4 Methodischer Teil

4.1  Materialien

4.1.1  Chemikalien

↓24

Calciumchlorid (CaCl2)

VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland

DMSO

Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland

Glucose

Serva Elektrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland

Kaliumchlorid (KCl)

Carl Roth GmbH & Co.KG, Karlsruhe, Deutschland

Magnesiumsulfat (MgSO4)

Carl Roth GmbH & Co.KG, Karlsruhe, Deutschland

Natriumchlorid (NaCl)

Carl Roth GmbH & Co.KG, Karlsruhe, Deutschland

Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3)

Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Natriumazid (NaN3)

Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland

Natriumazid (NaN3)

Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland

Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4)

Fluka, Taufkirchen, Deutschland

Paraformaldehyd (PFA)

Riedel de Haen, Seelze, Deutschland

Sylgard, Silicone Elastomer Kit 184 (PDMS):

Dow Corning GmbH, Wiesbaden, deutschland

Pluronic

Invitrogen, Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland

Tween 20

Appli Chem GmbH, Darmstadt, Deutschland

4.1.2 Antikörper und Farbstoffe

Calcein (λExmax = 495 nm, λEmmax = 514 nm):

↓25

Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland

Calcein Red Orange (λExmax = 575 nm, λEmmax = 591 nm):

Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland

↓26

Carbocyanin (Cy2) (λExmax = 490 nm, λEmmax = 508 nm) gekoppelter Polyklonaler Antikörper (IgG) aus Ziege gegen Maus IgG (H+L):

Dianova GmbH, Hamburg, Deutschland

DAPI (λExmax = 358 nm, λEmmax = 461 nm):

↓27

Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland

Dihydrocalcein (λExmax = 495 nm, λEmmax = 514 nm):

Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland

↓28

Monoklonaler Antikörper (IgG1) aus Maus gegen Maus FAK:

Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland

Phalloidin (λExmax = 546 nm; λEmmax = 573 nm):

↓29

Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland

Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit (λExmax = 492 nm, λEmmax = 517 nm):

Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland

4.1.3 Zellkultur

4.1.3.1  Zellen

↓30

3T3

DSMZ, Nr. ACC173, Braunschweig, Deutschland

C2C12

ATCC, Nr. CRL-1772, Wesel, Deutschland

CHO

ECACC, Nr. 85050302, Salisbury, Großbritannien

L929

DSMZ, Nr. Acc 2, Braunschweig, Deutschland

4.1.3.2 Medien / Puffer

DMEM Hepes Modifikation

Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland

HAM`s F12

Biochrom, Berlin, Deutschland

HANKS Puffer

Biochrom, Berlin, Deutschland

HEPES Puffer

Biochrom, Berlin, Deutschland

PBS (Ca2+/Mg2+)

Biochrom, Berlin, Deutschland

PBS (w/o)

Biochrom, Berlin, Deutschland

RPMI 1640

Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland

4.1.3.3 Zusätze

Fibronektin

Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland

FKS

0341G Biochrom, Berlin, Deutschland

Gentamycin

Biochrom, Berlin, Deutschland

L-Glutamin

Biochrom, Berlin, Deutschland

Penicillin/Streptomycin

Biochrom, Berlin, Deutschland

Pferdeserum

Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland

Trypsin/EDTA

Biochrom, Berlin, Deutschland

4.1.3.4 Transfektion

↓31

pEGFP-Aktin DNA Plasmid:

BD Biosciences Clontech, Heidelberg, Deutschland

pDsRed2-C1 DNA Plasmid:

BD Biosciences Clontech, Heidelberg, Deutschland

Optifect Reagenz

Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland

E. coli Top 10™

Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland

Qiaprep® Spin mini-Kit

Quiagen, Hilden, Deutschland

4.1.4 Labormaterialien und Laborgeräte

Deckglaskammer NUNC

Nalge NUNC, Wiesbaden, Deutschland

Zählkammer

Thoma, Carl Roth GmbH & Co Kg, Karlsruhe, Deutschland

Zentrifuge

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München, Deutschland

Brutschrank

Binder, Tuttlingen, Deutschland

Sterilbank

Baker Company, Stanford, USA

Strukturierte Glassubstrate (10x10 mm):

NaWoTec GmbH, ein Unternehmen der Carl Zeiss SMT AG, Rossdorf, Deutschland

4.1.5 Mikroskopie

CPLN 10xRC:

Olympus Deutschland, Hamburg, Deutschland

IX 71 mit IX2-RFAL:

Olympus Deutschland, Hamburg, Deutschland

IX2-ARCEVA:

Olympus Deutschland, Hamburg, Deutschland

IX2-RFAEVA:

Olympus Deutschland, Hamburg, Deutschland

IX2-DIC 60 Einheit (IX2-LWPO, IX2AN, Prisma):

Olympus Deutschland, Hamburg, Deutschland

Laser: Argon 488

Laser 2000, München, Deutschland

PlanAPO 60xOil TIRFM:

Olympus Deutschland, Hamburg, Deutschland

U-LH100HG Lampe:

Olympus Deutschland, Hamburg, Deutschland

U-MNIBA2:

Olympus Deutschland, Hamburg, Deutschland

U- N41002:

Olympus Deutschland, Hamburg, Deutschland

Nose piece stage:

Olympus Deutschland, Hamburg, Deutschland

Inkubations- Kammer:

Olympus Deutschland, Hamburg, Deutschland

Uniblitz VMM-T1 Shutter Driver / Timer:

Uniblitz, Garching, Deutschland

Immersionsöl (RT):

Olympus Deutschland, Hamburg, Deutschland

Immersionsöl (Brechungsindex 1,514 bei 37 °C):

