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Material und Methoden

Die Reinheit der verwendeten Chemikalien war pro analysis, sie wurden von kommerziellen Herstellern bezogen. Spezielle Materialien und Geräte werden bei der Beschreibung ihrer Verwendung definiert.

3.1  Isolierung der Typ-II-Pneumozyten

Die Durchführung der Tierversuche wurde von der zuständigen Behörde des Landes Berlin genehmigt, die Bedingungen der Tierhaltung genügten den Anforderungen des Deutschen Tierschutzgesetzes.

Typ-II-Pneumozyten wurden durch Verdauung des zerkleinerten Lungengewebes mit Elastase und anschließender Reinigung der proteolytisch isolierten Zellen auf IgG-Platten (nach Dobbs et al. 1986) isoliert: Dazu wurden ca. 120g schwere Wistar-Ratten durch die Applikation von 40mg Pentobarbital in 7500I.E. Heparin betäubt und die Lungen mit „with-Puffer“ (140mM NaCl, 5mM KCl, 2mM CaCl2, 2,5mM Na3PO4, 1,3mM MgSO4, 6mM Glucose, 10mM HEPES, pH 7,4) über die Arteria pulmonalis blutfrei gespült. Anschließend wurden die Lungen mit „without-Puffer“ (140mM NaCl, 5mM KCl, 6mM Glucose, 0,2mM EGTA, 10mM HEPES, 2,5mM Na3PO4, pH 7,4) lavagiert, zerkleinert und mit 6mg Elastase (Schweinepankreas von Roche Biochemicals, Deutschland) 32min verdaut. Die Typ-II-Pneumozyten wurden nach Filtration über Gaze verschiedener Porenweite bei 160×g, 10min, 4°C abzentrifugiert. Durch Inkubation der Zellpräparation auf IgG-(Rat IgG, Sigma Chemicals, Deisenhofen, Deutschland)-beschichteten Plastikschalen für 45min bei 37ºC und 5% CO2 wurden die Makrophagen weitgehend entfernt. Pro Ratte wurden dabei 15-20×106 Zellen gewonnen, die Vitalitätsfärbung mit 0,2% Trypanblau ergab >95% vitale Zellen. Die Reinheit der frisch isolierten Typ-II-Pneumozyten lag bei 70-85%.

Für Messungen in Zellsuspension wurden 2×106 Zellen in 1ml Dulbecco´s Modified Eagle Medium ohne Phenolrot (DMEM; GibcoBRL, Life Technologies, Paisley, Scotland) aufge­nommen.

Durch Ausplattieren von 0,8-1,1×106 Zellen/3,5mm2 in 2ml DMEM mit 10% fetalem Kälber­serum (FKS von GibcoBRL) und Inkubation für 18h bei 37°C und 5% CO2 über Nacht im Brutschrank (Heraeus, Deutschland) wurden adhärente Zellen gewonnen.


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Die Proteinbestimmung als Maß für die Menge der isolierten Zellen erfolgte mit dem BCA-(Bicinchoninic Acid)-Proteinbestimmungstest von Pierce: Die entstandenen Kupfer-Protein-Komplexe wurden bei einer Wellenlänge von λ=570 nm quantifiziert.

3.2 Modelle zur Beschreibung des oxidativen Stress

3.2.1 Hyperoxie in vivo

Männliche Wistar-Ratten wurden 44h bei 95% Sauerstoff, Kontrolltiere unter gleichen Bedin­gungen bei Raumluft gehalten. Die Ratten wurden durch intraperitoneale Applikation von Pentobarbital betäubt und die Typ-II-Zellen wie unter Kapitel 3.1 beschrieben präpariert. Heparin-Plasma wurde aus der Vena Cava Inferior entnommen und zentrifugiert, Broncho­alveoläre Lavage (BAL) wurde nach viermaliger Lavage mit w/o-Puffer und Zentrifugation (160×g, 10min, 4°C) gewonnen.

