Hyperoxie Antioxidative Abwehr

Der Einfluss von Hyperoxie auf alle Antioxidantien im Gewebe kann durch die Messung der totalen antioxidativen Kapazität (TAC) erfasst werden, deren größter Anteil Glutathion (GSH) darstellt: Es macht ca. 90% der intrazellulären nicht-proteingebundenen Thiole der Zelle aus und ist somit eines der wichtigsten Antioxidantien der Zelle (Jenkinson 1988). GSH wirkt antioxidativ, indem es zu Glutathiondisulfid (GSSG) oxidiert wird, welches durch die Glutathionreduktase wieder zu GSH reduziert wird. Unter physiologischen Bedingungen beträgt die Konzentration von GSSG ca. 0,2-1% der gesamten GSH-Konzentration.

Catalase und Superoxiddismutasen (SOD) sind wichtige antioxidative Enzyme der Typ-II-Zellen: Das unter Hyperoxie entstehende Superoxidanionradikal (•O₂ ^―) wird von SOD zu H₂O₂ abgebaut, welches wiederum von Catalase zu O₂ und H₂O abgebaut wird.

TAC – totale antioxidative Kapazität, GSH – reduziertes Glutathion, GSSG – oxidiertes Glutathion, SOD – Superoxiddismutasen; Werte in % von Kontrolle ± Standardabweichung, Kontrollwerte: TAC 58,8 ± 6,9nmol/mg Protein, GSH 34,8 ± 5,9nmol/mg Protein, Catalase 100 ± 12mU/mg, SOD 7,5 ± 1,73mU/mg Protein; n: Anzahl der unabhängigen Experimente, *p<0,05 (paariger Student´s t-test).
Antioxidanz

Kontrolle

Hyperoxie

TAC (n=3)

100%

105 ± 20%

GSH (n=2)

100%

77 / 75%

GSSG (n=2)

100%

118 / 120%

Catalase (n=5)

100%

89 ± 30%

SOD (n=3)

100%

308 ± 73% *

Tabelle 4.1 Einfluss von in vivo Hyperoxie auf antioxidative Parameter von frisch isolierten Typ-II-Zellen

Unter Hyperoxie finden wir keine Veränderungen der TAC der Typ-II-Pneumozyten (Tabelle 4.1), auch im Plasma und in der Bronchoalveolären Lavage (BAL) lässt sich keine Veränderung der TAC nachweisen (nicht gezeigt). Unter Hyperoxie kommt es des Weiteren zu einem leichten Abfall des Anteils von reduziertem GSH sowie einem Anstieg des GSSG-Anteils. Die Aktivität der Catalase wird durch Hyperoxie nicht beeinflusst, wohingegen die SOD-Aktivität stark ansteigt - bei großer Standardabweichung lagen alle gemessen Einzelwerte der SOD über 200% der Kontrollwerte.

Lipidperoxidation

Da die Typ-II-Zellen auf oxidativen Stress durch Hyperoxie v.a. mit einem Anstieg der SOD-Aktivität reagieren, während die anderen gemessenen Parameter nur geringe bzw. keine Veränderungen zeigen, stellt sich die Frage, ob eine Schädigung durch Hyperoxie eintritt, indem z.B. Surfactantlipide oxidiert werden. Um diese Arbeitshypothese zu prüfen, haben wir die Konzentration von Malondialdehyd (MDA), Lipidhydroperoxiden (LOOH) und die PAF-ähnlichen Substanzen (PAF-Related Compounds, PAF-RC) bestimmt. MDA und LOOH sind Abbauprodukte der Radikalkettenreaktion (s.a. Abbildung 1.5), PAF-RC entstehen durch oxidative Kettenverkürzung der ungesättigten Fettsäuren in sn-2 Position des Phosphatidylcholins, ihre Konzentration im Gewebe wird durch PAF-Acetylhydrolase (PAF-AH) und Phospholipase A₂ (PLA₂) reguliert.

