Jancke , Mathias: Speichelglykane als Adhäsionsfaktoren bei rasch fortschreitender Parodontitis

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Kapitel 1. Einleitung

1.1 Ätiologie der Parodontitis

Als Parodontopathien werden allgemein die entzündlichen Erkrankungen des Zahnhalteapparates bezeichnet. Mit Ausnahme der Gingivitis, die ohne irreversible Folgen am Parodont über Jahre bestehen kann, führen diese Erkrankungen zu einem Abbau des alveolären Knochens und der desmodontalen Fasern. Dies führt im fortgeschrittenen Stadium zu Zahnlockerung und Zahnverlust ( 131 ).
Die Erkenntnis über die entzündliche Natur der Erkrankungen drückt sich aus in dem Wandel der Krankheitsbezeichnung von Parodontose, wie sie in der deutschen Bevölkerung noch weit verbreitet ist, zu Parodontitis, der heute gültigen klinischen Bezeichnung.
Trotz aller wissenschaftlichen Bemühungen der letzten Jahrzehnte ist Parodontitis eine Erkrankung mit unvollständig geklärter Ätiologie ( 47 ). Obwohl bereits der arabische Arzt Rhazas (850 - 923 v. Ch.) in seiner Abhandlung Albucasis (963 - 1013 v. Ch.) eine Beziehung zwischen Parodontitis und mikrobiellen Ablagerungen auf Zähnen herstellte und Fouchard 1728 und Pasch 1767 die Reinigung der Zähne als Parodontaltherapie empfohlen hatten ( 117 ), wurde der Zusammenhang zwischen entzündlichen Erkrankungen der zahntragenden Strukturen und bakteriellen Belägen erst vor 30 Jahren durch die klassische Studie von Löe et al. im heutigen Sinne der Wissenschaft bewiesen ( 90 ). Daraus entwickelte sich die unspezifische Plaquehypothese, die eine rein quantitative Veränderung der Plaque für die destruktiven Prozesse am Zahnhalteapparat verantwortlich macht ( 148 ). Sie ist Grundlage der heute noch gängigen Therapie der Parodontitis, nämlich der möglichst vollständigen Beseitigung bakterieller Beläge. Gestützt wird diese These von Untersuchungen, in denen Therapieerfolge mit der Intensität unspezifischer Kontrolle der Plaque korrelieren. Die Schwere des klinischen Erscheinungsbildes der Parodontitis geht bereits nach der einleitenden Hygienephase der Parodontaltherapie signifikant zurück ( 96 ).
Die regelmäßige professionelle Plaquekontrolle und optimale häusliche Mundhy


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giene nach erfolgter Parodontaltherapie ist für den Langzeiterfolg von entscheidender Bedeutung ( 89 ). Für die Mehrzahl der Fälle ist das absolut zutreffend. Viele, wenn auch nicht alle Patienten, reagieren auf eine konservative Behandlung durch Skaling und Wurzelglättung sehr gut, besonders in Kombination mit der Gabe eines Breitspektrumantibiotikums ( 107 ).
Es lassen sich jedoch nicht alle an Parodontitis erkrankten Individuen, selbst bei optimaler Nachsorge und Mundhygiene, zu einem dauerhaften Behandlungs-erfolg führen ( 93 ). Eine Minderheit von Fällen, in denen die gängige Therapie nicht erfolgreich ist, ließ Zweifel an der Allgemeingültigkeit der unspezifischen Plaquehypothese aufkommen. Es gibt bisher keine Indikatoren, mit denen vor Behandlungsbeginn auf eine konservative Therapie nicht ansprechenden Fälle identifiziert werden könnten ( 108 ). Therapie-refraktäre Fälle, Formen von besonderem Schweregrad (RPP) und solche mit einem festen Verteilungsmuster der Läsionen (juvenile Parodontitis) wurden zum Gegenstand intensiver Forschung. Die akuten Entzündungen in der rasch fortschreitenden Parodontitis wie auch die typischen Läsionen bei der juvenilen Parodontitis ließen sich statistisch nicht mit der Anhäufung bakterieller Plaque in Verbindung bringen.
Auf der Suche nach dem Auslöser der mit schnellem Alveolarknochenabbau verlaufenden akuten Schübe wurden bei mikrobiologischen Untersuchungen von Plaqueproben einige Bakterienspezies häufiger oder in erhöhter Zahl in der Mikroflora der befallenen Zahnfleischtaschen gefunden.
Darauf basierend entwickelte sich die spezifische Plaquehypothese, die eine qualitative Veränderung der Plaque und das Überwuchern von parodontalpathogenen Keimen als Auslöser der entzündlichen Reaktion verantwortlich macht ( 143 ). Auf der Grundlage der spezifischen Plaquehypothese entwickelte sich eine intensive Erforschung der oralen Mikroflora und prädisponierender Wirtsfaktoren. Quantitative Verteilungsmuster verschiedener Bakterienspezies in parodontalen Läsionen führten zu der Annahme, daß man nicht mit nur einer Krankheit zu tun habe, sondern mit mehreren verschiedenen Erkrankungen mit unterschiedlicher Ätiologie und Wirtsantwort ( 46 ). Für die juvenile Parodontitis wurde sogar von

