[Seite 45↓]

5  Diskussion

5.1 Zellkulturbedingungen als Stressfaktor

Im Allgemeinen wird angenommen, dass die Isolation der Zellen aus dem Zellverband einen Stressfaktor darstellt und die Zellen sich unter optimalen Bedingungen in der Zellkultur von diesem Stress erholen. Dies unterstützen die Ergebnisse von Brandes und Finkelstein, die kurz nach der Isolation eine hohe Synthese der HSP 70, 53 und 25 zeigen, welche im Laufe der Zellkultur abnimmt und nach 18h nicht mehr nachweisbar ist (1989). In dieser Arbeit dagegen zeigen wir, dass die HSP-Expression direkt nach der Isolation relativ gering ist und während der Zellkultur insbesondere die Expression von HSP 32 stark zunimmt (Kapitel 4.1.2).

Brandes und Finkelstein bestimmen die Proteinsynthese der Hitzeschockproteine, indem sie isolierte Typ-II-Zellen je 1 Stunde in Leucin-depletiertem Medium halten und anschließend mit [3H]-Leucin inkubieren, d.h. auch die Kontrollzellen werden 2 Stunden in der Zellkultur bei 37°C und Raumluft gehalten. Es ist daher denkbar, dass nicht die Isolation aus dem Zell­verband die Synthese der Hitzeschockproteine erhöht hat, sondern diese zweistündige Zell­kultur. Ein anderer Unterschied ist, dass Brandes und Finkelstein die Typ-II-Zellen mit Elastase/Tryspin-Verdauung mit anschließender Gradientenzentrifugation isolieren, wohin­gegen wir die Zellen durch Elastase-Verdauung und IgG-Reinigung nach Dobbs et al. (1986) gewinnen. Letztlich kann auch nicht ausgeschlossen werden, dass unterschiedliche Tier­spezies zu den widersprüchlichen Ergebnissen zur HSP-Expression führen, da Brandes und Finkelstein Typ-II-Pneumozyten aus Kaninchenlungen isolieren, während wir Typ-II-Zellen aus Rattenlungen verwenden.

Es gibt allerdings weitere Hinweise, dass allein die basalen Zellkulturbedingungen eine oxidative Belastung für die Zellen darstellen: So finden Buckley et al. (1998) nach in vivo Hyperoxie eine erhöhte Expression von proapoptotischen Markern wie p53, p21 und Bax sowie vermehrte DNA-Fragmentation lediglich in adhärenten Zellen, nicht aber in frisch isolierten Zellen. Auch steht ein Anstieg der HSP-32-Expression, wie wir ihn für Typ-II-Zellen im Verlauf der Zellkultur gezeigt haben, oft in Zusammenhang mit oxidativem Stress (Choi 1996).


[Seite 46↓]

Welche Prozesse diesen in vitro Stress auslösen, ist nicht bekannt; zum einen könnte der höhere Sauerstoffpartialdruck der Raumluft im Vergleich zum Gewebe diesen Stress verur­sachen, andererseits ist aber auch eine unzureichende Versorgung mit Antioxidantien durch das Zellmedium denkbar. Für eine mangelhafte Versorgung mit Antioxidantien in der Zell­kultur spricht, dass wir unter alimentärer Vitamin-E-Depletion einen ähnlich starken HSP-32-Anstieg wie in der Zellkultur finden (Topbas 2000), nicht jedoch unter H2O2-Belastung (Kapitel 4.1.2). Auch zeigen Risé und Galli (1999), dass Hep-G2-Zellen nur 0,5% des Vitamin-E-Gehaltes von Lebergewebe enthalten und dass FKS aus dem Kulturmedium diese Differenz nicht ausgleichen kann, da es selbst nur wenig mehr Vitamin E als die Zellen enthält. Allerdings haben auch die Matrix, auf der die Zellen wachsen, und die Zelldichte Auswirkungen auf die Schädigung der Zellen in Basalkultur.

Die im Laufe der Zellkultur sinkende Catalase-Aktivität (signifikant nach 48h, Kapitel 4.1.2) könnte auf den Beginn einer Differenzierung der Typ-II-Zellen zu Typ-I-Zellen zurückzu­führen sein, da Typ-I-Zellen im Vergleich zu Typ-II-Zellen eine um ein vielfaches geringere Aktivität an antioxidativen Enzymen wie Catalase oder SOD aufweisen (Panus 1989, Simon 1991, Kinnula 1992). Die meisten anderen Gruppen finden ebenfalls einen Rückgang der Aktivität von SOD (Aerts 1992) und Catalase (Kinnula 1992, Aerts 1992, Simon 1991) in der Zellkultur. Panus et al. (1989) dagegen messen einen Anstieg der SOD- und Catalase-Aktivi­tät. Der GSH-Gehalt bleibt in einer der Untersuchungen unverändert (Simon 1991) bzw. steigt sogar an (Aerts 1992). Wir finden jedoch einen deutlichen Abfall der GSH-Konzentration unter Zellkulturbedingungen (Kapitel 4.1.2). Diese unterschiedlichen Ergebnisse sind wahrscheinlich auf unterschiedliche Trägermedien, die für die Zellkultur verwendet werden, und die daraus folgenden unterschiedlichen Zeitpunkte in der Differenzierung zu Typ-I-Zellen zurückzuführen.