Cargille über Winopal Forschungsbedarf, Ahnsbeck, Deutschland

Kamera Orca-ER, C4742-95-12ERG:

Hamamatsu, Garching, Deutschland

Axiovert 200 M mit LSM 510 Meta mit entsprechender Software:

Carl Zeiss AG Deutschland, Jena, Deutschland

EC Plan-Neofluar 40x/1,30 Oil DIC:

Carl Zeiss AG Deutschland, Jena, Deutschland

Diodenlaser: 405 nm, 30 mW:

Carl Zeiss AG Deutschland, Jena, Deutschland

Argon Laser: 458, 477, 488 und 514 nm, 30 mW:

Carl Zeiss AG Deutschland, Jena, Deutschland

Helium-Neon Laser 1: 543 nm, 1 mW:

Carl Zeiss AG Deutschland, Jena, Deutschland

Openlab Software

Improvision, Coventry, UK

Image J

NIH, Bethesda, USA

4.2 Methoden

4.2.1  Zellkultur

↓32

L929-Fibroblasten wurden in RPMI 1640 Medium mit 3,6 mM L-Glutamin kultiviert.
3T3-Fibroblasten und C2C12-Muskelzellen wuchsen in Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM) mit 200 mM L-Glutamin. RPMI und DMEM enthielten jeweils 25 mM Hepes Puffer. CHO-Epithelzellen wurden in HAM´s F12 Medium mit 1,75 mM L-Glutamin kultiviert. Alle Medien wurden mit 10 Prozent fötalem Kälberserum (FKS) und 1 Prozent Gentamycin versetzt. Alle Zellen wurden nach jeweils 3-4 Tagen umgesetzt. Dazu wurden die Zellen zweimal mit HANKS Puffer gespült und mit Trypsin/EDTA versetzt. Die Trypsinmengen und die Trypsinierungszeiten richteten sich jeweils nach der Stärke der Substrathaftung. Je nach Wachstumsverhalten kamen unterschiedliche Zellzahlen auf eine 25 cm2 Flasche zum Einsatz (s. Tabelle 1). C2C12-Muskelzellen durften nicht dichter als bis zu 50-60 Prozent Konfluenz aufwachsen, da sonst die Differenzierung zu Myotuben einsetzt. Zur Differenzierung wuchsen die Zellen bis zur Konfluenz auf und das Medium wurde statt mit FKS mit 2 Prozent Pferdeserum versetzt. Wenn nicht anders erwähnt, wurden 103 Zellen / cm2 als Präparat für 48 Stunden bei 37 °C 95 Prozent Feuchtigkeit und 5 Prozent CO2 in 9,4 cm2 Deckglas Kammern kultiviert.

Tabelle 1: Übersicht über die Zellkultivierung

Zelllinie

Zellzahl / Flasche

Trypsinmenge [ml]

Trypsinierungszeit [min]

3T3

2 x 104

0,5

6

CHO

1 x 104

0,5

8-10

C2C12

8 x 103

0,5

8-10

L929

5 x 104

0,1

4

4.2.2 Beschichtung von Substratoberflächen

Zur Modifikation von Substratoberflächen aus Glas wurden diese mit dem extrazellulären Matrixprotein Fibronektin (FN) beschichtet. Dazu wurde eine Seite einer 2 x 4,4 cm2 Deckglas Kammer 30 Minuten mit einer FN-Lösung (50 μg / ml in ddH2O) inkubiert. Um eine gleichmäßige Beschichtung zu erreichen, darf die Lösung nicht eintrocknen. Anschließend wurde der Überstand abgenommen und die Kammer 2 x mit 1 ml PBS gespült. Die zweite Seite der Deckglas-Kammer diente als Kontrolle und wurde genauso behandelt. Die fertigen Kammern wurden direkt eingesetzt. Da der Adhäsionsprozess auf FN sehr gut und schnell vor sich geht, konnten die Zellen bereits nach 2 Stunden beobachtet werden. Daher wurde die Zelldichte auf 104 Zellen / cm2 erhöht. Zu Kontrollzwecken wurden zusätzlich Inkubationszeiten von 6 bzw. 24 Stunden auf FN durchgeführt.

4.2.3 Fluoreszenzverfahren

↓33

Zur Analyse von intrazellulären Bestandteilen kommen Fluoreszenzverfahren zur Anwendung. Dazu werden die Targetstrukturen mittels direkter oder indirekter Markierung an Fluorophore gekoppelt. Bei den direkten Verfahren können die Targetstrukturen mit fluoreszierenden Farbstoffen wie z. B. DAPI oder Phalloidin direkt gefärbt werden, bei den indirekten werden die Strukturen über Antikörper erkannt, die an das Fluorophor gekoppelt sind. Für Lebenduntersuchungen werden zytosolische Zellfarbstoffe und zusätzlich Fusionsproteine mit fluoreszierenden Proteinen (GFP) eingesetzt.

