5 Ergebnisse

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Mit Hilfe der Langzeit-TIRF-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass die ventrale Zellmembran von adhärenten Zellen eine zellspezifische Strukturierung aufweist. Diese Strukturierung steht mit dem Adhäsionsverhalten der Zellen im Zusammenhang und hat ebenfalls Auswirkungen auf die Migration der Zellen. Des Weiteren wurde beobachtet, dass die Adhäsionsmuster auf die Bildung von Zellspuren Einfluss haben. Dabei besteht ein direkter Zusammenhang zwischen der Zellspurmorphologie und dem Adhäsionsmuster der Zellen. Zur Untersuchung dieser Zusammenhänge wurden zwei Fibroblastenzelllinien (L929 und 3T3) sowie eine Muskelzelllinie (C2C12) und eine Epithelzelllinie (CHO) gewählt, die ein weit gefächertes Migrationsverhalten zeigen und teilweise bereits mit Zellspurbildung in Verbindung gebracht werden konnten.

5.1  Dynamik des Migrationsverhaltens

Für die technische Nutzung der Zellspuranalyse ist es wichtig, den Zusammenhang zwischen der Zellspurentstehung und der Migration der Donorzelle zu verstehen und zu beeinflussen. Daher wurde das physiologische Migrationsverhalten der Zelllinien in In-vitro-Kultur untersucht. Zur Charakterisierung der Dynamik wurden von vier Zelllinien mit unterschiedlichem Migrationsverhalten Zeitrafferaufnahmen im Relief-Contrast (RC-) Durchlichtverfahren aufgenommen. Die Bildserien wurden mit Hilfe von Trajektorien ausgewertet. Die Trajektorien dienen als Grundlage zur Analyse des Migrationswegs der einzelnen Zellen und zeichnen den Weg einer Zelle bis zur nächsten Zellteilung nach.

Abbildung 10 : Migrationstrajektorien aus Zeitrafferaufnahmen im RC-Durchlichtverfahren der vier untersuchten Zelllinien. Der Beobachtungszeitraum betrug 60 Stunden, der Zeitabstand zwischen den Einzelbildern 10 Minuten. Die Trajektorien verfolgen jeweils den Wanderungsweg einer Zelle bis zur nächsten Zellteilung. A: CHO-Zellen wachsen in kleinen Gruppen und migrieren nicht. B: L929-Zellen migrieren über große Strecken und bleiben dabei vereinzelt. C: C2C12-Zellen legen kürzere Strecken zurück und tendieren zur Bildung kleiner Gruppen. D: 3T3-Zellen migrieren ähnlich wie C2C12-Zellen. Die Zellen einer Gruppe bewegen sich gemeinsam.

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Das unstimulierte Migrationsverhalten der verschiedenen Zelllinien in In-vitro-Kultur weist deutliche Unterschiede auf. Dabei ist das Verhalten nicht von der Zelldichte abhängig, sondern die beschriebenen Prinzipien sind von Beginn kurz nach der Aussaat bis zum Erreichen der Konfluenz zu beobachten.

Die CHO-Epithelzelllinie zeigt kein ausgeprägtes Wanderungsverhalten (Abbildung 10 A). Die Zellen adhärieren in kleinen Gruppen und haben Kontakt zu ihren Nachbarn. Die Gruppen bleiben weitgehend unverändert und werden durch Zellteilung langsam größer, bis sie aufeinander stoßen und eine geschlossene Schicht bilden. Die Trajektorien zeigen nur minimale Bewegungen ohne Vorzugsrichtung an.

Im Gegensatz dazu vermeiden L929-Fibroblasten Kontakt zu Nachbarzellen und sind sehr mobil (Abbildung 10 B). Die Trajektorien zeigen lange Wegstrecken an, die voneinander unabhängig verlaufen. Zellen, die sich während der Migration begegnen, ändern ihre Laufrichtung bzw. umrunden einander (B, unten: blau (1) und gelb (13)). Nach einer Zellteilung wandern die beiden Tochterzellen in entgegengesetzter Richtung davon (Mitte rechts; weiß (36) und blau (37)). Dieses Verhalten bleibt erhalten, bis die Zellen zur Konfluenz aufgewachsen sind. Dabei verteilen sich die Zellen die ganze Zeit optimal über die zur Verfügung stehende Fläche und vermeiden den direkten Zell-Zell-Kontakt.

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C2C12- und 3T3-Zellen weisen eine Mischung aus den bereits beschriebenen Verhaltensformen auf. Beide Zelltypen sind mobil, neigen aber trotzdem dazu Zell-Zell-Kontakte aufzubauen und kleine Gruppen zu bilden. An den Trajektorien erkennt man, dass die Zellen direkt aufeinander zu gelaufen sind. Drei C2C12- und vier 3T3-Zellen bilden jeweils eine Zellgruppe (Abbildung 10 C oben rechts, C2C12: weiß (39), blau (33) und türkis (36); D unten rechts, 3T3: pink (5), gelb (6), blau (8) und weiß (7)). Bestehende Gruppen bewegen sich gemeinsam, so dass die Trajektorien parallel verlaufen (D oben rechts, 3T3: blau (34), grün (35) und gelb (32)). Wenn sich Zellen von Gruppen lösen, bleiben die Zell-Zell-Kontakte bestehen, so dass sich lange Ausläufer bilden (D oben rechts, 3T3: gelb (32) und gelb (14)). Treffen Zellen zufällig aufeinander, verläuft die Migrationsrichtung anschließend parallel (C unten links, C2C12: türkis (25), grün (23) und lila (27)).

Insgesamt erscheint die Bewegung der C2C12- und der 3T3-Zellen gleichmäßiger als die der L929-Zellen. Das könnte sowohl durch unterschiedliche Migrationsmechanismen als auch durch Spannungen verursacht werden, die vermutlich entstehen, wenn sich Zellen einer Gruppe in entgegengesetzte Richtungen bewegen.

5.2 Charakterisierung der Adhäsion

Nachdem ein unterschiedliches Migrationsverhalten bei den Zellen festgestellt wurde, wird darauf aufbauend die Adhäsion der Zellen untersucht, unter der Prämisse, dass die Adhäsion Einfluss auf die Zellspurentstehung hat. Dazu wurden die Zellen mit dem zytosolischen Farbstoff Calcein gefärbt. Bei Calcein handelt es sich um einen nicht zytotoxischen Volumenmarker, der frei löslich im Zytosol der Zellen vorliegt. Dadurch wird die gesamte Zelle gleichmäßig gefärbt. Diese Färbung ermöglicht es lebende Zellen direkt zu untersuchen, so dass nicht mit der Ausbildung von Artefakten durch eine Fixierung gerechnet werden muss.

