Jancke , Mathias: Speichelglykane als Adhäsionsfaktoren bei rasch fortschreitender Parodontitis

Kapitel 2. Material und Methode

2.1 Auswahl der Probanden


28

Die Probanden stammten aus dem Patientenaufkommen der damaligen Abteilung für Parodontologie der Zahnklinik Nord der Freien Universität Berlin, jetzt Abt. für Parodontologie und Synoptische Zahnmedizin des Zentrums für Zahnmedizin des Universitätsklinikums Charité der Medizinischen Fakultät der Humboldt-Universität zu Berlin (Leiter Prof. Dr. Dr. J.P. Bernimoulin). Alle in die Studie aufgenommenen Testpersonen hatten sich in der Abteilung mit akuten Problemen auf Grund ihrer parodontalen Erkrankung vorgestellt. Es handelte sich entweder um Zahnlockerungen 3. Grades mit drohendem Zahnverlust oder um schmerzhafte Exazerbationen einer oder mehrerer parodontaler Läsionen. Diese waren mit starker Blutung auf Sondierung und/oder Pusentleerung bis zu parodontalen Abszessen begleitet. Nach der initialen Schmerztherapie wurden die Patienten in die erste Phase der Parodontaltherapie geführt, die aus mindestens zweimaliger supragingivaler Plaque- und Zahnsteinentfernung sowie Mundhygieneinstruktion und deren Kontrolle besteht. Danach wurde ein Parodontalstatus und ein Röntgenstatus erstellt. Anhand der nun vorhandenen Unterlagen wurden elf Patienten ausgewählt, bei denen nach enger Auslegung der Kriterien der Abteilung in Anlehnung an die Definition von Page et al ( 108 ) eine rasch fortschreitende Peridontitis vorlag. Die Auswahlkriterien waren der Umfang des Verlustes an Zahnhalteapparat im Verhältnis zum Alter des Patienten, das Verteilungsmuster der Destruktionen und das Erscheinungsbild der aktiven Läsionen. Zur Beurteilung der Destruktionen im Parodont wurden an jedem Zahn vier Meßpunkte (mesial, distal, vestibulär, oral) in die Wertung genommen. Die Weisheitszähne wurden nicht berücksichtigt.

Abbildung 2:Röntgenstatus einer 26 jährigen Patientin mit rasch fortschreitender Parodontitis

2.1.1 Minimalwerte

Bei einem 29-jährigen Patienten waren nur 17,6% der Meßpunkte mit 5 und mehr Millimetern Taschentiefe als eindeutig pathologisch eingestuft worden, die sich auf 10 von 27 Zähnen verteilten. Darunter fanden sich aber 4 Meßpunkte mit 9 mm und mehr verteilt auf zwei verschiedene Quadranten.
Im Falle einer 38-jährigen Patientin fand sich nur ein Meßpunkt mit 9 mm Tachentiefe, es wurden aber mehr als die Hälfte der Meßpunkte als pathologisch eingestuft und es waren alle 28 Zähne befallen. Darunter befanden sich 11 Meßpunkte mit 7 bis 8 mm Tiefe.
Diese beiden Beispiele zeigen, wie unterschiedlich die Verteilung der Destruktionen sein können. Im ersten Fall sind mehrere tiefe Knochenkrater in verschie


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denen Quadranten anzutreffen, die sich an kariesfreien ungefüllten Zähnen ohne jede prothetische Versorgung befinden. Die Defekte sind keinesfalls auf iatrogene Noxen zurückzuführen, was schon von sich aus den Verdacht auf eine rasch fortschreitende Form der Parodontitis lenkt. Solche Fälle findet man zwar auch in höherem Lebensalter, sie fallen aber dann laut Definition nicht mehr in die Gruppe der typischen RPP-Patienten. Im zweiten Fall sind die Destruktionen gleichmäßiger verteilt, was dem Bild einer fortgeschrittenen Erwachsenenparodontitis entspricht. Das Lebensalter der Patientin zusammen mit dem klinischen Bild der aktiven Läsionen gibt aber hier den Ausschlag für die Diagnose einer RPP.

