300 μl einer vorgewärmten Trypsin/ EDTA-Lösung (0,05 % Trypsin/ 0,02 % EDTA) hinzu­gegeben und die Lösung einige Minuten unter dem Mikroskop inkubiert. Die abgelösten Zellen wurden mittels einer sterilen Pipette aufgenommen, mit der doppelten Menge Medium versetzt, bei 200g fünf Minuten zentrifugiert, mit Medium/ Zusatz resuspendiert und in eine neue Kulturflasche pipettiert.

Gleichzeitig wurden von dieser Zellsuspension jeweils Proben à 10⁵ Zellen eingefroren. Die Zellen wurden in ein Kryoröhrchen suspendiert, zentrifugiert und nach Abpipettieren des Überstandes in einem Stickstoffbehälter gelagert. Für die Injektion im Tumormodell wurden die Zellen wie oben beschrieben aufgetaut, ihre Vitalität geprüft und die Zellzahl mittels Neubauer-Zählkammer bestimmt.

Für die Experimente wurden insgesamt 55 Ratten in Abhängigkeit vom verwendeten Gas in zwei Gruppen à 25 Tiere und eine Kontrollgruppe à 5 Tiere unterteilt.

Die Anlage des Pneumoperitoneums erfolgte bei fünf Ratten gleichzeitig, die dadurch eine Kohorte bildeten. Jedes dieser fünf Tiere war der gleichen Gruppe zugeordnet. Für die Biopsieentnahme wurde zum entsprechenden Zeitpunkt eine der Ratten nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und somit einer Untergruppe zugewiesen (Abbildung 4).

Den Kohorten der CO₂-Gruppe wurde zum Zeitpunkt des Experiments je ein Kontrolltier beigeordnet. Es wurden also zu Beginn des Experiments nicht fünf, sondern sechs Tiere ausgewählt, narkotisiert, deren Bauch rasiert und die Tumorzellen appliziert. Das Pneumoperitoneum wurde aber nur bei fünf Tieren aufgebaut. Das zufällig ausgewählte sechste diente als Kontrolltier. Die Biopsieentnahme erfolgte bei dieser Ratte zwei Stunden nach Injektion der malignen Zellen in die Bauchhöhle. Die Untersuchung der Kontrolltiere diente der Gewinnung von Negativkontrollen.

Abbildung 4: Einteilung der Gruppen, Kohorten, Untergruppen

Die Narkotisierung der Tiere erfolgte durch die intramuskuläre Injektion von Xylazinhydrochlorid (Rompun^® 2 %, Bayer Vital GmbH, Deutschland; 10 mg/kg Kör­per­­gewicht) und Ketaminhydrochlorid (Ursotamin^®, Serum-Werk Bernburg AG, Deutschland; 80 mg/kg Körpergewicht) in eines der Hinterbeine. Die Spontanatmung blieb während des gesamten Experiments erhalten. Nach Einleitung der Narkose wurde den Tieren der Bauch rasiert und desinfiziert. Daraufhin wurden 10⁵ maligne Zellen mit einer Subkutannadel intraperitoneal injiziert und die Ratten durch eine Stanzmarke am Ohr gekennzeichnet.

Zur Anlage des Pneumoperitoneums wurde die Bauchhöhle der Ratten mit einer Venenverweilkanüle (1,4 mm Durchmesser) punktiert. Unter Zuhilfenahme von Dreiwegehähnen und Plastikschläuchen wurden die fünf Tiere einer Kohorte gleichzeitig an einen Insufflator (Electronic Laparoflator, Karl Stolz GmbH, Deutschland) angeschlossen.

Es folgte der Aufbau des Pneumoperitoneums mit dem entsprechendem Gas und einem Druck von 15 mm Hg. Bei der Verwendung von Helium wurde der Druckminderer gewechselt, so dass gleiche Druckbedingungen herrschten. Nach begonnener Insufflation schwankte der Druck maximal in einem Bereich von +/- 2 mm Hg um den Zieldruck. Der anfängliche Gasfluss betrug 1 l/min, der gesamte Gasverbrauch 1,5 +/- 0,3 l. Nach 30 Minuten wurden die Verbindungsschläuche dekonnektiert und die Bauchhöhle desuffliert. Zuletzt wurden die Venenverweilkanülen entfernt und die Ratten in den Tierstall entlassen.

Die Auswahl der Zeitpunkte zur Probenentnahme resultierte aus Angaben in der Literatur (1.3.2). Nach Einwirkung einer Noxe auf das Mesothel stellten sich in den ersten Stunden morphologische Veränderungen der Zellen ein (Lethola 1986), die nach 12 – 24 Stunden ihren Höhepunkt erreichten (Volz 1999a). Entzündungszellen waren besonders in der ersten beiden Tagen zu beobachten (Dizerega/Rodgers 1992). Die anschließenden Regenerationsvorgänge setzten mit der Entzündung ein und nahmen ca. 3 – 5 Tage in Anspruch (Watters/Buck 1972). (1.3.2)

Zu den oben angegebenen Zeitpunkten wurde ein Tier aus der Kohorte zufällig ausgewählt und durch die intramuskuläre Injektion einer Überdosis Rompun®/Ursotamin® getötet. Der Ratte wurde daraufhin intraperitoneal 10 ml einer Glutaraldehydlösung (GA; 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,3) injiziert. Zur Biopsieentnahme wurde zunächst ein medianer Bauchhautschnitt durchgeführt und dann die Haut von der darunter liegenden Muskelschicht abpräpariert. Daraufhin wurde die Bauchhöhle eröffnet und mehrere ca. 1 x 1 cm große Biopsate, bestehend aus dem Peritoneum und der darunter liegenden Muskelschicht, von der parietalen Bauchwand entnommen. Die Gewebsproben wurden mit Nadeln auf einem Korkstück aufgespannt und so für sechs Stunden in einer mit GA gefüllten Schale bei 8°C aufbewahrt. Bei Entnahme der Proben aus den Schalen wurde die dem Peritoneum abgewandte Seite mit einem Faden markiert, um die Seiten nach der eine Schwärzung bewirkenden Postfixierung identifizieren zu können. Darauffolgend wurden die Biopsien in mit GA gefüllte Probentöpfe überführt, in denen sie 24 Stunden kühl gelagert wurden.