4.2.3.1  Färbungen

Zur Beobachtung von Adhäsionskontaktmustern mussten lebende Zellen gefärbt werden. Dazu wurde als erstes ein Volumenzellfarbstoff gewählt, der die intakte Zellmembran passieren kann und in der Zelle angereichert wird. Da die Carboxylgruppen von Fluoreszenzfarbstoffen im Zellmedium geladen wären, werden diese mit Acetoxymethyl (AM)-Estern als Schutzgruppe umgesetzt. So erhält man ein ungeladenes Fluorophor, das membrangängig ist. Intrazellulär wird der AM-Ester von unspezifischen Esterasen hydrolysiert (Homolya et al. 1993). Das Fluorophor erhält seine Ladung zurück und kann die Zelle nicht mehr verlassen (Ionenfallenmechanismus). Zusätzlich wird der Farbstoff in der Zelle angereichert (progressive Färbung), da durch die Hydrolyse der Konzentrations-gradient des veresterten Farbstoffs über die Membran hinweg aufrechterhalten wird. Da die Zellen gleichmäßig über die gesamte Zelloberfläche beladen werden, ist nicht mit Farbstoffschwankungen innerhalb einer Zelle zu rechnen, allerdings können verschiedene AM-Fluorophore von verschiedenen Zellen unterschiedlich gut aufgenommen werden (Esposito et al. 2002). Des Weiteren sind die Hydrolyseprodukte (Essigsäure und Formaldehyd), sowie der Farbstoff selbst in größeren Konzentrationen zellschädlich, so dass es bei zu großen Farbstoffkonzentrationen zu Vergiftungserscheinungen kommen kann (Liminga et al. 1999).

Die Farbstoffe Calcein, Dihydrocalcein und Calcein Red Orange beruhen auf dem oben beschriebenen Mechanismus. Die beiden blau anregbaren Farbstoffe Calcein und Dihydrocalcein konnten in allen Zellen verwendet werden, Calcein Red Orange wirkte auf L929-Fibroblasten innerhalb kürzester Zeit zytotoxisch und konnte daher nicht eingesetzt werden. Calcein Red Orange hat allerdings den Vorteil mit niederenergetischerem, grünen Licht angeregt zu werden, was bei Langzeitstudien Zellschäden durch Strahlung vorbeugt. Dieser Farbstoff ist allerdings auch in der AM-Form fluoreszent und kann daher nicht im Medium verbleiben, da sonst eine hohe Hintergrundfluoreszenz entstehen würde. Dihydrocalcein hingegen muss nach der Abspaltung der Esterschutzgruppen in der Zelle zusätzlich noch oxidiert werden, bevor der Farbstoff fluoresziert.

↓34

Zur Färbung mit Calcein, Dihydrocalcein und Calcein Red Orange wurde ein spezieller Puffer (Calceinpuffer) angemischt und die Zellen einmal in dem Puffer gewaschen. Dieser Puffer ist in der Zusammensetzung normalem Medium nachempfunden und ermöglicht die Kultivierung der Zellen bis zu 24 Stunden. Der Calceinpuffer wurde aus 10 fach-Lösungen immer frisch zusammengesetzt (127 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgSO4, 10 mM Glucose, 10 mM HEPES, 5 mM NaHCO3, 0,5 mM NaH2PO4, und wahlweise 2 mM CaCl2). Da AM-Ester von Fluoreszenzfarbstoffen in der Regel schlecht wasser-löslich sind, wurde zur Aufnahme des Farbstoffs ein nichtionisches und nichttoxisches Detergenz (Pluronic F127) als Lösungsvermittler eingesetzt. 50 Mikrogramm Farbstoff wurden in je 20 Mikroliter Pluronic F127 und wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) aufgenommen und dann auf die Endkonzentration verdünnt. Nach der Inkubation wurde die Farbstofflösung durch normalen Calceinpuffer ersetzt und die Zellen direkt mikroskopiert. Für Langzeitstudien wurde die Konzentration reduziert und die Zellen verblieben während des gesamten Experimentes in der Farbstofflösung.

Da die Calceinfarbstoffe ungebunden im Zytosol liegen, werden sie nur durch eine intakte Zellmembran in der Zelle gehalten. Dies ist bei fixierten Zellen nicht mehr gegeben. Daher müssen hier Farbstoffe eingesetzt werden, die mit den zytosolischen Proteinen reagieren können. Dabei kommen zwei verschiedene Mechanismen in Frage: Thiol- oder Aminreaktive Farbstoffe. Erstere reagieren intrazellulär mittels eines endständigen Chlorids mit der Thiolgruppe von Glutathion. Diese Verbindung wird bei Teilungen gleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt und ist fixierbar. Aminreaktive Farbstoffe, wie der Vybrant SE CMFDA Farbstoff, besitzen einen Succinimidylester als reaktive Gruppe. Intrazellulär reagieren diese Substanzen unter Ausbildung einer Peptidbindung mit Aminogruppen von Proteinen. Auch dieses Produkt ist fixierbar. Um das Umgebungs-medium möglichst proteinfrei zu bekommen wird die Anzahl der Waschschritte auf drei erhöht. Trotzdem ist für Anwendungen der TIRF-Mikroskopie zu berücksichtigen, dass die Proteinschicht, die aus dem Medium auf den Glasboden absorbiert, einen erhöhten und unregelmäßigen Hintergrund hervorrufen kann. Im Gegensatz zu den Calceinfarbstoffen, die direkt nach dem Färben einsetzbar sind, benötigen die fixierbaren Farbstoffe noch mindestens eine Stunde Reaktionszeit, in der die intrazellulären Bindungen ausgebildet werden.

Um fixierte Präparate zu erhalten, wurden die Zellen drei Mal mit warmem PBS gewaschen und mit 4 Prozent Paraformaldehydlösung für 10 Minuten bei 37 °C inkubiert. Nach der Fixierung wurde überschüssiges Paraformaldehyd abgewaschen (3 Mal PBS) und die Zellen zur Färbung eingesetzt. Zur Visualisierung des Aktinzytoskeletts wurde ein fluoreszenzgekoppeltes Phalloidin, das bizyklische, giftige Heptapeptid des Grünen Knollenblätterpilzes gewählt (Wulf et al. 1979). Phalloidin interkaliert in die Spalte, die normalerweise das Nukleotid und das zweiwertige Kation bindet, und stabilisiert die filamentöse Form des Aktins (Otterbein et al. 2001). Die Färbung von Zellkernen erfolgte mit 4´,6-Diamino-2-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI), einem Fluoreszenzmarker, der in die AT reichen Regionen der DNA interkaliert (Dolezel et al. 1992). Aktive Zelladhäsionen wurden an Hand der Fokalen Adhäsions Kinase (FAK) mittels Antikörperfärbung identifiziert.