Zusammenfassend zeigen wir, dass in Abhängigkeit von der verwendeten Zellpräparation unterschiedliche Ergebnisse erzielt werden, insbesondere Untersuchungen von adhärenten Typ-II-Zellen spiegeln nicht die Wirkung verschiedener in vitro Behandlungen der Zellen wieder, sondern sind durch die basalen Kulturbedingungen verfälscht. Insgesamt müssen daher die Aussagen von einigen publizierten Ergebnissen relativiert werden.


[Seite 47↓]

Für weitere Untersuchungen ist es wichtig, die unzureichenden Zellkulturbedingungen zu verbessern, da es zum einen Versuche gibt, die z.B. aufgrund ihrer kurzen Inkubationszeit schwer in Zellsuspension mit der anschließenden Zentrifugation durchführbar sind. Zum anderen lässt sich die Reinheit der Typ-II-Zellen durch die Zellkultur verbessern: V.a. Erythrozyten kommen in unterschiedlichen Anteilen in der Zellpräparation vor und können die Untersuchungsergebnisse beeinflussen, sie sind aber durch fehlende Adhärenz in der Zellkultur relativ einfach von Typ-II-Zellen zu trennen (Dobbs 1986). Des Weiteren ist denkbar, dass Zelloberflächenproteine durch die Verdauung mit Elastase zerstört und im Laufe der Zellkultur regeneriert werden. Die begonnenen Untersuchungen zur Optimierung der Zellkultur (Panus 1989, Simon 1991, Aerts 1992, Buckley 1998) sind ein wesentlicher Beitrag, die experimentellen Schwierigkeiten und widersprüchlichen Ergebnisse zu minimieren.

5.2 Antioxidative Abwehr

5.2.1 Glutathion als schnelles Reaktionssystem nach H2O2-Belastung

Typ-II-Zellen enthalten relativ hohe Konzentrationen von GSH, welches sie aktiv aus dem Plasma durch das alveoläre Epithel in den Surfactant transportieren; der GSH-Gehalt der BAL ist so um ein Vielfaches höher als der des Plasmas (Brown 1992, Jenkinson 1988). Durch den Abbau von Peroxiden und Hydroperoxiden wirkt GSH antioxidativ, daneben reduziert es oxidierte Disulfide von Proteinen und erhält so ihre Struktur und Funktion (Jenkinson 1988, Cotgreave 1997).

Einen ähnlichen zeitlichen Verlauf wie die GSH-Konzentration unter H2O2-Belastung mit ihrem initalen steilen Abfall und der folgenden schnellen Erholung (Kapitel 4.1.2, Abbildung 4.1) zeigt die GSH-Konzentration von Erythrozyten, die mit H2O2 inkubiert werden (Clahsen 1992, Moison 1995). Es wird daher vermutet, dass die Erythrozyten sowohl die pulmonalen Endothelzellen als auch die gesamte Lunge vor oxidativer Schädigung schützen (Moison 1995). Dieser Schutzmechanismus trifft allerdings für die Typ-II-Zellen nicht zu, da Typ-II-Zellen keine direkte Verbindung mit den Blutkapillaren haben und somit nicht in direkten Kontakt zu Erythrozyten treten können.


[Seite 48↓]

Zum antioxidativen Potential der Lunge trägt GSH aufgrund seiner hohen Konzentration in der Lunge und der eigenen antioxidativen Kapazität (Miller 1993) entscheidend bei. Das anti­oxidative Potential eines Gewebes kann z.B. durch die totale antioxidative Kapazität (TAC) erfasst werden. Der parallele Verlauf der TAC und der GSH-Konzentration mit dem steilen Abfall und der schnellen Regeneration innerhalb von 10min unter H2O2 bestätigt, dass die GSH-Konzentration maßgeblich für die TAC ist (Kapitel 4.1.2). Der Abfall der GSH-Konzen­tration nach 6×10min bei unveränderter TAC könnte mit der Annahme erklärt werden, dass andere Antioxidantien nach 60min den GSH-Abfall kompensieren.