3.2.2 H2O2 in vitro

106 adhärente Typ-II-Zellen wurden mit 2ml 0,5mM H2O2-Lösung in DMEM bis zu 60min inkubiert, die Konzentration der eingesetzten H2O2-Lösung wurde dabei durch Titration mit 10mM KMnO4 überprüft. Es wurde DMEM ohne Phenolrot verwendet, da Fujiwara et al. (1998) nachgewiesen haben, dass Phenolrot in Konzentrationen, wie sie in Medien vorkom­men, als Antioxidanz wirkt. Bei einigen Experimenten wurden den Zellen nach 10min erneut H2O2 zugesetzt (Endkonzentration: 0,5mM), bei einer Gesamtinkubationszeit von z.B. 30min wurde dieses Zeitschema dann 3×10min genannt. Die Zellen wurden anschließend mit eiskaltem PBS (Dulbecco´s w/o NaCO3, GibcoBRL) gewaschen und mit den Triton X-100 (Endkonzentration: 1% in den jeweiligen Puffern) lysiert.

Für Experimente in Zellsuspension wurden 106 frisch isolierte Zellen in 0,5ml DMEM aufge­nommen und 0,1ml H2O2 in DMEM zugegeben, so dass die Endkonzentration 0,5mM H2O2 betrug. Bei Inkubation der Zellen mit H2O2 für 3 bzw. 6×10min wurde nach 10min erneut 0,1ml H2O2-DMEM zugegeben, so dass die Endkonzentration 0,5mM H2O2 betrug. Am Ende der Inkubationszeit wurden die Zellen bei 160×g, 4°C, 10min abzentrifugiert und weiter­bearbeitet.


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3.3  Bestimmung der H2O2-Konzentration

Zur Bestimmung der H2O2-Konzentration wurde der Test nach Berndt und Bergmeyer (1970) verwendet: H2O2 bildet in Gegenwart von Peroxidase mit o-Dianisidin einen Farbkomplex, der bei einer Wellenlänge von λ=436nm photometrisch quantifiziert werden kann. Der Mess­ansatz enthielt: 0,1ml Zellmedium bzw. H2O2-Standard in DMEM mit 1,2ml 0,12mM Na3PO4 (pH 7,0), 8400U/l Peroxidase (Roche Biochemicals, Deutschland) und 50mg/l o-Dianisidin.

3.4 Antioxidantien

3.4.1 Totale antioxidative Kapazität (TAC)

Die totale antioxidative Kapazität (TAC) wurde nach Miller et al. (1993) bestimmt: Radikale wurden durch 2,2-Azino-bis-(3-Ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS) photometrisch bei einer Wellenlänge von λ=734nm nachgewiesen, diese Radikalgeneration wurde durch Anti­oxidantien in der Probe bzw. durch das Tocopherol-Analog Trolox® (3-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure) als Standard gehemmt und so quantifiziert. Es wurden 106 Typ-II-Zellen in 0,1ml 0,1% Triton X-100, 0,7ml BAL bzw. 10µl Heparin-Plasma eingesetzt.

3.4.2 Glutathion (GSH)

Glutathion (GSH) wurde nach Griffith (1983) photometrisch bestimmt: 5,5-Dithiobis-2-nitro­benzolsäure reagiert zu Thiobis-2-Nitrobenzolsäure mit einem Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von λ=412nm. Reduziertes GSH wird direkt derivatisiert, oxidiertes GSH-Disulfid (GSSG) wird unter NADPH-Verbrauch von Glutathionreduktase zu GSH reduziert. Die pro Zeiteinheit entstehende Thio-bis-2-Nitrobenzolsäure ist dabei von der Menge des gesamten Glutathions (GSH + GSSG) abhängig. 106 adhärente Typ-II-Zellen wurden mit 0,2ml 0,1%Triton X-100 lysiert, die Extinktionsänderung ΔE bei λ=412nm für Δt=30s gemessen.