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In Kombination mit der TIRF-Mikroskopie ist es möglich eine Strukturierung der Kontaktfläche der Zelle zum Substrat selektiv zu analysieren. Auf Grund des exponentiell abfallenden Anregungsfeldes erscheinen glasnahe Bereiche heller als solche, die weiter entfernt sind. Strukturen in der ventralen Zellmembran, beispielsweise durch Adhäsion verursacht, sorgen dafür, dass das Zytosol der Zelle in manchen Bereichen näher an der Oberfläche lokalisiert ist und damit heller fluoresziert. Auf diese Weise wird die Gesamtstrukturierung der ventralen Zellmembran untersucht. Dieser Ansatz hat neben der Tatsache, dass es sich um lebende Zellen handelt, zusätzlich den Vorteil, dass man sich nicht im Vorhinein auf eine spezielle Adhäsionsform festlegen muss. Dieses wäre bei der Wahl eines Antikörpers gegen ein Protein der Adhäsionsstrukturen der Fall gewesen. Abbildung 11 zeigt die Aufnahmen, die bei der mit der Calceinfärbung durchgeführten Untersuchung entstanden.

Abbildung 11 : Vergleich des Adhäsionsmusters der untersuchten Zelllinien mittels TIRF-Mikroskopie und Korrelation des Musters mit dem filamentösen Aktin. Die Färbung erfolgte zytosolisch mit Calcein oder Vybrant CFDA SE. Aktin wurde mit Phalloidin-Alexa 546 gefärbt. L929-Fibroblasten wurden mit zweierlei Morphologien gefunden: nichtpolarisiert (A-C) und polarisiert (D-F). Das Adhäsionsmuster ist bei beiden Morphologieformen punktförmig. C2C12-, 3T3-und CHO-Zellen zeigen ein riefenförmiges Adhäsionsmuster (G-O). Das Adhäsionsmuster bei der Färbung mit Vybrant CFDA SE (B, E, H, K, N) ist ähnlich dem der Färbung mit Calcein (A, D, G, J, M). Die Aktinfärbung zeigt, dass das filamentöse Aktin für die Ausprägung des Adhäsionsmusters verantwortlich ist. C2C12- (I), 3T3- (L) und CHO-Zellen (O) haben lange, parallel angeordnete Aktinfasern. Bei den L929- Zellen sind im Aktinbild Punkte zu erkennen (C, F).

Die ventrale Membran der Zellen ist nicht gleichmäßig parallel zum Substrat angeordnet, sondern weist eine zelltypspezifische Strukturierung auf, die mit der TIRF-Mikroskopie sichtbar gemacht werden kann. Diese Strukturierung wird auf die Adhäsion der Zellen am Substrat zurückgeführt und wird daher im Folgenden als Adhäsionsmuster bezeichnet werden.

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Die erste Spalte von Abbildung 11 zeigt die Adhäsionsmuster der Calcein gefärbten Zellen in der TIRF-Mikroskopie (Abbildung 11 A, D, G, J, M). Die L929-Fibroblasten treten in zwei verschiedenen Morphologieformen auf. Die nichtpolarisierte Zelle ist rund und adhäriert punktförmig am Substrat (A). Das Auftreten lediglich vereinzelter Adhäsionspunkte spricht dafür, dass der gesamte Zellkörper außerhalb des
TIRF-Anregungsfeldes liegt. Bei der zweiten Morphologieform der L929-Zellen handelt es sich um polarisierte Zellen, wie sie in der Literatur im Zusammenhang mit der Migration beschrieben werden (Ridley et al. 2003). Das Adhäsionsmuster der polarisierten Zelle ist in zwei Teile zu unterteilen. Im Bereich der Zellfront ist ein flächiger Adhäsionsbereich zu erkennen. Im hinteren Teil der Zelle gleicht das Adhäsionsmuster dem der nichtpolarisierten Zelle und erscheint punktförmig (D). Der Bereich der Zellfront ist kaum strukturiert und gleichmäßig hell, was darauf hindeutet, dass sich die Zelle dort sehr nah am Glassubstrat befindet.

Die Zellen der anderen drei Zelllinien zeigen ein streifenförmiges Adhäsionsmuster (Abbildung 11, G-O). Dabei erscheint die Zellunterseite an sich dunkel und wird von langen parallelen hellen Streifen durchzogen. Da diese Streifen heller als der Rest der Zellmembran sind, müssen sie näher am Substrat lokalisiert sein, also nach unten vertiefte Riefen in der Zellmembran darstellen. Daher wird diese Form des Adhäsionsmusters im Folgenden als riefenförmig bezeichnet.

Bei C2C12-Zellen ist der Bereich zwischen den Riefen komplett dunkel, d. h. der über den Riefen liegende Zellkörper wird vom TIRF-Feld nicht angeregt. (Abbildung 11, G). Das bedeutet, dass die Riefen hier tiefer sind als z. B. bei 3T3-Zellen (J), bei denen die gesamte Zellunterseite zu erkennen ist und die Riefen lediglich heller fluoreszieren. In C2C12- und 3T3-Zellen erstrecken sich die Riefen über die gesamte Zellunterseite parallel zur Zelllängsachse. In CHO-Epithelzellen findet man die Adhäsionsriefen im Unterschied zu C2C12- und 3T3-Zellen entlang der Zellränder (M). Häufig ist das Zentrum bei diesen Zellen nicht strukturiert.

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Zur genaueren Bestimmung der Ursachen für die Strukturierung der Zellunterseite wurde überprüft, ob die Adhäsionsmuster mit definierten Strukturen der Adhäsionskomplexe in Zusammenhang zu bringen sind, da die Strukturierung der ventralen Zellmembran auf die Adhäsion der Zellen am Substrat zurückgeführt wird. Auf Grund der langen parallelen Riefen bei einem Teil der Zellen wurde eine Beteiligung des Aktinzytoskeletts überprüft.

Die Färbung des filamentösen Aktins (F-Aktin) erfolgte mit Fluoreszenz-gekoppeltem Phalloidin-Alexa 546. Da diese Färbung nur im fixierten Zustand der Zellen möglich ist, musste das Adhäsionsmuster ebenfalls mit einem fixierbaren Farbstoff angefärbt werden. Das vorher verwendete Calcein eignet sich dafür nicht; stattdessen wurde Vybrant CFDA SE verwendet. Vybrant CFDA SE ist wie Calcein membrangängig, bildet aber mit zytosolischen Proteinen Schiff´sche Basen aus und kann somit fixiert werden. Das Adhäsionsmuster nach der Vybrant CFDA SE Färbung unterscheidet sich im Prinzip nicht vom beobachteten Muster in den Calcein gefärbten Zellen (Abbildung 11). Die zellspezifischen Adhäsionsmuster sind mit beiden Färbemethoden zu erkennen. Daraus kann man schließen, dass die Adhäsionsmuster durch die Fixierung nicht verändert wurden. Insgesamt wurde allerdings eine stärkere Hintergrundfluoreszenz detektiert. Extrazellulär am Glas adsorbierte Proteine aus dem Medium reagieren ebenfalls mit dem Farbstoff und bilden so die Hintergrundfluoreszenz aus (H, N). Intrazellulär wurde mit Vybrant CFDA SE eine selektivere Färbung als mit Calcein erwartet, da nur die Proteine des Zytosol gefärbt wurden. Dies ist nicht der Fall, sondern die Ausprägung der zellspezifischen Muster ist unschärfer als bei Calcein. Daraus lässt sich schließen, dass die Vybrant CFDA SE Färbung nicht strukturerhaltend ist. Zusätzlich ist zu bedenken, dass Aktin den Hauptbestandteil der zytosolischen Proteine darstellt und daher mit Vybrant CFDA SE wohl hauptsächlich Aktin gefärbt wurde. Somit eignet sich der Farbstoff nicht für die untersuchte Fragestellung.