MDA – Malondialdehyd; LOOH – Lipidhydroperoxide; PAF-RC – PAF-ähnliche Substanzen; PAF-AH – PAF-Acetylhydrolase; PLA₂ – Phospholipase-A₂; Werte in % der Kontrolle ± Standardabweichung; Kontrollwerte Plasma: MDA: 1,88 ± 0,36 nmol/ml; LOOH: 2,17 ± 0,69 nmol/ml; PAF-RC: 0,41 ± 0,15pmol/ml; PAF-AH: 32,4 ± 3,3nmol/min/ml; Kontrollwerte BAL: MDA 0,79 ± 0,21 mmol/mg Protein; LOOH: 0,30 ± 0,12 mmol/mg Protein; PAF-RC: 0,06 ± 0,03 mmol/mg Protein; PAF-AH: 3,7 ± 1,1nmol/min/mg Protein; n: Anzahl der unabhängigen Experimente, *p<0,05 (paariger Student´s t-test) vs. Kontrolle.
Plasma

BAL

Kontrolle

Hyperoxie

Kontrolle

Hyperoxie

MDA (n=6)

100%

130 ± 19% *

100%

108 ± 26%

LOOH (n=3)

100%

260 ± 77% *

100%

122 ± 53%

PAF-RC (n=5)

100%

264 ± 55% *

100%

133 ± 33 %

PAF-AH (n=3)

100%

109 ± 6%

100%

32 ± 5% *

PLA₂ (n=4)

100%

98 ± 11%

100%

76% ± 41%

Tabelle 4.2 Einfluss von in vivo Hyperoxie auf die Lipidperoxidation und auf die Aktivität der antioxidativen Enzyme PAF-AH und PLA₂ im Plasma und in der Bronchoalveolärer Lavage (BAL)

Tabelle 4.2 zeigt, dass Hyperoxie zu einem signifikanten Anstieg der Lipidperoxidation im Plasma führt, wobei die Aktivität der antioxidativen Enzyme PAF-AH und PLA₂ unverändert bleibt. In der Lavage dagegen fällt die Aktivität der PAF-AH auf ein Drittel, während keine Veränderung der Lipidperoxidation oder der PLA₂-Aktivität nachweisbar ist. Beide Ergebnisse passen insofern nicht zusammen, als eine verminderte PAF-AH-Aktivität zu erhöhten PAF-RC in der BAL führen sollte. Möglich ist, dass PAF-AH nicht in den Surfactant-Subfraktionen lokalisiert ist, die die Substrate der PAF-RC enthalten: Wir haben deshalb den Einfluss von Hyperoxie auf die Aktivität der PAF-AH in den verschiedenen Subfraktionen der Lavage untersucht. Die Surfactantsubfraktionen wurden dabei durch Differentialzentrifugation der Lungenlavagen isoliert (nach Guthmann 1999).

BAL - Bronchoalveolären Lavage, Daten aus n=3 unabhängige Experimente, *p<0,05 (paariger Student´s t-test) vs. Kontrolle.
Fraktion

Kontrolle

Hyperoxie

[nmol/h/mg Protein ]

[nmol/h/mg Protein]

% von Kontrolle

Makrophagen

46 ± 9

23 ± 7 *

50%

Typ-II-Pneumozyten

33 ± 3

36 ± 4

109%

BAL

222 ± 60

69 ± 11 *

31%

P3 (1000×g; 20min)

33± 17

30 ± 15

91%

P4 (60 000×g; 60min)

79 ± 30

31 ± 17

39%

P5 (100 000×g; 16h)

51 ± 18

16 ± 4 *

31%

Überstand

28 ± 2

15 ± 7 *

54%

Tabelle 4.3 PAF-AH-Aktivität in Lungenzellen und verschiedenen Fraktionen der BAL: Einfluss von in vivo Hyperoxie

In den Fraktionen P4 und P5, die den Surfactantmonolayer repräsentieren (Magoon 1983, Guthmann 1995), messen wir die höchste PAF-AH-Aktivität. Zusammen mit der P3-Fraktion, die dem frisch sezernierten Surfactant entspricht, enthalten diese Fraktionen ca. 75% des totalen Surfactants. Es fällt auf, dass die PAF-AH-Aktivität unter Hyperoxie lediglich in den Makrophagen, der P5-Fraktion und im Überstand signifikant abnimmt, d.h. in den Anteilen des Surfactants, die für die Oberflächenfunktion des Surfactants weniger bedeutend sind.

