dd..yyyyMaterial und MethodenBei den durchgeführten Einzeluntersuchungen (wie die Behandlung mit Wachstumsregulatoren oder die Kühlung) wurde auf Pflanzenbestände zurückgegriffen, die zuvor unter funktionellen morphologischen Gesichtspunkten beobachtet und bewertet worden waren. Da in den Beschreibungen zu Material und Methoden in den spezifischen Versuchsabschnitten nur in Ausnahmefällen auf den detaillierten Werdegang der jeweiligen Versuchsvariante eingegangen wird, soll nachfolgend der schematische Versuchsaufbau für die einzelnen Vermehrungsvarianten dargestellt werden.Die in den nachfolgenden Abbildungen Abbildung 5-5.1, Abbildung 5-5.2 und Abbildung 5-5.3 verwendete Codierung der Versuchsvarianten findet sich im Ergebnisteil der Arbeit an den entsprechenden Stellen zur genauen Identifikation wieder.VersuchsaufbauDie generativ vermehrten Bestände wurden aufgrund ihres Umfangs und ihres vergleichbaren Entwicklungszustandes für alle Versuchsvarianten verwendet. Zur Sicherung des Stichprobenumfangs für die statistischen Untersuchungen von mindestens 20 Pflanzen wurde im Zeitraum der Durchführung 1997/98 ein Bestand von 1200 Pflanzen angelegt.Abbildung 5‑5.1: Versuchsübersicht für Aster alpinus aus generativer Vermehrung. Die schattierten Flächen kennzeichnen den Zeitraum und die Dauer der Kultivierung der Stauden im Gewächshaus. Die aufgeführten Abkürzungen haben folgende Bedeutung: A: Aussaat; P: Pikieren; T: Topfen; K: Kühlung, ET: Einräumtermin, BAP: Cytokininbehandlung mit 6-Benzylaminopurin (die Ziffern geben die Konzentrationsstufen an, wobei BAP 1 = 15 mg/l, BAP 2 = 20 mg/l und BAP 3 = 25 mg/l entsprechen); Frld.: Freilandstandort; ohne ET: keine Einräumung in Kühl- oder GewächshäuserDie generativ vermehrten Aster alpinus sollten mit den vegetativ vermehrte Pflanzen verglichen werden. Durch Fehler in der Kulturführung und die Inhomogenität der Bestände der vegetativ vermehrten Pflanzen war die Gesamtzahl der zur Verfügung stehenden Pflanzen nicht ausreichend. Ein direkter Vergleich mit den Sämlingspflanzen war daher nur mit Einschränkung möglich. Der Zeitpunkt der Vermehrung war so angelegt, daß der Entwicklungszustand der Stecklinge mit dem der Sämlingspflanzen korreliert.Abbildung 5‑5.2: Versuchsübersicht für Aster alpinus aus vegetativer Vermehrung Die schattierten Flächen kennzeichnen den Zeitraum und die Dauer der Kultivierung der Stauden im Gewächshaus. Die aufgeführten Abkürzungen haben folgende Bedeutung: S: Stecklingsvermehrung; T: TopfenIn einer dritten Versuchsreihe wurden die für die Untersuchungen unter In-vitro-Bedingungen aufgesetzten Sproßknospen weiter kultiviert. Nach einer Überführungsphase unter Folie wurden die Astern getopft und durchgängig im Gewächshaus gehalten. Dieser Versuch fand über zwei Winterperioden (1995/96 und 1996/97) statt. Der Pflanzenbestand umfaßte im Verlaufe des gesamten Untersuchungszeitraumes etwa 50 Pflanzen.Abbildung 5‑5.3: Versuchsübersicht für Aster alpinus aus In-vitro-Vermehrung Die schattierten Flächen kennzeichnen den Zeitraum und die Dauer der Kultivierung der Stauden im Gewächshaus. Die aufgeführten Abkürzungen haben folgende Bedeutung: T: Topfen, P: