Kapitel 2. Material und Methode

2.1 Auswahl der Probanden

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Die Probanden stammten aus dem Patientenaufkommen der damaligen Abteilung für Parodontologie der Zahnklinik Nord der Freien Universität Berlin, jetzt Abt. für Parodontologie und Synoptische Zahnmedizin des Zentrums für Zahnmedizin des Universitätsklinikums Charité der Medizinischen Fakultät der Humboldt-Universität zu Berlin (Leiter Prof. Dr. Dr. J.P. Bernimoulin). Alle in die Studie aufgenommenen Testpersonen hatten sich in der Abteilung mit akuten Problemen auf Grund ihrer parodontalen Erkrankung vorgestellt. Es handelte sich entweder um Zahnlockerungen 3. Grades mit drohendem Zahnverlust oder um schmerzhafte Exazerbationen einer oder mehrerer parodontaler Läsionen. Diese waren mit starker Blutung auf Sondierung und/oder Pusentleerung bis zu parodontalen Abszessen begleitet. Nach der initialen Schmerztherapie wurden die Patienten in die erste Phase der Parodontaltherapie geführt, die aus mindestens zweimaliger supragingivaler Plaque- und Zahnsteinentfernung sowie Mundhygieneinstruktion und deren Kontrolle besteht. Danach wurde ein Parodontalstatus und ein Röntgenstatus erstellt. Anhand der nun vorhandenen Unterlagen wurden elf Patienten ausgewählt, bei denen nach enger Auslegung der Kriterien der Abteilung in Anlehnung an die Definition von Page et al ( 108 ) eine rasch fortschreitende Peridontitis vorlag. Die Auswahlkriterien waren der Umfang des Verlustes an Zahnhalteapparat im Verhältnis zum Alter des Patienten, das Verteilungsmuster der Destruktionen und das Erscheinungsbild der aktiven Läsionen. Zur Beurteilung der Destruktionen im Parodont wurden an jedem Zahn vier Meßpunkte (mesial, distal, vestibulär, oral) in die Wertung genommen. Die Weisheitszähne wurden nicht berücksichtigt.

Abbildung 2:Röntgenstatus einer 26 jährigen Patientin mit rasch fortschreitender Parodontitis

2.1.1 Minimalwerte

Bei einem 29-jährigen Patienten waren nur 17,6% der Meßpunkte mit 5 und mehr Millimetern Taschentiefe als eindeutig pathologisch eingestuft worden, die sich auf 10 von 27 Zähnen verteilten. Darunter fanden sich aber 4 Meßpunkte mit 9 mm und mehr verteilt auf zwei verschiedene Quadranten.
Im Falle einer 38-jährigen Patientin fand sich nur ein Meßpunkt mit 9 mm Tachentiefe, es wurden aber mehr als die Hälfte der Meßpunkte als pathologisch eingestuft und es waren alle 28 Zähne befallen. Darunter befanden sich 11 Meßpunkte mit 7 bis 8 mm Tiefe.
Diese beiden Beispiele zeigen, wie unterschiedlich die Verteilung der Destruktionen sein können. Im ersten Fall sind mehrere tiefe Knochenkrater in verschie

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2.1.2 Maximalwerte

Eine 36 Jahre alte Probandin hatte 63% der Meßpunkte mit mindestens 5mm, davon 18 Meßpunkte mit 7 bis 8 mm sowie 10 Meßpunkte mit mindestens 9 mm verteilt auf alle vier Quadranten. Alle 25 Zähne waren befallen. Bei einem 37 jährigen Patienten wurden 45,2 % der 104 Meßpunkte als pathologisch eingestuft, 17 davon waren 7 bis 8 mm tief. Insgesamt 13 Meßpunkte wurden mit 9 mm und mehr in 3 Quadranten gemessen. Von den 26 vorhandenen Zähnen waren nur 4 nicht befallen. Tabelle 2 gibt die bei den Probanden gemessenen Tiefen der Meßpunkte und ihr Verhältnis zur Gesamtzahl wieder.