Der direkte Vergleich des Adhäsionsmusters in der Calceinfärbung mit der Anordnung des Aktinzytoskeletts zeigt, dass letzteres für die Ausbildung der Adhäsionsmuster verantwortlich ist. In der nichtpolarisierten L929-Zelle findet man ein punktförmiges Aktinbild (Abbildung 11 C), das dem Adhäsionsmuster entspricht. Der polarisierte L929-Fibroblast besitzt eine Zellfront mit kurzen Aktinfasern und einen Zellkörper mit Aktinpunkten oder sehr kurzen Aktinfasern (F). An der Zellfront ist nur das Lamellipodium zu erkennen. Der restliche Bereich der Lamelle erscheint dunkel. Auch diese Anordnung lässt sich im Adhäsionsmuster wiederfinden. In C2C12- (I), 3T3- (L) und CHO-Zellen (O) sind lange parallele Fasern zu beobachten, die den Riefen im Adhäsionsmuster entsprechen.

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Die folgende Tabelle enthält eine Zusammenfassung der bisher gewonnenen Ergebnisse.

Tabelle 3: Die Tabelle zeigt eine Zusammenfassung der bisher untersuchten Zelleigenschaften

Zell-Linie

Anordnung der Zellen

Migration

Migrationsform

Adhäsions-muster

CHO

nur in Zellgruppen

nahezu keine Migration

Bewegung erfolgt nur nach der Zellteilung zur erneuten Adhäsion

riefenförmig
entlang der Zellränder

L929

Individuell, kein Kontakt mit Nachbarzellen

Migration: ca. 23 μm / h

Zellen vermeiden Kontakt zu Nachbarzellen
voneinander unabhängige Migration der Einzelzellen

punktförmig

C2C12

kleine Zellgruppen

Migration: ca. 17,5 μm / h

Zellen nehmen Kontakt mit Nachbarzellen auf
Migration der Zellen aufeinander zu oder in kleinen Gruppen

riefenförmig
parallel zur Zelllängsachse

3T3

kleine Zellgruppen

Migration: ca. 6,5 μm / h

Zellen nehmen Kontakt mit Nachbarzellen auf
Migration der Zellen aufeinander zu oder in kleinen Gruppen

riefenförmig
parallel zur Zelllängsachse

Die Aktinfasern erscheinen in den Zellen mit riefenförmigem Adhäsionsmuster in der Intensität homogen, sie müssen also parallel zum Substrat angeordnet sein
(Abbildung 11 F). Da nur das F-Aktin der Zellen angefärbt wurde, muss auch das punktförmige Aktinbild in L929-Zellen durch filamentöses Aktin verursacht werden.

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Dieser vermeintliche Widerspruch wurde daher näher untersucht. Ausgehend von der Annahme, dass das punktförmige Muster auf die zur Aufnahme verwendete Mikroskopietechnik zurückgeführt werden könnte, wurden die Aktinsignale bei Anregung durch ein evaneszentes Feld mit denen bei Anregung mit Epifluoreszenz verglichen. Diesem Experiment liegt die Frage zu Grunde, ob die Aktinfilamente in den L929-Zellen in höheren Ebenen der Zelle liegen und die punktförmigen Signale das Ende von bogenförmig angeordneten Fasern darstellen. Zum Vergleich wurde die Lage des
F-Aktins in einer Zelle mit riefenförmigem Adhäsionsmuster (hier C2C12) ebenfalls untersucht. Abbildung 12 zeigt die Aktinstrukturen im Vergleich.

Abbildung 12 : Vergleich der sichtbaren Aktinstrukturen nach Anregung durch TIRF- oder Epifluoreszenzbeleuchtung (Falschfarbendarstellung im RGB-Raum). A, B: Bei C2C12-Muskelzellen ist zwischen TIRF- (A) und Epifluoreszenzanregung (B) kein Unterschied erkennbar. C: Überlagerung von A und B: Die Fasern erscheinen weiß. D-F: polarisierter L929-Fibroblast. Im Epifluoreszenzbild (E) sind zusätzlich zum TIRF-Bild (D) Aktinfasern zu erkennen, die sich von der Zellmitte zum Ende des Zellausläufers hin erstrecken. Die Überlagerung (F) zeigt, dass die Fasern (F, rot) die im evaneszenten Feld sichtbaren Aktinbereiche (F, weiß) verbinden.

Im Gegensatz zu den vorherigen Abbildungen, bei denen die Grauwertbilder in den Farben der Fluoreszenz nachkoloriert wurden, handelt es sich bei Abbildung 12 um eine Falschfarbendarstellung im RGB-Farbraum. Die Zuordnung der Einzelfarben zu den detektierten Signalen bei TIRF- oder Epifluoreszenzanregung erfolgte derart, dass sich für Signale, die mit beiden Anregunsarten detektiert wurden, in der Überlagerung der beiden Bilder die Farbe weiß ergibt. Somit wurden die bei TIRF-Anregung detektierten Signale mit den beiden Farben grün und blau belegt, so dass die Bilder türkis erscheinen. Den Signalen der Epifluoreszenzbeleuchtung wurde die Farbe rot zugeordnet. Die Signale unter Epifluoreszenzbeleuchtung wurden auf derselben Fokusebene aufgenommen, wie die Signale aus dem evaneszenten Anregungsfeld. Dadurch wurde die Eindringtiefe der Anregungsfluoreszenz erhöht, aber trotzdem der Fokusbereich auf das ventrale Aktin gelegt.

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Das Bild der C2C12-Muskelzelle bei TIRF-Anregung ist von gleichmäßig hellen, parallelen Aktinfasern dominiert (Abbildung 12 A). Dieses Aktinbild entspricht den vorherigen Ergebnissen. Bei Anregung durch Epifluoreszenzbeleuchtung ändert sich grundsätzlich an den Signalen nichts. Allerdings bildet nicht fokussiertes Streulicht aus höheren Schichten der Zelle einen rötlichen Hintergrund (B). Dieser Bereich ist bei Anregung durch das evaneszente Feld schwarz, da das Aktin des Zellkörpers außerhalb des
TIRF-Anregungsfeldes liegt. Bei der C2C12-Zelle sind die Signale aus den beiden Anregungsformen nahezu identisch (Abbildung 12 C). An den Stellen, wo die Aktinfasern in der Überlagerung nicht komplett weiß erscheinen, kann man erkennen, dass sie bei TIRF-Anregung zwar vorhanden sind, aber in geringerer Stärke fluoreszieren. Die Aktinfasern in C2C12-Muskelzellen liegen gleichmäßig parallel zur basalen Zellmembran.