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Die quantitative Differenzierung von GSH und oxidiertem GSH (GSSG) erfolgte im Testkit von ImmunDiagnostik (Bensheim, Deutschland) nach Derivatisierung, HPLC und an­schließender Fluoreszenzdetektion. 1,5×106 frisch isolierte Typ-II-Zellen wurden in 80µl einer Lösung mit 0,5% Triton X-100 und internem Standard (0,2µmol/ml) gegeben, 5µl des Zelllysat dienten zur Proteinbestimmung. Die Messungen wurden entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt: Nach der Derivatisierung wurden zwei 50µl Aliquote des klaren Überstandes der Messansätze über HPLC (Merck Euro Lab, Berlin, Deutschland) an Prontosil AQ HPLC Säule (Bishoff Chromatographie, Leonberg, Deutschland; 5µm; 125×4mm) mit einem Fluoreszenzdetektor (Merck, Hitachi F1050, Berlin, Deutschland; Anregungswellen­länge 385nm, Emissionswellenlänge 515nm) gemessen. Für die Quantifizierung wurde die Fläche des GSH-Peaks mit der Fläche des internen Standards ins Verhältnis gesetzt.

3.4.3 Vitamin E

Die Bestimmung des Vitamin-E-Gehaltes erfolgte nach Catignani und Bieri nach HPLC-Trennung (1983): Aus 3×106 Typ-II-Zellen bzw. 0,2ml Heparin-Plasma bzw. 10ml BAL wurde Vitamin E mit 0,45ml Isopropanol und 4,5µg internem Standard (Vitamin-E-Acetat) extrahiert. Die Isoformen des Vitamin E wurden in 50µl des Extraktes an einer RP-Säule (C18-Nucleosil 100, 10µm, 250x4mm) mit isokratischem Fluss von 1,3ml/min bei 50°C und Methanol/H2O (19:1) als Laufmittel getrennt, detektiert wurde bei einer Wellenlänge von λ=295nm. alpha-Tocopherol wurde durch die relative Retentionszeit zum internen Standard identifiziert und durch den Vergleich der integrierten Flächen der Probe und des Standards quantifiziert.

3.4.4 Polyungesättigte Fettsäuren (PUFA)

Der Gehalt an polyungesättigten Fettsäuren (PUFA) wurde durch HPLC-Analyse nach Lipid­extraktion und dünnschichtchromatographischer Trennung gemessen (nach Rüstow 1993). 106 Typ-II-Zellen in 0,5ml 0,1% Natriumlaurylsulfat (SDS) bzw. 0,2ml Heparin-Plasma bzw. 1ml BAL wurden mit Margarinsäure (17:0) als Standard versetzt und eine Lipidextraktion nach Bligh und Dyer (1959) durchgeführt. Die neutralen Lipide wurden von den Phospho­lipiden durch eindimensionale Dünnschichtchromatographie auf H60 Silika Gel (Merck, Deutschland) in Hexan/Äther (80:20) als Lösungsmittel getrennt. Die Startregion mit den Phospholipiden wurde mit 5% Methanol in Hexan zu Fettsäuremethylester umgeestert, die Fettsäuremethylester anschließend dünnschichtchromatographisch gereinigt und gaschromato­graphisch getrennt (Hewlett Packard 5890 Series II).


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3.5  Aktivität antioxidativer Enzyme

3.5.1 Catalase

Catalase spaltet H2O2 zu H2O und O2, der H2O2-Abfall kann bei einer Wellenlänge von λ=240nm photometrisch gemessen werden (UV-Methode nach Aebi 1983). Die Catalase-Aktivität wurde in 1,1 ml Probenvolumen mit 50mM Na3PO4 (pH 7,4) und 10,9mM H2O2 bei 22°C und 240nm gemessen. Für die Messung der zellulären Catalase wurde 0,1ml Zelllysat (0,5×106) in 0,1% Triton X-100 eingesetzt.