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Tabelle 2: Zahnfleischtaschentiefen der RPP-Patienten

Patient			vorhandene Zähne		Mess-punkte	gemessene Taschentiefe in mm Anzahl der Meßpunkte
Nr.	Alter	Sex	gesamt	befallen	gesamt	<4	4	5	6	7-8	9+	5+
P 4	26	w	28	15	112 in %	74 66	12 10,7	4 3,6	11 9.8	7 6,3	4 3,6	26 23,2
P 5	37	m	26	22	104 in %	45 43,3	12 11,5	10 9,6	7 6,7	17 16,3	13 12,5	47 45,2
P 6	31	m	27	25	108 in %	45 41,7	17 15,7	18 16,7	8 7,4	15 13,9	4 3,7	45 41,7
P 7	22	w	28	25	112 in%	46 41,1	10 8,9	19 17	11 9,8	18 16,1	8 7,1	56 50
P 9	38	w	28	28	112 in %	34 30,4	17 15,2	32 28,6	17 15,2	11 9,8	1 0,9	61 54,5
P 10	36	w	25	25	100 in %	22 22	15 15	21 21	14 14	18 18	10 10	63 63
P 11	26	m	28	26	112 in%	43 38,4	18 16,1	16 14,3	18 16,1	11 9,8	6 5,4	51 45,5
P 12	29	m	27	10	108 in %	75 69,4	14 13,0	5 4,6	8 7,4	2 1,9	4 3,7	19 17,6
P 13	30	m	26	23	104 in %	40 38,5	12 11,5	20 19,2	15 14,4	14 13,5	3 2,9	52 50
P 14	32	w	27	11	108 in %	72 66,7	12 11,1	2 1,9	8 7,4	7 6,5	7 6,5	24 22,2
P 20	29	w	22	15	88 in %	54 61,4	6 6,8	6 6,8	6 6,8	8 9,1	8 9,1	28 31,8

Entsprechend der Kriterien von Page waren immer nur einige der vorhandenen Läsionen in einem akuten Entzündungszustand. Die Auswertung der Röntgenbilder zeigte lokal tiefe Destruktionen ohne festes Verteilungsmuster, die häufig in Nachbarschaft zu nicht befallenen Meßpunkten lagen. Die Testpersonen waren zum Zeitpunkt der Untersuchung 22 bis 38 Jahre alt. Mit dem Einverständnis der Patienten für die Teilnahme an der Studie wurde eine eingehende allgemeine Anamnese erhoben, um andere bestehende Erkrankungen sowie die Behandlung mit Hormonpräparaten auszuschließen. Es gab unter den Probanden

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2.1.3 Kontrollen

Zu jedem Probanden wurde eine Kontrollperson gleichen Geschlechts streng nach parodontaler Gesundheit ausgewählt, das heißt, es durften kein meßbarer Attachmentverlust und keine Entzündungszeichen vorhanden sein. Das Alter hatte weitgehend mit der Testperson übereinzustimmen, und Rauchern bzw. Nichtrauchern unter den Probanden wurden nur ebensolche Kontrollen gegenübergestellt. Eine Übersicht der Daten beider Gruppen zeigt Tabelle 3. Die Altersdifferenz der RPP-Patienten zu ihrer jeweiligen Kontrollperson beträgt im Median -6 Monate, der Bereich erstreckt sich von -26 Monaten bis zu +4 Monaten.