Im Gegensatz dazu kann man bei den L929-Zellen zwischen den Signalen der beiden Anregungsformen einen deutlichen Unterschied erkennen. Abbildung 12 D zeigt das Aktinbild eines polarisierten Fibroblasten bei TIRF-Anregung. Die Zelle lässt sich in zwei Bereiche unterteilen. Die Lamelle und der Zellkörper bilden den vorderen und größeren Teil. Der Zellausläufer ist zwar länger, umfasst aber das kleinere Zellvolumen. Die Aktinverteilung über die gesamte Zelle ist nicht homogen. Am Übergang der Zelle zum Zellausläufer ist eine sternförmige Aktinanreicherung zu erkennen. Der Zellausläufer zeigt das bekannte Punktmuster. Am Ende der Zelle befindet sich noch mal ein Bereich mit einem verstärkten Aktinsignal (D). Die Lamelle besitzt nur eine geringe Signalintensität und ist wenig strukturiert. Im Lamellipodium sind Ansätze von Aktinfasern zu erkennen. Regt man diese Zelle mit Epifluoreszenz an, so erkennt man zusätzlich zu den beschriebenen Strukturen lange Aktinfasern (E). Diese Filamente verbinden die zentrale, sternförmige Aktinansammlung mit dem Zellende. Das Lamellipodium ist verbreitert und die Fasern sind im Vergleich zum Signal bei TIRF-Anregung verlängert (D). In der Überlagerung bleiben die Fasern rot, d. h. diese Signale kommen nicht vor, wenn die Anregung mit dem evaneszenten Feld erfolgt (F). Die Punkte, die Zellfront und die zentrale sternförmige Aktinstruktur erscheinen weiß, da sie bei beiden Anregungsarten detektierbar sind. Die mittleren Teile des Aktinskeletts in L929-Fibroblasten sind mit dem TIRF-Feld nicht anregbar. Daraus lässt sich schließen, dass die Aktinfasern in Bögen in der Zelle liegen.

5.3  Dynamik der Adhäsionsmuster

Nachdem die zellspezifischen Grundmuster der Adhäsion bei den verschiedenen Zelllinien charakterisiert sind und auf die Anordnung des ventralen Aktins zurückgeführt werden konnten, wurde anschließend die Dynamik der Adhäsionsstrukturen betrachtet, in der Annahme, daraus die ersten wesentlichen Gesetzmäßigkeiten für die Entstehung von Zellspuren ableiten zu können.

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Dazu wurde der mikroskopische Aufbau derart modifiziert, dass eine Zeitrafferstudie von gefärbten Zellen im TIRF-Modus durchgeführt werden konnte. Die dazu ergriffenen Maßnahmen sind im Methodenteil aufgeführt und waren das Ergebnis eines langwierigen Optimierungsprozesses. Erst nach Abschluss dieser Arbeiten war es möglich, Fokusstabilität im TIRF-Modus über mehrere Tage zu gewährleisten. Ebenfalls konnte auf Grund der Verwendung eines automatischen Verschlusssystems die Strahlungsintensität, der die Zellen ausgesetzt waren, deutlich reduziert werden. Dadurch wurden erstmals experimentelle Bedingungen geschaffen, unter denen sich Zellen über Tage normal teilen und weiterhin migrieren konnten.

5.3.1  Darstellung von Bildserien aus Zeitrafferstudien mittels einer Farbkodierung

Zur Auswertung von Zeitrafferstudien und zur Darstellung von dynamischen Prozessen in statischen Einzelbildern, wurde eine Methode entwickelt, die die Änderung der Signale über die Zeit von drei aufeinander folgenden Bildern in einem Bild darstellt. Dazu wurde eine Farbkodierung im RGB-Farbraum genutzt. Wie im Methodenteil (s. Abschnitt 4.2.4.3) beschrieben, wurden jeweils drei aufeinander folgende Grauwertbilder den Farben blau, grün und rot zugeordnet und übereinander gelegt. Abbildung 13 zeigt die Kodierung und die damit erzielten Effekte schematisch.

Abbildung 13 : Schema zur Erklärung der eingesetzten Farbkodierung: A: Drei aufeinander folgende Grauwertbilder (t = -30 min, t = -15 min und t = 0 min) werden zu einem RGB-Bild übereinander gelegt. Dieser Vorgang wird mit allen Bildern einer Zeitserie wiederholt: b/g/r = 1/2/3, 2/3/4, ... n-2/n-1/n. B: schematische Zelle während der Migration in der Farbkodierung.

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Die nach der Überlagerung der Grauwertbilder erhaltenen Farben geben Auskunft darüber, wie lange und zu welchem Zeitpunkt das Signal in der Zeitserie zu beobachten war. Die farbkodierten Bilder beschreiben daher nicht mehr einen Zeitpunkt, sondern einen Zeitraum von 30 Minuten. Daraus ergeben sich die folgenden Farbinterpretationen: Signale, die im letzten Bild einer Dreierserie entstanden sind, erscheinen rot; Signale, die nur im mittleren Bild vorhanden sind, erscheinen grün; Signale, die nur im ersten Bild vorhanden waren, erscheinen blau. Fluoreszenzsignale, die auf mehreren Bildern zu sehen sind, ergeben Mischfarben. Dabei ergibt sich für Signale, die sowohl im ersten als auch im zweiten Bild detektiert werden, als Farbe gelb. Signale, die im zweiten und dritten Bild erscheinen, sind türkis dargestellt und Signale, die konstant auf allen drei Bildern vorhanden sind, werden weiß kodiert. Abbildung 13 A zeigt die Bedeutung der Farben an Hand der drei Zeitpunkte.

In Abbildung 13 B ist als Beispiel für diese Auswertemethode schematisch eine migrierende Zelle in der klassischen Migrationsform dargestellt. Bei einer linear von links nach rechts wandernden Zelle würden sich die Signale wie im Schema dargestellt zu den einzelnen Farben ergeben. Dann lassen sich auf Grund der Farbkodierung Aussagen über die Wanderungsrichtung der Zelle machen. Ebenso lassen sich interessante Aussagen über die Langlebigkeit von Signalen und damit über die dahinter stehenden Strukturen, wie z. B. über das Aktinzytoskelett oder die Stabilität von Adhäsionsmustern, treffen. Diese Tatsache wird im weiteren Verlauf der Arbeit von großer Bedeutung sein.