Eine wichtige Einschränkung der TAC ist, dass sie nur im hydrophilen Medium gemessen wird und daher z.B. das lipophile Vitamin E nur zu 3% in die TAC im Plasma eingeht (Miller 1993). Entsprechend zeigt sich der Abfall der Vitamin-E-Konzentration nach 30min nicht in einem Abfall der TAC (Kapitel 4.1.2).

5.2.2  Erhöhte Catalase/Superoxiddismutasen-Aktivität nach H2O2-Stress

H2O2 dringt innerhalb von 10min (Kapitel 4.1.2) in die Zelle ein und wird durch Catalase zu Sauerstoff und Wasser abgebaut. H2O2 kann aber auch in der Fenton-Haber-Weiss-Reaktion durch Metallkatalyse ([LINK to cms:entry] ) Superoxidanionradikale (•O2 ) generieren, die dann durch Superoxiddismutasen (SOD) wieder in das ungefährlichere H2O2 zurückverwandelt werden (nach Elstner 1983, Aebi 1983).

Abbildung 5.1 SOD/Catalase-System.

H2O2-Inkubation erhöht die Catalase- und SOD-Aktivität der Typ-II-Zellen (Kapitel 4.1.2), wobei auffällt, dass insbesondere bei mehrfachem Zusatz von H2O2 die SOD-Aktivität stark ansteigt, wohingegen sie bei einmaliger H2O2-Gabe nur leicht und erst nach 60min erhöht ist. Die Catalase-Aktivität jedoch wird durch ein- oder mehrfache H2O2-Gabe nicht beeinflusst (Kapitel 4.1.2). Eine mögliche Erklärung ist, dass die •O2 –Radikale, die von den SOD abgebaut werden, hauptsächlich bei längerer und wiederholter H2O2-Exposition entstehen und dadurch eine stärkere Erhöhung der SOD-Aktivität induziert wird. Es kann aber auch nicht ausgeschlossen werden, dass die Expressionsrate beider Enzyme innerhalb des untersuchten Zeitintervalls stark differiert und dadurch die unterschiedlichen Aktivitäten nach H2O2-Gabe verursacht werden.


[Seite 49↓]

5.2.3  Einfluss von Hyperoxie auf die pulmonale antioxidative Abwehr

Cao et al. (1999) vermuten, dass unter Hyperoxie niedermolekulare Antioxidantien aus der Lunge in das Serum wandern, da sie unter Hyperoxie einen Abfall der pulmonalen neben einer Erhöhung der plasmatischen proteinfreien antioxidativen Kapazität finden. Wir können dagegen bei subletaler Hyperoxie in vivo keine Veränderung der gesamten totalen antioxida­tiven Kapazität (TAC) der Typ-II-Zellen nachweisen (Kapitel 4.1.1), allerdings haben wir auch die totale antioxidative Kapazität inklusive der Proteine gemessen.

Hyperoxie in vivo führt bei unveränderter Catalase-Aktivität zu einem starken Anstieg der SOD-Aktivität (Kapitel 4.1.1) in den Typ-II-Zellen. Wie schon in 5.1.1 diskutiert, kann spekuliert werden, dass unter Hyperoxie bevorzugt •O2 entsteht, so dass vor allem die Aktivität der SOD ansteigt, während die Aktivität des H2O2-abbauenden Enzyms Catalase unverändert ist. Allerdings ist auch hier eine unterschiedliche Expressionsrate beider Enzyme im Beobachtungszeitraum nicht auszuschließen.

Auch andere Autoren fanden eine erhöhte SOD-Aktivität unter Hyperoxie, es wurde daher vermutet, dass die Superoxiddismutasen für die pulmonale Adaptation unter Hyperoxie eine entscheidende Rolle spielen (Chang 1995, Quinlan 1994). Allerdings zeigen Frank et al. (1978) und Baker et al. (1989), dass eine Erhöhung der Aktivität antioxidativer Enzyme nicht mit der Überlebensrate oder dem Grad der Lungenschädigung unter Hyperoxie korreliert.

5.3 H2O2 hemmt die Surfactantlipidsynthese

Mehrere Untersuchungen zeigen, dass unter oxidativem Stress sowohl die Gesamtmenge als auch einzelne Komponenten des Surfactants abnehmen (Holm 1988, Holm 1991, Crim 1995, Rice 1992). Zum einen könnte die Synthese von Surfactantbestandteilen gehemmt werden, zum anderen ihr Abbau so verändert sein, dass ein erhöhter Verbrauch von Surfactantlipiden z.B. durch Oxidation nicht kompensiert werden kann.