Zusammenfassend finden wir unter Hyperoxie:

Keine Veränderung der totalen antioxidativen Kapazität in Plasma, BAL und Typ-II-Zellen. In den Typ-II-Zellen kommt es zu einem Abfall des Anteils von reduziertem GSH und einer Erhöhung des Anteils von oxidiertem GSSG (Tabelle 4.1).
Die Aktivität des antioxidativen Enzyms Catalase bleibt unverändert, die SOD-Aktivität dagegen steigt auf das dreifache an (Tabelle 4.1).
In der Lunge ist keine Lipidperoxidation messbar, im Plasma zeigt sich jedoch ein Anstieg der MDA-, LOOH- und PAF-RC-Konzentration (Tabelle 4.2).
Die plasmatische PAF-AH-Aktivität bleibt dabei unverändert, während die PAF-AH-Aktivität in der Lunge auf ein Drittel absinkt (Tabelle 4.2). Die PAF-AH nimmt v.a. in den funktionell weniger wichtigen Subfraktionen des Surfactants ab (Tabelle 4.3).

Kultivierung von Typ-II-Pneumozyten in Gegenwart von H₂O₂ Einfluss der Zellkulturbedingungen

Wie in Kapitel 1.2 diskutiert, wurde wegen widersprüchlicher Ergebnisse bei Untersuchungen mit dem Ganztiermodell ein vereinfachtes Modell gesucht: Dazu werden Typ-II-Pneumozyten in Primärkultur unter Basalbedingungen (Raumluft und 37°C) in der Kultur gehalten und in Gegenwart von H₂O₂ inkubiert. Da nicht auszuschließen ist, dass allein die basalen Kulturbedingungen einen Stressfaktor darstellen, haben wir zunächst untersucht, inwieweit die Kultivierung der Zellen unter Basalbedingungen einen Einfluss auf das antioxidative Potential oder die HSP-Expression hat.

SOD – Superoxiddismutasen-Aktivität, TAC – totale antioxidative Kapazität, GSH – Glutathion, HSP – Expression der Hitzeschockproteine, Vergleich von frisch isolierten Zellen (Zellsuspension) und adhärenten Zellen nach 18h Zellkultur. Werte in % Kontrolle ± Standardabweichung bzw. Optische Dichte (OD) der Western Blots für HSP; Kontrollwerte: Catalase 128 ± 14mU/mg Protein, SOD 7 ± 1,32mU/mg Protein, TAC 53 ± 5,3µmol/mg Protein, GSH 38 ± 4,1nmol/mg Protein; n: Anzahl der unabhängigen Experimente, *p<0,05 (Student´s t-test) vs. Zellsuspension.

Zellsuspension

adhärente Zellen (18h)

Catalase (n=4)

100 ± 11%

63 ± 43%

SOD (n=3)

100 ± 19%

100 ± 30%

TAC (n=3)

100 ± 10%

139 ± 59%

GSH (n=3)

100 ± 12%

40 ± 16% *

HSP 32 (n=2)

1

9,02 / 3,04

HSP 60 (n=2)

1

1,07 / 0,47

HSP 70 (n=2)

1

2,29 / 1,51

HSP 90 (n=2)

1

1,39 / 1,81

Tabelle 4.4 Einfluss einer 18-stündigen Zellkultur auf die Aktivität der antioxidativen Enzyme Catalase und SOD, die totale antioxidative Kapazität (TAC), den GSH-Gehalt sowie die HSP-Expression von Typ-II-Zellen

Die Inkubation von Typ-II-Zellen unter Primärkulturbedingungen führt zu einem deutlichen Abfall der GSH-Konzentration, während die Zellkultur keinen Einfluss auf die totale antioxidative Kapazität (TAC) oder die SOD-Aktivität hat. Der Abfall der Catalase-Aktivität nach 18h ist nicht signifikant, fällt aber im Laufe der Kultur weiter und erreicht nach 48h signifikante Werte (nicht gezeigt).

Die Expression von HSP 32 steigt dagegen während der Kultivierung der Zellen deutlich an. HSP 70 und 90 zeigen einen weniger starken Anstieg in der Zellkultur, HSP 60 zeigt keine Veränderung.

H₂O₂-Clearance

Um auszuschließen, dass ein unterschiedlicher Gehalt von Makrophagen und Lymphozyten, die in den Typ-II-Zellpräparationen als Verunreinigung enthalten sind, unsere Messergebnisse verfälschen, haben wir die Zusammensetzung der Zellpräparation vor und nach der Inkubation mit H₂O₂ im Durchflußzytometer (FACS) gemessen: Dabei zeigt sich kein Unterschied von H₂O₂-behandelten und Kontrollzellen (nicht gezeigt). Um des Weiteren den Einfluss von H₂O₂ auf die Vitalität der Typ-II-Zellen zu messen, haben wir nach Inkubation mit H₂O₂ zum einen eine Vitalitätsfärbung mit 0,02% Trypanblaulösung durchgeführt, zum anderen wurde die Aktivität der Lactatdehydrogenase (LDH) im Zellmedium gemessen: Beide Parameter zeigen ebenfalls keinen Unterschied zu den Kontrollzellen (nicht gezeigt).