3.5.2 Superoxiddismutasen (SOD)

Superoxidanionradikale (•O2 ) bilden über verschiedene Oxidationsschritte aus NaNO2,Sulphanilamid und Naphtylendiamin einen Azofarbstoff, der bei einer Wellenlänge von λ=540nm gemessen werden kann. Durch SOD wird •O2 zu H2O2 und O2 abgebaut und dadurch die Farbstoffbildung verhindert, der Zusammenhang zwischen SOD-Aktivität und der Extinktion ist logarithmisch (nach Elstner 1983). Superoxidanionradikale wurden durch Reaktion von Anthraquinon-2-sulphoninsäure und NADH, katalysiert durch Diaphorase, und anschließender Autooxidation gewonnen. SOD-Standard und Diaphorase stammten von Roche Biochemicals, Deutschland. Für den Test wurden 106 Typ-II-Zellen in 0,2ml 0,1% Triton X-100 eingesetzt.

3.6 Synthese von Surfactantlipiden

3.6.1 Zelluläre Palmitinsäure-(16:0)-Aufnahme

Die Fettsäure-Aufnahme von Typ-II-Zellen wurde anhand der initialen Aufnahme radioaktiv markierter Palmitinsäure (16:0) gemessen (nach Guthmann 1999). Für die Inkubationslösung wurden 29µl [(9,10)n-3H]-16:0 (1µCi/ml; Amersham, Buckinghamshire, England) und 229µl 16:0 (1mg/ml) in Ethanol mit Cellite (Sulpeco) unter N2 getrocknet, anschließend mit 3ml DMEM und 0,33% BSA (fettsäurefreies Rinderalbumin, Roche Biochemicals) 1h bei 37°C gerührt. Der Überstand nach Zentrifugation wurde mit DMEM 1:10 verdünnt (Inkubations­lösung). Je 106 Typ-II-Zellen wurden mit 1ml Inkubationslösung 30sec inkubiert, anschlies­send nacheinander mit 1% BSA in DMEM, DMEM und PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit 0,5ml 1% SDS lysiert, 0,4ml des Lysates wurden mit 4ml Szintillationsflüssigkeit (Optiphase „Hisafe 3“) im Szintillationscounter (Wallac Scintillation Products Philip´s Szintilationscounter PW 4700 mit automatischer Kompensation für Quenching) gemessen.


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3.6.2  Phosphatidylcholin-(PC)-Synthese

Die Synthese von PC wurde durch Einbau von 14C-markiertem Cholin und 3H-markierter Palmitinsäure (16:0) in PC gemessen. 106 Zellen wurden mit 8,6µg 16:0 und 1,1µCi [(9,10)n-3H]-16:0 (Amersham, England), 0,15ml 0,5% BSA, 2,8µCi-[Methyl-14C]-Cholinchlorid in DMEM 10min inkubiert. Nach Waschen mit 0,2% BSA in DMEM wurden die Zellen mit 0,4ml 0,1% SDS lysiert, aus 0,3ml des Lysates wurden die Lipide nach Bligh und Dyer (1959) extrahiert und auf der Dünnschicht (Kieselgel 60, Schichtdicke 0,25cm, Merck, Deutschland) mit Chloroform/Methanol/Wasser (130/80/10) getrennt. Die PC-Region auf der Platte wurde an Hand eines mitchromatographierten Standards identifiziert, abgetragen und mit 4ml Szintilationsflüssigkeit im Szintilationscounter die Radioaktivität gemessen.