2.1.2 Maximalwerte

Eine 36 Jahre alte Probandin hatte 63% der Meßpunkte mit mindestens 5mm, davon 18 Meßpunkte mit 7 bis 8 mm sowie 10 Meßpunkte mit mindestens 9 mm verteilt auf alle vier Quadranten. Alle 25 Zähne waren befallen. Bei einem 37 jährigen Patienten wurden 45,2 % der 104 Meßpunkte als pathologisch eingestuft, 17 davon waren 7 bis 8 mm tief. Insgesamt 13 Meßpunkte wurden mit 9 mm und mehr in 3 Quadranten gemessen. Von den 26 vorhandenen Zähnen waren nur 4 nicht befallen. Tabelle 2 gibt die bei den Probanden gemessenen Tiefen der Meßpunkte und ihr Verhältnis zur Gesamtzahl wieder.


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Tabelle 2: Zahnfleischtaschentiefen der RPP-Patienten

Patient

vorhandene Zähne

Mess-punkte

gemessene Taschentiefe in mm

Anzahl der Meßpunkte

Nr.

Alter

Sex

gesamt

befallen

gesamt

<4

4

5

6

7-8

9+

5+

P 4

26

w

28

15

112
in %

74
66

12
10,7

4
3,6

11
9.8

7
6,3

4
3,6

26
23,2

P 5

37

m

26

22

104
in %

45
43,3

12
11,5

10
9,6

7
6,7

17
16,3

13
12,5

47
45,2

P 6

31

m

27

25

108
in %

45
41,7

17
15,7

18
16,7

8
7,4

15
13,9

4
3,7

45
41,7

P 7

22

w

28

25

112
in%

46
41,1

10
8,9

19
17

11
9,8

18
16,1

8
7,1

56
50

P 9

38

w

28

28

112
in %

34
30,4

17
15,2

32
28,6

17
15,2

11
9,8

1
0,9

61
54,5

P 10

36

w

25

25

100
in %

22
22

15
15

21
21

14
14

18
18

10
10

63
63

P 11

26

m

28

26

112
in%

43
38,4

18
16,1

16
14,3

18
16,1

11
9,8

6
5,4

51
45,5

P 12

29

m

27

10

108
in %

75
69,4

14
13,0

5
4,6

8
7,4

2
1,9

4
3,7

19
17,6

P 13

30

m

26

23

104
in %

40
38,5

12
11,5

20
19,2

15
14,4

14
13,5

3
2,9

52
50

P 14

32

w

27

11

108
in %

72
66,7

12
11,1

2
1,9

8
7,4

7
6,5

7
6,5

24
22,2

P 20

29

w

22

15

88

in %

54

61,4

6

6,8

6

6,8

6

6,8

8

9,1

8

9,1

28

31,8

Entsprechend der Kriterien von Page waren immer nur einige der vorhandenen Läsionen in einem akuten Entzündungszustand. Die Auswertung der Röntgenbilder zeigte lokal tiefe Destruktionen ohne festes Verteilungsmuster, die häufig in Nachbarschaft zu nicht befallenen Meßpunkten lagen. Die Testpersonen waren zum Zeitpunkt der Untersuchung 22 bis 38 Jahre alt. Mit dem Einverständnis der Patienten für die Teilnahme an der Studie wurde eine eingehende allgemeine Anamnese erhoben, um andere bestehende Erkrankungen sowie die Behandlung mit Hormonpräparaten auszuschließen. Es gab unter den Probanden


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und den Kontrollen keine Auffälligkeiten hinsichtlich besonderer Anfälligkeit für andere Erkrankungen. Weitere Voraussetzung war, daß keine frühere Parodontalbehandlung durchgeführt worden war und daß in den vergangenen 3 Monaten keine Behandlung mit Antibiotika stattgefunden hatte. Mit den elf Patienten, die alle Bedingungen erfüllten, wurde ein Termin für die Probenentnahme vereinbart. Das Verhältnis der an der Studie teilnehmenden Testpersonen von sieben weiblichen zu fünf männlichen Probanden war zufällig, ebenso das Vorkommen von jeweils einem gewohnheitsmäßigen Zigarettenraucher in den Geschlechtergruppen.