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Tabelle 3: Zuordnung der Kontrollen zu den erkrankten Probanden

Test	Geb. Dat.	Kontrolle	Geb. Dat.	Geschlecht	Raucher
P 3	05.58	P 32	01.59	w	nein
P 4	01.67	P 24	04.66	w	nein
P 5	01.56	P 21	06.55	m	nein
P 6	12.61	P 17	06.61	m	nein
P 7	02.71	P 15	11.70	w	nein
P 8	08.53	P 33	06.54	w	nein
P 9	08.55	P 31	05.55	w	ja
P 10	12.56	P 34	12.56	w	nein
P 11	01.67	P 22	07.66	m	nein
P 12	03.64	P 18	01.62	m	nein
P 13	10.62	P 19	01.63	m	ja
P 14	01.61	P 16	05.61	w	nein
P 20	11.63	P 23	04.63	w	nein

2.2 Probenentnahme

Die Speichelentnahme wurde bei allen Testpersonen nach abgeschlossener initialer Parodontaltherapie, jedoch vor dem Beginn der zweiten Phase der Therapie, bestehend aus der subgingivalen Kürettage und Wurzelglättung, durchgefürt. Die letzte Nahrungsaufnahme lag mindestens 2 Stunden zurück. Die Probanden gaben auf Befragen an, keinen Hunger zu verspüren. Alle Proben wurden tagsüber zwischen 09.00 und 17.00 Uhr entnommen. Die gesamte Prozedur wurde für jeden Probanden in einer Sitzung durchgeführt, die ca. 1 bis 1 ½ Stunden dauerte. Für die Untersuchung stand ein vom allgemeinen Klinikbetrieb abgetrennter Raum mit Tageslicht zur Verfügung, in dem sich eine Dentaleinheit und sämtliche notwendigen Materialien befanden.

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2.2.1 Apparatur

Zur Entnahme der Speichelproben wurde eine speziell für diesen Zweck entwickelte Apparatur eingesetzt.Sie besteht aus sechs Silikonsaugern, die über Silikonschläuche mit einer Unterdruckbox verbunden wurden. Innerhalb der Dichtfläche der Sauger ist ein Messingdrahtgitter eingearbeitet. Damit wird verhindert, daß die bewegliche Mucosa in den Hohlraum eingesaugt wird und den Schlauchanschluß verschließt. Die Sauger wurden hergestellt, indem die späteren Hohlräume aus weichem Dentalwachs auf einer Glasplatte aufgewachst und dann mit additionsvernetzendem Silikon umspritzt wurden.

Abbildung 3: Intraorale Bestandteile der Speichelsaugeranlage

Die der Glasplatte anliegenden Ränder wurden dadurch zu absolut glatten Dichtflächen. Nach dem Ausbrühen des Wachses waren die in den Wachskern eingearbeitenden Messinggitter fest in die Wand der Saugers integriert.
Für den harten Gaumen wurde ein ca. 4 cm großer kommerziell erhältlicher Kunststoffsaugnapf oval zurechtgeschnitten. Die dünn auslaufenden Ränder

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In der Unterdruckbox sind in einem Ständer die Probengefäße untergebracht, in die das Durchtrittsröhrchen für die jeweilige Entnahmestelle hineinragt. Der Unterdruckanschluß wird mit dem Speichelsaugeranschluß der zahnärztlichen Behandlungseinheit verbunden, der einen Unterdruck von - 5 mmHg liefert.
Zur Stimulation des adrenergen Systems wurde körperliche Arbeit auf einem einfachen Fahradergometer geleistet, zur Kontrolle der Pulsfrequenz diente ein elektronischer Pulszähler für Sportler.

Abbildung 4: Unterdruckbox mit Probengefäßen

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2.2.2 Vorgehensweise

Die gereinigte und getrocknete Apparatur wurde vor dem Einsetzen in den Mund komplett zusammengesetzt und an den Unterdruck angeschlossen. Mit dem zweiten Saugschlauch der Dentaleinheit wurde der bis dahin im Mundboden angesammelte Speichel entfernt. Dann wurde zuerst der individualisierte Oberkieferlöffel mit dem Gaumensauger eingesetzt, danach der Unterkieferlöffel appliziert und schließlich die Sauger für den Parotisspeichel plaziert. Während 20 Minuten wurde dem Probanden in Ruhe auf dem Bahandlungsstuhl sitzend Speichel entnommen, anschließend die Apparatur aus dem Mund entfernt. Nachdem sich durch den Luftzutritt der Inhalt der Schläuche in die Probengefäße entleert hatte, wurden diese aus der Unterdruckbox entnommen, verschlossen und durch neue ersetzt.