3.7 Lipidperoxidation

3.7.1 Malondialdehyd (MDA)

Malondialdehyd (MDA), aber auch andere Substanzen, reagieren mit Thiobarbitursäure zu einem Fluoreszenzfarbstoff, d.h. in dem hier angewandten Test werden alle thiobarbitur­säurereaktive Substanzen erfasst (Ohkawa 1979). 106 Typ-II-Zellen in 0,15ml H2O bzw. 0,1ml Plasma bzw. 1,5ml BALwurden in 0,3ml 1,35mM Acetatpuffer (pH 3,5), 0,3ml 20mM Thiobarbitursäure und 0,04ml 8,1% SDS 60min bei 90°C inkubiert, als Standard diente 1,1,3,3-Tetrahydroxypropan in Eisessig (10-140µl). Anschließend wurde auf Eis 0,2ml H2O und 1ml 1-Butanol dazugegeben, 20min bei 4°C geschüttelt und dann 10min lang bei 3000×g zentrifugiert. Der organische Überstand wurde bei 514nm Primärstrahlung und 554nm Sekundärstrahlung im Fluoreszenzspektrometer gemessen.

3.7.2 Lipidhydroperoxide (LOOH)

Zur Bestimmung der Lipidhydroperoxide wurde der Testkit LPO-CC (Kamiya Biomedical Co., Thousand Oaks, CA, USA) verwendet, bei dem Lipidhydroperoxide zu Hydroxyl­derivaten reduziert werden, die dann in Gegenwart von Hämoglobin Methylenblau bilden, das wiederum bei einer Wellenlänge von λ=675nm gemessen werden kann. Als Standard diente 50µM Cumenhydroperoxid. Vor dem Assay wurden die Lipide nach Bligh und Dyer (1959) aus den Proben extrahiert, unter N2 eingeengt und in 0,1ml Isopropanol wieder aufgenommen (Leerwert 0,1ml Isopropanol). Für die Messungen wurden 5×106 Typ-II-Zellen mit 0,5ml 0,1% SDS lysiert bzw. 0,5ml Heparin-Plasma bzw. 5ml BAL eingesetzt.


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3.7.3  PAF-ähnliche Substanzen (PAF-Related Compounds, PAF-RC)

Die Messung der PAF-ähnlichen Substanzen (PAF-RC) erfolgte nach Lipidextraktion, Derivatisierung und HPLC-Trennung nach Frey et al. (2000). Die Lipide von 107 Typ-II-Zellen in 0,5ml PBS bzw. 0,5ml Heparin-Plasma bzw. 12ml BAL (nach Zentrifugation bei 100.000×g für 1h) wurden mit 2ml Methanol, 1ml Dichlormethan und 0,5ml H2O extrahiert, 0,5nmol 1-Palmitoyl-2-Suberoyl-Phoshpatidylcholin diente als interner Standard. Der Lipidextrakt wurde mit 300µl 0,1M 9-(Chloromethyl)-Anthracen in Benzen/Triethylamin (4:1) 2h bei 70°C derivatisiert. Die Phospholipide wurden anschließend auf der Extract-Clean-Silica-Kartusche (200mg/3,0ml Alltech, Unterhaching) erst mit 4ml Chloro­form/Triethylamin (9:1), anschließend mit 4ml Methanol/Ammoniak (32%; 95+5) eluiert.

Das Eluat wurde mittels HPLC getrennt (Silica-Phase, Lichrosorb Silica Säule 100; 5µm, 60x8mm), als Laufmittel diente Acetonitril/H2O (88:12). Die Trennung erfolgte bei einem Fluss von 2,5ml/min und einer Temperatur von 50°C. Die fluoreszenzmarkierten Phospho­lipide wurden bei einer Anregungswellenlänge von λ=360nm und einer Emissionswellen­länge von λ=460nm detektiert, im UV-Bereich wurde bei einer Wellenlänge von λ=205nm nicht derivatisiertes PC detektiert. Die am Ende des PC-Peaks eluierten PAF-RC wurden gesammelt und in einem zweiten Schritt auf einer RP-Säule C18 Säule Nucleosil 100 (10µm, 250x4mm) bei 50°C und einem Fluss von 1ml/min quantifiziert. Als Laufmittel diente Methanol/H2O (9:1) mit 20mM Cholinchlorid bis zur 29.Minute und Methanol/Acetonitril (9:1) mit 20mM Cholinchlorid ab der 31.Minute. Die Detektion erfolgte im Fluoreszenz­bereich wie oben beschrieben. PAF-RC wurden durch ihre relative Retentionszeit von 0,80 zum internen Standard identifiziert, die Quantifizierung erfolgte durch den Vergleich der Peakfläche von PAF-RC mit der des internen Standards.