↓35

Die genauen Protokolle mit Konzentration, Wasch- und Inkubationsbedingungen sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Tabelle 2: Übersicht über die verwendeten Antikörper und Farbstoffe, sowie deren spektrale Daten und die eingesetzten Protokolle.

Farbstoff / Antikörper

Ex max [nm]

Em max [nm]

Medium

Konzen-tration

Inkuba-tion

Waschen

vorher

Waschen

nachher

Anti Maus FAK

---

---

PBS + 2 % BSA

1,25 μg / ml

60 min, 4 °C

60 min, PBS + 2 % BSA

3x PBS + 0,1 %Tween, 5 min

Anti Maus IgG

490

508

PBS + 2 % BSA

30 μg / ml

60 min, 4 °C

10 min, PBS + 2 % BSA

3x PBS + 0,1 % Tween, 5 min

Calcein

495

514

Calcein-puffer
(-Ca2+)

10 μg / ml

15 min, 37 °C

1x Calcein-puffer (+Ca2+)

1x Calcein-puffer (+Ca2+)

Calcein Red Orange

575

591

Calcein-puffer

10 μg / ml

15 min, 37 °C

1x Calcein-puffer (+Ca2+)

1x Calcein-puffer (+Ca2+)

DAPI

358

461

PBS

0,1μg / ml

5 min,
RT

1x PBS

2x PBS, 5 min

Dihydro-calcein

495

514

Calcein-puffer
(-Ca2+)

10 μg / ml

15 min, 37 °C

1x Calcein-puffer (+Ca2+)

1x Calcein-puffer (+Ca2+)

Calceine Langzeit

---

---

Medium

1 μg / ml

Perma-nent

1x Medium

---

Phalloidin Alexa Fluor 546

546

573

PBS

0,2 μg / ml (3U)

60 min,
4 °C

1x PBS

2x PBS, 5 min

Vybrant SE CMFDA

492

517

Medium ohne FCS

5,6 μg / ml

15 min,
4 °C

3x PBS

3x PBS

4.2.3.2 Lebend-Fluoreszenzmarker

Um Zeitrafferstudien von Proteinen des Zytoskeletts durchführen zu können, muss aus einem Fluoreszenzmarker und dem gewünschten Targetprotein ein Fusionsprotein hergestellt werden. Dazu werden die Targetproteine und die Fluoreszenzmarker in einem Plasmid zusammenkloniert und anschließend in eukaryotische Zellen mittels Lipofektion (Felgner et al. 1987) transformiert. Dort werden die prokaryotischen Plasmide mit Hilfe eines viralen Promotors exprimiert.

↓36

Hier kamen zwei Fluoreszenzmarker zum Einsatz: pEGFP („enhanced“ grün fluoreszierendes Protein,) und pDsRed2-C1 (Discosoma rot fluoreszierendes Protein). Bei EGFP handelt es sich um eine rotverschobene (λAbsmax = 488 nm, λEmmax = 507 nm) Mutante (Cormack et al. 1996) des aus Aequorea victoria isolierten Wildtyp-GFP (Shimomura et al. 1962). GFP und seine spektral ähnlichen Mutanten haben sich zu dem meistgenutzten Reportergensystem in allen Bereichen der Biotechnologie entwickelt (Misteli und Spector 1997). Allerdings ist manchmal ein zweiter Marker, möglichst mit einer deutlich anderen spektralen Charakteristik von Nöten. In diesem Falle wurde zusätzlich ein reines pDsRed2-C1-Plasmid verwandt. Damit konnten die Zellen zytosolisch gefärbt werden, so dass die Beobachtung der Adhäsionsmuster über längere Zeiträume möglich wurde. DsRed wurde ursprünglich aus der Blauscheibenanemone Discosoma spec isoliert (Matz et al. 1999). Dieses Fluorophor benötigt allerdings 3 bis 4 Tage zur Reifung, was die Anwendungsmöglichkeiten in der Biotechnologie deutlich schmälert. Daher stellten Bevis et al. eine Reihe von Mutanten her (Bevis und Glick 2002). Bei DsRed2 gelang es durch den Austausch von sechs Aminosäuren eine schnellere Reifung, bereits innerhalb von 24 Stunden, zu erhalten. Das Fluorophor wird bei λ = 558 nm angeregt und emittiert bei λ = 583 nm maximal.

Die gekauften Plasmide wurden in E.coli Top 10 nach den Standardprotokollen vermehrt und mittels eines Plasmidisolationskits aufgereinigt.

Nach dem folgenden Protokoll vergehen zwischen Aussaat der Zellen und Start der mikroskopischen Beobachtung 4 Tage, statt normalerweise 2 Tage (s. 4.2.1). Da die Zellen im Präparat noch die Möglichkeit zur Migration haben sollen und die Zelldichte in allen Präparaten konstant bleiben soll, müsste die Zellzahl zur Aussaat entsprechend geviertelt werden. Im Gegenzug belastet die Transfektion die Zellen und führt zu einer Verlangsamung der Zellteilung. Eine Zellzahl von 5x 102 Zellen / cm2 führte zu den gewünschten Ergebnissen und wurde daher für die Transfektionsexperimente gewählt.