Die farbkodierten Einzelbilder repräsentieren nach der Überlagerung eine Zeitspanne. Die drei zu Grunde gelegten Datenpunkte liegen zu Beginn, in der Mitte und am Ende des überspannten Zeitraums. Das erste Bild einer Abbildung, mit t = 0 bezeichnet, entspricht den Grauwertbildern zum Zeitpunkt t = -30, t = -15 und t = 0. Die angegebenen Zeiten in den folgenden Bildern beziehen sich dann immer auf die Verschiebung des gesamten Beobachtungszeitraumes.

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Die folgenden Abbildungen von Zeitserien werden immer unter Anwendung des soeben beschriebenen Systems der Farbkodierung dargestellt und interpretiert.

5.3.2 Dynamik des Adhäsionsmusters von CHO-Zellen

Zunächst wurde das experimentelle System zur Untersuchung der Dynamik des Adhäsionsmusters an den nichtmigrierenden Epithelzellen (CHO) etabliert. Das erforderte eine Modifizierung des Protokolls zur Calceinfärbung dahingehend, dass der Farbstoff im Medium verbleiben konnte und die Zellen permanent mit Farbstoff beladen wurden.

Abbildung 14 : Zeitrafferstudie der Adhäsionsmuster von CHO-Zellen nach Calceinfärbung mittels TIRF-Mikroskopie. Der Abstand zwischen den Grauwertbildern betrug 15 Minuten. Die Einzelbilder ergeben sich aus der RGB-Farbkodierung (s. Abbildung 13 ). Stabile Bereiche erscheinen weiß, Änderungen in Farbe. Das Adhäsionsmuster von CHO-Epithelzellen ist über einen Zeitraum von mehreren Stunden stabil (weiß, A-D).

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Abbildung 14 stellt die Ergebnisse einer TIRF-Zeitrafferstudie des Adhäsionsmusters von CHO-Zellen über 8 Stunden dar. Die Aufnahmen zeigen auch über den längeren Zeitbereich und nach der Überlagerung für die Farbkodierung ein hohes Maß an Schärfe und Helligkeit. Daraus lässt sich schließen, dass die Adaption der Färbung an den längeren Zeitraum erfolgreich war und die Fokusstabilität gewährleistet ist.

Wie mittels der RC-Durchlichtaufnahmen gezeigt wurde bewegen sich die CHO-Zellen kaum (s. Abbildung 10, A). Daher sind erwartungsgemäß auch keine großen Änderungen in der Zeitrafferaufnahme zu beobachten. Folglich erscheint das Adhäsionsmuster in der Farbkodierung weiß. An den Ecken der Zellen tauchen immer wieder farbige Bereiche auf. Dort spiegeln sich das Tasten der Zelle und die kleinen Bewegungen wieder, denen keine Vorzugsrichtung zugeordnet werden konnte. Die Dynamik des Adhäsionsmusters entspricht damit genau dem im RC-Durchlichtverfahren beobachteten Verhalten der Zellen in In-vitro-Kultur (s. Abbildung 10).

5.3.3 Dynamik des Adhäsionsmusters von L929-Fibroblasten

Bei der Übertragung des experimentellen Aufbaus auf die migrierenden Zellen stellte sich folgendes Problem dar. Die wiederholte Bestrahlung von L929-Fibroblasten mit blauem Licht erwies sich in Kombination mit dem angereicherten Calcein in der Zelle als zytotoxisch. Eine weitere Reduzierung der Strahlung war nicht möglich, da die gewählten Zeitabstände bereits das maximal sinnvolle Zeitintervall ausschöpfen (ein Bild in 15 Minuten). Daher wurde eine grün anregbare Variante des Calceinfarbstoffs (Calcein Red Orange) getestet. Dieser Farbstoff kam ebenfalls nicht in Frage, da er sich bereits ohne Anregung als zytotoxisch herausstellte.

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Eine zellverträgliche Variante stellte die Transfektion mit einem reinen DsRed-DNA-Vektor dar. Transfizierte Zellen zeigten keine morphologischen Auffälligkeiten oder Änderungen des Wachstumsverhaltens. Zellteilungen konnten mehrfach unter TIRF-Bedingungen beobachtet werden. DsRed liegt wie Calcein im Zytosol vor und wird auf Grund des viralen Promoters permanent exprimiert, so dass immer genügend Fluorophor zur Verfügung steht. Zusätzlich wird die Strahlungsbelastung reduziert, da es sich um ein grün anregbares Fluorophor handelt. Die im TIRF-Feld beobachteten Adhäsionsmuster entsprechen denen einer Calceinfärbung. Aus Abbildung 15 lässt sich die Dynamik der Adhäsionsmuster einer DsRed-transfizierten L929-Zelle ablesen.

Abbildung 15 : Zeitrafferstudie des Adhäsionsmusters eines mit DsRed-transfizierten L929-Fibroblasten mittels TIRF-Mikroskopie. Die Einzelbilder ergeben sich aus der Farbkodierung (s. Abbildung 13). Die Bildfolge zeigt die Dynamik der Zelle und ihres Adhäsionsmusters im Verlauf von 10 Stunden. Die Morphologie des Fibroblasten ändert sich von nichtpolarisiert (A, B), auf polarisiert (C) und die Zelle beginnt zu migrieren (D-F). Der gestrichelte Kreis markiert die Ursprungsposition der Zelle.

Während des Beobachtungszeitraums veränderte sich die Morphologie des L929-Fibroblasten und die Zelle begann zu migrieren. Dabei konnte gleichzeitig eine Veränderung des Adhäsionsmusters beobachtet werden. Die nichtpolarisierte Zelle ist rund und haftet punktförmig am Substrat (Abbildung 15 A). Der gestrichelte Kreis markiert die Ursprungsposition der sitzenden Zelle. Bereits hier kann man auf der rechten Seite der Zelle den Ansatz einer Front erkennen, der auf Grund der Farbkodierung rot erscheint. 2 Stunden später hatte sich die Zelle in die angezeigte Richtung gestreckt (B). Die Adhäsion im runden Zellkörper wurde dabei nicht verändert. Nach vier Stunden hatte sich die Zelle in ihrer Länge fast verdoppelt. Die Front ist stark adhärent und es sind keine auffallenden Strukturelemente zu sehen (Abbildung 15 C). Im Gegensatz dazu hatte sich die Adhäsion im hinteren Bereich der Zelle etwas verringert. Die jetzt noch vorhandenen Adhäsionspunkte sind Teil der Adhäsion der Ursprungszelle (A, C). Dieser Prozess setzte sich in den folgenden 4 Stunden weiter fort. Die Zelle entwickelte eine vollständige Migrationsfront und nahm die typische Dreiecksform an (D, E). Die Adhäsion im Zellausläufer wurde dabei weiter reduziert. Dabei blieben Adhäsionspunkte erhalten, die bereits in der sitzenden Zelle zu sehen waren (A, D). Die Zellfront ist breiter als normal und leicht nach innen gekrümmt (E). Diese Tatsache erklärt sich daraus, dass die Zelle nicht in eine eindeutige Vorzugsrichtung wanderte. In Abbildung 15 F hat sich eine zweite Front gebildet. Die Zelle änderte ihre Migrationsrichtung und wanderte nach oben.

