2 Einleitung

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In der medizinischen und biotechnologischen Forschung und Nutzung nimmt die Bedeutung der individuellen Zelle und damit deren kontaminationsarme und zerstörungsfreie Charakterisierung in steigendem Maße zu. Dies begründet sich aus dem Wunsch einer weiteren Verwendung der Zellen nach der Analyse, z. B. als Ausgangspunkt für Zellklone, die dann nach ausreichender Vermehrung für Zelltherapien der Medizin oder für das „Tissue Engineering“ verwendet werden können. Molekularbiologische Techniken wie die PCR, die Massenspektrometrie aber auch eine Vielzahl spezifischer Fluorenszenzmarkierungen erfüllen diese Forderung nicht oder nur bedingt. Der Nachteil der genannten hochauflösenden Verfahren ist, dass zur Analyse die Zelle in der Regel fixiert oder lysiert, d. h. abgetötet werden muss. Somit erhält man zwar die gewünschte Aussage, jedoch steht die Zelle für weiter führende Versuche nicht zu Verfügung.

Große Bedeutung erlangt daher die zerstörungsfreie einzelzellbasierte spezifische Bestimmung zellulärer Proteine, um Aussagen über Zellveränderungen treffen zu können. Beispiele hierfür sind die Tumorigenität von Krebszellen, der Differenzierungsgrad von Stammzellen oder die Vitalität toxisch exponierter Zellen. Verfahren zur zerstörungsfreien Einzelzellcharakterisierung sind Impedanz- und NMR-Verfahren, AFM-basierte molekulare Sondentechniken oder Sensorarrays (Artemov et al. 1999; Baumann et al 1999; Brischwein et al. 2003; Ehret et al 1998; Jaasma et al. 2006; Prechtel et al. 2002). Allerdings sind zur Zeit alle diese Ansätze entweder gerätetechnisch sehr aufwändig oder erfordern hochstabilisierte und standardisierte Verfahren.

Im Organismus erfolgt die Zell-Zell-Kommunikation, z. B. im Zusammenhang mit neugebildeten Zellen des Immunsystems, durch Zell-Zell-Oberflächenwechselwirkungen. Dies sollte das natürliche Vorbild für die biotechnologisch noch zu entwickelnden technischen Zellcharakterisierungssysteme sein. In einem einzigen Schritt, z. B. durch Kultivierung von Zellen auf Sensoroberflächen ist diese Aufgabe nicht zu lösen. Vielmehr handelt es sich um ein sehr komplexes Aufgabenfeld, das nur über das schrittweise Verständnis der Vorgänge der Zelladhäsion und Zell-Oberflächen-Interaktion voran-getrieben werden kann. Entsprechend handelt es sich um ein derzeit über nano-technologische Ansätze sehr stark beforschtes Gebiet der Zellbiologie (Arnold et al. 2004; Liliensiek et al. 2006).

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Bei Untersuchungen der aktiven Wanderung von Zellen wie Makrophagen, Fibroblasten aber auch dendritischer Zellen und Stammzellen verschiedenster Herkunft (Tier, Mensch) zeigte sich, dass diese Zelltypen mehr oder minder ausgedehnte Zellrückstände auf den Substraten hinterlassen (Kirfel et al. 2003; Mayer et al. 2004; Rigort et al. 2004). Detaillierte mikroskopische Untersuchungen und molekulare Charakterisierungen solcher Zellrückstände zeigten, dass neben kleinen ca. hundert Nanometer großen Membran-patches bei etwa 20 bis 30 Prozent der Zellen dendritische „Materialspuren“ einer Länge von bis zu mehreren hundert Mikrometern ausgebildet werden, die bislang nur wenig Beachtung gefunden haben. Diese können zum einen während der häufig zu beobachtenden Vor- und Rückbewegung der Zellen wieder aufgenommen aber auch durch Abreißen vom Zellkörper auf dem Substrat hinterlassen werden. Es handelt sich um etwa 120 Nanometer dicke membranumhüllte Filamente mit dendritsicher Verzweigung an denen bis zu 1 Mikrometer große Membranpatches vorkommen können (Fuhr et al. 1998; Zimmermann et al. 1999). Ein Beispiel ist in Abbildung 1 gezeigt, das deutlich macht, dass es sich bei diesen „Zellspuren“ nicht um Filopodien handelt.