Pikieren, K: Kühlung, V: erstmalige Transplantation der SproßknospenUntersuchungen zum Wachstums- und EntwicklungsverlaufPflanzenmaterialFür die Untersuchungen wurde Saatgut der Fa. BENARY verwendet. Für den Vergleich zur vegetativen Vermehrung wurden Stecklinge aus zweijährigen, unter Glas verfrühten Beständen entnommen. Bei der Stecklingsentnahme wurde darauf geachtet, daß zum Entnahmezeitpunkt nicht sichtbar blühinduzierte Stecklinge selektiert wurden, um die vegetative Entwicklung nicht zu beeinträchtigen. Verwendet wurden Kopf­stecklinge mit einer definierten Anzahl ausgewachsener Blätter (3 bis 5) und einer gleichmäßigen Länge (5 – 6 cm). Bei dieser Bonitur wurde des weiteren das Frischgewicht der Stecklinge erfaßt. In der folgenden Tabelle sind die verwendeten Größenklassen für die Stecklingsvermehrung dargestellt:Tabelle 5‑5.1: Klassifizierung des Stecklingsmaterials für die Untersuchungen 1997GruppierungAnzahl der StecklingeGewicht (in g/Steckling)Länge (in cm)3 – 4 Blätter880,805,55 – 6 Blätter880,956,17 – 8 Blätter881,386,2KulturbedingungenDie eingangs erwähnten Überschneidungen bei den Sorteneigenschaften und das ausschließliche Angebot von Sortenzüchtungen (keine Wildarten) sind die Gründe für die Wahl einer spezifischen Sorte als bevorzugtes Versuchsobjekt. Bei normaler Entwicklung wies die Sorte ‘Happy End‘ nur geringe Schwankungsbreiten auf und entsprach in ihrer Variationsbreite den anderen geprüften Sorten (JENDE, 1995).Die Beobachtung von Sämlings- und Stecklingspflanzen erfolgte über einen Zeitraum von 3 Jahren (09/1995-06/1998). Die Gestaltung der Kulturbedingungen richtete sich nach dem jeweili­gen Untersuchungsziel und den Entwicklungsstadien der Pflanzen.Die Anzucht der Sämlinge und Stecklinge erfolgte in einfachverglasten Gewächshäusern auf Tischen. Sämlinge und Stecklinge wurden in verschiedenen Sätzen kultiviert. Als Substrat wurde ein Gemisch aus Torfkultursubstrat (TKS 1, Fa. KLASMANN) und Perlite im Verhältnis 3 : 1 verwendet; die Aussaaten wurden zusätzlich mit einer Deckschicht aus Sand versehen. Präventiv gegen Pythium- und Phytophthorabefall wurde die Aussaat mit Previcur N (Fa. AGREVO) 0,25 %ig angegossen. Die Aufstellung der Saatkisten zur Keimung erfolgte bei einem Temperaturniveau von 18-20°C. Nach erfolgter Keimung wurde die Temperatur auf 15°C gesenkt. Die Stecklinge wurden ebenfalls mit Previcur N angegossen, jedoch in einer schwächeren Konzentration (0,15%ig). Die Vermehrungspaletten wurden in den ersten 3 Wochen bei 18°C und später bis zum Topfen ebenfalls bei 15°C aufgestellt.Mit durchschnittlich 3 bis 4 entwickelten Blättern wurden die Sämlinge etwa 4 Wochen nach der Aussaat pikiert und Anfang Juli mit 8 bis 10 entwickelten Laubblättern in 9 cm Kunststofftöpfe getopft. Zu diesem Zeitpunkt haben die Pflanzen überwiegend nur einen Sproß. Das Topfen der Stecklinge erfolgte 6 Wochen nach der Stecklingsvermehrung. Zu diesem Zeitpunkt weisen die meist einsprossigen Stecklinge etwa 6 bis 10 Blätter auf. In Abhängigkeit von den Untersuchungsvarianten wurden die Pflanzen entweder in einfachverglasten Gewächshäusern auf Tischen aufgestellt oder wurden aus Gründen der Kultursicherheit in