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Im Adhäsionsmuster nichtmigrierender L929-Zellen gibt es dynamische und stabile Adhäsionen (Geggier und Fuhr 1999). Hier wurde ergänzend gezeigt, dass Adhäsionspunkte auch dann erhalten bleiben, wenn die Zelle ihre Morphologie ändert (Abbildung 15 A, E). Um diese Beobachtung zu verifizieren wurde die Farbkodierung modifiziert. Das in einem Bild dargestellte Zeitintervall wurde von 30 Minuten auf
6 bzw. 8 Stunden vergrößert. Die nach dieser Modifizierung weiß erscheinenden Adhäsionspunkte, sind sowohl in der nichtpolarisierten Zelle, als auch in der migrierenden Zellform zu finden.

Abbildung 16 : Darstellung der stabilen Adhäsionspunkte des in Abbildung 15 gezeigten L929-Fibroblasten mittels einer modifizierten Farbkodierung . Die Überlagerung wurde aus Bildern zu den Zeitpunkten t = -6 h, t = -3 h und t = 0 h (A, B) und t = -8 h, t = -4 h und t = 0 h (C) gemacht. Die weiß erscheinenden Adhäsionspunkte bleiben über den gesamten Beobachtungszeitraum erhalten.

In den ersten 6 Stunden der Beobachtung ist die Änderung der Morphologie zu erkennen. Dabei bleibt ein großer Teil der Adhäsionen aus der nichtpolarisierten Zelle erhalten. Man erkennt an Hand der weißen Färbung den Umriss und einen großen Teil des Adhäsionsmusters der nichtpolarisierten Zelle wieder (Abbildung 16 A). Die Zellfront erscheint komplett rot, da sie erst im letzten Bildpunkt dazugekommen ist. Die Änderung ist zwischen den Stunden 6 und 12 deutlich kleiner, da die Zelle während dieser Zeitspanne nur die Front verändert. Daher ist die Front nach rechts-unten gelb und die neue Front nach oben rot eingefärbt (B). Die Anzahl der stabilen Adhäsionspunkte (B, weiß) ist geringer geworden, da die Adhäsion in den Zellausläufern während der Migration reduziert wird. Betrachtet man die Zeitspanne von 8 Stunden erscheint die komplette Zellfront rot, da dieser Teil erst in den zweiten 4 Stunden entstanden ist (C). Adhäsionspunkte aus der Ursprungsmorphologie sind im Bereich des Zellausläufers zu finden (Abbildung 16 C, weiße Punkte). Ihre Anzahl ist deutlich reduziert.

5.3.4 Dynamik der Adhäsionsmuster von C2C12-und 3T3-Zellen

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Zum Vergleich mit dem Ergebnis bei den L929-Fibroblasten wurde die Dynamik des Adhäsionsmusters der beiden anderen migrierenden Zelllinien untersucht, um festzustellen, ob auch dort stabile Adhäsionsmuster zu beobachten sind. Auf Grund der Übereinstimmung der Ergebnisse werden die C2C12- und 3T3-Zellen im Folgenden zusammengefasst behandelt.

Abbildung 17 : Zeitrafferstudie des Adhäsionsmusters einer DsRed-transfizierten C2C12-Zelle mittels TIRF-Mikroskopie. A: Typisches Adhäsionsmuster einer C2C12-Muskelzelle. Der dynamische Bereich der Zelle wird vergrößert dargestellt (A, rotes Quadrat). Die Einzelbilder ergeben sich aus der Farbkodierung (s. Abbildung 13). Die Zelle bewegt sich in den ersten 3 Stunden vorwärts, (B-G) dreht dann um (H) und zieht den vorgeschobenen Teil wieder zurück (I-P). Auf Grund der Farbkodierung erscheint eine Protrusion rot und gelb und eine Retraktion der Zelle türkis und blau. Das Adhäsionsmuster bleibt bei diesen Prozessen stabil (weiße Färbung).

In Abbildung 17 A ist eine C2C12-Muskelzelle nach DsRed-Transfektion während der Beobachtung im evaneszenten Feld über einen Zeitraum von 7 Stunden gezeigt. Aus der Ausrichtung der Riefen, die normalerweise entlang der Zelllängsachse verlaufen, kann man schließen, dass die Zelle ihre Bewegungsrichtung geändert hat. Die ursprüngliche Bewegungsrichtung verlief von oben nach unten und nun wird die Wanderungsrichtung nach rechts verändert. Die Zelle selbst ist entsprechend geformt. Das Adhäsionsmuster ist aus Riefen zusammengesetzt, die die Zelle aber nicht komplett durchspannen. Der obere Teil der Zelle zeigt nur noch ein undeutliches Adhäsionsbild, während der untere Teil eine bevorzugte Ausrichtung nach rechts aufweist. Der dynamische Teil ist vergrößert dargestellt (A, rotes Quadrat).

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Während der ersten 3 Stunden bewegte sich die Zelle diagonal nach unten
(Abbildung 17 B-H). Während der Protrusion ist die Zellfront auf Grund der Farbkodierung rot eingefärbt (B-E). Die Protrusionsfront ist zuerst unstrukturiert (B, C), dann bilden sich die Adhäsionsriefen aus (E-G), wobei bestehende Riefen in den Protrusionsbereich hinein verlängert werden (D, E). Zusätzlich konnten kurze Riefen beobachtet werden, die unverändert an einer Stelle bestehen blieben, während sich die Zelle darüber hinweg bewegte (E-G). Nach 3 Stunden Beobachtung hatte die Zelle ihre maximale Ausdehnung erreicht (H).

In den folgenden 4 Stunden zog sie sich wieder zurück (Abbildung 17 I-P). Retraktionsvorgänge erscheinen in der Farbkodierung in den Farben türkis und blau. Entlang der Zellgrenze erstreckt sich daher ein Saum in türkis-blauen Farben. Während des Zurückziehens ist die Membran von Riefe zu Riefe leicht nach innen gekrümmt (L-N). Die Riefen an sich sind deutlich stabiler, da sie im Farbsaum noch in weiß zu erkennen sind (N). Dabei macht es den Eindruck, als würden die Riefen über die Zellgrenze hinaus ein Stückchen überstehen (M). Insgesamt sind weder bei der Protrusion noch bei der Retraktion die Adhäsionsmuster verändert worden, da sie die ganze Zeit über weiß erhalten bleiben. Änderungen sind nur an den Enden der einzelnen Riefen zu beobachten.