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einer Infektion mit einem spezifischen Erreger (Actinobacillus actinomycetemcomitans) gesprochen ( 137 ).
Der schubweise Verlauf des destruktiven Prozesses ist vermutlich Ausdruck einer Interaktion von Mikroflora und Wirtsabwehr, die um einen labilen Gleichgewichtszustand schwankt. Milieuveränderungen in der Zahnfleischtasche führen zu einer überdimensionalen Vermehrung parodontalpathogener Keime, die eine heftige Abwehrreaktion des Gewebes auslöst. Neben der Reduktion der auslösenden Mikroorganismen findet durch sie auch eine Zerstörung des umliegenden Gewebes statt ( 139 ). Nach Einstellung eines neuen Gleichgewichtes sind im reparativen Prozess die epithelialen Gewebestrukturen durch eine größere Wachstumstendenz im Vorteil. Die Gingiva wächst an der Zahnwurzel entlang dem Desmodont entgegen und beschränkt damit den Knochen in seiner Defektfüllungstendenz. Eine Vertiefung der Tasche ist die Folge.
Unterschiedliche Taschentiefen bedeuten eine Bandbreite von verschiedenen ökologischen Milieus, die einer entsprechenden Vielzahl bakterieller Spezies in ihren Anforderungen gerecht werden können. Dies erhöht die Anzahl möglicher bakterieller Interaktionen und damit die Wahrscheinlichkeit, daß Pathogenitätsfaktoren zur Ausprägung und Wirkung kommen ( 138 ). Untersuchungen an therapie-refraktären Fällen ergaben das gehäufte Auftreten oder die Persistenz einzelner oder mehrerer parodontalpathogener Keime, die sich durch eine auf den speziellen Keim abgestimmte Antibiotikatherapie eliminieren ließen ( 136 ). Neuere Therapieformen wie die systemische und neuerdings auch die lokale Anwendung von Antibiotika als Adjuvantien zur instrumentellen und chirurgischen Therapie tragen diesen Erkenntnissen Rechnung ( 43 , 112 , 136 ).
Bei der durch konservative Therapie erfolgten Reduktion der Gesamtzahl der Keime werden natürlich auch die Parodontalpathogene erreicht. Durch regelmäßige häusliche Mundhygiene wird der Aufbau der Plaque bereits in einem Stadium unterbrochen, das von grampositiven Keimen dominiert ist. Dadurch besteht die Chance, daß sich eine mit gesunden Verhältnissen assoziierte Mikroflora etabliert und die ökologische Nische besetzt. Dies verhindert oder

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verzögert das Auftreten einer Reinfektion mit parodontalpathogenen Keimen und damit eines Rezidivs.
Folgerichtig zielen heutige Therapieansätze in der Parodontologie nicht mehr so sehr auf die chirurgische Elimination der Zahnfleischtaschen sondern auf die Herstellung und Erhaltung eines ökologisch vorteilhaften Milieus auch in den vorhandenen Defekten.

1.1.1 Bakterielle Aspekte

Gemeinsam ist allen Formen von Parodontitis und den Gingivitiden, daß sie durch bakterielle Besiedelung ausgelöst werden, die als Folge der Invasion von Mikroorganismen und/oder deren Produkten in das Wirtsgewebe eine Abwehrreaktion auslöst.

1.1.1.1 Plaquebildung

Die Bildung einer ausgereiften Plaque auf einer gereinigten Zahnoberfläche beginnt mit der Adsorption von Speichelglykoproteinen. Die durchschnittliche Dicke dieser Schicht, des Pellikels, erreicht nach 2 Stunden eine Stärke von ca. 100 nm und etwa 400 nm nach 24 - 48 Stunden ( 86 ). Sie enthält Amylase, saure und glykosylierte Prolin-reiche Proteine (PRP‘s), Statherine und Histatine. Hinzu kommen Proteinfragmente, die aus proteolytischer Aktivität des Speichels resultieren ( 58 ). Auf diesem Pellikel siedeln zuerst vorwiegend grampositive Kokken und in geringerer Anzahl grampositive Stäbchen. Der Anteil grampositiver Bakterien an der initialen Plaque beträgt 90 %. Die Streptokokken stabilisieren die frühe Plaque durch Produktion von extrazellulären Polysacchariden, die als Matrix und als Nahrungskohlenhydrate dienen.
Wird die Plaquebildung nicht durch Mundhygienemaßnahmen gestört, wächst die Gesamtzahl der Keime und es verschiebt sich bereits innerhalb der ersten zwei Tage das Spektrum der Mikroflora hin zu einem größeren Anteil an gramnegativen Kokken und Stäbchen. Am dritten und vierten Tag dieser klassischen Studie ( 90 ) wurden vermehrt Fusobakterien und filamentförmige Bakterien


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gefunden. Am 5. bis 9. Tag kommen Spirillen und Spirochäten hinzu, so daß das komplexe Bild einer etablierten Plaque erreicht ist. Nach ca. 7 Tagen beträgt der Anteil grampositiver Kokken und Stäbchen nur noch 50 % ( 147 ). Durch das Dickenwachstum der Plaque entstehen sich in Sauerstoff- und Substratangebot unterscheidende Milieubereiche, die verschiedenen bakteriellen Spezies optimale Lebensbedingungen bieten.
Mit den Mechanismen des Aufbaus der dentalen Plaque haben sich zahlreiche Studien beschäftigt. Insbesondere die Adhäsion an orale Strukturen und die Koaggregation der Mikroorganismen rücken dabei in den Vordergrund. So fand Gibbons ( 40 ) eine hohe Affinität bestimmter Bakterienstämme an PRPs, zu denen Actinomyces, Bacteroides und einige Stämme von Steptokokkus mutans gehören. Eine hohe Selektivität der beteiligten Adhäsine kommt dadurch zum Ausdruck, daß innerhalb einer Spezies bestimmte Stämme adhärieren können, andere dagegen nicht. Interessanterweise binden einige Bakterien nur an PRPs, die an Hydroxylapatit adsorbiert sind, nicht aber an gelöste. Offensichtlich bewirkt die Adsorption der Moleküle eine Konformationsänderung und legt versteckte Bindungsstellen frei, von Gibbons „Cryptitope“ genannt. Ein anderes Beispiel für die Komplexität der Vorgänge ist die Wirkung von Neuraminidase auf das Adhäsionsverhalten unter anderem von Bakterien wie Eikenella corrodens, Fusobakterium nucleatum und Bacteroides intermedius, die als Parodontalpathogene angesehen werden. Diese Bakterien besitzen eine relativ verbreitete Spezifität für Galaktosylreste, die auf Erythrozyten, epithelialen Zellen und experimentellen Pellikeln durch Sialinsäuren verdeckt sein können und daher erst nach einer Behandlung mit Neuraminidase freigelegt werden. Der verstärkende Effekt von Neuraminidase auf die Adhärenz ist ein sicheres Indiz für die Bedeutung von desialylierten Kohlenhydraten bei der Interaktion. Enzyme vermutlich bakteriellen Ursprungs wie Proteasen ( 157 ) und Glykosidasen ( 99 ) inklusive der Neuraminidase kommen in Individuen mit Periodontitis und/oder schlechter Mundhygiene in höherem Maße vor als in gesunden Kontrollen.
Die Bindung von in Puffer gelösten Porphyromonas (früher Bacteroides) gingiva