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3.7.4  PAF-Acetylhydrolase (PAF-AH)

Die PAF-Acetylhydrolase-(PAF-AH)-Aktivität wurde durch Freisetzung von 3H-markierter Essigsäure aus 3H-PAF bestimmt (modifiziert nach Stafforini 1987): 0,6×106 Typ-II-Zellen wurden in 30µl 0,1% Triton X-100 aufgenommen, heparinisiertes Plasma wurde mit 100mM HEPES, 1mM EGTA (pH 7,2) 1:100 verdünnt, für Messungen in der BAL wurden 30µl eingesetzt. Der Substrat-Mix, bestehend aus 50µl=1,1×106dpm 1-Hexa-decyl-2-[3H]acetyl-sn-glycero-3-phosphorylcholin (DuPont) und 40µl PAF (10mM in Ethanol), wurde unter Stick­stoff getrocknet und in 1ml 0,01% Tween 20 wiederaufgenommen. Zu den Proben wurden 10µl 0,5M HEPES, 5mM EGTA (pH 7,2 bei 37°C) und 10µl Substrat-Mix zugegeben und 30min bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde mit 2,5ml Chloroform/Methanol (4:1) und 0,45ml 10mM Tris-Puffer (pH 7,4) gestoppt und mindestens 30sec kräftig gemischt. Die 3H-Aktivität wurde in 0,5ml des wässrigen Überstandes mit 4ml Szintillationsflüssigkeit im Szintilationscounter (Wallac 1410 Pharmacia, Uppsala, Schweden) gemessen.

3.7.5 Phospholipase A2 (PLA2)

Die Phospholipase-A2-(PLA2)-Aktivität wurde durch die Freisetzung von Fettsäuren aus 2‑[1-14C]-Arachidonyl-Phosphatidylethanolamin (14C-PE, NEN, Boston, USA) nach Nakamura et al. (1995) und Kim und Bonventre (1993) gemessen. 0,05ml Substrat (spezifische Radio­aktivität 55Ci/mol) wurde unter N2 getrocknet und in 0,1ml Dimethylsulfoxid (DMSO) resuspendiert. 2×106 Typ-II-Zellen, 0,1ml Heparin-Plasma (1:5 verdünnt), 0,1ml BAL in 75mM Tris-Base und 5mM CaCl2 (pH 8,5 bei 37°C) wurden mit 0,9nmol 14C-PE 60min bei 37°C inkubiert, anschließend mit 0,56ml Dole-Reagenz (48,75ml Isopropanol, 50ml n-Heptan, 1,25ml 0,5M Schwefelsäure) und 0,11ml H2O gestoppt (nach Dole und Meimertz 1961), gemischt und 3min bei 1900×g zentrifugiert. Die obere organische Phase wurde mit 25mg Kieselgel 60 (LiChroprep 60, Merck, Deutschland, Korngröße 15-25µm) und 0,85ml n-Heptan 5min bei 22°C inkubiert und anschließend 5min bei 1900×g zentrifugiert. 0,8ml des Überstandes mit freien Fettsäuren wurde mit 4ml Szintilationsflüssigkeit gemessen.