2.1.3 Kontrollen

Zu jedem Probanden wurde eine Kontrollperson gleichen Geschlechts streng nach parodontaler Gesundheit ausgewählt, das heißt, es durften kein meßbarer Attachmentverlust und keine Entzündungszeichen vorhanden sein. Das Alter hatte weitgehend mit der Testperson übereinzustimmen, und Rauchern bzw. Nichtrauchern unter den Probanden wurden nur ebensolche Kontrollen gegenübergestellt. Eine Übersicht der Daten beider Gruppen zeigt Tabelle 3. Die Altersdifferenz der RPP-Patienten zu ihrer jeweiligen Kontrollperson beträgt im Median -6 Monate, der Bereich erstreckt sich von -26 Monaten bis zu +4 Monaten.


32

Tabelle 3: Zuordnung der Kontrollen zu den erkrankten Probanden

Test

Geb. Dat.

Kontrolle

Geb. Dat.

Geschlecht

Raucher

P 3

05.58

P 32

01.59

w

nein

P 4

01.67

P 24

04.66

w

nein

P 5

01.56

P 21

06.55

m

nein

P 6

12.61

P 17

06.61

m

nein

P 7

02.71

P 15

11.70

w

nein

P 8

08.53

P 33

06.54

w

nein

P 9

08.55

P 31

05.55

w

ja

P 10

12.56

P 34

12.56

w

nein

P 11

01.67

P 22

07.66

m

nein

P 12

03.64

P 18

01.62

m

nein

P 13

10.62

P 19

01.63

m

ja

P 14

01.61

P 16

05.61

w

nein

P 20

11.63

P 23

04.63

w

nein

2.2 Probenentnahme

Die Speichelentnahme wurde bei allen Testpersonen nach abgeschlossener initialer Parodontaltherapie, jedoch vor dem Beginn der zweiten Phase der Therapie, bestehend aus der subgingivalen Kürettage und Wurzelglättung, durchgefürt. Die letzte Nahrungsaufnahme lag mindestens 2 Stunden zurück. Die Probanden gaben auf Befragen an, keinen Hunger zu verspüren. Alle Proben wurden tagsüber zwischen 09.00 und 17.00 Uhr entnommen. Die gesamte Prozedur wurde für jeden Probanden in einer Sitzung durchgeführt, die ca. 1 bis 1 ½ Stunden dauerte. Für die Untersuchung stand ein vom allgemeinen Klinikbetrieb abgetrennter Raum mit Tageslicht zur Verfügung, in dem sich eine Dentaleinheit und sämtliche notwendigen Materialien befanden.


33

2.2.1 Apparatur

Zur Entnahme der Speichelproben wurde eine speziell für diesen Zweck entwickelte Apparatur eingesetzt.Sie besteht aus sechs Silikonsaugern, die über Silikonschläuche mit einer Unterdruckbox verbunden wurden. Innerhalb der Dichtfläche der Sauger ist ein Messingdrahtgitter eingearbeitet. Damit wird verhindert, daß die bewegliche Mucosa in den Hohlraum eingesaugt wird und den Schlauchanschluß verschließt. Die Sauger wurden hergestellt, indem die späteren Hohlräume aus weichem Dentalwachs auf einer Glasplatte aufgewachst und dann mit additionsvernetzendem Silikon umspritzt wurden.

Abbildung 3: Intraorale Bestandteile der Speichelsaugeranlage

Die der Glasplatte anliegenden Ränder wurden dadurch zu absolut glatten Dichtflächen. Nach dem Ausbrühen des Wachses waren die in den Wachskern eingearbeitenden Messinggitter fest in die Wand der Saugers integriert.
Für den harten Gaumen wurde ein ca. 4 cm großer kommerziell erhältlicher Kunststoffsaugnapf oval zurechtgeschnitten. Die dünn auslaufenden Ränder