In der Literatur gibt es unklare Angaben darüber, wie schnell H₂O₂ aus dem Inkubationsmedium von den Zellen aufgenommen und verstoffwechselt wird (Simon 1991, Engstrom 1990). Wir haben daher die H₂O₂-Clearance von adhärenten Typ-II-Pneumozyten untersucht (Tabelle 4.5). Um auszuschließen, dass unter unseren Inkubationsbedingungen H₂O₂ im Zellmedium abgebaut wird, haben wir H₂O₂in zellfreiem Medium (DMEM) inkubiert, unter diesen Bedingungen bleibt die H₂O₂-Konzentration unverändert (nicht gezeigt).

Adhärenten Zellen wurden mit 0,5mM H₂O₂ inkubiert, zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die verbleibende H₂O₂-Konzentration im Kulturmedium gemessen. Werte ± Standardabweichung; Daten aus n=3 unabhängigen Experimenten; *p<0,05 (ANOVA) vs. Ausgangskonzentration.
Inkubationszeit mit H₂O₂

0min

1min

2min

5min

10min

30min

500µM

225 ± 12µM *

96 ± 67µM *

41 ± 46µM *

0 ± 1µM *

0µM

Tabelle 4.5 Einfluss der H₂O₂-Inkubationszeit auf die H₂O₂-Clearance adhärenter Typ-II-Zellen

Tabelle 4.5 zeigt, dass nach 10min kein H₂O₂im Kulturmedium mehr nachzuweisen ist, deshalb haben wir haben bei einigen der folgenden Versuche nach 10min die Zellen erneut mit H₂O₂-haltigem Medium inkubiert.

Antioxidative Abwehr

Eines der wichtigsten Schutzsysteme der Zellen gegen oxidativen Stress ist das Glutathion (GSH/GSSG)-System: Oxidiertes GSSG wird durch die Glutathionreduktase wieder in GSH umgewandelt, das dafür notwendige NADPH wird durch den Pentosephosphatzyklus mit dem Schlüsselenzym Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase zur Verfügung gestellt (Griffith 1983). Unter oxidativem Stress kann GSH aber auch mit anderen SH-Gruppen zu sog. gemischten Disulfiden reagieren (Ishii 1992). Wir haben hier den Einfluss von H₂O₂ auf die Konzentration des gesamten GSH gemessen.

Um das gesamte antioxidative Potential der Zellen abschätzen zu können, haben wir die totale antioxidative Kapazität (TAC) bestimmt, weiterhin die Konzentration der lipophilen Antioxidantien Vitamin E und der polyungesättigten Fettsäuren (PUFA), einem möglichem Substrat der ROS. PUFA werden dabei leicht oxidiert und können durch den Verbrauch von ROS die Oxidation anderer Zellbestandteile verhindern; sie wirken deshalb antioxidativ (Sies 1993).

GSH – Glutathion-Konzentration, TAC – totale antioxidative Kapazität, Vitamin-E-Konzentration, PUFA – polyungesättigten Fettsäuren; Werte in % der Kontrolle ± Standardabweichung; Kontrollwerte: GSH 34,8 ± 5,9nmol/mg Protein; TAC 76,6 ± 5,36µmol/mg Protein, Vitamin E 6,0 ± 0,4ng/10⁶ Typ-II-Zellen, PUFA/Palmitinsäure 0,43 ± 0,081. n: Anzahl der unabhängigen Experimente; *p<0,05 (ANOVA: Dunnett´s Test) vs. Kontrolle, n.b. nicht bestimmt.
Zeit nach H ₂ O ₂ -Gabe

GSH

TAC

Vitamin E

PUFA

[min]

n=5

n=3

n=3

n=2

Kontrolle

100 ± 17%

100 ± 7%

100 ± 6%

100 ± 19%

5min H₂O₂

62 ± 19% *

68 ± 7% *

86% (n=1)

n.b.