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lis, ein mit rasch fortschreitender Parodontitis assoziierter Keim, an Erythrozyten und buccale epitheliale Zellen wird durch Speichel unterbunden. Derselbe Keim bindet auch an Actinomyces spp., was nicht von Speichelbestandteilen inhibiert werden kann. In einem in vivo Experiment konnte eine große Anzahl von Porphyromonas gingivalis 60 Minuten nach Gabe der Bakterien nur von plaquebe-deckten Flächen isoliert werden, nicht jedoch von vorher gereinigten Arealen. Ein früheres Experiment mit Bacteroides melanogenicus zeigte das gleiche Ergebnis ( 39 ). Offensichtlich hat die vorhandene Plaque einen starken Einfluß auf die Kolonisation durch nachfolgende Spezies.
In dem Versuch, Vorgänge bei dem Aufbau der Plaque zu entschlüsseln, setzen sich mehrere Arbeiten mit dem Koaggregationsverhalten von Plaquebakterien auseinander. Eine gute Übersicht über die vielfältigen Interaktionen zwischen den beteiligten Spezies, unter denen Fusobakterium nucleatum eine pluripotente Mittlerrolle einnimmt, findet sich bei Kolenbrander ( 70 ). Die mögliche Erklärung für das primäre Wachstum einer Schicht grampositiver Streptokokken auf dem Pellikel ist die Fähigkeit dieser Bakteriengruppe zur Koaggregation innerhalb der Spezies, die von keiner anderen Art geteilt wird. Alle anderen getesteten Spezies sind in der Lage, mit anderen Bakterien zu koaggregieren, nicht jedoch mit solchen der eigenen Art ( 69 ).

1.1.1.2 Parodontalpathogene

Im zentralen Interesse der mikrobiologischen Erforschung der Mundhöhle steht die Isolierung von pathogenen Keimen aus der äußerst komplexen lokalen Mikroflora. Aus parodontalen Läsionen läßt sich gegenüber nicht pathologisch veränderten Bereichen auch innerhalb eines Individuums eine veränderte Plaquezusammensetzung isolieren ( 143 ). Die Populationen folgen einem Gradienten in den von ihnen geforderten Lebensbedingungen ( 91 ). So finden sich entsprechend der Milieuveränderungen von der offenen Mundhöhle hinein in den Sulcus gingivalis gehäuft Anaerobier und gramnegative Erreger ( 28 ), unter denen einige mit großer Wahrscheinlichkeit an der Auslösung der Erkrankung beteiligt sind.


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Die Hinweise gehen aber nicht in Richtung einer spezifischen Infektion im Sinne Kochs, sondern machen eine Mehrzahl von Bakterien mit verschiedenen Pathogenitätsfaktoren für die Knochendestruktionen verantwortlich: Actinobacillus actinomycetemcomitans, Fusobakterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia (früher Bacteroides intermedius), Camphylobacter rectus (früher Wolinella recta), Eikenella corrodens, Bacteroides forsythus, Spirochäten und Treponema spp. u. a. werden mit parodontalen Erkrankungen in Verbindung gebracht ( 160 ). Sie sind an der Zusammensetzung der subgingivalen Plaque in aktiven Taschen zu einem höheren Prozentsatz beteiligt als in nicht aktiven Taschen, wohingegen andere Bakterien (Streptococcus sanguis, Streptococcus mitis, Actinomyces spp.) mit inaktiven Taschen assoziiert werden und ihnen eine möglicherweise protektive Wirkung zugesprochen wird ( 27 ). In verschiedenen Formen der Parodontitis werden unterschiedliche Keime regelmäßig gehäuft gefunden. So wird Actinobacillus actinomycetemcomitans eine Hauptrolle in der juvenilen Parodontitis zugeschrieben während in der RPP Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola und Spirochäten gehäuft gefunden werden. Das Vorkommen von Aa scheint aber auch in therapierefraktären Fällen der Erwachsen-enparodontitis eine Rolle zu spielen.
Die Einordnung einer Spezies als parodontalpathogen und die Definition ihrer Rolle bei der Initiierung der Erkrankung stößt auf vielfältige Probleme. So werden alle verdächtigen Spezies auch in der Mundhöhle nicht erkrankter Personen und in nicht aktiven Taschen erkrankter Personen gefunden. Daher besteht die Vermutung, daß eine kritische Anzahl an Pathogenen überschritten sein muß, bevor die pathogene Wirkung auftritt, wobei diese Schwelle je nach Abwehrlage des Wirts verschieden hoch liegen kann. In Abhängigkeit von der Taschentiefe und den daraus resultierenden Milieufaktoren könnten bei demselben Individuum unterschiedliche Spezies nachgewiesen werden. Eine Vielzahl von mikrobiologischen Verfahren wird angewandt, um Plaqueproben zu untersuchen, wodurch Ergebnisse nicht vorbehaltlos miteinander vergleichbar sind. Keine dieser Methoden ist bisher in der Lage, sämtliche in einer Probe befindlichen Spezies zu

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identifizieren. Je feiner die Methoden zur Identifikation einer Spezies werden, desto häufiger lassen sich Subspezies oder verschiedene Genotypen herausarbeiten, deren Pathogenität unterschiedlich sein kann ( 102 ).
Ein weiteres Problem stellt die Milieuveränderung dar, die mit der Entzündung in einer Läsion einhergeht. Manche Spezies finden erst dadurch die zu ihrer Vermehrung und/oder Ausprägung von Pathogenitätsfaktoren notwendigen Bedingungen, werden folglich gehäuft in diesen Läsionen gefunden und möglicherweise fälschlich als Initiatoren der Entzündung angesehen. Hinzu kommt, daß Interaktionen von verschiedenen Spezies symbiotischer oder hemmender Natur bis zur Übertragung von Pathogenitätsfaktoren die möglichen Wirkungen einzelner Spezies potenzieren und zwar mit jeder weiteren beteiligten Spezies um ein Vielfaches. Einen Überblick über die Schwierigkeit, die tatsächliche Rolle einer bakteriellen Spezies in der Ätiologie von Parodontopathien zu determinieren, haben Socransky und Haffajee gegeben ( 138 ).