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adaptieren gut an der Gaumenschleimhaut. Wegen der unbeweglichen Gaumen-schleimhaut konnte hier auf das Messinggitter verzichtet werden. An einem modifizierten Kunststoffkonfektionslöffel befestigt, läßt er sich mit Hilfe von wenig hochviskösem Abformmaterial individualisieren und an den Oberkiefer-seitenzähnen befestigen.
Für den Unterkiefer sind drei Sauger an einem frontal ausgeschnittenen Kunststofflöffel befestigt, um vier Entnahmestellen zu erreichen. Zwei 2,5 x 0,8 cm große nierenförmige Sauger decken lingual jeweils die Caruncula und die Plica sublingualis ab. Es kann dadurch der Speichel der großen Unterkieferdrüsen nach links und rechts getrennt entnommen werde. Wegen der eng beieinander liegenden Ausführungsgänge kann jedoch nicht das Sekret der Gl. submandibularis von dem der Gl. sublinguales getrennt werden. Um eine störungsfreie Entnahme des sublingualen Sekretes trotz seiner hohen Viskosität zu erreichen, müssen hier Schläuche mit 2 mm Innendurchmesser eingesetzt werden. Durch die Befestigung der ableitenden Schläuche der Submandibularissauger an einem zurechtgeschnittenen Kunststofflöffel bleiben die Sauger in ihrer Position etwas flexibel und passen sich beim Einsetzen automatisch den anatomischen Platzverhältnissen an. Eine optische Kontrolle ist jederzeit möglich.
Ein weiterer Sauger von 6,5 x 1,5 cm ist ebenfalls an dem Kunststofflöffel für den Unterkiefer befestigt und wird im Vestibulum plaziert, um den Speichel der Gll. labiales aufzufangen. In ihm sind zwei Schlauchanschlüsse jeweils am äußersten linken und rechten Ende angebracht. Da es nicht vorgesehen war, bei den Gll. labiales nach links und rechts zu unterscheiden, befinden sich beide Anschlüsse in einem gemeinsamen Sauger. Der Löffel sorgt für eine Lagerung der Konstruktion auf der Zahnreihe des Unterkiefers, wobei sich eine Fixierung der Apparatur mit Abformmaterial an den Zähnen als überflüssig erwies.
Für die Parotis ist je ein frei zu plazierender runder Sauger mit 2 cm Durchmesser an einem Schlauch mit 1 mm Innendurchmesser vorhanden, der auf die Papilla parotidea gesetzt wird und durch den Unterdruck an seinem Platz gehalten wird. Die gesamte Konstruktion war bis auf einen Fall, in dem wegen einer starken Oberkieferkompression auf den Gaumensauger verzichtet werden mußte, bei

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allen Probanden problemlos zu adaptieren und wurde gut toleriert. Es war damit möglich, den Speichel der großen Drüsen vollständig und gleichzeitig sowie nach Ausführungsgängen getrennt zu entnehmen.

In der Unterdruckbox sind in einem Ständer die Probengefäße untergebracht, in die das Durchtrittsröhrchen für die jeweilige Entnahmestelle hineinragt. Der Unterdruckanschluß wird mit dem Speichelsaugeranschluß der zahnärztlichen Behandlungseinheit verbunden, der einen Unterdruck von - 5 mmHg liefert.
Zur Stimulation des adrenergen Systems wurde körperliche Arbeit auf einem einfachen Fahradergometer geleistet, zur Kontrolle der Pulsfrequenz diente ein elektronischer Pulszähler für Sportler.

Abbildung 4: Unterdruckbox mit Probengefäßen


36

2.2.2 Vorgehensweise

Die gereinigte und getrocknete Apparatur wurde vor dem Einsetzen in den Mund komplett zusammengesetzt und an den Unterdruck angeschlossen. Mit dem zweiten Saugschlauch der Dentaleinheit wurde der bis dahin im Mundboden angesammelte Speichel entfernt. Dann wurde zuerst der individualisierte Oberkieferlöffel mit dem Gaumensauger eingesetzt, danach der Unterkieferlöffel appliziert und schließlich die Sauger für den Parotisspeichel plaziert. Während 20 Minuten wurde dem Probanden in Ruhe auf dem Bahandlungsstuhl sitzend Speichel entnommen, anschließend die Apparatur aus dem Mund entfernt. Nachdem sich durch den Luftzutritt der Inhalt der Schläuche in die Probengefäße entleert hatte, wurden diese aus der Unterdruckbox entnommen, verschlossen und durch neue ersetzt.

