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Anhang A.

A.1 Materialien und Geräte für die Untersuchung

A.1.1 Laborgeräte und Instrumente

• 96-well Mikrotiterplatten (Nunc GmbH Deutschland, Wiebaden)
• Eppendorf Multipette^® (Eppendorf, Berlin)
• Eppendorf Zentrifuge 5415c (Eppendorf, Berlin)
• Gefrierschrank (-20°C) (Liebherr)
• Gefrierschrank (-80°C)
• Greiner-Röhrchen (Greiner, Nürtlingen)
• Inkubator Heraeus VT 5042 EK (Heraeus Holding GmbH, Hanau)
• Kühlschrank (4°C) (Liebherr)
• Lagerungskästen für Greiner-Röhrchen (Greiner, Nürtlingen)
• Multikanalpipette (Capp, Dänemark)
• Pipettenspitzen (R. Brand GmbH & Co, Wertheim)
• Satorius Analysewaage (Satorius GmbH, Göttingen)
• Schüttler IKA MTS 4 (IKA Labortechnik, Staufen i. Br.)
• Spektralphotometer Dynatech MR 7000 (Dynatech, Denkendorf)
• Waschautomat Dynatech MR 7000 (Dynatech, Denkendorf)
  

A.1.2 Puffer

• Proben - Verdünnungspuffer:
  PBS + 150mM NaCl (= 0,766 g/l)
• Lektinassay - Puffer
  PBS
  + 150 mM NaCl/l
  + 0,05 mM CaCl₂/l
  + 0,1 mM MnCl₂/l
  + 2,0 mM MgCl₂/l
  

  ---

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  + 0,025 mM ZnCl₂/l
  + 0,2%TWEEN (Sigma Biochemica, Deisenhofen)
• Wasch - Puffer:
  PBS + 0,05% TWEEN (Sigma Biochemica, Deisenhofen)
• Phosphatpuffer (PBS) für Beschichtung:
  1,2g KH₂PO₄ + 8,22g Na₂HPO₄ / l , pH=7,6

A.1.3 Lektine

• Biotinylierte pflanzlichen Lektine (Sigma Biochemica, Deisenhofen & Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim)
  Die jeweilige Bindungsspezifität ist der Tabelle 4, die zur Beschichtung verwendeten Glykokonjugate und Standards sind der Tabelle 5 zu entnehmen.
  

A.1.4 Standards und Beschichtungen

• BSA--Mannopyranosid (Sigma Biochemica, Deisenhofen)
• BSA-Fukosylamid (Sigma Biochemica, Deisenhofen)
• BSA-Galaktosamin (Sigma Biochemica, Deisenhofen)
• BSA-Galaktose-1,3-N-Acetyl-Galaktosamin (Janssen Biochemica, Beerse, Belgien)
• BSA-N-Acetyl-Galaktosamin (Sigma Biochemica, Deisenhofen)
• Fetuin (Sigma Biochemica, Deisenhofen)
• Fukose (Sigma Biochemica, Deisenhofen)
• Kontrolle (Ansatz für 30ml)
  -Methyl-Mannopyranosid 15mmol (87,39 mg)
  N-Acetyl-Galaktosamin 10mmol (66,36 mg)
  Methyl--Galaktopyranosid 15mmol (87,39 mg)
  Fucose 25mmol (123,15 mg)
  N-Acetyl-Neuramin-Laktose 1:60 (500µl)
  Mannan 1:3000 (10µl)
  N-Acetyl-Glukosamin 30mmol
  Kontrollserum (Albumin) 1:20000 1,5µl
  + 29 584 µl steriles Aqua dest
• Mannan (Sigma Biochemica, Deisenhofen)

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• Methyl--D-Galaktopyranosid (Sigma Biochemica, Deisenhofen)
• Methyl--Mannopyranosid (Sigma Biochemica, Deisenhofen)
• Muzinpräparation
• N-Acetyl-Galaktosamin (Sigma Biochemica, Deisenhofen)
• N-Acetyl-Glukosamin (Sigma Biochemica, Deisenhofen)
• N-Acetyl-Neuramin-Laktose (Sigma Biochemica, Deisenhofen)
• N-Acetyl-saures-Glykoprotein (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim)

A.1.5 Färbung

• Tetramethylbenzidin (TMB) - Färbepuffer
  1% TMB-Substrat in GALLATI-Puffer
  
  TMB-Substrat:
  240mg TMB + 5 ml DMSO (Dimethyl-Sulfon-Oxid) + 5ml Ethanol
  (Fluka-Chemie, Buchs, Schweiz)
  GALLATI-Puffer:
  8,4g Zitronensäure-Monohydrat auf 160ml Aqua dest. mit 4N KOH auf ph-Wert 3,95 einstellen und auf 200 ml mit Aqua dest. auffüllen. Zur Fertigstellung 68 µl 30%tiges H₂O₂ dazugeben (in dunkler Flasche ca. 3 Wochen im Kühlschrank lagerbar).
• Streptavidin, gekoppelt mit Peroxidase als sekundäres Konjugat: (Calbiochem Corporation, La Jolla, USA)

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