Abbildung 5: Speichelentnahme in Ruhe

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Abbildung 6: Speichelentnahme auf dem Fahrradergometer

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2.3 Probenverarbeitung

Zur Messung der antiadhäsiven Kapazität des Speichels diente ein kompetitiver Lektinbindungs-Inhibitionstest ( 61 ). Dabei wird die Bindung eines pflanzlichen Lektins an seinen spezifischen Rezeptor durch die Speichelprobe entsprechend ihrem Gehalt an dem entsprechenden Rezeptorsaccharid verhindert.

Abbildung 7: Prinzip des kompetitiven Lektinbindungsinhibitionstests. Aus Seemann 1996 ( 132 )

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Tabelle 4: Verwendete Pflanzenlektine und die an sie jeweils spezifisch bindenden Kohlenhydratstrukturen

Abkürzung	Lektin	Bindungsspezifität (WU et al. 1988)
AAA	Anguilla anguilla Agglutinin	a1-2 gebundene Fucose
ConA	Concanavalin A	Trimannosyl Struktur in High-Mannose-Type-Glykanen
GNA	Galantus nivalis Agglutinin	terminale Mannose
GS1	Griffonia simplicifolia Agglutinin	terminales -N-Acetyl-Galaktosamin terminale Galaktose
SNA	Sambucus nigra Agglutinin	terminale a-2,6 gebundene Sialinsäure
PNA	Peanut Agglutinin	b-D-Galaktose-1,3 D-N-Acetyl-galaktosamin
VVA	Vicia villosa Agglutinin	terminales 1,3-N-Acetyl-galaktosamin
WGA	Wheat germ Agglutinin	1,4 b-D-N-Acetyl-glukosamin

Die Konzentrationsbestimmung der verschiedenen Glykanstrukturen des Speichels erfolgte auf 96-well-Mikrotiterplatten. Maximal 10 Proben fanden auf einer Platte Platz, wobei jede Probe in vier Verdünnungsstufen als Doppelbestimmung aufgetragen wurde. Aus den Standardverdünnungen des für das Lektin spezifi

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Abbildung 8: Schematische Darstellung der Raumaufteilung einer Mikrotiterplatte im kompetitiven Lektin-Inhibitionstest (LW = Leerwert in Probenpuffer). Jede Probe wurde in vier Verdünnungen gemessen, jede Verdünnung als Doppelmessung in zwei Wells.

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Tabelle 5: Beschichtung der Mikrotiterplatten mit der für das jeweilige Lektin spezifischen Kohlenhydratstruktur und verwendete Standardlösung zum Vergleich mit der Inhibitionswirkung der Speichelprobe.
LAP=Lektinassay-Puffer, BSA=bovines Serumalbumin, PBS=Phosphatpuffer