Abbildung 5: Speichelentnahme in Ruhe


37

Der Proband wurde nun gebeten, auf dem Fahrradergometer Platz zu nehmen und mit dem Treten zu beginnen. Sobald eine Pulsfrequenz von über 100/min erreicht war, wurde die Apparatur erneut eingesetzt und für 20 Minuten Speichel entnommen. Währenddessen leistete der Proband körperliche Arbeit, um eine Pulsfrequenz von 140/min zu erreichen und möglichst konstant zu halten. Die Proben wurden sofort nach Entnahme unter Kühlung für 10 Minuten bei 5000 U/min zentrifugiert, aus dem Überstand in fünf Portionen zu je 0,1 ml aliquotiert und bei - 80 °C eingefroren.

Abbildung 6: Speichelentnahme auf dem Fahrradergometer


38

2.3 Probenverarbeitung

Zur Messung der antiadhäsiven Kapazität des Speichels diente ein kompetitiver Lektinbindungs-Inhibitionstest ( 61 ). Dabei wird die Bindung eines pflanzlichen Lektins an seinen spezifischen Rezeptor durch die Speichelprobe entsprechend ihrem Gehalt an dem entsprechenden Rezeptorsaccharid verhindert.

Abbildung 7: Prinzip des kompetitiven Lektinbindungsinhibitionstests. Aus Seemann 1996 ( 132 )


39

Der bekannte Lektinrezeptor ist an ein Glykoproteins gebunden, mit dem die Mikrotiterplatte beschichtet wird. Diese wird mit der Speichelprobe und dem biotinmakierten Lektin inkubiert. Nach der Inkubationszeit wird Streptavidinperoxidase an das Biotin gebunden, um eine Farbreaktion zu katalysieren. Dadurch kann das nach der Inkubationszeit gebundene Lektin photometrisch bestimmt werden. Zum Vergleich wird eine Standardlösung des als Rezeptor bekannten Kohlenhydrats verwendet. Die verwendeten Lektine und ihre Bindungsspezifitäten sind in Tabelle 4 zusammengestellt.

Tabelle 4: Verwendete Pflanzenlektine und die an sie jeweils spezifisch bindenden Kohlenhydratstrukturen

Abkürzung

Lektin

Bindungsspezifität
(WU et al. 1988)

AAA

Anguilla anguilla Agglutinin

a1-2 gebundene Fucose

ConA

Concanavalin A

Trimannosyl Struktur in High-Mannose-Type-Glykanen

GNA

Galantus nivalis Agglutinin

terminale Mannose

GS1

Griffonia simplicifolia Agglutinin

terminales alpha-N-Acetyl-Galaktosamin
terminale Galaktose

SNA

Sambucus nigra Agglutinin

terminale a-2,6 gebundene Sialinsäure

PNA

Peanut Agglutinin

b-D-Galaktose-1,3 D-N-Acetyl-galaktosamin

VVA

Vicia villosa Agglutinin

terminales 1,3-N-Acetyl-galaktosamin

WGA

Wheat germ Agglutinin

1,4 b-D-N-Acetyl-glukosamin

Die Konzentrationsbestimmung der verschiedenen Glykanstrukturen des Speichels erfolgte auf 96-well-Mikrotiterplatten. Maximal 10 Proben fanden auf einer Platte Platz, wobei jede Probe in vier Verdünnungsstufen als Doppelbestimmung aufgetragen wurde. Aus den Standardverdünnungen des für das Lektin spezifi


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schen Kohlenhydrats (Tabelle 5) jeder Platte wurde eine Standardkurve erstellt. Zusätzlich wurde eine Kontrollprobe aus einem Poolserum (unverdünnt und 1:3 verdünnt) gemessen. Die Zusammensetzung des Poolserums ist im Abschnitt „Materialien“ angegeben. In Abbildung 8 ist die räumliche Aufteilung einer Mikrotiterplatte schematisch dargestellt.