Grundbeeten eingesenkt. Im Freiland wurden die Pflanzen mit den Töpfen grundsätzlich in den gewachsenen Boden eingesenkt. Die Standdauer der Versuchsvarianten betrug 2 Vegetationsperioden.Detaillierte Kulturtermine für die in den einzelnen Untersuchungsjahren vorgenommenen Maßnahmen sind in der Anlage A1 aufgeführt. Diese Termine entsprechen den allgemeinen Empfehlungen der Saatgutfirmen (Fa. BENARY, 1997, Fa. JELITTO, 1996).Die Solltemperaturen nach der Keimung oder Bewurzelung betrugen 15°C. Der Temperaturverlauf in den Phasen nach erfolgter Jungpflanzenetablierung ergab sich weitestgehend aus dem natürlichen Witterungsver­lauf im Freiland bzw. aus dem Temperaturverlauf in den Gewächshäusern. In den Wintermonaten wurden die Gewächshäuser frostfrei gehalten; die Solltempe­ratur betrug 5°C. Die Temperaturmeßwerte wurden von der am Standort Köpenick befindlichen Wetterstation übernommen. Erfaßt wurde fortlaufend die Lufttemperatur in 2 m Höhe in einem Intervall von 20 min.Die Bewässerung der Pflanzenbestände erfolgte in den Häusern und auch im Freiland durch eine Bewässerung mit Handbrause bedarfsabhängig.Aus den Ergebnissen der Bodenuntersuchungen wurde der Düngebedarf der getopften Pflanzen abgeleitet. Verabreicht wurden je Vegetationsperiode etwa 2 bis 3 Düngegaben Wuxal (0,1%ig) oder Mannalin rot (0,1%ig).UntersuchungsmethodikDer Bestandsaufbau für alle Versuche mit den jeweiligen Varianten sah einen Stichprobenumfang von mindestens 20 Pflanzen je Variante vor. Durch Kulturfehler konnte dieser Vorgabe in wenigen Fällen nicht entsprochen werden. In den Auswertungen der Varianten wird darauf gesondert verwiesen. Der Gesamtbestand ein- und zweijähriger Pflanzen wies während des gesamten Untersuchungszeitraumes ei­nen Umfang von etwa 2.500 Pflanzen auf.Die laufenden Beobachtungen der äußerlich sichtbaren Veränderungen erfolgten in einem ein- bis dreiwöchigem Zähl- und Meßrhythmus. In die Erfassung gingen der Pflanzendurchmesser, die Anzahl der Sprosse (soweit sinnvoll), die Anzahl und der Status der ausgebildeten Blüten ein Histologische UntersuchungenPflanzenmaterialDie Umstimmungsphase der vegetativen Sproßknospen in die reproduktive Phase wurde durch histologi­sche Untersuchungen gesondert erfaßt. Dazu wurden ab dem 15.09. in vierzehntägigem Abstand Sproßknospen von Freilandpflanzen entnommen. Zur Vorbereitung auf die Einbettung wurden diese mit einer Rasierklinge weitestgehend entblättert.UntersuchungsmethodikZur Fixierung der entblätterten Sproßknospen wurde eine AFE–Lösung (100 ml) hergestellt. Diese bestand aus 9 Teilen Ethanol (50%ig), 0,5 Teilen Formalin (34%ig) sowie 0,5 Teilen Eisessig (40%ig). Die Sproßknospen wurden anschließend zur Entlüftung bei 15 °C 24h (dunkel) im Fixiergemisch aufbewahrt. Die Spülung der Präparate erfolgte im Anschluß an die Fixierung in einer aufsteigenden Alkoholreihe. Nachfolgend ist die Abfolge dargestellt:- 50%iges Ethanol120 min- 70%iges Ethanol60 min- 70%iges Ethanol30 min (2 x)Nach der Entnahme aus der 70 %igen Ethanollösung wurden die Sproßknospen in folgenden Lösungen inkubiert:- 2-Ethoxyethanol (10 ml)120 min- 96%iges Ethanol (10 ml)120 min- Vorbereitungslösung–Ethanol (96%ig)–Gemisch (1:1)120 min- Vorbereitungslösung24hZur Herstellung der Vorbereitungslösung wurden 100 ml Hauptlösung mit 1 g pulverförmigem Härter 1 (beides Technovit 7100; Fa. HERAEUS-KULZER-GmbH) gemischt.Als Einbettmittel wurde die Vorbereitungslösung benutzt, mit der infiltriert wurde. In 10 ml Vorbereitungslösung wurde 1 ml Härter II (Technovit 7100; Fa. HERAEUS-KULZER-GmbH) unter Vermeidung von Luftblasen eingerührt. Die fertige Lösung wurde mittels Pipette in die Form gegeben. Nach etwa 4 min war die Lösung ausreichend viskos, so daß die Sproßknospen in der Form stabil positioniert werden konnten. Bei Raumtemperatur (20 °C) waren die Proben nach 24 h homogen polymerisiert.Die Befestigung der Probe am Histobloc erfolgte mit Technovit 3040 (Fa. HERAEUS-KULZER-GmbH). Dazu wurde die rückseitige Vertiefung des Histobloc bis etwa 2 mm über den Blockboden ausgegossen. Nach einer Polymerisationsdauer von 1 h wurden die schneidfähigen Proben aus den Histoblöcken gehebelt.Die Blöcke wurden mit einem Mikrotom (Fa. REICHERT-JUNG) in einer Stärke von 5 µm geschnitten, in einem Wasserbad gestreckt und auf Objektträgern fixiert. Zur Einfärbung wurden die Objektträger für 5 min in Toluidinblau eingestellt und nach der Behandlung solange mit Aqua dest. gespült, bis sich keine Farbstoffwolken mehr lösten. Anschließend wurden die Objektträger kurz (10 – 15 sec.) in Lugolsche Lösunggestellt und danach in Leitungswasser ausgiebig gewaschen. Die Präparate wurden abschließend auf einer Heizplatte bei 60 °C getrocknet.Untersuchungen in der In-vitro-KulturPflanzenmaterialUm den Beginn der Ruhe und der Blütenentwicklung zeitlich besser eingrenzen zu können, wurden ab Mitte September Sproßknospen aus dem Freiland in die In-vitro-Kultur überführt. Das Ausgangsmaterial entstammte zum Teil selbst aus mikrovermehrten Beständen oder aus generativer Vermehrung. UntersuchungsmethodikDie Sproßknospen wurden zunächst von allen ausdifferenzierten Blättern befreit und in einer Lösung mit 3 % NaOCl und 0,01 % Tween-20 sterilisiert. Dazu wurden die Sproßknospen etwa 20 min in der Lösung bewegt und danach 5 min in Aqua dest. gewaschen.In vierzehntägigem Rhythmus wurden 5 bis 10 mm lange Sproßsegmente auf frischen Nährboden transplantiert. Aufgrund der relativ großen Kontaminationsgefahr wurden die Sproßsegmente einzeln in Reagenzgläsern (150 x 25 mm), die 30 ml Nährmedium enthielten und mit Aluminiumfolie verschlossen wurden, kultiviert.Tabelle 5‑5.2: Zusammensetzung der verwendeten Nährmedien (Angaben in mg/l Medium)Transplantation zur Kontrolle der BlühinduktionIn–vitro–BewurzelungSubstanzAnorgan. Makronährstoffe* KH2PO4170,0170,0CaCl2 x 2 H2O440,0440,0MgSO4 x 7 H2O370,0370,0NH4NO31650,01650,0KNO31900,01900,0Na2 x EDTA37,337,3FeSO4 x 7 H2O27,827,8Anorgan. Mikronährstoffe*MnSO4 x 4 H2O22,322,3ZnSO4 x 4 H2O8,68,6CuSO4 x 5 H2O0,0250,025CoCl2 x 6 H2O0,0250,025H3BO36,26,2Na2MoO4 x 5 H2O0,250,25Fe5,05,0sonstige organische Substanzmyo – Inositol100,0100,0Thiamin – HCl2,52,5Pyridoxin – HCl0,20,2Biotin0,20,2Indol-3-essigsäure (IES)0,056-Benzylaminopurin (BAP)0,5Indol-3-buttersäure (IBS)0,25C – QuelleSaccharose30.000,030.000,0* Makro- und Mikronährstoffzusammensetzung