Das Prinzip der Elektronenmikroskopie entspricht größtenteils dem der Lichtmikroskopie. Anstelle einer Lichtquelle wird eine Elektronenquelle verwendet, zur Fokussierung und Lenkung der Strahlen werden elektromagnetische Felder eingesetzt. Während der Lichtstrahl durch das Auge wahrgenommen wird, werden die Elektronen durch einen Detektor registriert und ein Bild errechnet. Die Vorteile der Elektronenmikroskopie liegen im stärkeren Auflösungsvermögen (ca. 1 nm gegenüber 0,1 μm bei der Lichtmikroskopie), der höheren größtmöglichen Vergrößerung (bis 150.000fach versus ca. 1.000fach) und der größeren Schärfentiefe. Bei der Transmissionselektronenmikroskopie werden die Proben wie in der Lichtmikroskopie durchstrahlt. Die Bildentstehung der Rasterelektronenmikroskopie beruht auf reflektierten und in der Probe erzeugten Elektronen. Dadurch kann die Oberfläche einer Probe genau beurteilt werden. Die Beobachtung erfordert jedoch eine besondere Vorbehandlung der Biopsate (3.2.2).

Im Rasterelektronenmikroskop (REM) werden Elektronen aus einer Elektronenquelle freigesetzt und durch ein starkes elektrisches Feld in einem Vakuum beschleunigt. Magnetische Felder bündeln und lenken den Elektronenstrahl so, dass die Proben zeilenförmig abgetastet wird. Das Auftreffen der Elektronen auf das Präparat resultiert in Reflektion (Rückstreuelektronen), Absorption mit der Entstehung von Probenstrom oder Freisetzung weiterer Elektronen (Sekundärelektronen). Rückstreu- und Sekundärelektronen werden durch einen Detektor registriert und hieraus ein Bild errechnet. Das Ergebnis wird auf einem Monitor abgebildet und kann photographiert oder digital gespeichert werden.

Das verwendete Gerät war ein DSM 982 Gemini (Zeiss, Deutschland). Der Kathodenstrom betrug 150 mA und die Beschleunigungsspannung 5 kV. Es wurde ein Arbeitsabstand von 10 mm eingehalten. Die Biopsate wurden bei 20 bis 5000facher Vergrößerung standardisiert ausgewertet. Die Dokumentation erfolgte anhand von Photographien und digitaler Speicherung (3.2.3).

Nach der Fixierung in Glutaraldehyd (3.1.4) erfolgte eine Postfixierung mit Osmiumtetraoxid (1 % Osmiumtetraoxid in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,3), die eine Stabilisierung und damit geringere Extraktion der Lipide bewirkte. Darüber hinaus wurde durch die Anlagerung von Schwermetall die Leitfähigkeit des Präparats erhöht. Vor und nach der Postfixierung wurden die Proben mit 0,1M Phosphatpuffer (pH 7,3) gewaschen. (Tabelle 1)

Die Beobachtung im REM erfordert ein Hochvakuum, daher mussten die Proben entwässert und getrocknet werden. Nach der vollständigen Entwässerung über eine aufsteigende Alkoholreihe wurden die Proben mit Hexamethyldisilazan (HMDS; Sigma, Deutschland) infiltriert und luftgetrocknet (Bray 1993). Durch seinen geringen Dampfdruck verdampfte HMDS so langsam, dass keine das Gewebe schädigenden Oberflächenspannungen entstanden. Im Anschluss an die Trocknung wurden die Präparate mit Hilfe von Leitsilber auf Probenteller montiert. (Tabelle 1)

Die getrockneten biologischen Proben hatten durch den Wasserverlust ihre Leitfähigkeit eingebüßt. Darüber hinaus bestanden sie aus leichten Elementen mit einer schlechten Sekundärelektronenemission. Um Aufladungen und thermische Belastungen durch das Elektronenbombardement sowie eine schlechte Sekundärelektronenausbeute zu vermeiden, wurden die Präparate in einer Hochvakuum - Kleinbeschichtungsanlage (MED 020, BAL – TEC AG, Fürstentum Liechtenstein) mit einer dünnen Goldschicht überzogen.

Maligne Zellen wurden mikroskopiert, um sie in den Gewebeproben erkennen zu können. 10⁶ maligne Zellen wurden aus dem Medium in Glutaraldehyd überführt und sechs Stunden fixiert. Es erfolgte keine Postfixierung. Die Vorgänge Entwässerung, Trocknung und Beschichtung entsprachen der Behandlung der festen Proben. Zwischen den einzelnen Vorgängen wurde die Tumorzelllösung mit 200g zentrifugiert. Nach der Infiltration mit HMDS wurden die Zellen ein letztes Mal zentrifugiert und mit einer kleinen Menge HMDS resuspendiert. Ein Tropfen dieser dicken Suspension wurde auf einem Objektträger aufgebracht und getrocknet.