10min H₂O₂

88 ± 25%

105 ± 18%

79% (n=2)

104 ± 32%

3×10min H₂O₂

97 ± 6%

95±12%

73 ± 7% *

118 ± 26%

6×10min H₂O₂

62 ± 17% *

113 ± 18%

n.b.

69 ± 36%

Tabelle 4.6 Einfluss der Inkubation adhärenter Typ-II-Zellen in Gegenwart von 0,5mM H₂O₂ auf die Konzentration verschiedener Antioxidantien

Abbildung 4.1 Einfluss der Inkubation adhärenter Typ-II-Zellen in Gegenwart von 0,5mM H₂O₂ auf die GSH-Konzentration.

Bei der Inkubation von Typ-II-Zellen mit H₂O₂ verlaufen die GSH-Konzentration und die TAC zunächst parallel: Nach einem steilen Abfall innerhalb der ersten 5min wird die GSH-Konzentration schnell regeniert und erreicht nach 10min wieder Kontrollwerte. Im weiteren Verlauf fällt die GSH-Konzentration aber im Gegensatz zur TAC wieder langsam ab und erreicht nach 6×10min 60% der Ausgangskonzentration (p<0,05). Es scheint daher, dass GSH die Typ-II-Zellen vor allem vor dem initialen oxidativen Stress schützt.

Unter H₂O₂ fällt der Vitamin-E-Gehalt dagegen kontinuierlich über die gesamte Inkubationszeit ab, der Anteil des Vitamin E-Chinons bleibt dabei unverändert (nicht gezeigt). Die PUFA-Konzentration zeigt keinen Unterschied zur Kontrolle, auch die Anteile der Arachidonsäure (20:4) und der Linolsäure (18:2) werden durch H₂O₂ nicht beeinflusst (nicht gezeigt). Es kann spekuliert werden, dass Vitamin E in der Lage ist, die PUFA effektiv vor oxidativer Schädigung zu schützen.

Neben der Konzentration der Antioxidantien haben wir die Aktivität der antioxidativen Enzyme Catalase und Superoxiddismutasen (SOD) in den Typ-II-Zellen gemessen (Tabelle 4.7).

SOD – Superoxiddismutasen. Werte in % von Kontrolle ± Standardabweichung; Kontrollwerte: Catalase 100 ± 12mU/mg, SOD 7,5 ± 1,73mU/mg; Daten aus n=3 unabhängigen Experimenten; *p<0,05 (ANOVA) vs. Kontrolle, #p<0,05 (Student´s t-test) vs. 30min.
Zeit nach H ₂ O ₂ -Gabe

Catalase

SOD

Kontrolle

100 ± 12%

100 ± 23%

10min

138 ± 60%

269 ± 142% *

30min

136 ± 42%

103 ± 28%

60min

172 ± 32% *

173 ± 18%

3×10min

117 ± 36%

259 ± 90% *#

6×10min

132 ± 39%

268 ± 97% *

Tabelle 4.7 Einfluss der Inkubation adhärenter Typ-II-Zellen in Gegenwart von 0,5mM H₂O₂ auf die zelluläre Aktivität der antioxidativen Enzyme Catalase und SOD

Unter H₂O₂-Behandlung steigt die Aktivität von Catalase und SOD in den Typ-II-Zellen zeitabhängig an; hierbei fällt allerdings auf, dass die SOD-Aktivität bei mehrfacher Gabe von H₂O₂ einen stärkeren Anstieg gegenüber der einmaligen Gabe zeigt (signifikant für 30min vs. 3×10min).

Surfactantlipidsynthese

Es ist bekannt, dass oxidativer Stress zu einem verminderten Gehalt von Surfactantlipiden in der BAL und den Typ-II-Zellen führt (Holm 1991, Crim 1995, Hudak 1995, Guthmann 2003). Dies kann verschiedene Ursachen haben: Zum einen kann die Synthese der Surfactantlipide gehemmt werden, zum anderen können Surfactantlipide oxidiert werden. Wir haben daher in den folgenden beiden Abschnitte den Einfluss von H₂O₂-Inkubation sowohl auf die Surfactantlipidsynthese als auch auf die Lipidperoxidation untersucht.