↓37

Nach 2 Tagen Wachstum in der NUNC-Kammer wurden die Zellen transfiziert. Dazu wurde serumfreies Medium mit zusätzlich 2 mM L-Glutamin hergestellt und die Zellen einmal mit PBS gewaschen. Parallel dazu wurden 4,5 Mikrogramm DNA (pEGFP-Aktin-DNA und pDsRed2-C1-DNA, und 12 Mikroliter Optifect Reagenz in je 500 Mikroliter serumfreiem Medium aufgenommen und bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Nach 5 Minuten wurden die Lösungen vereinigt und für weitere 30 Minuten bei RT inkubiert. Diese Mischung wurde auf 2 Milliliter aufgefüllt und für 24 Stunden auf die Zellen gegeben. Nach einem weiteren Waschschritt (1-mal PBS) und 24 Stunden Regenerationszeit in Vollmedium wurden die Zellen für die Mikroskopie eingesetzt. Nach 48 Stunden war auch der Auffaltungsprozess der Proteine abgeschlossen, so dass die gewünschten Strukturen beobachtet werden konnten. Da auch bei längeren Zeitrafferstudien keine morphologische Auffälligkeiten beobachtet werden konnten, die Teilungsraten wieder normal waren und auch die C2C12-Muskelzellen noch in der Lage waren zu differenzieren, wurde das Zellverhalten als normal und mit untransfizierten Zellen vergleichbar angesehen.

Um zu Überprüfen, ob die transfizierten Proteine wie die endogenen Analoga von der Zelle verwendet werden, wurden pEGFP-Aktin-transfizierte Zellen mit Phalloidin gegengefärbt. Es konnten keinerlei Unterschiede zwischen der Verwendung des endogenen und des GFP-markierten Aktins festgestellt werden.

4.2.4 Totale Interne Reflexions Fluoreszenz (TIRF-) Mikroskopie

Die Wahl der mikroskopischen Beobachtungstechnik ergibt sich aus der Lokalisation der zu untersuchenden Ereignisse. Da diese am Übergang vom Substrat zur Zelle lokalisiert sind, wurde die Totale Interne Reflexions Fluoreszenz (TIRF-) Mikroskopie gewählt. Dabei handelt es sich um ein Fluoreszenz-Mikroskopieverfahren, bei dem die Anregung des Präparates durch ein bei Totalreflexion entstehendes evaneszentes Feld erfolgt. Da die Intensität dieses Feldes vom Substrat weg exponentiell abfällt, erhält man nur eine sehr geringe Eindringtiefe in das Präparat. Dadurch ergibt sich eine bis zu zehnfach bessere Diskriminierung in z-Richtung, als sie z. B. mit einem „Confocal Laser Scanning“ (CLS-) Mikroskop erreicht wird. Abbildung 4 zeigt den Anregungsbereich einer Zelle durch ein evaneszentes Feld.

↓38

Abbildung 4 : Darstellung des Anregungsbereiches durch ein evaneszentes Feld bei der TIRF-Mikroskopie.

Die Diskriminierung in z-Richtung führt dazu, dass weiter im Zellinneren liegende Fluorophore nicht angeregt werden, sondern eine Fokussierung auf den substratnahen Bereich stattfindet. Daher zeichnet sich die TIRF-Mikroskopie durch die exklusive Abbildung der substratnahen Strukturen und durch ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis aus.

Die TIRF-Mikroskopie gewinnt in den Biowissenschaften immer mehr an Bedeutung. Die enormen Vorteile zur Beobachtung substratnaher Phänomene, können seit der Entwicklung von TIRF-fähigen Objektiven leichter genutzt werden. Weitere geeignete Bereiche für die Anwendung der TIRF-Mikroskopie sind Vesikelfusionen mit der Zellmembran, wie sie bei der Exozytose vorkommen, oder Einzelmolekülstudien, wie die Umsetzung des ATP durch Myosin (Toomre und Manstein 2001). Im Folgenden werden kurz die grundlegenden Prinzipien dargestellt, wobei anschließend genauer auf den experimentellen Aufbau eingegangen wird.

↓39

Tritt ein Lichtstrahl aus einem optisch dichteren Medium (z. B. Glas) in ein optisch dünneres Medium (z. B. Wasser) über, so wird er gemäß des Snellius´schen Gesetzes gebrochen.

wobei α1, der Einfallswinkel des eintreffenden Lichtstrahls, α2 der Austrittswinkel des gebrochenen Lichtstrahls und n die Brechungsindices der Medien beschreibt. Ist n2 (Wasser) < n1 (Glas), so wird der Lichtstrahl vom Lot weg gebrochen. Dieser Effekt wird umso größer, je größer der Einfallswinkel α ist. Für den Grenzfall, dass das austretende Licht parallel zur Phasengrenze verläuft, ergibt sich der Einfallswinkel aus dem Quotienten der beiden Brechungsindices gemäß:

↓40

Da das Licht in das optisch dünnere Medium nicht mehr eintreten kann, sondern an der Grenzfläche vollständig reflektiert wird, wird der Winkel αT als kritischer Winkel der Totalreflexion bezeichnet. Im Falle von Borosilikatglas und dem Zytosol einer Zelle (n2 = 1,358-1,374) (Lanni et al. 1985) beträgt der Winkel, ab dem Totalreflexion erreicht wird, bei Anregung von Licht mit der Wellenlänge 488 Nanometer (n1Glas = 1,524) zwischen 63,0 und 64,3 Grad und bei Anregung von Licht mit der Wellenlänge 546 Nanometer (n1Glas = 1,519) zwischen 63,4 und 64,8 Grad.