1.1.2 Wirtsfaktoren.

Auf der Suche nach prädisponierenden Faktoren für die Entwicklung einer Parodontitis wurden unterschiedliche Funktionsdefekte der zellulären Abwehr gefunden. Dies betrifft vor allem die früh einsetzenden und fulminant verlaufenden Formen. Systemische Erkrankungen, die mit generalisierten Defekten des Immunsystems vergesellschaftet sind, wie der juvenile Diabetes mellitus und die erworbene Immunschwäche AIDS, gehen häufig mit einer schweren Parodontitis einher. Erbliche Dysfunktionen des Phagozytensystems, die bei Down-Syndrom, Chediak-Steinbrinck-Higashi-Syndrom und des Papillon-Lefèvre-Syndrom auftreten, sind auffallend häufig mit sehr früh einsetzenden und fulminant verlaufenden Parodontopathien assoziiert ( 38 ).
Für die juvenile Parodontitis sind eine Reihe von Funktionsstörungen der phagozytierenden Zellen beschrieben worden. In 70 -75 % der Fälle ist die chemotaktische Antwort der neutrophilen Granulozyten reduziert. Die Monozyten sind zu einem geringeren Anteil ebenfalls betroffen ( 2 , 22 , 84 , 154 , 155 ). Die Bakterien


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phagozytose durch neutrophile Granulozyten ist bei den meisten Patienten mit juveniler Parodontitis ebenfalls eingeschränkt ( 22 , 154 ). Für diese Form der Parodontitis wird eine erbliche Disposition diskutiert. Sie tritt familiär gehäuft auf. Eine x-chromosomal dominante wie eine autosomal rezessive Vererbung kommen in Frage ( 11 , 15 , 128 ).
Unter den Merkmalen der rasch fortschreitenden Parodontitis, wie Page und Schroeder sie zusammenstellten, werden unter anderem Funktionsdefekte der neutrophilen Granulozyten und der Makrophagen angeführt ( 108 , 109 ). In den Fallstudien, die Page et al. 1983 mit dem Ziel veröffentlichten, die RPP als eigene Entität zu etablieren, wird das klinische Bild dieser Form der Parodontitis geschildert und durch Laborparameter ergänzt. Gefunden wurde eine anormale Chemotaxis der neutrophilen Granulozyten. Diese reagierten entweder verstärkt oder reduziert. Wie bei der juvenilen Parodontitis können auch die Makrophagen betroffen sein, wobei kein Patient Defekte in beiden Zelltypen hatte. Angesichts der sehr unterschiedlichen Abweichung vom normalen Verhalten der untersuchten Zelltypen und der sehr geringen Zahl der untersuchten Probanden stellt sich hier die Frage der Aussagefähigkeit dieser Angaben. Die allgemeinen Anamnesen der Patienten ergaben keine Auffälligkeiten, wie sie bei generalisierten Dysfunktionen des Phagozytensystems zu erwarten wären. Die Untersuchung auf Antikörper gegen Porphyromonas gingivalis und Actinobacillus actinomycetemcomitans ergab erwartungsgemäß bei allen Patienten hohe Titer gegen eine von beiden oder beide Spezies ( 108 ). Eine Arbeit aus unserer Klinik konnte keine signifikanten Unterschiede in der Freisetzung von Entzündungsmediatoren durch Gewebsmakrophagen bei RPP-Patienten im Vergleich zur Kontrollgruppe feststellen ( 79 ).

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1.2 Speichel

Die Funktion der Speicheldrüsen des Menschen besteht in der Bildung eines kompliziert zusammengesetzten Sekretes, das eine Reihe wesentlicher Aufgaben für den Gesamtorganismus erfüllt. Der Speichel besteht zu mehr als 95% aus Wasser, sein spezifisches Gewicht ist 1050. Seine Funktionen bestehen in der Pufferung des pH-Wertes der Mundhöhle, Remineralisierung der Zähne, Emulgation und enzymatischer Spaltung von Nahrung, Befeuchtung und Erhalt der Elastizität der Schleimhaut sowie Schutz vor pathogenen Mikroorganismen. Diese Aufgaben werden von einer Vielzahl in den Speichel sezernierter Stoffe erfüllt.

1.2.1 Speichelproteine

Es können heute etwa 25 bis 35 verschiedene Proteine in stimuliertem Speichel gefunden werden (150 bis 264mg Protein/ 100ml Speichel), von denen der größte Bestandteil Prolin-reiche Proteine (PRP's) und Amylase sind ( 4 ). Amylase besteht aus zwei Isoenzymen, einer glykosylierten Form und einer Form, die keine Kohlenhydrate enthält ( 94 ). Amylase ist durch die Spaltung der alpha-(1-4)-glykosidischen Bindung von Stärke, Glykogen und anderen Glukosepolymeren an der Nahrungsverdauung beteiligt. Prolinreiche Proteine und das kleine Protein Statherin verhindert eine Präzipitation von Kalzium in den Ausführungsgängen der Speicheldrüsen. Sie sorgen damit für eine Übersättigung des Speichels mit Kalzium, der dem Zahnschmelz zur Remineralisation zur Verfügung steht ( 48 ). Lysozym (syn. Muramidase) ist ein bakterizid wirkendes körpereigenes Abwehrprotein, das zur Lyse grampositiver Bakterien führt, indem es das in deren Zellwand vorkommende Murein spaltet. Gramnegative Bakterien, denen dieser Zellwandbestandteil fehlt, werden von Lysozym nicht angegriffen ( 57 ).