Fixierungsverfahren haben Einfluss auf Morphologie und Größe von Zellen. Entwässerung und Trocknung führen zu einer Schrumpfung, beispielsweise verringert sich der Durchmesser von Erythrozyten um 25-30 % (Gusnard/Kirschner 1977). Weiterhin kann die Präparation der Proben u.a. durch auftretende Oberflächenspannungen die Morphologie der Zelloberflächen verändern (Virtanen 1984). Größen- und Formveränderungen sind bei der HMDS- und der häufiger verwendeten Kritische-Punkt-Trocknung gleich (Braet 1997).

Vorgang

Zeitdauer

Fixierung und Postfixierung

Fixierung in Glutaraldehyd

Waschen mit Phosphatpuffer

Postfixierung mit Osmiumtetraoxid

Waschen mit Phosphatpuffer

6 Stunden

2 x 15 Minuten

2 Stunden

2 x 15 Minuten

Entwässerung mit Ethanol:

70 %

90 %

100 %

2 x 15 Minuten

2 x 15 Minuten

2 x 15 Minuten

Trocknung

Infiltration mit HMDS

Lufttrocknung

2 x 15 Minuten

12 Stunden

Montage auf den Probenteller

 

 

Beschichtung der Proben

 

 

Tabelle 1: Die einzelnen Präparationsschritte

Dieses Biopsat wurde zwölf Stunden nach CO₂-Pneumoperitoneum gewonnen. Die Mesothelzellen behielten ihre flache, polygonale Form. Zellgrenzen waren deutlich erkennbar. Dazwischen war eindeutig die Basalmembran zu erkennen. Die Verbindung zwischen den Mesothelzellen blieb durch Interzellularbrücken aufrechterhalten. Form und Anzahl der Mikrovilli waren unbeeinträchtigt.

Abbildung 7: Separation der Mesothelzellen in 200, 1000, 2000 und 5000facher Vergrößerung

Diese Bilderserie wurde von einem Präparat erstellt, das einer Ratte 96 Stunden nach Applikation eines CO₂-Pneumoperitoneums entnommen wurde. Die Mesothelzellen zeigten eine Retraktion des apikalen Zellpols der Mesothelzellen. Die Zellgrenzen waren gut erkennbar, jedoch war an keiner Stelle die Basalmembran freigelegt.

Abbildung 8: Retraktion des Mesothels in 200, 1000, 2000 und 5000facher Vergrößerung

Wiederholt zeigten sich offensichtliche Zerstörungen des normalen Mesothelaufbaus, die durch Retraktion, Separation und Ablösung von Mesothelzellen gekennzeichnet waren, und damit das Bild einer Entzündung zeigten. Außerdem fanden sich in diesen Probenausschnitten regelmäßig Rundzellen. Diese Entzündungen waren immer streng lokal begrenzt bzw. scharf abgegrenzt. Sie dehnten sich nie auf einen ganzen Quadranten oder ein vollständiges Präparat aus. Bei Auftreten dieser Veränderung wurde der entsprechende Quadrant als „entzündlich verändert“ gewertet.

Abbildung 9: lokale Entzündung des Peritoneums in 200, 1000, 2000 und 5000facher Vergrößerung

In einer Probe eines Kontrolltieres konnte eine offensichtlich mechanische Läsion dokumentiert werden. Sie hatte die Form von zwei parallelen, ca. 5 mm langen und 6-8 µm breiten Streifen. Die Deckzellen waren abgelöst, die Basalmembran freigelegt. Es lagen keine Veränderungen des umliegenden Mesothels vor. Fibrinbeläge, Tumor- oder Entzündungszellen ließen sich nicht nachweisen.

Abbildung 10: Verletzung des Mesothels in 200, 1000, 2000 und 5000facher Vergrößerung

In einigen Proben war das Mesothel von Rissen durchzogen. Die Risse waren bis zu 5µm breit und 150µm lang. Die Risse folgten nicht den Zellgrenzen, sondern bildeten schluchtenartige, in die Tiefe ziehende Eröffnungen der peritonealen Oberfläche.

Abbildung 11: Risse in 200 und 2000facher Vergrößerung

Auf dem Mesothel liegende Erythrozyten waren leicht an ihrer Form und Größe zu erkennen. Sie traten einzeln oder als Zellballen auf.

Abbildung 12: Erythrozyten in 200 und 2000facher Vergrößerung

Stellenweise waren die Mesothelzellen von feinkörnigen Belägen bedeckt. Diese verklebten die Mikrovilli und erschwerten die Beurteilung des Peritoneums. Sie variierten in ihrer Dichte, nicht aber in der feinkörnigen Struktur.

Abbildung 13: feinkörnige Beläge in 200, 1000, 2000 und 5000facher Vergrößerung

Erythrozyten, feinkörnige Beläge, Risse und mechanische Läsionen wurden als Präparationsartefakt angesehen.

Um die Peritoneumsbiopsien zu entnehmen, wurde die Bauchhöhle eröffnet. Dabei kam es mitunter zur Kontamination des Peritoneums mit Blut. Obwohl die Proben abgespült wurden, kann nicht ausgeschlossen werden, dass dabei Erythrozyten am Mesothel haften blieben (4.3.6). Die Verunreinigung von Proben des Bauchfells durch rote Blutkörperchen wurde zuvor von Dobbie bei Untersuchungen des Peritoneums im Zusammenhang mit der Peritonealdialyse beschrieben und explizit als Artefakt bezeichnet (Dobbie 1989).