Abbildung 8: Schematische Darstellung der Raumaufteilung einer Mikrotiterplatte im kompetitiven Lektin-Inhibitionstest (LW = Leerwert in Probenpuffer). Jede Probe wurde in vier Verdünnungen gemessen, jede Verdünnung als Doppelmessung in zwei Wells.


41

Zunächst erfolgte die Beschichtung der Platten mit den an das Glykoprotein gebundenen spezifischen Kohlenhydraten in der Konzentration 1 µg/ml. Die Verdünnung erfolgte mit Phosphatpuffer. Pro Well wurden 100 µl eingebracht und eine Stunde bei Zimmertemperatur auf einem Rüttler inkubiert.
Während der Inkubationszeit wurden die Standards und Speichelproben vorbereitet. Nach dem Auftauen und 3-minütigem Zentrifugieren (10.000 g) der Speichelproben erfolgte die erste Verdünnung auf 1:7,5 mit Probenpuffer. Bis zum Erhalt von insgesamt vier Verdünnungen wurde jeweils um den Faktor 5 weiterverdünnt. Die Standards wurden entsprechend den Angaben in der Tabelle 5 in fünf Verdünnungsstufen erstellt. Die jeweiligen Verdünnungsfaktoren wurden in Vorversuchen empirisch ermittelt. Nach viermaligem Waschen der Platten wurden pro Well 25 µl der Standard-, Kontroll- oder Probenlösung aufgetragen und durch 75 µl der Lektin-Lösung in der jeweiligen Verdünnung (siehe Tabelle 5) auf 100 µl ergänzt. Die Platten wurden anschließend eine halbe Stunde gerüttelt und über Nacht bei +4C zur Einstellung des Gleichgewichts inkubiert.
Am darauffolgenden Tag wurden die Platten erneut viermal gewaschen und pro Well 100 µl Streptavidinperoxidase in einer Verdünnung von 50 µg/ml pipettiert. Darauf schloß sich eine einstündige Inkubationsphase auf einem Rüttler bei Raumtemperatur an.

42

Tabelle 5: Beschichtung der Mikrotiterplatten mit der für das jeweilige Lektin spezifischen Kohlenhydratstruktur und verwendete Standardlösung zum Vergleich mit der Inhibitionswirkung der Speichelprobe.
LAP=Lektinassay-Puffer, BSA=bovines Serumalbumin, PBS=Phosphatpuffer

Lektin

Beschichtung
(1:1000 in PBS)

Standard

Anguilla anguilla Agglutinin
1:40 000 in LAP* + 0,1% BSA

BSA-Fucosylamid

Fucose, 300 mM
Verd.1 1:4; Verd.2-5 1:3;
6. LW in Probenpuffer

Concanavalin A
1:40 000 in LAP* + 0,1%BSA

BSA-a-Mannopyranosid

Methyl-a-Mannopyranosid,
300 mM
Verd.1 1:10; Verd.2-5 1:3;
6. LW in Probenpuffer

Galantus nivalis Agglutinin
1:20 000 in LAP* + 0,1% BSA

BSA-a-Mannopyranosid

Mannan, 0,4 mg/l
Verd.1 1:1000; Verd.2-5 1:3;
6. LW in Probenpuffer

Griffonia simplicifolia Agglutinin
1:40 000 in LAP* + 0,1% BSA

BSA- N-Acetyl-Galaktosamin

N-Acetyl-Galaktosamin, 300 mM
Verd.1 1:10; Verd.2-5 1:8;
6. LW in Probenpuffer + 1mM EDTA

Sambucus nigra Agglutinin
1:40 000 in LAP* + 0,1% BSA

Fetuin

6´ Sialyllaktose, 1mg/l N-Acetyl-Neuramin-Laktose
Verd.1 1:25; Verd.2-5 1:3;
6. LW in Probenpuffer