Die klassische Elektrodynamik erlaubt es allerdings nicht, dass sich eine elektromagnetische Welle diskontinuierlich verhält und einfach verschwindet (Steyer und Almers 2001). Daher entsteht an der Grenzfläche ein so genanntes „evaneszentes Feld“, das in das optisch dünnere Medium eindringen kann. Abbildung 5 zeigt diese Situation schematisch.

↓41

Abbildung 5 : Schematische Darstellung des evaneszenten Feldes, das sich bei Totalreflexion ausbildet.

Das evaneszente Feld hat dieselbe Frequenz wie das totalreflektierte Licht (Axelrod 2001), besitzt allerdings keine reelle Ausbreitung mehr, sondern fällt in der Intensität von der Grenzfläche her exponentiell ab (Axelrod 1981). Die Intensität des evaneszenten Feldes kann im Abstand z von der Grenzfläche wie folgt berechnet werden.

↓42

Dabei ist die theoretische Eindringtiefe dp des evaneszenten Feldes als der Wert definiert, bei dem die Ursprungsintensität I0 auf I0 / e abgefallen ist. Die theoretische Eindringtiefe hängt von der Wellenlänge λ und dem Einfallswinkel des verwendeten Lichts sowie den beiden Brechungsindices n1 und n2 der Medien ab.

Die in der Standardanwendung erreichten Eindringtiefen liegen bei ungefähr 100 Nano-metern. Damit erreicht die TIRF-Mikroskopie eine deutlich höhere Diskriminierung in
z-Richtung als die CLS-Mikroskopie. Zudem erhält man neben einem guten Signal-Rauschverhältnis auch eine Minimierung der lichtinduzierten Zellschäden und des Ausbleichens der Probe gegenüber Standardfluoreszenztechniken.

↓43

Zum Erhalt eines TIRF-Feldes wurden im Zusammenhang mit einem Objektiv mit hoher numerischer Apertur (PlanAPO60xOil TIRFM) zwei verschiedene Aufbauten eingesetzt. Für fixierte, einfarbige Präparate wurden ein Argonlaser und der entsprechende Laser-TIRF-Kondensor (IX2-RFAEVA) eingesetzt. In Kombination mit der Inkubationskammer und für Mehrfarb-TIRF-Anwendungen wurde die TIRF-Beleuchtung mit einer Quecksilberdampflampe (U-LH100HG) und den Filtersets U-MNIBA2 (Exciter: BP 470 -490 nm, Dichroid: LP 505 nm, Emitter: BP 510 - 550 nm) und U-N41002 (Exciter: BP 510 – 560 nm, Dichroid: LP 565 nm, Emitter: BP 572,5 - 647,5 nm) realisiert. Dazu wurde der "L-shape" Kondensor (IX2-RFAL) mit dem TIRF-„set-up“ (IX2-ARCEVA) ausgerüstet.

Da TIRF-Beleuchtung mit einer Quecksilberlampe ungewöhnlich ist, soll im Folgenden kurz der Strahlengang erläutert werden: Direkt hinter der Kollimatorlinse der Quecksilberlampe ist der Erregerfilter positioniert und filtert die gewünschten Wellenlängen aus. Dann wird das Licht über einen Keil in die Randbereiche der Kondensoroptik verschoben und wird dort durch eine halbmondförmige Blende beschnitten, damit nur die Randbereiche der Beleuchtung zur Anregung benutzt werden können. Dieses Blendenbild wird in die hintere Fokusebene des Objektivs projiziert. Das Anregungslicht durchläuft dann axenfern das Objektiv und der austretende Strahl wird auf Grund der hohen NA total reflektiert. Bei Einsatz eines Lasers als Anregungsquelle muss der Laserstrahl ebenfalls so eingekoppelt werden, dass er entfernt von der optischen Achse im Randbereich des Objektivs auf die Frontlinse trifft, wo er dann beim Austritt ebenfalls total reflektiert wird. Abbildung 6 zeigt den Strahlengang für beide Anregungs-möglichkeiten und das austretende evaneszente Feld.

Abbildung 6 : Strahlengang des TIRF-Aufbaus mit Laser- und Lampenanregung

4.2.4.1  Bildaufnahme

↓44

Die Bildaufnahme erfolgte mittels einer Peltier gekühlten CCD Kamera und openlab Software. Für Zeitrafferaufnahmen im RC-Durchlichtverfahren wurde die programminterne Routine eingesetzt. Die Bildabstände wurden dem Experiment entsprechend gewählt. Zur Aufnahme von Zeitrafferserien im TIRF-Modus wurde zusätzlich ein automatisches Verschlusssystem (Uniblitz VMM-T1 „Shutter / Driver / Timer“) vor die Lampe geschaltet. Dadurch konnte der Stress für die Zellen durch die Bestrahlung mit hochenergetischem Licht minimiert werden. Die Synchronisation von Verschlusssystem und Bildaufnahme wurde durch eine Verbindung zwischen Shutter und Rechnertastatur realisiert. Die Bildaufnahme erfolgte standardmäßig mit einer Belichtungszeit von 400 Millisekunden und einer halbmaximalen Detektorverstärkung.

4.2.4.2 Zeitserien

An die Aufnahme von Zeitserien über lange Zeiträume werden experimentell hohe Anforderungen gestellt. Dabei müssen zum einen die Umgebungsbedingungen für die Zellen möglichst konstant und physiologisch gehalten werden, zum anderen ergeben sich aus der Klimatisierung des Aufbaus Probleme mit der Fokusstabilität bei hochauflösenden Mikroskopietechniken.