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1.2.2 Glykoproteine des Speichels

Die im Speichel vorkommenden Glykoproteine lassen sich in folgende Gruppen einteilen:
Solche, die jeweils eine selbstständige Glykoproteingruppe darstellen:

Solche, die zur Gruppe der serösen Glykoproteine gehören mit geringerem Molekulargewicht, N-glykosidischer Bindung und einem hohen Anteil an Mannose:

Schließlich die Gruppe der mukösen Glykoproteinen mit hohem Molekulargewicht, überwiegend O-glykosidischer Bindung und geringem Anteil an Mannose, die

Die Glykoproteine haben verschiedene sich teilweise überlappende Funktionen, von denen hier die antibakteriellen Funktionen genannt werden sollen.
Laktoferrin wirkt bakteriostatisch, indem es das für viele Bakterien essentielle Eisen mit hoher Affinität bindet ( 18 ). Allerdings findet dieser Effekt seine Grenze in der Absättigung des Laktoferrins mit Eisenatomen ( 45 ).
Unter Mitwirkung des im Speichel vorkommenden Enzyms Laktoperoxidase wird Thiocyanat mit H202 zu Hypothiocyanat umgesetzt ( 52 ). Dieses Endprodukt des antibakteriellen Systems ( 145 ) behindert den Metabolismus der Mikro


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organismen, indem es Enzyme der Glykolyse und des Kohlenhydrattransportes hemmt. Für viele Mikroorganismen, unter anderem jene, aus deren Stoffwechsel das zur Reaktion notwendige H202 stammt, ist Hypothiocyanat direkt toxisch ( 146 ).
Die statistisch signifikanten Korrelationen zwischen der Konzentration der genannten Abwehrstoffe im Speichel und klinisch meßbaren Faktoren wie Gingivitis und Plaquemenge lassen allerdings nur auf einen Einfluß dieser Abwehrfunktionen von weniger als 10% an der Variation der klinischen Erscheinungen schließen ( 54 ).

Das sekretorische Immunglobulin A (sIgA) gehört zum spezifischen Immunsystem. Es besteht aus 2 IgA Molekülen, deren Fc-Enden durch eine J-Kette (15-16 kDa) über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Das sIgA hat durch seine dimere Form eine größere Stabilität gegenüber bakteriellen Proteasen als die monomeren Formen der Immunglobuline. Die antibakterielle Wirkung beruht vor allem auf der Bindung an spezifische Antigene und deren Agglutination ( 17 ).

Die hochmolekularen Muzine und prolinreichen Glykoproteine haben mit ihrem Kohlenhydratanteil großen Einfluß auf die Adhärenz von Mikroorganismen an orale Strukturen. Glykane stellen spezifische Rezeptoren für bakterielle Adhärenzmoleküle, sogenannte Lektine, dar. Nach Bindung an Hydroxylapatit wird eine Adhäsion von Bakterien an die Zähnen gefördert, während sie im Speichel gelöst die Lektine der Mikroorganismen besetzen. Dadurch wird eine Adhäsion der Keime an die Strukturen der Mundhöhle verhindert ( 144 ).
Die Muzine sind im Gesamtspeichel in zwei Hauptklassen vorhanden (MG 1 und MG 2), die hauptsächlich im submandibulären und sublingualen Speichel und den Sekreten der kleinen Speicheldrüsen gefunden werden. Die prolinreichen Glykoproteine werden überwiegend von der Parotis sezerniert. Alle bestehen aus einem Polypeptidgerüst mit Oligosaccharidseitenketten. Das Molekulargewicht und die Proportion von Peptid zu Kohlenhydratanteil variieren zwischen den Gruppen ( 30 ). Einige Charakteristika sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

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Tabelle 1: Aus Edgar 1992 ( 30 )

 

MG1

MG2

PRP

Relatives Molekulargewicht (kDa)

<103

200 - 500

40

Polypeptidanteil (%)

15

30

60

Kohlenhydratanteil (%)

75

68

30

Untereinheiten

Ja

Nein

Nein

Gebundenes Sulfat

Ja

?

Nein

Gebundenes Phosphat

Nein

?

Ja

Gebundene Sialinsäure

Ja

Ja

?

Blutgruppenaktivität

Ja

Ja

Nein


Muzine sind von Becherzellen oder submukösen Drüsenzellen gebildete Glykoproteine, deren Oligosaccharidseitenketten durch O-Glykan-Bindung an die Aminosäuren Serin oder Threonin an den Proteinanteil gebunden sind. Humane Muzine enthalten 70 - 85% Kohlenhydrate, 50 - 80% ihres Proteinanteils besteht aus nur fünf Aminosäuren in der relativen Mengenverteilung Threonin > Serin, Prolin > Glycin, Alanin. Damit unterscheiden sie sich sowohl im Kohlenhydratanteil als auch im Verhältnis der Aminosäuren von den Muzinen anderer Spezies ( 124 ). Die Glykokonjugate der mukösen Sekrete der Gl. sublingualis und der Gl. submandubularis sowie der meisten kleinen Speicheldrüsen liefern hohe Anteile an O-Gykanen, die charakteristischerweise keine Mannose enthalten und deren relativer Anteil an N-Acetylgalaktosamin (GalNAc) und Sialinsäure erheblich größer ist als bei den serösen Glykoproteinen ( 149 ). In den serösen Sekreten der Parotis überwiegen Glykokonjugate mit Kohlenhydratanteilen vom Typ der N-Glykane mit typischerweise hoher Konzentration von Mannose, endständigen Fukose- und Sialinsäureresten und wenig oder keinem N-Acetylgalaktosamin.
Der Syntheseweg der O-Glykane nach Kopplung eines GalNAc an Ser oder Thr ist sehr variabel. Immer scheinen jedoch sehr hochspezifische Enzyme an der Synthese der Oligosaccharide beteiligt zu sein.


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Im Gegensatz dazu ist der enzymatische Syntheseweg der N-Glykane von Hirschberg und Snider als ein komplexes Zusammenspiel von endoplasmatischem Retikulum (ER) und Golgiapparat eingehend beschrieben worden ( 51 ). Die Proteinkette wird an den Ribosomen des ER in das Lumen des ER hinein synthetisiert, wo Glc3Man9GlcNAc2 Oligosaccharide auf einen Asparaginsäurerest via Dolicholphosphat übertragen werden. Im Golgiapparat wird der Transport der Glycanreste in das Lumen von spezifischen Carriern bewerkstelligt ( 156 , 157 ). Nach en-bloc-Transfer des neugebildeten Glykoproteins im Golgiapparat ( 115 ) werden die N-Glykane vom High-Mannose-Typ (Mannose-reichen Typ) über einen Hybrid-Typ in einen Komplex-Typ umgewandelt. Die endständigen Glukosereste sowie nacheinander sechs der neun Mannosereste werden enzymatisch abgespalten, wobei intermediär oligomannosylhaltige Glykane (Hybrid-Typ) entstehen. An der verbleibenden Core-Region mit endständigen Mannoseresten werden durch die Glykosyltransferasen des Golgiapparates die zusammengesetzten Oligosaccharidstrukturen der Glykoproteine vom komplexen Typ synthetisiert. Die Untersuchung endständiger Kohlehydrate im Parotisgewebe verschiedener Säugetierspezies unter Verwendung spezifischer Lektine ergab Unterschiede sowohl zwischen den Arten als auch innerhalb einer Art, sowie auch unter den verschiedenen Gewebearealen innerhalb einer Drüse ( 1 ).