Im Vergleich zu den L929-Fibroblasten zeigen die C2C12-Muskelzellen deutlich weniger Variationen in ihrem Adhäsionsmuster. Ein ähnliches Verhalten wird auf Grund der Gleichheit der Adhäsionsmuster auch für die 3T3-Fibroblasten erwartet. In Abbildung 18 ist die Dynamik des Adhäsionsmusters einer 3T3-Zelle nach DsRed-Transfektion zu erkennen.

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Abbildung 18 : Zeitrafferstudie eines typischen Adhäsionsmusters einer DsRed-transfizierten 3T3-Zelle mittels TIRF-Mikroskopie. Die Einzelbilder ergeben sich aus der Farbkodierung (s. Abbildung 13) Die Zelle verkürzt sich entlang der Riefenrichtung (A-C) und wird deutlich breiter (A-E).

Das TIRF Bild zeigt stabile Riefen entlang der Zelllängsachse (Abbildung 18 A). Zwei verschiedene Bewegungen wurden während der Beobachtung überlagert. Die Zelle verkürzte sich entlang der Riefenrichtung (A-C) und wurde gleichzeitig breiter (C-E). Das Zurückziehen der Zelle ist wie bei den C2C12-Zellen von einem farbigen Saum begleitet. In diesem Fall erfolgte der Vorgang jedoch schneller, so dass der türkis-farbene Bereich sehr schmal ausfällt und der blaue Bereich sehr breit (C). Gleichzeitig erkennt man wieder die leicht nach innen gewölbte Membran. Die Riefenenden sind hier noch in weiß zu erkennen, während der Saum bereits türkis oder blau gefärbt ist (C-E).

Auf Grund der Farbkodierung entsprechen sich eine Verbreiterung der Zelle und eine Protrusion farblich. Wird die Zellseite komplett nach rechts verschoben, so erscheint dieser Teil rot (Abbildung 18 A, C). In dem neu entstandenen Bereich bilden sich wieder Adhäsionsriefen aus (E). Eine längere Beobachtung dieser Zelle war nicht möglich, da von unten links eine nichttransfizierte Zelle ins Bild gewandert ist und sich unter die beobachtete 3T3-Zelle geschoben hat. Die zweite Zelle verwischte daher die Signale und behinderte das Sichtfeld (B-E).

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Die Untersuchung der Dynamik der Adhäsionsmuster hat ergeben, dass die Riefen eine besonders stabile Struktur darstellen. In den ortsfesten CHO-Zellen weisen sie gar keine Schwankungen auf, in den mobilen Zellen (C2C12, 3T3) bleiben sie konstant erhalten. Modifikationen treten lediglich an den Enden der einzelnen Riefen auf. Ebenfalls beobachtet wurde, dass die Zelle sich über die Riefe hinwegbewegt (C2C12) oder dass eine Zellseitenwand komplett verschoben wurde (3T3). Das Punktmuster in den
L929-Fibroblasten unterliegt einer größeren Dynamik. Dort bleiben nur einzelne Adhäsionspunkte im Bereich des Zellausläufers erhalten.

5.4 Entstehung von Zellspuren

5.4.1  Beobachtung des Entstehungsprinzips und Morphologie von Zellspuren

Bei der Entstehung von Zellspuren spielt die Adhäsion des Zellendes eine besondere Rolle, so dass die Untersuchung auf diesen Bereich konzentriert wird. Da die L929-Zellen häufig Zellspuren hinterlassen (Fuhr et al. 1998), wird auf diesen Zelltyp fokussiert. Abbildung 19 stellt die dabei beobachteten Besonderheiten dar.

Abbildung 19 : Zeitrafferstudie des Adhäsionsmusters im Zellausläufer einer DsRed-transfizierten L929-Zelle mittels TIRF-Mikroskopie. A: L929-Fibroblast in der typischen Migrationsmorphologie. Der Zellausläufer (A, rotes Quadrat) ist vergrößert dargestellt. Die Einzelbilder ergeben sich aus der Farbkodierung (s. Abbildung 13). Die Zelle bewegt sich zunächst auf der Stelle (B, C), beginnt zu wandern (D, E) und verlässt den Bildausschnitt. Dabei bleibt ein Teil der Adhäsionspunkte zurück (J-P).

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Die beobachtete Zelle zeigte zwar eine typische Migrationsmorphologie, begann aber nicht gleich zu migrieren, sondern fluktuierte erst eine Zeit lang auf einer Stelle. Dabei schwankte der Zellausläufer in seiner Breite (Abbildung 19 B, rote Ränder). In den folgenden 9 Stunden wurde der Zellausläufer kontinuierlich schmaler und der Zellkörper verlagerte sich weiter in Richtung des Zellschwerpunktes und damit in diesem Falle aus dem Bildausschnitt hinaus (C-E). In der gesamten Bildfolge sind Streulichtanteile aus den höheren Bereichen des Zellkörpers zu erkennen, die als weißer Schleier im rechten Teil der Bildausschnitte zu erkennen sind. Auf Grund der Überlagerung der Signale erscheinen diese Bereiche in der Farbkodierung fälschlicherweise besonders prominent. Die Tatasache, dass die Signale vom Adhäsionsmuster im Zellausläufer deutlich zu erkennen sind und keine Defokussierung aufweisen, zeigt allerdings, dass die Bilder an sich der bisher gezeigten, hohen mikroskopischen Qualität entsprechen.

Im Gegensatz zu den vorher beobachteten Retraktionsvorgängen wurde in diesem Fall keine türkis-blaue Färbung beobachtet, was darauf hindeutet, dass diese Retraktion sehr schnell verlaufen ist. Der Zentralbereich des Zellausläufers blieb stabil adhärent (weiß), während die Ränder grün erscheinen. Eine grüne Einfärbung bedeutet, dass das Signal nur auf dem mittleren Bild einer Dreierserie zu finden ist. Somit ist der Zellausläufer innerhalb von 15 Minuten schmaler geworden (Abbildung 19 D, E). In diesem Zusammenhang wurde auch die Mischfarbe lila (blau und rot) erstmalig beobachtet (E). Diese Farbe bedeutet, dass das Signal auf dem ersten und dritten Bild einer Serie detektiert wurde. Die beobachtete Zelle muss also einen Teil ihres Zellkörpers zurück über den noch adhärenten Ausläufer (E) verlagert haben. Dementsprechend war 3 Stunden später wieder deutlich mehr vom Zellkörper zu erkennen (F). Im Weiteren wanderte die Zelle ein Stück nach rechts (F-J), bevor sie endgültig nach oben den Bildausschnitt verließ (K-P).