Abbildung 1 : TIRF-mikroskopische Aufnahme einer Zellspur von L929

Auch ausgeprägte dendritische Zellausläufer von mehreren hundert Mikrometern Ausdehnung umfassen selten mehr als ein Prozent des Zellvolumens. Dies erklärt, noch dazu unter dem Gesichtspunkt des Nährstoffüberangebots der gängigen Zellkulturmedien, dass die Ausbildung derartiger Zellfilamente für den Energiehaushalt und Stoffwechsel der Einzelzelle auch bei Verlust der Zellspur keine Belastung darstellen sollte. Spezifische Proteinmarkierungen ergaben des Weiteren, dass die dendritischen Zellausläufer in repräsentativer Weise die molekulare Membrankomposition der Erzeugerzelle wiederspiegeln (Zimmermann et al. 2001). Dies legte frühzeitig den Gedanken nahe, abgetrennte Zellausläufer, im Folgenden als „Zellspuren“ bezeichnet, zur Oberflächen-charakterisierung einzelner Zellen zu nutzen. So könnte beispielsweise auf einem speziell präparierten Chip und bei gerichteter Eigenmigration von Zellen die Zellspurablage induziert werden. Nach schonender Abtrennung dieser Zellrückstände vom Zellkörper, könnten die Chips fraktioniert werden, so dass z. B. zwei getrennte Substratteile entstehen. Auf dem einen Substratteil befinden sich die Zellen und zuordenbar auf dem anderen Teil die dazugehörigen Spuren. Die Zellspuren könnten nun zerstörungsfrei aber auch kontaminierend bis zur kompletten Destruktion analysiert werden, ohne die noch lebende Verursacherzelle zu belasten, die weiter kultiviert werden kann (Duschl und Lankenau 2005).

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Abbildung 2 schematisiert dieses Prinzip am Beispiel einer Zelle.

Abbildung 2 : Schematische Darstellung der technischen Nutzung von Zellspuren.

Für eine biotechnologische Nutzung der Zellspuren, müsste dieser Prozess jedoch reproduzierbar gestaltet und wenn möglich, gesteuert werden können. Sehr wenig ist bisher jedoch über die Zellspurbildung, insbesondere die Dynamik und Beeinflussung durch Oberflächenstrukturierung bzw. -funktionalisierung bekannt. Diese Lücke mit neuen methodischen Ansätzen und vergleichenden Untersuchungen zu füllen, ist eine der Aufgaben der vorliegenden Arbeit.

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Für die analytische Nutzung von Zellspuren ergeben sich vielfältige medizinische und biotechnologische Anwendungsmöglichkeiten. Beispiele sind die Erfassung des Differenzierungszustandes von Stammzellen, ebenso wie die Charakterisierung der Aktivierung von Immunzellen oder des Metastasierungspotenzials von Krebszellen. Um die Zellspuranalyse technisch einsetzten zu können, ist es allerdings essenziell, den Zusammenhang zwischen der Zellspurentstehung und der Bewegung der Donorzelle zu verstehen, um gezielt auf beide Prozesse Einfluss nehmen zu können. Je nach Anwendung oder der zur Analyse der Zellspurparameter verwendeten Techniken, sind verschiedene Ansprüche an die Beschaffenheit der Zellspuren und die Dimensionierung des Substrats zu stellen. Sollen beispielsweise Zellspuren von mehreren Zellen parallel untersucht werden, ist es wünschenswert, dass die Zellen von einem definierten Startpunkt möglichst zielführend zu einem definierten Endpunkt migrieren und keine Überkreuzung der Trajektorien und damit der Spuren stattfindet. Spielt hingegen bei der zu untersuchenden Fragestellung der zeitliche Ablauf eine Rolle, wie bei der Expression von Oberflächenrezeptoren nach Stimulation, sollten die Zellspuren möglichst lang sein und nicht segmentiert auftreten. Diese Beispiele zeigen, dass eine Vielzahl von Parametern zu berücksichtigen sind und insbesondere die Erfassung der Dynamik der Zelladhäsion und Spurenbildung beobachtbar sein muss. Ein weiteres Ziel der Arbeit bestand daher in der Entwicklung und dem Aufbau eines Mikroskopiersystems zur hochauflösenden Erfassung der Zelladhäsionsmuster und Zellspuren als auch der Dynamik ihrer Veränderung über Zeitraffersequenzen.