Feinkörnige Beläge repräsentieren am ehesten einen Niederschlag von Proteinen (4.3.7). Sie könnten durch Blutungen während der Biopsieentnahme oder infolge eines serösen Exsudates entstanden sein. Im ersten Fall wären sie definitiv als Artefakt zu werten. Im zweiten könnte ein seröses Exsudat Ausdruck einer entzündlichen Veränderung sein. Eine Assoziation der feinkörnigen Beläge mit anderen entzündlichen Veränderungen ließ sich aber nicht feststellen. Außerdem unterschieden sich die Beläge in ihrer Struktur eindeutig von in der Literatur beschriebenen, im Zusammenhang mit Entzündungen auftretenden, schwammartigen oder feinfädigen Fibrinauflagerungen (Jonecko 1990, Henrich 1986). Daher ist davon auszugehen, dass es sich hierbei um Präparationsartefakte handelt.

In einigen Proben war das Mesothel von Rissen durchzogen (4.3.5). Anders als die Spalten zwischen separierten Deckzellen folgten die Risse nicht den Zellgrenzen. Die unter dem Mesothel liegende Basalmembran war nicht freigelegt, sondern vielmehr durchtrennt. Das Auftreten von Rissen war immer lokal begrenzt. Die für die Rasterelektronenmikroskopie notwendige Entwässerung und Trocknung der Proben verursachen regelmäßig eine Schrumpfung des organischen Materials, die zu dessen Zerreißung führen kann (Braet 1997). Daher entstanden Risse am ehesten während der Präparation und sind als Schrumpfungsartefakte anzusehen.

Weiterhin ist in Betracht zu ziehen, dass es sich bei der Separation der Mesothelzellen (4.3.1) ebenfalls um ein Schrumpfungsartefakt handelt, wie es in ähnlicher Form bei Endothelzellen der Kornea von Virtanen beschrieben wurde (Virtanen 1984). Die interzellulären Verbindungen zwischen den Deckzellen bestehen u.a. aus Desmosomen und sind beständig gegenüber mechanischer Belastung (Dobbie 1989). Denkbar wäre, dass die Zellen schrumpften und die Tendenz entwickelten, sich voneinander zu trennen. An Orten bestehender Zellkontakte blieben sie dann miteinander verbunden, während sich dazwischen Lücken bildeten und die Basalmembran interzellulär sichtbar wurde. Andererseits wurde eine Separation von Mesothelzellen in der Literatur bislang regelmäßig als Zeichen einer entzündlichen Reaktion des Bauchfells betrachtet (1.3.2). Daher wurde davon ausgegangen, dass es sich bei der Separation der Deckzellen nicht um Artefakte handelte, sondern um eine entzündliche Veränderung.

In einer Probe aus der Kontrollgruppe wurden zwei streifenförmige Verletzungen des Peritoneums dokumentiert (4.3.4). Die parallele Anordnung und der schnurgerade Verlauf lassen keinen anderen Schluss zu, als dass diese Läsion durch artifizielle mechanische Manipulation verursacht wurde.

Das alleinige Auftreten von Separation oder Retraktion der Mesothelzellen wurden jeweils als entzündliche Veränderungen gewertet (1.3.2). Die Veränderungen waren nicht punktuell zu finden, sondern ihr Auftreten hatte eher flächigen Charakter. Ihrer Morphologie und ihrem Ausbreitungsmuster nach lassen sich die Veränderungen mit dem Einwirken einer global wirkenden Noxe vereinbaren, wie sie Insufflationsgas und –druck darstellen. Diese Phänomene traten jedoch nur fünf bzw. sieben Mal insgesamt auf, im Verhältnis zur Gesamtzahl der Proben (55) also eher selten (Tabelle 3).

Aufgrund des gleichzeitigen Auftretens der Einzelbefunde Retraktion, Separation und Ablösung der Deckzellen sowie Deformation der Mikrovilli und des Vergleichs dieser Phänomene mit Aufnahmen aus der Literatur ist davon auszugehen, dass die „lokal begrenzten Entzündungen“ keine Artefakte darstellen (4.3.3, Guo 1993, Lethola 1986, Whitaker/Papadimitriou 1985). Da die verursachende Noxe keinen Einfluss auf die Morphologie der entzündlichen Veränderungen des Peritoneums hat, kann aus dem alleinigen Auftreten derselben kein Rückschluss auf die Ursache gezogen werden (1.3.2). Der äußere Umriss der lokalen Entzündungen war unregelmäßig und lässt somit – anders als bei der mechanischen Läsion (4.3.4, 5.1.1) – ebenfalls keinen Schluss auf deren Genese zu. Das Auftreten von Rundzellen innerhalb dieser lokalen inflammatorischen Veränderungen gibt insofern keine Erklärung, da – selbst wenn es sich dabei um die Absiedlung Tumorzellen handelte (5.1.3) – nicht zwischen Ursache und Folge unterschieden werden könnte: Tumorzellen können sowohl entzündliche Veränderungen des Mesothels induzieren als auch mit hoher Affinität an solchen anhaften (Buck 1973, Aoki 1999). Das eindeutig regional begrenzte Vorkommen spricht gegen die Vermutung, Insufflationsgas oder –druck hätten diese Form der entzündlichen Veränderung hervorgerufen, da diese am ehesten großflächige Veränderungen hervorrufen würden. Denkbar wäre, dass es bei einigen Tieren während des Pneumoperitoneums zu einer lokalen Kontamination der Bauchhöhle mit Staub oder Bakterien oder Latexpartikel und einer entsprechenden Entzündungsreaktion kam.

Rundzellen wurden felderförmig verteilt auf intaktem Mesothel oder innerhalb von lokal begrenzten entzündlichen Veränderungen des Mesothels beobachtet (4.3.3, 4.3.8). Unklar ist, um welche Art von Zellen es sich handelt.