Eine optimale DPPC-Synthese ist an eine ausreichende Aufnahme exogener Palmitinsäure (16:0) durch Typ-II-Zellen gebunden, wir haben deshalb die initiale Fettsäurenaufnahme nach H₂O₂-Inkubation gemessen. Des Weiteren haben wir die PC-Synthese unter H₂O₂ anhand des Einbaus von ³H-Palmitinsäure und ¹⁴C-Cholin in PC untersucht.

Werte in % von Kontrolle ± Standardabweichung; Daten aus n=3 unabhängigen Experimenten; *p<0,05 (t-test) vs. Kontrolle; *p<0,05 (ANOVA: Dunnett´s Test) vs. Kontrolle; n.b. nicht bestimmt.
Zeit nach H ₂ O ₂ -Gabe

16:0-Aufnahme

Cholin-Einbau

16:0-Einbau

Kontrolle

100%

100 ± 37%

100 ± 44%

10min

n.b.

44 ± 3% *

55 ± 1% *

3×10min H₂O₂

75 ± 12%

29 ± 7% *

12 ± 3% *

6×10min H₂O₂

51 ± 13% #

18 ± 8% *

12 ± 1% *

Tabelle 4.8 Einfluss der Inkubation adhärenter Typ-II-Zellen in Gegenwart von 0,5mM H₂O₂ auf die initiale ³H-Palmitinsäure-(16:0)-Aufnahme sowie den ¹⁴C-Cholin- und ³H-16:0-Einbau in PC

Sowohl die initiale Aufnahme von Palmitinsäure als auch der Einbau von Cholin- und Palmitinsäure sind unter H₂O₂-Inkubation vermindert, wobei die Fettsäureaufnahme in geringerem Maße und erst bei 6×10min signifikant gehemmt wird. Da der Cholin- und 16:0-Einbau aber schon innerhalb von 10min reduziert sind, kann die verminderte Aufnahme exogener Palmitinsäure nicht der alleinige Grund der reduzierten PC-Synthese sein. Holm et al. finden in diesem Zusammenhang unter H₂O₂ (Holm 1991) und Hyperoxie (Holm 1988) eine Hemmung der SH-Gruppenhaltigen G3P-Acyltransferase (GPAT), einem Enzym, das den Einbau von Palmitinsäure in Glycerol-3-Phosphat katalysiert (s.a. Abbildung 1.2).

Lipidperoxidation

H₂O₂ führt zu einem Abfall der Konzentration des wichtigsten lipophilen Antioxidanz Vitamin E, daher ist eine Erhöhung der Lipidperoxidation wahrscheinlich. Um diese Arbeitshypothese zu prüfen, haben wir den Einfluss von H₂O₂ auf die Konzentration von Lipidhydroperoxiden (LOOH) und PAF-ähnlichen Substanzen (PAF-RC) sowie die Aktivität der PAF-Acetylhydrolase (PAF-AH) und der Phospholipase A₂ (PLA₂) gemessen.

LOOH – Lipidhydroperoxide, PAF-RC – PAF-related Compounds, PAF-AH – PAF-Acetylhydrolase-Aktivität, PLA₂ – Phospholipase-A₂-Aktivität; Werte in % von der Kontrolle ± Standardabweichung, Daten aus n=3 unabhängigen Experimenten (LOOH: n=2), Kontrollwerte: LOOH 32,3 nmol/mg Protein; PAF-AH 3607 dpm/min/µg Protein; PLA₂ 388 dpm/min/mg Protein; *p<0,05 (ANOVA) vs. Kontrolle.
Zeit nach H ₂ O ₂ -Gabe

LOOH

PAF-RC

PAF-AH

PLA ₂

Kontrolle

100%

100%

100 ± 18%

100 ± 12%

5min H₂O₂

213%

510%

189 ± 3% *

184 ± 88% *

3×10min H₂O₂

241%

423 ± 18% *

59 ± 22% *

133 ± 62%

Tabelle 4.9 Einfluss der Inkubation frisch isolierter Typ-II-Zellen in Gegenwart von 0,5mM H₂O₂ auf die Lipidperoxidation sowie die Aktivität der antioxidativen Enzyme PAF-AH und PLA₂ in frisch isolierten Typ-II-Zellen