Für Aufnahmen von Zeitserien wurde ein IX-71-Mikroskop mit einer Inkubationskammer ausgestattet. Dadurch konnten Temperatur (37 °C), CO2-Konzentration (5 Prozent) und Luftfeuchtigkeit (65 Prozent) den Kulturbedingungen in einem Brutschrank angepasst werden. Im Gegensatz zum Brutschrank sind allerdings bei einer Inkubationskammer die Außenwände nicht isoliert, so dass sich über die Kammer ein Temperaturgradient einstellt. Zusätzlich befindet sich das Mikroskopstativ teilweise außerhalb der beheizten Kammer, so dass auch dort ein Temperaturgradient zu erwarten ist. Das hat die folgenden Konsequenzen.

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Zum einen darf die Luftfeuchtigkeit 65 Prozent nicht überschreiten, da sich sonst an den kältesten Stellen Kondenswasser bildet, das in das Mikroskop fließen kann. Zum zweiten können sich durch die Temperaturgradienten Auswirkungen auf die Fokusstabilität ergeben. Der durch die geringere Luftfeuchtigkeit aufgetretene Medienverlust in den Präparaten wurde durch Abdecken der Präparate minimiert und durch adäquate Mengen an ddH2O bei mehreren Versuchstagen ausgeglichen. Bei gering vergrößernden Objektiven (10fach-RC) konnte die Problematik der Fokusschwankungen vernachlässigt werden. Sollte allerdings ein Bild im TIRF-Feld unter der hohen Vergrößerung (63fach TIRFM) konstant gehalten werden, musste der Mikroskopaufbau modifiziert werden.

Ein derzeit auf dem Markt befindlicher Software-Autofokus ist nicht hilfreich, da auf Grund der Zytotoxizität längerer Zellbestrahlung die Beleuchtungszeit gering gehalten werden muss. Zudem ist es nicht sinnvoll auf der Beobachtungsstelle per Software nach zu fokussieren, da sich dabei an den Fluorophoren bis zur eigentlichen Bildaufnahme Bleicheffekte einstellen. Ein Ausweg aus diesem Problem wäre ein Hardware-Autofokus, der mittels einer Laserdiode über die Reflexion am Glassubstrat die Präparatlage bestimmt. Zur Zeit der Bildaufnahme war bei keinem Mikroskophersteller ein solches System verfügbar. Inzwischen hat Olympus allerdings ein Hardware-Autofokus-System entwickelt, das demnächst auf dem Markt sein wird und für derartige Probleme zukünftig zur Verfügung stehen wird. Indes ist auch eine rein mechanische Lösung für das beschriebene Problem möglich. Der Mikroskoptisch wurde im Endeffekt durch eine „nose piece stage“ (Prototyp) ersetzt. Da dieser Tisch im Objektivrevolver anstatt am Stativ befestigt wird und das Objektiv aufnimmt, werden Mikroskoptisch und Objektiv mechanisch und thermisch gekoppelt. Der Präparateteller sitzt wie ein Deckel auf dem Tischgehäuse und wird magnetisch gehalten. Die Fokuslage wird durch ein Feingewinde manuell geregelt. Mit Hilfe dieser Konstruktion ließen sich auch im TIRF-Modus stabile Fokuslagen über Tage realisieren.

Abbildung 7 : IX-71-Mikroskop mit Inkubationskammer unter Verwendung der „nose piece stage“ (links). Präparat auf der „nose piece stage“ in der Vergrößerung (rechts)

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Zur Steuerung der Inkubationskammer wurde vom Hersteller ein Programm zur Verfügung gestellt, das von einem separaten Rechner aus gesteuert wird. Bei Ölimmersionsobjektiven muss berücksichtigt werden, dass der Brechungsindex temperaturabhängig ist. Daher wurde ein Spezialöl eingesetzt, das bei 37 °C einen Brechungsindex von n = 1,514 hat (Cargille, Type 37). Unter diesen Bedingungen konnten die Zellen mehrere Tage kultiviert und beobachtet werden. Dabei wurden weder Veränderungen in der Teilungsrate noch morphologische Auffälligkeiten beobachtet und C2C12-Muskelzellen waren noch in der Lage zu differenzieren. Daher wurde das Zellverhalten als normal und mit Experimenten aus dem Zellinkubator vergleichbar angesehen.

4.2.4.3 Bildverarbeitung

Die aufgenommenen Bilder wurden aus dem programminternen Formatstandard in das gebräuchliche tif-Format konvertiert und dann mit ImageJ-Software weiterverarbeitet. Um Intensitätsschwankungen, beispielsweise verursacht durch Helligkeitsinhomogenitäten der Lampe, auszugleichen, wurde bei TIRF-Zeitserien die Fluoreszenzintensität in allen Bildern maximal ausgesteuert und angeglichen (0 = Hintergrund und 255 = maximales Zellsignal). Zur Auswertung von Bildern aus Zeitserien wurde eine Farbcodierung eingesetzt. Dazu wurden drei aufeinander folgende Grauwertbilder (z. B. Zeitpunkte -30,
-15 und 0 Minuten) zu einem RGB-Bild verschmolzen. Dabei repräsentieren die drei Farben blau, grün und rot die Fluoreszenzintensität an den drei Zeitpunkten t = -30,
t = -15 und t = 0 Minuten. Dieser Vorgang wurde mit allen Bildern einer Zeitserie wie folgt wiederholt: b/g/r = 1/2/3, 2/3/4, 3/4/5…n-2/n-1/n.