Betrachtet man die Morphologie der Rundzellen, könnte es sich dabei um Entzündungszellen wie Makrophagen bzw. Lymphozyten einerseits oder um Tumorzellen andererseits handeln. Papadimitriou beschrieb Peritonealmakrophagen anhand elektronen­mikroskopischer Aufnahmen als runde bis ovale Zellen, deren Oberfläche Mikrovilli, Fältelungen, Rillen, Furchen, Ausstülpungen und Einsenkungen zeigte (Papadimitriou 1973). Ihr Durchmesser gab er mit 5-20 µm an. Kaufman erkannte in elektronenmikroskopischen Studien des Peritoneums Lymphozyten; es waren Rundzellen, die einen Durchmesser von 5 µm hatten und auf ihrer Oberfläche Mikrovilli besaßen (Kaufman 1982). In der gleichen Arbeit gab er die Größe von Makrophagen mit 10-12 µm an; Granulozyten maßen 7 µm und ihre Oberfläche war von Auffältelungen gekennzeichnet. Koga untersuchte die Implantation von Leberkarzinomzellen in der Bauchhöhle. Sie konnten als Rundzellen mit einem mittleren Durchmesser von 16 µm eindeutig von mesothelialen Deckzellen unterschieden werden (Koga 1980). In den Aufnahmen der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Kolonkarzinomzellen charakterisierten kurze Mikrovilli sowie feine Auffältelungen und Einbuchtungen die Zelloberfläche (3.1.1, 4.2). Der Zelldurchmesser betrug zwischen 5 und 8,5 µm. Die Oberfläche der in den Proben vorhandenen Rundzellen war von feinen Auffältelungen sowie Ein- und Ausbuchtungen geprägt. Ihr Durchmesser lag zwischen 4 und 7,5 µm (4.3.8). Ihrer Morphologie nach könnte es sich also sowohl um die applizierten Tumorzellen als auch um Peritonealmakrophagen handeln.

Beurteilt man zusätzlich die Anordnung der Rundzellen auf dem Peritoneum, muss die Lokalisation ihres Auftretens hinzugezogen werden. Zum einen fanden sich Rundzellen in Bereichen inflammatorischer Veränderungen (4.3.3), zum anderen regional begrenzt auf dem Mesothel aufliegend (4.3.8), diese Form wird im weiteren als Rundzellfeld bezeichnet.

Im Falle der Rundzellfelder spricht das Vorliegen von Mitosen der Rundzellen gegen die Annahme, dass es sich hierbei um Entzündungszellen handelt, da diese sich nicht mehr in der Peripherie teilen (Junqueira/Carneiro 1996). Außerdem spräche das gehäufte Vorkommen von Makrophagen oder anderen Entzündungszellen für das Vorliegen einer entzündlichen Reaktion; das Auftreten von Rundzellen war aber nicht regelmäßig mit weiteren entzündlichen Veränderungen assoziiert. Die Beobachtungen von Mitosen und die Anordnung in Gruppen lassen sich dagegen gut mit der Annahme vereinbaren, es handele sich bei den Rundzellen um Tumorzellen.

Innerhalb lokal begrenzter Entzündungen fanden sich keine Mitosen der Rundzellen. Das Vorliegen entzündlicher Veränderungen ohne die vorherige Zugabe von Tumorzellen würde für die Diagnose „Makrophagen“ sprechen, die sich in einer Arbeit von Haney et al. regelmäßig nach Verletzungen des Peritoneums an entsprechender Stelle nachweisen ließen (Haney 2000). In diesem Zusammenhang ist aber zu bedenken, dass sich intraperitoneale Metastasen bevorzugt an Orten von Bauchfellläsionen bilden (Aoki 1999), Tumorzellen demgemäss eine hohe Affinität zu geschädigten Bezirken des Mesothels besitzen. Die Lokalisation der Rundzellen an Orten entzündlicher Veränderungen eröffnet daher keine Möglichkeit, zwischen Makrophagen und Tumorzellen zu unterscheiden.

Zusammenfassend muss festgestellt werden, dass sich die Rundzellen aufgrund ihrer Morphologie und Anordnung nicht identifizieren ließen. Es ist sogar in Frage zu stellen, ob es sich hierbei um einen einheitlichen Zelltyp handelt, z.B. könnten innerhalb der Rundzellfelder Tumorzellen und im Zusammenhang mit entzündlichen Veränderungen des Mesothels Makrophagen aufgetreten sein.

Das Peritoneum aller Kontrolltiere präsentierte ein intaktes Mesothel. Die Oberfläche der parietalen Bauchwand war von einer Schicht flacher Mesothelzellen typischer Morphologie und Anordnung bedeckt. Die Biopsate der Kontrolltiere wurden zwei Stunden nach Applikation der Narkose und Injektion der malignen Zellen entnommen; in diesem Zeitraum hätten bei Einwirkung einer Noxe Veränderungen des Peritoneums erkennbar sein müssen (1.3.2). Es war daher davon auszugehen, dass die intraperitoneale Injektion von Tumorzellen und die Durchführung der Anästhesie keine morphologischen Alterationen des Mesothels verursachten.