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Abbildung 1: Substitution von Mannose im Golgyapparat und Synthese komplexer Glykanstrukturen

1.2.3 Innervation der Speicheldrüsen

Für die Speicheldrüsen des Menschen ist gesichert, daß sowohl parasympathische als auch sympathische Nervenfasern an der Innervation beteiligt sind. Das präganglionäre Neuron der parasympathischen Fasern für die Gl. parotis (Ohrspeicheldrüse) liegt im Nucleus salivatorius inferior in der Rautengrube, dasjenige für die Gl. submandibularis (Unterkieferspeicheldrüse) und die Gl. sublingualis (Unterzungenspeicheldrüse) sowie für die kleinen Speicheldrüsen der Schleimhaut im Nucleus salivatorius superior. Die sekretorischen Fasern für die Gl. parotis verlassen mit dem N. glossopharyngeus das Rautenhirn und gelangen vom Ganglion petrosum als N. tympanikus über die Paukenhöhle in das Ganglion oticum. Von dort besteht eine Verbindung über den N. auriculotemporalis zur Gl. parotis.
Die Fasern für die anderen Drüsen aus dem Nucleus salivatorius superior ziehen


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weitgehend über die Chorda tympani an ihren jeweiligen Bestimmungsort. Namentlich für die Gl. sublingualis sind auch parasympathische Fasern aus dem N. hypoglossus gesichert. Diese aufgeführte nervale Versorgung ist nur grob schematisch. Variable zusätzliche Versorgungen über die Nn. facialis, glossopharygeus, vagus und hypoglossus haben eine individuell verschiedene Bedeutung für die parasympathische Versorgung ( 98 ).
Die sympathische Innervation nimmt ihren Ursprung vom Nucleus intermedius lateralis des Rückenmarks im Segment C 8 bis Th 1. Die Umschaltung auf das zweite Neuron erfolgt im Ganglion cervikale superius. Von hier ziehen sympathische Nervenfasern entlang der großen Halsgefäße zu den entsprechenden Kopfspeicheldrüsen.
Speichelfluß und Zusammensetzung stehen in Beziehung zu der Art der autonomen Innervation und Stimulation. Bei parasympathischer Stimulation ist das Volumen des Speichels pro Zeiteinheit sehr hoch, bei sympathischer Stimulation ist der zu erzielende maximale Speichelfluß im Vergleich zum Drüsengewebe relativ klein. Adrenerge Stimulation führt im Gegensatz zu cholinerger Stimulation zu einer erhöhten Ausscheidung von Glykoproteinen, Amylase und Saccharidmolekülen ( 98 ).
Unterschiede bestehen zwischen den Speicheldrüsen hinsichtlich der verschiedenen Protein- bzw. Glykoproteinfraktionen. Diese basieren auf den Anteilen von serösen bzw. mukösen Zellen im Drüsenparenchym. So wird Amylase in den serösen Acini produziert, und ihre Konzentration ist daher im Sekret der Gl. parotis etwa fünf Mal höher als in der Gl. submandibularis. Untersuchungen mit der Polyacrylamidgel-Elektrophorese ergaben mindestens vier verschiedene Isoenzyme in der Gl. Parotis, von denen nicht alle in der Gl. Submandibularis vorkommen ( 80 ).
Die mukösen Zellen der mandibulären Drüsen produzieren Glykoproteine, in deren Kohlenhydratanteil sich Blutgruppenstrukturen finden, während diese im Parotisspeichel praktisch nicht vorkommen. Eine Steigerung der Proteinsekretion unter beta-adrenerger Stimulation durch Isoproterenol findet in der Gl. submandibularis ebenso statt wie in der Parotis, wobei bei letzterer der relative

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Effekt zur Flußrate jedoch sehr viel größer ist. Ebenso ist der Gehalt an bestimmten anorganischen Anteilen unterschiedlich. Unter beta-adrenerger Reizung fallen die Sekretion von Kalium, Kalzium und Bikarbonat wesentlich höher aus als unter parasympathischer Stimulation. Mit einer Steigerung der Flußrate steigt der Gehalt an Natrium, Chlorid und Bikarbonat, Kalium fällt hingegen auf einen relativ konstanten Spiegel ab. Der Gehalt an Bikarbonat kann dabei beim Menschen deutlich über die Plasmakonzentration ansteigen ( 78 ). Die physiologischen Grundlagen der Speichelsekretion hat Yusuke Imai ausführlich zusammengestellt ( 53 ).

1.2.4 Steuerung der Glykoproteinsynthese

Es wurden vielfältige Versuche unternommen, um die Regulationsmechanismen der Glykoproteinsynthese und -sekretion aufzudecken. Die Gruppe um Kousvelari und Baum konnte in Studien an intakten Azinuszellen von Ratten zeigen, daß die erhöhte Aufnahme von 14C-markierter Mannose unter der Stimulation mit dem beta-adrenergen Agonisten Isoproterenol eine gesteigerte N-Glykosylierung widerspiegelt ( 76 ). In einem früheren Experiment unseres Labors an lebenden Ratten stellte sich heraus, daß nach der Injektion von verschiedenen Sekretionsstimulantien allein unter Isoproterenolwirkung eine signifikant höhere Konzentration terminaler Mannosylreste im Speichel nachgewiesen werden konnte ( 63 ). Die gesteigerte Glykoproteinproduktion unter der Wirkung von Isoproterenol beruht vermutlich auf der durch cAMP vermittelten Erhöhung der Synthese von Dolichol-gebundenen Oligosacchariden ( 105 ). An isolierten mikrosomalen Membranen konnte demonstriert werden, daß der Aufbau der primären Oligo-saccharidseitenkette im ER via Dolicholphosphat-gebundener Kohlenhydrate offensichtlich einer Neurotransmitter-abhängigen Steuerung von Schlüssel-glykosyltransferasen unterliegt, die die Kohlenhydratreste von ihren entsprech-enden Nukleotiden auf Dolicholphosphat übertragen ( 7 ). Gleichzeitig scheint die verstärkte Bereitstellung von Dolichol-Phosphat-Intermediaten mit einer gesteigerten Synthese des Polypeptidanteils der Glykoproteine einherzugehen, wie die Untersuchung mit (14C)Leucin-markierten Zellen ergab ( 105 ). Der durch