4.2.5 „Confocal Laser Scanning“-Mikroskopie (CLSM)

Bei der Mikroskopie von strukturierten Oberflächen kommt es beim Einsatz der
TIRF-Mikroskopie zu Problemen. Die Grenzfläche, an der das evaneszente Feld entsteht, besteht nicht mehr nur aus Glas, sondern ist streckenweise mit zwei Metallschichten bedampft. Auf Grund der Stärke der Metallschichten sind diese lichtundurchlässig. Daher kann die Reaktion der Zellen auf die Oberflächen nicht mehr beobachtet werden, da sie von unten nicht mehr beleuchtet werden. Somit wurde für die strukturierten Präparate das CLS-Mikroskop zur Detektion eingesetzt. Da CLS-Mikroskopie inzwischen zu den Standardtechniken gehört, wird die Funktionsweise nur kurz beschrieben.

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Das CLS-Mikroskop bietet eine Möglichkeit sehr hochaufgelöste Bilder in Form von optischen Schnitten in allen Ebenen eines Präparates zu machen, da nur das Licht aus dem Fokuspunkt der Bildebene zur Bildentstehung verwendet wird. Zentrales Element des konfokalen Prinzips sind zwei Lochblenden, die in einer Bildebene mit dem Fokuspunkt liegen (konfokal) und Streulicht aus den umgebenen Ebenen abschneiden (Minsky 1957). Da immer nur ein Fokuspunkt betrachtet wird, muss zur Bildentstehung der Fokuspunkt das Bild abrastern bzw. „scannen“. Das zur Fluoreszenzanregung eingesetzte Laserlicht wird durch den Hauptfarbteiler auf das Präparat fokussiert. Der Fokuspunkt wird über galvanisch betriebene Spiegel durch die Probe bewegt. Das emittierte Fluoreszenzlicht wird anschließend durch das Detektor-„Pinhol“ beschnitten und mit Photomultipliern detektiert (Földes-Papp et al. 2003).

Bei den Experimenten wurden die folgenden Einstellungen verwandt: zur Anregung wurden der Diodenlaser (405 nm), der Argon-Laser (488 nm) und der Helium-Neon-Laser 1 (543 nm) eingesetzt. Ferner kamen die folgenden Filtersätze zum Einsatz: der Hauptfarbteiler (HFT) HFT 405/488/543 wurde mit den Nebenfarbteilern (NFT) NFT 545 und NFT 490 kombiniert.

Als Detektionsfilter wurden zwei Bandpass-Filter (BP) BP 420-480 und BP 505-530 und ein Langpass-Filter LP > 560 nm gewählt. Die Auflösung betrug 1024x1024 Pixel, was einer Bildbreite von 123 Mikrometern entspricht.

4.2.6 Strukturierung von Oberflächen

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An die strukturierten Oberflächen wurden verschiedene Anforderungen gestellt. Als Basis wurden die Standardglassubstrate gewählt. Dadurch ist zum einen die Vergleichbarkeit gewährleistet und zum anderen sind die Präparate lichtmikroskopisch analysierbar. Für den gewünschten Größenbereich von 100 Nanometern bis einigen Mikrometern lateraler Ausdehnung eignen sich Metallstrukturen, die im Elektronenstrahl-Lithographieverfahren hergestellt werden können. Dabei ist die Höhe der Strukturen frei wählbar. Um die Oberfläche weiter modifizieren zu können wurde für die Strukturierung Gold gewählt. Dadurch steht über die Möglichkeit einer Thiol-Goldbindung eine Oberflächenchemie zur Verfügung, die die Strukturen beliebig modifizieren kann. Prinzipiell ist auch eine weitere Modifikation der Glasoberfläche möglich.

4.2.6.1  Elektronenstrahl-Lithographie

Die Herstellung der Strukturen erfolgte beim Kooperationspartner NaWoTec GmbH. Da es sich bei der Elektronenstrahl-Lithographie um einen technisch anspruchsvollen Vorgang handelt, soll kurz der Ablauf der Herstellung umrissen werden.

Auf gereinigte Glasoberflächen wird eine Metallbasisschicht (10 nm) aus Titan oder Crom aufgedampft, da für die Elektronenstrahl-Lithographie eine leitende Oberfläche nötig ist, die die entstehenden Ladungen ableitet. Anschließend wird ein Photolack auf die Basisschicht aufgebracht. Die Belichtung erfolgt unter Einsatz eines Elektronenstrahls. Dadurch können beliebige Muster in den Lack geschrieben werden. Anschließend werden die belichteten Teile des Lacks chemisch entfernt und eine Haftschicht aus Titan (10 nm) und die Goldschicht in der gewünschten Höhe (60 nm) aufgedampft. Ein Haftvermittler ist nötig, da Gold selbst nicht beständig an Glas bindet. In den belichteten Bereichen liegt das Gold jetzt direkt auf dem Titan und bildet die gewünschten Strukturen. Mit der chemischen Entfernung des nicht belichteten Lacks verschwindet gleichzeitig das Gold in den Zwischenräumen. Anschließend wurde die Basisschicht wieder entfernt, damit das Präparat lichtmikroskopisch zugänglich ist. Das Ätzen einer Titanbasisschicht kann beispielsweise mit konzentrierter Schwefelsäure bei 150 °C erfolgen. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist der gesamte Prozess in Abbildung 8 schematisch dargestellt.

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Abbildung 8 : Schematische Darstellung der einzelnen Prozessschritte bei der Strukturherstellung

Die vom Projektpartner hergestellten Strukturen zeichneten sich durch eine hohe Qualität und eine große Steilheit der Strukturkanten aus. Alle Susbtrate waren zellverträglich und die Haftung auf dem Glassubstrat wurde durch die Zellkultivierung nicht beeinträchtigt. Abbildung 9 zeigt die rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von Winkelstrukturen.

Abbildung 9 : Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme einer Beispielstruktur, hier Titanwinkel.


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04.09.2007