Von den je 25 Ratten, denen ein Pneumoperitoneum mit dem Insufflationsgas CO₂ oder Helium bei einem Insufflationsdruck von 15 mm Hg appliziert wurde, konnten jeweils bei 21 Tieren (84 %) keine Veränderungen des Peritoneums im Sinne einer Entzündung festgestellt werden. Viermal wurden in jeder Gruppe entzündliche Veränderungen beobachtet und ein nicht intaktes Peritoneum diagnostiziert (16 %). Es lag keine Häufung der als global entzündlich veränderten Proben innerhalb einer Kohorte oder Untergruppe vor, d.h., diese Fälle waren weder innerhalb der Tiere konzentriert, die zugleich einem Pneumoperitoneum unterzogen wurden, noch traten sie gehäuft auf bei Tieren, denen die Proben zu einem gleichen Zeitpunkt nach dem Pneumoperitoneum entnommen wurden. Entzündliche Veränderungen traten also sowohl selten als auch zufällig verteilt auf.

Daher wurden die Hypothesen, „ein Pneumoperitoneum mit Kohlendioxid oder Helium verursachte entzündliche Veränderungen des Peritoneums“, abgelehnt (P<0,01). Ein Unterschied zwischen den Gruppen wurde nicht festgestellt (P<0,01).

Dieses Ergebnis steht jedoch im Widerspruch zu den Ergebnissen experimenteller Studien anderer Autoren.

Volz et al. untersuchten rasterelektronenmikroskopisch das parietale Peritoneum von Mäusen nach Kapnoperitoneum und dokumentierten entzündliche Veränderungen, die bei Zugabe von Tumorzellen in die Bauchhöhle eine Peritonealkarzinomatose begünstigten (Volz 1999a, Volz 1999b). Die Veränderungen zeigten sich ausnahmslos bei allen Tieren. Die Kriterien zur Beurteilung der peritonealen Alterationen sowie die Zeitpunkte der Probenentnahmen (0 – 96h), das verwendete Gas und die Dauer des Eingriffs entsprachen der vorliegenden Studie. Im Unterschied dazu verwendeten Volz et al. jedoch Mäuse (vs. Ratten) als Versuchstiere und einen dementsprechend geringeren Insufflationsdruck (4 vs. 15 mm Hg). Während sich bei den Mäusen exemplarisch der Verlauf einer Peritonitis beobachten ließ, wurden im vorliegenden Versuch keine Veränderungen des Rattenperitoneums dokumentiert. Anzumerken ist, dass Volz et al. Melanomzellen injizierten, die nicht zu den typischen malignen Zellen zu zählen sind, die man in der Bauchhöhle erwartet. Anhand dieser Tatsache kann das maligne Wachstumsmuster in Frage gestellt werden, die entzündlichen Veränderungen des Bauchfells wurden von der Arbeitsgruppe jedoch auch ohne Applikation von Tumorzellen beobachtet, so dass sie eindeutig auf das applizierte Kapnoperitoneum zurückgeführt wurden (Volz 1999a).

Rasterelektronenmikroskopische Betrachtungen des Mesothels von Mäusen innerhalb von drei Tagen nach Laparotomien und Laparoskopien mit unterschiedlichen Gasen (CO₂, Helium, Luft) wiesen nach Angaben von Suematsu et al. Alterationen der peritonealen Oberfläche unterschiedlicher Ausprägung nach, die sich bei längerer Operationsdauer (30 – 90 min) und steigendem Insufflationsdruck (5 und 10 mm Hg) in zunehmendem Maße dokumentieren ließen (Suematsu 2001). Diese Ergebnisse sind allerdings hinsichtlich verschiedener Aspekte kritisch zu betrachten. Die unterschiedlichen Veränderungen des Peritoneums in der Laparotomiegruppe (Ablösungen von Deckzellen) und der Laparoskopiegruppe (Retraktion und Separation der Deckzellen) führten die Autoren auf unterschiedliche pathophysiologische Mechanismen zurück. Die Verschlechterung der Befunde wurde anhand der „stärkeren Ausprägung der Interzellularspalten“ dokumentiert, dieses Kriterium wurde jedoch nicht quantifiziert und auf eine evtl. Freilegung der Basalmembran wurde nicht eingegangen. Außerdem untersuchten Suematsu et al. viszerales Peritoneum, das physiologischerweise durch kubische Zellen und tiefe Interzellularfurchen gekennzeichnet ist (Michailova 1999, Jonecko 1990). In diesen Punkten sind die Aussagen Suematsus nicht in sich schlüssig bzw. nicht mit der Literatur in Einklang zu bringen (1.3.2), was sich u.a. darin widerspiegelt, dass die Autoren außer Volz et al. keinen weiteren Wissenschaftler zitieren, der die Morphologie des Peritoneums und deren Alterationen untersuchte (Suematsu 2001).

Schaeff et al. beschrieben pathologische Veränderungen des humanen Mesothels während der ersten drei Stunden laparoskopischer Eingriffe, die während gaslosen minimal invasiven und konventionellen Operationen „nicht regelhaft und in dieser Ausprägung“ beobachtet wurden (Schaeff 1998a). Es wurden insgesamt 36 Biopsate entnommen, die Anzahl der Patienten pro Gruppe und die Anzahl der Proben pro Patient wurden nicht genannt. Weiterhin machten die Autoren keine Angaben über die Art der Erkrankungen, deren intraperitoneales Ausmaß und die durchgeführten Operationen. Ob die entzündlichen Veränderungen Folge der Grundkrankheit oder des Operationsverfahrens waren, wurde in der Arbeit nicht erörtert. Ebenfalls beschrieben die Autoren nicht, inwieweit sie die Entnahme und Auswertung der Proben standardisierten. Eindeutige Aussagen über die Auswirkungen des Pneumoperitoneums auf das Bauchfell konnten daher nicht aus den Ergebnissen der Arbeit abgeleitet werden.