Wir finden neben einer H2O2-induzierten Hemmung der PC-Synthese eineVerminderung des initialen Fettsäure-Uptakes bei Typ-II-Zellen (Kapitel 4.1.2). Palmitinsäure wird von Typ-II-Pneumozyten durch CD-36/FAT aufgenommen (Guthmann 1999), es ist daher denkbar, dass CD36/FAT durch H2O2 oxidiert wird und dadurch nicht mehr in der Lage ist, Fettsäuren in die Zelle zu transportieren. Andererseits würde auch ein ATP-Mangel, wie er mehrfach unter H2O2 beschrieben ist (LaCagnin 1990, Abernathy 1995, Crim 1995), die Fettsäureaufnahme vermindern können.


[Seite 50↓]

Der Einbau von Palmitinsäure und Cholin wird durch H2O2 schon nach 5min gehemmt, zu einem Zeitpunkt, wo die Fettsäureaufnahme noch unverändert ist (Kapitel 4.1.2). Dies spricht dafür, dass die Hemmung von Schlüsselenzymen wie der Glycerol-3-Phosphat-Acetyltrans­ferase (GPAT) ([LINK to cms:entry] ) eine entscheidende Rolle spielt. Guthmann et al. (2003) zei­gen in diesem Zusammenhang, dass die Hemmung der G3P-Acetyltransferase für die Reduk­tion der PC-Synthese bei Typ-II-Zellen aus Vitamin-E-depletierten Ratten verantwortlich ist. Da sowohl die GSH- als auch die Vitamin-E-Konzentration unter H2O2 abfallen (Kapitel 4.1.2), ist denkbar, dass das SH-haltige Enzym GPAT nicht ausreichend vor Oxidation geschützt und so inaktiviert wird.

5.4  Lipidperoxidation

5.4.1  In vivo Hyperoxie verändert die Lipidperoxidation in der Lunge nicht

Die PAF-Acetylhydrolase (PAF-AH) reguliert den Abbau von PAF und PAF-ähnlichen Substanzen (PAF-RC) und spielt daher eine wichtige Rolle bei der akuten und chronischen Lungenschädigung. Die Hemmung der PAF-AH-Aktivität in der Lunge unter Hyperoxie führt allerdings nicht zu einem Anstieg von Produkten der Lipidperoxidation (Kapitel 4.1.2). Auch Ambrosio et al. (1994) finden keine erhöhte MDA-Konzentration bei einer durch ROS-induzierten Hemmung der PAF-AH im Plasma. Wir zeigen, dass in der P3-Subfraktion, die den frisch sezernierten Surfactant repräsentiert, ebenso wie in den Typ-II-Zellen, die PAF-AH-Aktivität durch Hyperoxie nicht beeinflusst wird, wohingegen in den Makrophagen, dem Überstand und der P5-Subfraktion die PAF-AH-Aktivität sinkt. Wir nehmen an, dass das Enzym durch die Struktur der Lamellarkörperchen in den Typ-II-Zellen und/oder durch das höhere antioxidative Potential der Zellen und der verschiedenen BAL-Fraktionen geschützt wird.

Aus unseren Ergebnissen schließen wir, dass weder die hyperoxisch-bedingte Inhibition der PAF-AH-Aktivität noch die direkte Oxidation der Lipide in den Alveolen an der hyper­oxischen Lungenschädigung beteiligt sind. Es kann spekuliert werden, dass die empfindlich­eren vaskulären Endothelzellen der Lunge (Crapo 1980, Engstrom 1990) unter Hyperoxie direkt geschädigt werden, die Typ-II-Pneumozyten und der Surfactant dagegen aufgrund ihres höheren antioxidativen Potentials keine erhöhte Lipidperoxidation aufweisen. Es ist jedoch nicht auszuschließen, dass in der Lunge entstandene Lipidperoxidationsprodukte ins Plasma transportiert werden und dann dort nachweisbar sind.


[Seite 51↓]

5.4.2  In vitro H2O2 führt zu Lipidperoxidation in den Typ-II-Pneumozyten

Unter H2O2-Stress finden wir zunächst eine kurzzeitig erhöhte Aktivität von PAF-AH, die dann im Laufe der Inkubationszeit abnimmt (Kapitel 4.1.2); wir vermuten, dass die beschrie­bene Oxidation des PAF-AH-Proteins durch ROS (Triggiani 1997, Ambrosio 1994) diese Aktivitätsveränderungen auslöst. Die Aktivität der PLA2 bleibt im Gegensatz zur PAF-AH nach 60min noch leicht, allerdings nicht signifikant, erhöht (Kapitel 4.1.2). In Überein­stimmung mit unseren Ergebnissen finden Rice et al. (1992) unter H2O2 einen Anstieg der Konzentration von freien Fettsäuren durch eine verstärkte Aktivität der PLA2.