Unter H₂O₂ finden wir einen Anstieg der Konzentration von Lipidhydroperoxiden und PAF-RC, von den antioxidativen Enzymen zeigen sowohl PAF-AH als auch PLA₂ eine erhöhte Aktivität nach 5min. Die PAF-AH-Aktivität erreicht nach 10min wieder die Kontrollwerte (nicht gezeigt) und fällt bis zum Ende der Inkubationszeit auf 50%. Wir führen diese Veränderungen auf eine Hemmung der PAF-AH durch ROS zurück, z.B. durch Oxidation der SH-Gruppe im aktiven Zentrum des Enzyms oder durch oxidative Zerstörung des Enzymproteins. Die Aktivität der PLA₂ dagegen bleibt nach einem anfänglichen Anstieg leicht erhöht (nicht signifikant).
Expression von Hitzeschockproteinen (HSP)
Hitzeschockproteine (HSP) sind sehr sensible Indikatoren für zellulären Stress verschiedenster Art, u.a. auch für oxidativen Stress. HSP 32, das auch Hämoxygenase-1 (HO-1) genannt wird, katalysiert den ersten Schritt des oxidativen Zerfalls von Hämoglobin zu Bilirubin; hierbei ist HO-1 im Gegensatz zu den konstitutiv exprimierten HO-2 und 3 durch Stressfaktoren induzierbar (Wong 1997, Choi 1996). HSP 60 ist das einzige hier untersuchte Hitzeschockprotein, das im Mitochondrium lokalisiert ist. Als molekulares Chaperon unterstützt es die Faltung von neu synthetisierten oder beschädigten Proteinen (Wong 1997). HSP 70 und 90 regulieren dagegen die Initation des programmierten Zelltods, indem sie die Reifung von Apoptosomen beeinflussen (Xanthoudakis 2000, Wong 1997).

HSP – Hitzeschockproteine, Optische Dichte (OD) der Western Blots nach Gelelektrophorese und Detektion mit monoklonalen Antikörper, Werte bezogen auf Kontrolle ± Standardabweichung, n.b. nicht bestimmt, Daten aus n=3 unabhängigen Experimenten (n=2 für HSP 70).
Zeit nach H ₂ O ₂ -Gabe

HSP-Expression

[min]

HSP 32

HSP 60

HSP 70

HSP 90

Kontrolle

1

1

1

1

60min H₂O₂

2,49 ± 1,66

2,25 ± 0,63

7,23 / 5,27

4,72 ± 2,47

Tabelle 4.10 Einfluss der Inkubation frisch isolierter Typ-II-Zellen in Gegenwart von 0,5mM H₂O₂ auf die HSP-Expression frisch isolierter Typ-II-Zellen

H₂O₂ bewirkt einen Anstieg der Expression der Stressproteine in frisch isolierten Zellen insbesondere von HSP 70 und 90; HSP 32, das als Hämoxygenase antioxidative Funktion hat, steigt dagegen nur wenig an. Inkubiert man jedoch adhärente Zellen mit H₂O₂, findet sich nur ein geringer Anstieg der HSP-Expression (nicht gezeigt), vermutlich da die basale Expression von HSP in den Kontrollzellen schon durch die Zellkulturbedingungen erhöht ist (s. 4.1.2).

H₂O₂-Belastung von isolierten Typ-II-Pneumozyten führt zusammengefasst zu:

Einem kurzfristigen Abfall der zellulären GSH-Konzentration, die innerhalb von 10min wieder regeniert wird und dann im Laufe der weiteren Inkubation langsam absinkt (Tabelle 4.6, Abbildung 4.1).

Einem kontinuierlichem Absinken des Vitamin-E-Spiegels bei unveränderter PUFA-Konzentration (Tabelle 4.6).

Typ-II-Zellen reagieren auf H₂O₂ mit einem Anstieg der Aktivität ihrer antioxidativen Enzyme Catalase und SOD (Tabelle 4.7) und mit einer erhöhten Expression von Hitzeschockproteinen (Tabelle 4.10).

H₂O₂-Inkubation führt zu einem Abfall der Konzentration der Surfactantlipide, zum einen durch die Hemmung der Surfactantlipidsynthese; dabei wird sowohl die Palmitinsäure-Aufnahme als auch der Einbau von Palmitinsäure und Cholin in PC gehemmt (Tabelle 4.8). Zum anderen ist eine verstärkte Oxidation ungesättigter Surfactantlipide durch H₂O₂ nachweisbar (Tabelle 4.9).

H₂O₂-Stress führt zu einer oxidativen Hemmung der PAF-AH-Aktivität bei unveränderter Aktivität der PLA₂ (Tabelle 4.9).