Die Ergebnisse der vorliegenden Studie stimmen mit denen von Bloechle et al. überein (Bloechle 1999). Wurde bei Ratten eine Peritonitis durch Magenperforation induziert und im Folgenden eine Laparoskopie durchgeführt, konnten im Anschluss an das Pneumoperitoneum rasterelektronenmikroskopisch eindeutig die Zeichen einer Peritonitis beobachtet werden. In der Kontrollgruppe jedoch, die lediglich einem Pneumoperitoneum unterzogen wurde, zeigte sich während des Eingriffs und bis zu 12h später (letzter untersuchter Zeitpunkt) ein intaktes Mesothel. Die beschriebenen Lageveränderungen der Mikrovilli (flach liegend oder aufgerichtet) und die Faltenbildung des Bauchfells entsprechen am ehesten Artefakten, wurden in der Literatur nicht als wesentliches Kriterium zur Diagnose einer Peritonitis herangezogen und sind daher nicht als relevante Veränderung anzusehen (1.3.2). Während eine Magenperforation also eindeutig eine Peritonitis hervorrief, konnten nach Applikation des Pneumoperitoneums keine entzündlichen Veränderungen nachgewiesen werden.

Zur Aufklärung der zum Teil widersprüchlichen Ergebnisse könnten systematische Unterschiede bzw. Fehler in den Arbeitstechniken der unterschiedlichen Arbeitsgruppen herangezogen werden. Die Ergebnisse könnten in Abhängigkeit von Insufflationsgas, –druck, und –fluss, von Zusammensetzung der Tumorzellsuspensionen und Fixierungslösungen sowie von der Wahl der Versuchstiere variieren.

Die unterschiedlichen Ergebnisse ließen sich nicht durch die Verwendung der unterschiedlichen Insufflationsgase erklären, denn sowohl pathologische Veränderungen des Bauchfells als auch dessen Unversehrtheit wurden unter Verwendung von Helium und CO₂ beschrieben (Bloechle 1999, Suematsu 2001, Volz 1999a). Die Höhe des Insufflationsdruckes war am ehesten abhängig vom Tiermodell. In den Experimenten wurden Drücke von 4 bis 15 mm Hg aufgebaut. Eine Abhängigkeit der Alterationen des Mesothels von der Stärke des Druck – soweit hier vergleichbar – spiegelte sich in den Ergebnissen nicht wider. Ebenso kamen die Fixierungslösungen nicht als Störfaktoren in Frage. Das Peritoneum der ebenfalls damit behandelten Kontrolltiere war in jeder der hier diskutierten Arbeiten unversehrt. Volz et al. injizierten Tumorzellsuspensionen in die Bauchhöhle, deren Bestandteile für sich allein Veränderungen des Bauchfells hätten verursachen können (Volz 1999a). Die Zeichen einer Peritonitis konnten in demselben Tiermodell aber auch ohne Tumorzellinjektion nachgewiesen werden (Volz 1999b). Außerdem hatte die einfache Injektion der malignen Zellen in der vorliegenden Arbeit keinen Einfluss auf die Morphologie des Peritoneums. Weiterhin ergab sich die Frage nach dem Einfluss der Tierspezies, die untersucht wurde. Während in den Untersuchungen von Maus und Mensch Veränderungen des Mesothels im Sinne einer Peritonitis vorlagen, beschrieben Bloechle et al. übereinstimmend mit der vorliegenden Studie eine intakte Morphologie des Bauchfells von Ratten nach Applikation eines Pneumoperitoneums (Bloechle 1999, Schaeff 1998a, Suematsu 2001, Volz 1999a). Im Gegensatz dazu fanden Hazebroek et al. entzündliche Veränderungen des Peritoneums auch bei Ratten, so dass eine stärkere Resistenz des Rattenperitoneums nicht für das Phänomen verantwortlich gemacht werden konnte (Hazebroek 2002).

Weiterhin mussten der Gasfluss und –verbrauch während des Pneumoperitoneums berücksichtigt werden. In Betracht gezogen wurden diese Faktoren in der Literatur bisher nur zur Erklärung der Tumorzellausbreitung innerhalb der Bauchhöhle als sogenannter Chimney-Effect (Whelan 1996). Vorstellbar wäre jedoch, dass ein starker Fluss trockenen Gases eine Austrocknung des Peritoneums verursachen und das Bauchfell global schädigen könnte. Außerdem könnte im Sinne einer Scherkraft ein gerichteter Gasfluss das Peritoneum beeinträchtigen. Hazebroek et al. untersuchten den Einfluss von Temperatur und Insufflationsgasfeuchtigkeit auf die peritoneale Morphologie (Hazebroek 2002). Retraktion und Separation der Mesothelzellen ergaben sich unabhängig davon, ob für die Aufrechterhaltung des Pneumoperitoneums feuchtwarmes oder kalttrockenes Kohlendioxid verwendet wurde. Es lassen sich aus den Ergebnissen keine Rückschlüsse auf die Auswirkungen des Gasflusses ziehen, die Austrocknung des Mesothels durch einen starken Gasfluss hingegen scheint jedoch kein wesentlicher Faktor der morphologischen Veränderungen zu sein. Weiterhin könnte ein hoher CO₂– Gasfluss die mit dem Kapnoperitoneum verbundenen Phänomene Hypoxie, Hyperkapnie und Azidose verstärken und somit zu einer Schädigung des Bauchfells führen. Auch wenn sich im vorliegenden Experiment keine solchen Veränderungen zeigten, ist nicht auszuschließen, dass ein stärkerer Gasfluss, wie er z.B. während Operationen durch den Wechsel von Instrumenten entsteht, sich negativ auswirken könnte. Übereinstimmend damit berichteten Hazebroek et al., dass in einem Vorversuch versehentlich ein sehr hoch eingestellter Gasfluss (bis zu 50 l/min) zu erheblichen Alterationen des Mesothels führte, die bei normalen bzw. niedrigeren Gasflüssen nicht zu dokumentieren waren (persönliche Mitteilung). Im vorliegenden Experiment wurden ein maximaler Gasfluss von 1 l/min erreicht und 0,3 l Gas/ 30 min/ Tier verbraucht. Entzündliche Veränderungen des Bauchfells wurden dadurch nicht verursacht. Die Autoren der hier berücksichtigten Studien (Bloechle 1999, Volz 1999a, Suematsu 2001, Schaeff 1998b) gingen nicht weiter auf den Gasfluss bzw. –verbrauch ein, bzw. dokumentierten sie nicht. Vorstellbar wäre, dass in einigen Fällen ein zu hoher Gasfluss entzündliche Veränderungen verursachte.