Peanut Agglutinin
1:20 000 in LAP* + 0,1% BSA

BSA-Gal-1,3-N-Acetyl-Galaktosamin

Methyl-a-D-Galaktopyranosid, 300mM
Verd.1 1:10; Verd.2-5 1:2;
6. LW in Probenpuffer

Vicia villosa Agglutinin
1:40 000 in LAP* + 0,1% BSA

BSA-Galaktosamin

N-Acetyl-Galaktosamin, 300mM
Verd.1 1:10; Verd.2-5 1:8;
6. LW in Probenpuffer + 1mM EDTA

Wheat germ Agglutinin
1:20 000 in LAP* + 0,1%BSA

N-Acetyl-saures-Glykoprotein

N-Acetyl-Glukosamin, 300mM
Verd.1 1:5; Verd.2-5 1:4
6. LW in Probenpuffer

Nach erneutem viermaligem Waschen wurden 110 µl pro Well des frisch angesetzten chromogenen Substrates TMB-Gallati (10 µg/ml) für 10 Minuten bei


43

Dunkelheit inkubiert, bis eine abgestufte Blaufärbung in den Wells sichtbar wurde. Dieser enzymatische Farbumschlag wurde mittels 50 µl einer 4N H2SO4 Lösung gestoppt. Die dadurch eingetretene Gelbfärbung wurde photometrisch gemessen.
Die Stärke der Farbreaktion hängt von der Menge des an die Mikrotiterplatte gebundenen Lektins ab. Je stärker die Reaktion der Speichelprobe mit dem Lektin ist, desto weniger Lektin bindet noch an das Kohlenhydrat auf der festen Phase der Platte. Die Konzentration des Lektinrezeptors in der Speichelprobe wird als Prozent des bekannten Standards angegeben. Damit kann auf die Menge des für das Lektin spezifischen Kohlenhydrates in der Probe geschlossen werden. Eine typische Meßwertgrafik zeigt Abbildung 9.

Abbildung 9: Meßwertgrafik. OD = Optische Dichte, % std. = Prozent vom Standard


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2.4 Statistik

Die Messung der Proben erfolgte blind, d.h. aufgrund der neutralen Kodierung der Probenröhrchen war bei der Durchführung der Laboruntersuchung keine Zuordnung der Proben zu den Probanden oder Entnahmestellen möglich.
Da die Lektinbindungsaktivität der einzelnen Drüsen, insbesondere unter der Belastung auf dem Ergometer, nicht hinreichend bekannt war und die Probenmengen von den kleinen Speicheldrüsen stark begrenzt waren, wurden die Proben in vier Verdünnungen parallel untersucht. Dieses Verfahren ermöglichte eine sehr sichere Validierung der Proben ohne Kenntnis ihres Ursprungs. Es wurden Proben bzw. Werte eliminiert und, wo möglich, neu gemessen, wenn die Standardabweichung der Meßwertwiederholungen mehr als 25% (Ausreißerkriterium) betrug oder die Verdünnungen der einzelnen Proben keinen kontinuierlichen Abfall der Lektinbindungsaktivität zeigten. Zeigten sich diese Auffälligkeiten bei einzelnen Meßwertkurven, wurde die betreffende Probenserie insgesamt neu gemessen.

Aus den vier Verdünnungsstufen der Speichelproben wurde diejenige zur Beurteilung herangezogen, bei der die größte Anzahl der Einzelwerte für die relative Konzentration im linearen Bereich der Kurve lagen. Nach der analytischen Überprüfung der Meßergebnisse erfolgte eine Zusammenführung der laufenden Labornummer zu den jeweiligen Speichelproben der einzelnen Probanden.
Die nachfolgenden Berechnungen wurden mit dem Programm SPSS 6.0 für Windows 3.1 auf einem IBM-kompatiblen Rechner mit 386er- und mathematischem Koprozessor durchgeführt. Für den Vergleich der Parodontitispatienten mit den Kontrollen wurde der nichtparametrische Mann- Witney-Test, für den Vergleich innerhalb der Gruppen vor und nach Stimulation der nichtparametrische Wilcoxon-Test verwendet.


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