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Isoproterenol gesteigerte Einbau von (1-14C)-Glukosamin ließ sich nach Unter-brechung der Proteinsynthese unter der Wirkung von Cycloheximid nicht mehr auslösen ( 34 ). Der Vergleich der Ergebnisse aus den Versuchen mit Rattenzellen mit dem Verhalten von Zellen aus humanen Parotisbiopsaten erbrachte nur geringe Unterschiede, die darauf zurückgeführt werden, daß die Rattenzellen aus Inzuchtpopulationen stammten, während die humanen Zellen von verschiedenen nicht verwandten Individuen mit unterschiedlichen klinischen Diagnosen entnommen wurden ( 75 ).
Nach Langzeitgabe von Isoproterenol verringert sich die Gesamtproteinkonzen-tration sowie die Amylaseaktivität in Speichelproben, die nach Absetzen der Medikation entnommen werden. Dies ist vermutlich auf eine reaktive Reduzierung der beta-adrenergen Rezeptoren zurückzuführen ( 126 ). Die Verabreichung des beta-Adrenorezeptorblockers Propranolol über einen Monat führt zu einer Reduzierung der Gesamtproteinkonzentration im Speichel. Die Flußrate unter Stimulation mit Pilokarpin wird davon nicht beeinflußt. Gleichzeitig entsteht ein signifikant höheres Kariesrisiko, was auf einen verminderten Schutz der Zähne durch organische Speichelbestandteile zurückgeführt wird ( 104 ).

1.3 Adhäsion versus Antiadhäsion

Die Adhäsion von Bakterien an orale Strukturen findet in einem Mileu aus verschiedenen förderlichen und behindernden Faktoren statt. Mucosazellen und das Pellikel auf der Zahnoberfläche wie auch Bakterien sind negativ geladen und stoßen sich ab. Andere elektrodynamische oder van der Waal‘s Kräfte sind ihnen entgegen gerichtet ( 19 ). Zwischen den beteiligten Oberflächen stellt sich ein bestimmter Abstand ein, der von Kationen beeinflußt wird, die die negativen Ladungen umlagern. Ein saurer pH-Wert oder eine höhere Konzentration anderer Kationen wird den Abstand verringern, so daß Adhäsionsmoleküle in direkten Kontakt mit ihren Rezeptoren treten können ( 21 ). Es hat sich herausgestellt, daß Adhäsine auf Bakterien häufig als Bestandteile der Pili oder Fimbrien genannten Oberflächenfortsätze existieren, die aus der Glykokalix der Bakterien herausragen


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und den primär bestehenden Abstand zwischen den Zellen überbrücken können.
Wohl am besten charakterisiert sind die Typ-I-Fimbrien von E. Coli, die spezifisch an mannosehaltige Glykoproteine binden ( 133 ). Auf einigen E. Coli-Stämmen hat man sogenannte P-Fimbrien gefunden, die an ein für die Blutgruppe P kennzeichnendes Glykolipid binden. Es konnte gezeigt werden, daß Mädchen mit der Blutgruppe P ein signifikant höheres Risiko tragen, an von diesen E. Coli-Stämmen ausgelöster Pyelonephritis zu erkranken ( 92 ).
Des weiteren wurden M-Fimbrien auf der Oberfläche von bestimmten E. Coli-Stämmen entdeckt, die spezifisch für die Blutgruppe-M-Determinante im Glykophorin A sind, sowie S-Fimbrien, die Sialyl-alpha-(2 - 3) Galaktosyl-Strukturen auf menschlichen Erythrozyten erkennen, ( 101 ).
Eine Reihe von Arbeiten neueren Datums setzt sich mit der Adhäsion von vermutlich parodontalpathogenen Keimen auseinander. Anhand von Inhibitionstests werden die Bindungsspezifitäten der Bakterien charakterisiert, wobei immer wieder der lektinartige Bindungsmodus gefunden wird. Deutlich wird auch, daß verschiedene Stämme derselben Spezies unterschiedliche Affinitäten haben ( 106 , 158 ). Neben der Inhibition von Hämagglutination sowie Koaggregation und Adhäsion von Bakterien durch definierte Einzelzucker ist die diesbezügliche Wirkung von Speichel oder Speichelbestandteilen untersucht worden. Das ist für oralpathogene Keime von besonderer Bedeutung, denn der Speichel stellt in der Mundhöhle das Medium dar, in dem Adhäsion stattfindet und ihr förderlich sein oder sie behindern kann. Ebisu et al. extrahierten aus Sublingualis-/Submandi-bularisspeichel ein EcAF (Eikenella corrodens aggregating factor) genanntes 140 kDa Glykoprotein, dessen Wirkung auf E. corrodens sich durch GalNAc spezifisch hemmen läßt, das aber auch andere Bakterien GalNAc-unabhängig zu aggre-gieren in der Lage ist ( 29 ). Die Adhäsion von Eikenella corrodens an buccale epitheliale Zellen wird durch Behandlung der Zellen mit Neuraminidase gefördert, wohingegen sie durch Zugabe von D-Galaktose und GalNAc haltiger Kohlen-hydrate verhindert wird ( 162 ). Für einige der oral vorkommenden Stämme der Bacteroides-Gruppe wurde nachgewiesen, daß Speichel in der Lage ist, die

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Adhäsion dieser Bakterien an epitheliale Zellen zu unterbinden ( 106 ), nicht jedoch deren Bindung an Actinomyces und andere grampositive Plaquebakterien ( 135 ).
Jüngste Ergebnisse zeigen, daß der lektinartige Bindungsmodus auch für das Infektionsrisiko durch Viren eine Rolle spielt. Der Transport infektiöser HIV-1 Viren durch eine auf Filterpapier gezüchteten Schicht von humanen Epithelzellen konnte durch Inkubation mit hoch mannosehaltigen Glykanen sinifikant verringert werden. Verantwortlich für die Bindung des Hüllenglykoproteins 120 des HIV-1 Virus an humane epitheliale Zellen ist vermutlich dessen lektinartige Bindung an Oligomannosyl-Strukturen auf der Oberfläche der Epithelzellen ( 64 ).