Zusammenfassend war festzustellen, dass im vorliegenden Experiment ein Pneumoperitoneum mit den Insufflationsgasen CO₂ oder Helium keine entzündlichen Veränderungen des Peritoneums verursachte. Dieses Ergebnis stehen im Gegensatz zu anderen Studien über die Morphologie des Bauchfells nach Pneumoperitoneum. Dieser Widerspruch könnte z.B. durch die verwendeten Tiermodelle, die applizierte Tumorzelllinie oder unterschiedlichen Gasfluss erklärt werden.

Das Auftreten von Trokarmetastasen infolge von laparoskopischen Eingriffen führte zu intensiver Forschung über deren Ursachen. In diesem Kontext stellte sich die Frage, ob die Operationstechnik in kausalem Zusammenhang mit dem Auftreten von Metastasen steht. Im Allgemeinen wurden bisher für die Entstehung von Inzisionsmetastasen unabhängig vom operativen Verfahren hauptsächlich instrumentelle Manipulation am tumortragenden Organ, v.a. die intraoperative Tumorverletzung, und die damit verbundene Kontamination der Bauchhöhle durch Tumorzellen verantwortlich gemacht (siehe hierzu auch Kapitel 1.2.2).

Eine entscheidende Rolle spielten dabei die Freisetzung von Zytokinen, die Expression von Adhäsionsmolekülen und die Freilegung von Proteinen der extrazellulären Matrix im Wundbereich von Inzisionen und intraperitonealen Traumata (Aoki 1999, Goldstein 1993, Skipper 1989).

In einer Reihe von tierexperimentellen Studien waren die Wahl des Operationsverfahrens sowie im Falle der Laparoskopie die Insufflationsgase und –drücke bestimmende Faktoren für das Ausmaß des intraperitonealen Tumorwachstums und der Anzahl der Trokarmetastasen (Allendorf 1995, Bouvy 1996, Mathew 1996, Jacobi 1998b). Dabei war das Tumorwachstum nach gaslosen Laparoskopien geringer als nach konventionellen Laparoskopien oder Laparotomien.

Es gibt überdies Hinweise darauf, dass eine Kohlendioxidatmosphäre bzw. ein erhöhter Umgebungsdruck die für die Metastasenentwicklung wesentlichen Vorgänge Proliferation, Adhäsion und Invasion begünstigen könnte durch direkte Wirkung auf die Tumorzellen (Jacobi 1997c, Basson 2000, Puttick 1999b). Wildbrett et al. zeigten in diesem Zusammenhang, dass peritoneale Azidose und lokale Hypoxie während eines Pneumoperitoneums mit Veränderungen des intrazellulären Ca²⁺-Stoffwechsels einhergehen, die Einfluss nehmen könnten auf essentielle Zellfunktionen wie Proliferation und Apoptose (Wildbrett 2002 ).

Die Auswirkungen des Pneumoperitoneums auf das Peritoneum und die Mechanismen des intraperitonealen Tumorwachstums sind noch nicht abschließend geklärt. Auch wenn man – den Ergebnissen dieser Studie folgend – davon ausgeht, dass ein Pneumoperitoneum keine rasterelektronenmikroskopisch erkennbaren Veränderungen des Mesothels verursacht, ist nicht auszuschließen, dass diese operative Technik Veränderungen der Expression von Adhäsionsmolekülen, der Ausschüttung von Zytokinen oder der lokalen Immunabwehr herbeiführt, die eine Absiedlung von Tumorzellen begünstigen könnten. Ein in diesem Zusammenhang bisher nicht ausreichend berücksichtigter Faktor könnte ein erhöhter Gasfluss während des Pneumoperitoneums sein.

Offensichtlich ist eine adäquate chirurgische Technik und die Einhaltung chirurgisch – onkologischer Prinzipien am ehesten geeignet, um eine Tumorzellverschleppung und Metastasierung zu verhindern. Weiterhin hatten im Rahmen von Studien die Instillation antiadhärenter und zytotoxischer Substanzen zur Verringerung der Metastasen geführt und sind zum Teil bereits im klinischen Einsatz (Jacobi 1999a). Der Einfluss des Pneumoperitoneums auf das intraperitoneale Tumorwachstum sowie die Entstehung von Trokarmetastasen und deren Pathomechanismen sind noch nicht endgültig geklärt und bedürfen weiterer Erforschung. Ob laparoskopische Verfahren in der Tumorchirurgie zu einer erhöhten Rate von Lokalrezidiven führen und inwieweit sie Vorteile gegenüber der konventionellen Chirurgie bieten, ist zur Zeit Gegenstand prospektiver randomisierter Studien, deren Ergebnisse hier abgewartet werden müssen.