nach Murashige und Skoog (1962)Alle Nährmedien wurden mit 7 g/l Agar angereichert. Der pH-Wert wurde vor dem Autoklavieren auf 5,8 eingestellt. Die Nährmedien wurden 15 min bei 120°C autoklaviert. Die Kulturen wurden bei 24°C ± 2°C und einer Photoperiode von 16 h herangezogen. Als Lichtquelle diente Weißlicht (Philips TLD 36 W/33, kaltweiß; 50 µmol m-2 s-1 PAR)Untersuchungen zum Einfluß von CytokininPflanzenmaterialDas verwendete Cytokinin 6-Benzylaminopurin wurde ausschließlich bei Pflanzen aus generativer Vermehrung angewendet. Der Aussaatzeitpunkt für diese Varianten war 15.02.1997. Bis zum Behandlungsbeginn Anfang Juni hatten die Pflanzen durchschnittlich 1,9 Sproßknospen (Standardabweichung: 1,67) und etwa 7 bis 10 entwickelte Blätter.Während der Behandlungsphase standen die Pflanzen in Multitopfpaletten (1 9 cm) auf dem Ge­wächshausboden. KulturbedingungenDie Anzucht und Etablierung der Pflanzenbestände erfolgte unter den gleichen Kulturbedingungen, wie sie im Abschnitt 5.2 dargestellt sind. Die Solltemperatur im Gewächshaus während und nach der Behand­lungsphase sollte den natürlichen Bedingungen entsprechen; zeitweilig kam es aber zu wesentlich stärkerer Erwärmung. Dabei wurden Temperaturen bis zu 39° C gemessen. Während der Applikation wurden die Pflanzenbestände der jeweiligen Variante voneinander abgeschirmt, um die Exaktheit der Versuchsergebnisse zu gewährleisten.Untersuchungsmethodik Das verwendete 6-Benzylaminopurin (BAP) wurde in wenigen Tropfen 1N NaOH gelöst und mit Wasser so aufgefüllt, daß nach Neutralisation mit Salzsäure (1 N) eine Stammlösung der Konzentration von 1 mg/ml vorlag. Mit dieser Stammlösung wurden Lösungen unterschiedlicher Konzen­tration angesetzt: 15 mg/l, 20 mg/l und 25 mg/l BAP. Den Lösungen waren drei Tropfen Tween 20 pro Liter als Netzmittel zugesetzt worden.Die Applikation der Lösung erfolgte mittels Besprühen in den frühen Morgenstunden oder abends. Der Zeitraum der Behandlung war der 05.06.1997 bis zum 16.07.1997. Die Pflanzen wurden über einen Zeitraum von 6 Wochen zweimal je Woche tropfnaß be­sprüht. Im Anschluß an die Behandlung wurden die Pflanzen in 9 cm Töpfe getopft und im Freiland ausgestellt.Während und nach der Behandlung wurde die Anzahl der Sproßknospen und der Durchmesser der Pflanzen erfaßt. In den Erfassungszeitraum hinein fällt auch die Ausbildung der Infloreszenz der untersuchten Pflanzen.Untersuchungen zum Einfluß der Kühlung auf die Blütenbildung und -qualitätPflanzenmaterialFür die Untersuchungen zum Einfluß der Kühlung auf die Blühstimulierung und die Blütenentwicklung wurden ab dem dritten Quartal der Jahre 1995 und 1997 einjährige Pflanzen aus den Beständen entnom­men. Diese wiesen im Vorfeld der Versuche schon ein unterschiedliches Entwicksstadium auf, wel­ches durch unterschiedliche Vermehrungstermine und unterschiedliche Behandlungen (z. B. mit BAP) während der Kultur erreicht wurde. Ein Vergleich mit der natürlichen Entwicklung wurde durch die Pflanzenbestände im Freiland und gestaffelten Einräumterminen aus dem Freiland in das Gewächshaus erzielt.KulturbedingungenDie kontrollierte Kühlung der Pflanzen erfolgte in Kühlkammern mit einer