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3.8  Expression von Hitzeschockproteine (HSP)

Die Expression von Hitzeschockproteinen (HSP) wurde im Western Blot gemessen: 4×106 Typ-II-Zellen wurden in 0,5ml PBS lysiert, abzentrifugiert und in 40µl Lysepuffer (140mM NaCl, 1% Triton X-100, 10mM Tris, pH 7,5) aufgenommen. Nach Zentrifugation mit 1000×g, 4°C, 10min und Proteinbestimmung wurden 37µl des Überstandes mit 1,85µl 5mM EDTA, 0,5µl 1mM Dithiotreitol (DTT) und 0,95µl 0,4mM PMSF versetzt. Die Proben wurden mit Lämmli-Probenpuffer (2% SDS, 5% Glycerol, 10mM Dithiotreitol, 1% Brom­phenolblau, 62,5mM Tris-HCl, pH 6,8) auf 0,25µg/µl verdünnt und 5min bei 95°C inkubiert. Tabelle 3.1 zeigt die eingesetzten Proteinmengen von Typ-II-Zellen und Positiv-Kontrollen in der Elektrophorese.

Tabelle 3.1 Eingesetzte Proteinmengen für die HSP-Bestimmung

Hitzeschockprotein (HSP)

Positiv-Kontrolle

Typ-II-Zellen

HSP 32

5 ng

2 µg Protein

HSP 60

3 ng

4 µg Protein

HSP 70

15 ng

50 µg Protein

HSP 90

25 ng

5 µg Protein

HSP 32 entspricht der Hämoxygenase-1 (HO-1). Positiv-Kontrollen von der Firma Novex, Frankfurt/M, Deutschland.

Die Elektrophorese wurde in 12% SDS-Polyacrylamid-Gelen (Novex, Frankfurt/M, Deutschland) bei 30mA, 400-500V mit Lämmli-Puffer durchgeführt, als Molekulargewichts-Marker verwendeten wir MultiMarker Multi-Colored Standard (Novex, Frankfurt/M, Deutschland). Für den Western-Blot wurden das Elektrophoresegel und eine Polyvinyliden­difluorid-(PVDF)-Transfer-Membran in Transfer-Puffer (12mM Tris, 96mM Glycin, 20% Methanol) äquilibriert und bei 25V und 100mA 15-18h im TE Series Transphor Unit (Hoefer Scientific Instruments) bei 4°C geblottet. Die Transfereffizienz wurde mit Cromassie-Blau Färbung kontrolliert, anschließend wurde mit 100% Methanol und TBS (140mM NaCl, 3mM KCl, 16mM Tris, pH 7,4) gewaschen. Die PVDF-Membran wurde mit Blockierungslösung TBS-T [TBS mit 0,1% Polyoxyethylensorbitanmonolaureat (Tween) und 5% Magermilch­pulver] bei 4°C über Nacht blockiert. Danach wurde die Membran bei Raumtemperatur 60min mit 0,5µg/ml bzw. 2µg/ml für HSP 32 mit den primären Antikörpern (monoklonaler IgG1-Maus-Antikörper bzw. IgG2b-Maus-Antikörper für HSP 32, Stressgen Victoria, Kanada) in TBS inkubiert, als zweiter Antikörper wurde Meerrettich-Peroxidase-markiertes Schafs-


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Antimaus-IgG (DAKO, Dänemark; Verdünnung 1:2000) verwendet. Die Detektion erfolgte mit dem Hyperfilm ECL-System (Amersham, England) nach Angaben des Herstellers. Die Auswertung der optischen Dichte (OD) der Banden erfolgte dann mit der Software Pharmacia Image Master DTS Quantity One (Version 2.3).

3.9 Berechnungen und Statistik

Wurde die Konzentration der Proben mit Hilfe einer mitgeführten Standardreihe berechnet, war die Regressionsgerade der Standardwerte Grundlage für die Berechnung der Proben­werte; für das Bestimmtheitsmaß r2 galt dabei r2>0,95.

Die Ergebnisse werden als Mittelwert (MW) und Standardabweichung dargestellt. Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm SigmaStat der Firma SPSS Inc. (Version 2.03): Die Signifikanz wurde mit dem jeweils angegebenen Testverfahren berechnet, Unter­schiede von p<0,05 wurden dabei als signifikant angesehen.


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HTML-Version erstellt am:
09.06.2005