1.3.1 Lektine

Lektine sind in der Natur weit verbreitete Proteine oder Glykoproteine. Man findet sie in Mikroorganismen, Pflanzen, wirbellosen Tieren und Wirbeltieren einschließlich der Säuger ( 41 ). Der Terminus “Lektin“ (lat: legere = auslesen) wurde erstmals von Boyd und Shapleigh ( 16 ) verwendet, um die Eigenschaft dieser Substanzen, Kohlenhydratstrukturen selektiv zu erkennen, zu dokumentieren ( 153 ).
Lektine bewirken durch Bindung an spezifische Glykanstrukturen die Agglutination von Zellen oder die Präzipitation von Glykokonjugaten ( 42 ). Aufgrund dieser Eigenschaften wurden Lektine zur Charakterisierung von Erythrozyten ( 60 ) und Lymphozyten ( 134 ) sowie auch zur Erkennung transformierter und Unterscheidung von nicht transformierten Zellen verwendet ( 121 ). Des weiteren fanden Lektine Anwendung in der mikrobiologischen Diagnostik ( 26 ).
Bereits 1888 stellte Hermann Stillmark fest, daß Samenextrakte der Pflanze Ricinus Communis die Agglutination von Erythrozyten bewirken ( 141 ). Er nannte den von ihm gefundenen Stoff Ricin und vermutete zutreffend, daß es sich dabei um ein Protein handelt. Er glaubte, damit den Grund für die Giftigkeit der Pflanze gefunden zu haben. Die Reaktion des Samenextraktes mit Erythrozyten ist jedoch nicht für dessen Giftigkeit verantwortlich ( 35 ), das Agglutinin der Pflanze ist nicht mit dem Toxin identisch.


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In der Folgezeit nannte man Erythrozyten agglutinierende Substanzen Hämagglutinine, Agglutinine oder, da sie aus Pflanzen gewonnen wurden, Phytoagglutinine. Prokop et al. prägten nach der Entdeckung eines Lektins in der Eiweißdrüse von Schnecken den Begriff „Protektin“ ( 119 ), da sie hinter dem Bindungsvermögen des Proteins eine Schutzfunktion vermuteten. Aufgrund des inzwischen bekannten Auftretens dieser Proteine auch bei allen anderen Arten von Lebewesen ist der Begriff des Lektins erheblich umfassender geworden ( 41 ). Die Definition von Goldstein et al., nach der Lektine Proteine oder Glykoproteine nicht immunen Ursprungs sind, die Zellen agglutinieren und/oder Glykokonjugate präzipitieren und mindestens zwei Bindungsstellen besitzen, wurde 1981 vom Nomenclature Commitee of International Union of Biochemistry übernommen ( 103 ). Die Spezifität eines Lektins wird gewöhnlich definiert durch Bezeichnung der Mono- oder Oligosaccharide, die lektininduzierte Agglutinations-, Präzipitations- und Aggregationsreaktionen hemmen ( 42 ). Saccharide, die unabhängig von ihrer Herkunft Lektine mit hoher Affinität binden, werden als Lektinrezeptoren bezeichnet.
Die Oligosaccharid-Lektin-Komplementarität konnte durch Vergleiche der Minimalkonzentration verschiedener Zucker, die zur Hemmung einer Agglutinationsreaktion oder der Hemmung der Präzipitation zwischen dem Lektin und einem reaktiven Molekül erforderlich waren, festgestellt werden. Die Bindung zwischen Lektin und Saccharid beruht vermutlich auf Wasserstoffbindungen zwischen dem anomeren Sauerstoff und Hydroxylgruppen der Zucker einerseits sowie Carboxylgruppen von Aminosäuren des Lektins andererseits. Hemmversuche mit Mono- und Oligosacchariden waren in der Regel übertragbar auf die Wechselwirkung von Lektinen mit komplexen Sacchariden, Glykopro-teinen und Glykolipiden. Die höhere Affinitätskonstante, die für die Bindung von Agglutininen an komplexe Strukturen nachgewiesen werden konnte, wurde auf multivalente Interaktionen zwischen Lektin und komplexen Sacchariden zurückgeführt ( 44 ). Eine Zusammenstellung der bekannten Lektine und ihrer Bindungsspezifitäten haben Wu et. al. vorgenommen ( 161 ).


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1.4 Arbeitshypothese

Die bis hierhin dargestellten Grundlagen waren Veranlassung, eine Versuchsanordnung zu entwerfen, mit der mögliche Unterschiede in der Speichel-glykosylierung von Patienten mit schwerer Parodontitis im Vergleich zu einer Gruppe parodontal gesunder Kontrollen untersucht werden konnten.
Da die Speichelbestandteile offensichtlich einen erheblichen Einfluß auf die Überlebenschancen von aufgenommenen Mikroorganismen in der Mundhöhle haben, könnten Unterschiede im Glykosylierungsmuster Hinweise auf auf eine Prädisposition für Erkrankungen der Mundhöhle geben.
Die antiadhäsive Wirkung des Speichels sollte dabei mit Hilfe der kompetitiven Bindung von Speichelglykokonjugaten an Pflanzenlektine gemessen werden, um die Blockierung bakterieller Adhäsine zu simulieren. Der Speichel sollte so weit wie möglich unter Anwendung nichtinvasiver Methoden nach den verschiedenen Speicheldrüsen getrennt gewonnen und dadurch vor möglichen postsekretorischen Modifikationen durch das Mundhöhlenmilieu geschützt werden.
Da von vielen Parodontologen akute Exazerbationen parodontaler Läsionen bei Patienten unter Streß beobachtet werden, war für uns die Veränderung des Glykosylierungsmusters der Probanden bei physiologischer adrenerger Stimulation von Interesse. Untersuchungen von Glykokonjugaten im Speichel von Tieren unter körperlicher Belastung mit dem beta-Sympathomimetikum Isoproterenol zeigten deutliche Veränderungen gegenüber dem unstimulierten Zustand. Diese Untersuchung sollte zeigen, ob das auch beim Menschen und unter physiologischer, also endogener adrenerger Stimulation, der Fall ist.


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Mon Mar 25 12:16:49 2002