Gebläsekühlung und einer täglichen, achtstündigen Zusatzbelichtung (Fa. NARVA, LS 65 neuweiß deluxe 21, 65 W). Da sich die Pflanzen zum Zeitpunkt des Einräumens in die Kühlkammern im belaubten Zustand befan­den, konnte auf eine zeitlich befristete Zusatzbelichtung nicht verzichtet werden. Die Wärmeentwicklung durch das Lampenlicht verursachte einen verstärkten Kühlbedarf und damit verbunden, einen verstärkten Venti­latorbetrieb. Der dabei entstehende Luftzug führte zur verstärkten Austrocknung der Töpfe und par­tiellen Ausfällen. Diese ergaben sich zum einen aus der Austrocknung und zum anderen aus der zusätzlichen Bewässerung, die zur Kompensation des entstandenen Wasserverlustes gedacht war (Vernässungsschäden).Die Freilandbestände, die zu unterschiedlichen Terminen in die Gewächshäuser geräumt wurden bzw. die im Freiland verblieben, standen während der gesamten Winterperiode auf Beeten in eingesenkten Töp­fen.Nach der Kühlung wurden die Pflanzen in Gewächshäuser geräumt und dort im Grundbeet eingeschlagen. Die Solltemperatur lag bei etwa 10-12 °C. Durch den äußeren Witterungseinfluß bedingt kam es aber bereits zu sehr starken Erwärmungen im Gewächshaus, bei der ab der 14. KW Tagesdurchschnittstemperaturen von mehr als 18°C gemessen worden sind. UntersuchungsmethodikFür die Untersuchungen mit kontrollierter Kühlung wurden aus den vorhandenen Pflanzenbeständen mindestens 10, aber maximal 20 Pflanzen aus den Beständen entnommen und in den Kühlraum geräumt. Parallel wurde dazu eine Kontrollvariante im Freiland belassen (Code 10-13, Code 30-67).Die Pflanzen wurden zu einem einheitlichen Zeitpunkt in die Kühlzelle eingeräumt und nach entsprechender Kühldauer gestaffelt entnommen. Die Mindestkühldauer betrug 3 Wochen; die maximale Dauer 8 Wochen.Als Kühltemperaturen wurden sowohl in der Kühlzelle als auch im Freilandvergleich Temperaturen unter 2°C festgelegt.Nach der vorgesehenen Kühldauer wurden die Pflanzen aus dem Kühlraum und aus dem Freiland in einfachver­glaste Gewächshäuser geräumt. Dort erfolgte bis zur vollständigen Entwicklung der Blütenstände die Bonitur der Sproßknospen- und Blattentwicklung sowie der Blütenbildung.Statistische AuswertungDie statistischen Auswertungen erfolgten mit linearen Regressionsrechnungen. Die Untersuchungen auf Gleichheit der Gruppenvarianzen erfolgten mit der Levene-Statistik. Mehrfachvergleiche und Spannweitentests bzw. Tests auf Mittelwertdifferenzen wurden mit den nach Tukey-HSD, Bonferroni und Scheffe benannten Prozeduren durchgeführt. Die signifikanten Unterschiede sind mit dem Symbol * gekennzeichnet und bei den entsprechenden Tabellen bzw. Abbildungen angegeben.Mit der Software StatGraphics wurden die Meßwerte ein- und zweifaktoriell varianzanalytisch mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% verrechnet. Bei mehrfaktoriellen Versuchen wurden die Ergebnisse auf bestehende Wechselwirkungen geprüft.Für die Überprüfung der durchschnittlichen symptomfreien Periode (keine Verpilzung, keine „Entkräftungserscheinungen“) für verschiedene In-vitro-Sätze wurde eine Überlebensanalyse angewendet. Die Auswertung der Versuchsergebnisse erfolgte mit der Log-Rank- und Breslowmethode.