Lektin	Beschichtung (1:1000 in PBS)	Standard
Anguilla anguilla Agglutinin 1:40 000 in LAP* + 0,1% BSA	BSA-Fucosylamid	Fucose, 300 mM Verd.1 1:4; Verd.2-5 1:3; 6. LW in Probenpuffer
Concanavalin A 1:40 000 in LAP* + 0,1%BSA	BSA-a-Mannopyranosid	Methyl-a-Mannopyranosid, 300 mM Verd.1 1:10; Verd.2-5 1:3; 6. LW in Probenpuffer
Galantus nivalis Agglutinin 1:20 000 in LAP* + 0,1% BSA	BSA-a-Mannopyranosid	Mannan, 0,4 mg/l Verd.1 1:1000; Verd.2-5 1:3; 6. LW in Probenpuffer
Griffonia simplicifolia Agglutinin 1:40 000 in LAP* + 0,1% BSA	BSA- N-Acetyl-Galaktosamin	N-Acetyl-Galaktosamin, 300 mM Verd.1 1:10; Verd.2-5 1:8; 6. LW in Probenpuffer + 1mM EDTA
Sambucus nigra Agglutinin 1:40 000 in LAP* + 0,1% BSA	Fetuin	6´ Sialyllaktose, 1mg/l N-Acetyl-Neuramin-Laktose Verd.1 1:25; Verd.2-5 1:3; 6. LW in Probenpuffer
Peanut Agglutinin 1:20 000 in LAP* + 0,1% BSA	BSA-Gal-1,3-N-Acetyl-Galaktosamin	Methyl-a-D-Galaktopyranosid, 300mM Verd.1 1:10; Verd.2-5 1:2; 6. LW in Probenpuffer
Vicia villosa Agglutinin 1:40 000 in LAP* + 0,1% BSA	BSA-Galaktosamin	N-Acetyl-Galaktosamin, 300mM Verd.1 1:10; Verd.2-5 1:8; 6. LW in Probenpuffer + 1mM EDTA
Wheat germ Agglutinin 1:20 000 in LAP* + 0,1%BSA	N-Acetyl-saures-Glykoprotein	N-Acetyl-Glukosamin, 300mM Verd.1 1:5; Verd.2-5 1:4 6. LW in Probenpuffer

Nach erneutem viermaligem Waschen wurden 110 µl pro Well des frisch angesetzten chromogenen Substrates TMB-Gallati (10 µg/ml) für 10 Minuten bei

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Abbildung 9: Meßwertgrafik. OD = Optische Dichte, % std. = Prozent vom Standard

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2.4 Statistik

Die Messung der Proben erfolgte blind, d.h. aufgrund der neutralen Kodierung der Probenröhrchen war bei der Durchführung der Laboruntersuchung keine Zuordnung der Proben zu den Probanden oder Entnahmestellen möglich.
Da die Lektinbindungsaktivität der einzelnen Drüsen, insbesondere unter der Belastung auf dem Ergometer, nicht hinreichend bekannt war und die Probenmengen von den kleinen Speicheldrüsen stark begrenzt waren, wurden die Proben in vier Verdünnungen parallel untersucht. Dieses Verfahren ermöglichte eine sehr sichere Validierung der Proben ohne Kenntnis ihres Ursprungs. Es wurden Proben bzw. Werte eliminiert und, wo möglich, neu gemessen, wenn die Standardabweichung der Meßwertwiederholungen mehr als 25% (Ausreißerkriterium) betrug oder die Verdünnungen der einzelnen Proben keinen kontinuierlichen Abfall der Lektinbindungsaktivität zeigten. Zeigten sich diese Auffälligkeiten bei einzelnen Meßwertkurven, wurde die betreffende Probenserie insgesamt neu gemessen.

Aus den vier Verdünnungsstufen der Speichelproben wurde diejenige zur Beurteilung herangezogen, bei der die größte Anzahl der Einzelwerte für die relative Konzentration im linearen Bereich der Kurve lagen. Nach der analytischen Überprüfung der Meßergebnisse erfolgte eine Zusammenführung der laufenden Labornummer zu den jeweiligen Speichelproben der einzelnen Probanden.
Die nachfolgenden Berechnungen wurden mit dem Programm SPSS 6.0 für Windows 3.1 auf einem IBM-kompatiblen Rechner mit 386er- und mathematischem Koprozessor durchgeführt. Für den Vergleich der Parodontitispatienten mit den Kontrollen wurde der nichtparametrische Mann- Witney-Test, für den Vergleich innerhalb der Gruppen vor und nach Stimulation der nichtparametrische Wilcoxon-Test verwendet.

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