Markante Einflüsse auf die Zellspurentstehung sind über die Beeinflussung des Migrations- und das Adhäsionsverhalten der Zellen zu erwarten. Die Zellmigration ist ein biologischer Prozess von elementarer Bedeutung. Sie spielt z. B. bei der Embryogenese (Keller 2005; Montero und Heisenberg 2004), der Wundheilung im adulten Organismus (Santoro und Gaudino 2005) oder der Ausbildung von Metastasen bei Krebserkrankungen eine wesentliche Rolle (Friedl und Wolf 2003). Für die Entstehung von Zellspuren in In-Vitro-Systemen ist die aktive Zellmigration eine offensichtliche Grundvoraussetzung. Großen Einfluss auf die Zellspurbildung sollte auch die Adhäsion der Zellen am Substrat besitzen.

Da sowohl Zelladhäsion als auch Zellmigration auf der Interaktion der Zellen mit der Substratoberfläche beruhen, liegt es nahe, dass man auch durch eine Veränderung der Oberfläche beide Prozesse beeinflussen kann. Grundsätzlich bieten sich hier zwei Strategien an. Biochemische Methoden, wie die Beschichtung mit Proteinen, modifizieren beispielsweise die Adhäsivität des Substrats, da die Anzahl der physiologischen Bindungsstellen variiert wird (Palecek et al. 1997). Technische Lösungen, wie das strukturierte Aufbringen von Stoffen (Polymere oder Metalle als Nanostrukturen) auf der Oberfläche, verändern die Topographie des Substrats und so die Reaktionen der Zellen (Jungbauer et al. 2004; Tan und Saltzman 2002).

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Die Aufgabe der vorliegenden Arbeit bestand darin, einen experimentellen Aufbau zu entwickeln und umzusetzen, der die hochauflösende Beobachtung der dynamischen Prozesse der Zellmigration und Zelladhäsion auf künstlichen Substraten erlaubt. Des Weiteren sollte die Beobachtung der Dynamik des substratnahen Aktinzytoskeletts ermöglicht werden. Im Hinblick auf eine spätere technische Umsetzung sollte die Möglichkeit der parallelen Erfassung einer größeren Zahl von Zellen gegeben sein.

Wie sich in Vorexperimenten zeigte, handelt es sich bei Zelladhäsion, Zellmigration und Zellspurbildung um keine einheitlich ablaufenden Prozesse, sondern eher um stochastische Phänomene, so dass nicht jede beobachtete Zelle zu einem nutzbaren Datensatz führt (Richter et al. 2000). Der Messplatz sollte daher ausreichend lange Beobachtungszeiträume ermöglichen, um auch seltene Ereignisse im Verhalten der Zellen über die retrospektive Auswertung von Videosequenzen erfassen zu können. Daher müssen in dem zu realisierenden Mikroskopsystem die Kutivierungs-randbedingungen (Temperatur, CO2-Gehalt etc.) exakt einstellbar sein und über Tage ein automatischer Lauf garantiert werden. In der Kombination mit hochauflösenden Mikroskopieverfahren treten dabei technische Probleme wie beispielsweise Fokus-schwankungen und Kondenswasserbildung auf, die ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit zu lösen waren.

Zur Abbildung derartig feiner Strukturen sind theoretisch verschiedene mikroskopische Beobachtungstechniken nutzbar, z. B. die “Confocal Laser Scanning” (CLS-) Mikroskopie, die Interferenz Reflexions (IR-) Mikroskopie oder die Totale Interne Reflexions Fluoreszenz (TIRF-) Mikroskopie. Rasterelektronenmikroskopische Verfahren hingegen eignen sich nicht für dynamische Beobachtungen und können daher nicht zur Lösung des Problems genutzt werden. Anzustreben ist, dass möglichst nur der substratnahe Zellbereich erfasst wird und über die Abbildungstechnik keine erhebliche Beeinflussung der beobachteten Zelle erfolgt. Die optimale Zeitauflösung sollte zelltypspezifisch gewählt werden und in möglichst geschlossener Form die Änderungen der Adhäsionsmuster und die Formierung von Zellspuren wiedergeben.

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Für die Darstellung der Dynamik der Prozesse war angestrebt, aufgrund rascher Systemreaktionen, möglichst wenig Bildverarbeitung einsetzen zu müssen und, wenn möglich, zusammenfassende Darstellungen in Bildform zu entwickeln, die es erlauben, die Dynamik beispielsweise über Musterdarstellung oder Färbung auszudrücken. Hierzu waren eigene Algorithmen zu entwickeln und über kommerziell erhältliche Software umzusetzen.


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04.09.2007