H2O2-Inkubation führt nach 5min zu einem Anstieg der Konzentrationen von Lipidhydroper­oxiden und PAF-RC in den Typ-II-Zellen, zu einem Zeitpunkt also, wo die Aktivitäten der PAF-AH und der PLA2 sogar erhöht sind (Kapitel 4.1.2). Wir vermuten, dass die initial hohe H2O2-Konzentration die oxidative Abwehr der Zellen überwältigt und deshalb eine Oxidation der Lipide durch Antioxidantien wie Vitamin E nicht verhindert werden kann. Wie aber schon für Hyperoxie gezeigt, besteht auch unter H2O2-Stress zwischen der ROS-induzierter Hemmung der PAF-AH und der Lipidperoxidation kein direkter Zusammenhang.

5.5  Erhöhte Expression von Hitzeschockproteinen unter H2O2

HSP können die Expression anderer Proteine, z.B. der Akute-Phase-Proteine der Leber, stoppen und die Induktion der Apoptose verhindern. Bei der Induktion der HSP-Expression durch ein Stressagens wird auch der Schutz vor anderen Agentien erhöht (additiver Effekt). Verschiedenste Stressformen induzieren einen teilweise drastischen An­stieg der Expression zytoprotektiver HSP (Hightower 1991, Wong 1997, Wong 1998).

Die HSP-Expression wird durch den Transkriptionsfaktor „Heat Shock Factor“ (HSF) geregelt, der normalerweise als Monomer an Hitzeschockproteine bindet. Bindet z.B. HSP 70 bei oxidativem Stress an geschädigte Proteine, werden die Monomere freigesetzt und bilden Trimere, die dann als Transkriptionsfaktor wirken (Hightower 1991, Wong 1997).


[Seite 52↓]

Hämoxygenase-1 (HO-1), oder HSP 32, katalysiert den ersten Schritt des oxidativen Zerfalls von Hämoglobin zu Bilirubin; dabei entstehen neben freiem Eisen und dem vasodilatativ wirkenden Kohlenmonoxid (CO), welches die Sauerstoffversorgung der beschädigten Zellen sichern kann (Wong 1997), auch die Antioxidantien Bilirubin und Ferritin. Unter H2O2-Stress steigt die Expression von HSP 32 allerdings nur gering an (Kapitel 4.1.2).

Im Gegensatz dazu finden wir, ebenso wie Polla et al. (1996), einen sehr starken Anstieg von HSP 70 unter H2O2-Belastung (Kapitel 4.1.2). Auch durch in vivo Hyperoxie (Ho 1996), beim Asthma bronchiale, beim Ischämie/Reperfusions- und Entzündungsstress (Wong 1997) kommt es zu einem Anstieg der HSP-70-Expression in der Lunge. HSP 70 reguliert durch verschiedene Mechanismen die Reifung der Apoptosomen und verhindert so die Caspase 9-Aktivierung und die Einleitung des letzten Teils der apoptotischen Kaskade (Xanthoudakis 2000). Insgesamt gilt HSP 70 als das durch Stress am stärksten induzierbare HSP und wirkt im Zytoplasma, im endoplasmatischen Retikulum und in den Mitochondrien als Chaperon (Polla 1996, Wong 1997, Welch 1992).

H2O2 führt lediglich zu einem leichten Anstieg der HSP-90-Expression (Kapitel 4.1.2). HSP 90 wird mit der Aktivität des Steroidrezeptors in Verbindung gebracht und aktiviert zusam­men mit HSP 70 verschiedene Transkriptionsfaktoren (Hightower 1991, Wong 1997), seine exakte Funktion ist aber noch nicht geklärt.

Insgesamt kann spekuliert werden, ob für die Typ-II-Zellen, da sie selbst einen relativ hohen Gehalt an Antioxidanten besitzen (Kapitel 1.1), die antioxidative Funktion von HSP 32 weniger entscheidend ist und seine Expression deshalb unter H2O2 nur gering ansteigt. Da­gegen finden wir unter H2O2-Stress eine vermehrte Expression der Stressproteine, für die eine antiapoptotische Wirkung gezeigt werden konnte. Weitere Untersuchungen müssen allerdings zeigen, ob dies tatsächlich eine aktive Gegenregulation zur Einleitung des programmierten Zelltodes der Typ-II-Zellen darstellt.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
XDiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
09.06.2005