Die folgenden 3 Stunden sind mit kleinstmöglicher Zeitauflösung dargestellt, da in diesem Zeitintervall ein Teil der Adhäsionspunkte des Zellausläufers als Zellspur zurückblieb (Abbildung 19 F-O). Die Zelle zog sich wie beschrieben zurück, wodurch der Zellkörper in dem bereits bekannten Saum aus türkis und blau erscheint (G-J). Dabei blieben die Adhäsionspunkte im Zellausläufer bestehen (weiß, F-P). Allerdings wurden nicht die kompletten Adhäsionspunkte zurückgelassen, sondern ihre Anzahl wurde von der Zelle reduziert (I), kurz bevor sie die Stelle endgültig verließ (J). Die danach noch vorhandenen Adhäsionspunkte blieben auf dem Substrat zurück (K-P). Die Zelle löste ihre Adhäsionen offensichtlich weitgehend auf (F-J). An den Stellen, wo dies nicht vollständig erfolgte, hinterließ sie das Material auf der Oberfläche. In den letzten 2 Stunden des Beobachtungszeitraumes kann man erkennen, dass die zurückgelassenen Adhäsionspunkte stabil bleiben und sich nicht weiter verändern, obwohl noch eine Verbindung zur Zelle zu erkennen ist. Die Adhäsionspunkte sind mit dem Zellkörper der Zelle über dünne Schläuche verbunden (Abbildung 19 L-P).

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Der hier beobachtete Prozess kann als Ablage einer Zellspur betrachtet werden, auch wenn das Produkt nicht der in der Literatur beschriebenen Morphologie von Zellspuren entspricht (Fuhr et al. 1998). Es konnte beobachtet werden, dass die Zellspur aus den Adhäsionspunkten des Zellausläufers entsteht. Um diese Korrelation genau zu belegen, wurde wieder die Farbkodierung modifiziert. Abbildung 20 zeigt den Zellausläufer der L929-Zelle in der veränderten Farbkodierung. Es wurden dreimal 6 Stunden zu einem Bild zusammengefasst und einmal der gesamte Beobachtungszeitraum in einem RGB-Bild darstellt.

Abbildung 20 : Darstellung der Entstehung der Zellspur aus dem Adhäsionsmuster des L929-Fibroblasten mittels der modifizierten Farbkodierung. Bilder A bis C stellen jeweils 6 Stunden dar (Farbkodierung: t = -6 h, t = -3 h und t = 0 h). D zeigt ein Zeitfenster von 16 Stunden (Farbkodierung: t = -16 h, t = -8 h und t = 0 h). Die ehemaligen Adhäsionspunkte bilden die Endpunkte der Zellspur.

In den ersten 6 Stunden erkennt man, dass der Zellkörper den Bildausschnitt verlassen hatte und der Zellausläufer schmaler wurde. (Abbildung 20 A, türkis, blauer Bereich). Das Adhäsionsmuster blieb dabei unverändert (A, weiße Punkte). In den nächsten 6 Stunden verlagerte die Zelle ihren Zellkörper zurück (B, roter Bereich). Das Adhäsionsmuster des Zellausläufers blieb davon unberührt (B, weiße Punkte). Die letzten 6 Stunden zeigen die Veränderung der Zellspur. Der Zellkörper ist vollständig aus dem Bildausschnitt verschwunden (türkis-blauer Bereich). Die stabilen Adhäsionspunkte bilden die Endpunkte der Zellspur (C, weiße Punkte). Die linearen Elemente der Spur, die die ehemaligen Adhäsionspunkte mit der Zelle verbinden, erscheinen rot. Das bedeutet, dass diese Bereiche der Spur erst nach dem Zurückziehen des Zellkörpers entstanden sind (C). Ein kleiner Teil der Adhäsionspunkte ist türkis gefärbt. Offensichtlich unterliegt die Spur einem Alterungsprozess, so dass Bereiche abgebaut werden und verschwinden. In der Darstellung der gesamten 16 Stunden erkennt man, welche Bereiche der Ursprungs-adhäsion in der Zellspur wiederzufinden sind (D, weiße Bereiche). Diese Adhäsions-punkte sind gleichmäßig über den Zellausläufer verteilt.

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Damit wurde gezeigt, dass die Zellspurentstehung direkt mit den stabilen Adhäsionsbereichen der Zelle im Zusammenhang steht. Die hier beobachtete Zellspur ist morphologisch nicht identisch mit den in der Literatur beschriebenen Spuren von
L929-Fibroblasten (Fuhr et al. 1998). Die dort beschriebenen Zellspuren sind länger und über den gesamten Bereich verzweigt. Die bisher für 3T3-Zellen beschriebenen Spuren beziehen sich nur auf das „near field“, also den direkten Anschluss der Spur an die Zelle. Für C2C12- und 3T3-Zellen ist allerdings auf Grund der Tatsache, dass sie ein anderes Adhäsionsmuster besitzen, eine andere Spurmorphologie zu erwarten als die bei
L929-Zellen zu beobachtende.

Da es sich bei den CHO-Epithelzellen um eine nichtmigrierende Zelle handelt, wurden diese Zellen im Folgenden aus der Untersuchung ausgenommen. Zur Charakterisierung der Grundmorphologie der Zellspuren bei den verbleibenden drei Zelllinien wurden Zellspuren in der Calceinfärbung mittels TIRF-Mikroskopie aufgenommen. Die Tatsache, dass Zellspuren mit Calcein gefärbt werden können, deutet auf eine intakte Zellmembran der Spuren hin. Bei einer Verletzung der Membran könnte der Farbstoff nicht in der Spur verbleiben (s. 4.2.3.1). Abbildung 21 zeigt die Morphologie der Zellspuren und die Übergänge aus den Adhäsionsmustern in die Spuren bei L929-, C2C12- und 3T3-Zellen.

Abbildung 21 : Übergang Zelle-Spur (A, C, E) und abgelegte Zellspur (B, D, F) der verschiedenen Zelllinien aufgenommen mittels Calcein TIRF-Mikroskopie. A, B: L929-Fibroblasten hinterlassen reich verzweigte Zellspuren mit Knotenpunkten. Das „near field“ ist punktförmig (Abbildung 15, D). C, D: C2C12-Muskelzellen hinterlassen parallele, kaum verzweigte Spuren, die in dem riefenförmigen Adhäsionsmuster der Zelle ihren Ausgangspunkt haben (C). E, F: Spuren von 3T3-Fibroblasten ähneln denen der C2C12-Zellen (C-F).

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Ein L929-Fibroblast wurde während der Zellspurablage aufgenommen (Abbildung 21 A). Das Adhäsionsmuster der Zelle selbst ist nicht zu erkennen, da die Aussteuerung bei der Bildaufnahme auf die Spur eingestellt wurde. Im „near field“ der Spur sind ausschließlich punktförmige Adhäsionen zu erkennen (A). Die eigentliche Spur unterteilt sich in den reich verzweigten Anfangsbereich („far field“) und einen kurzen, weniger verzweigten Übergangsbereich, das „transitional field“. Viele der Verzweigungs- bzw. Endpunkte weisen Verdickungen auf und sind deutlich größer und heller als der Rest der Spur. In Abbildung 21 B ist eine ausgeprägtere Spur mit gleicher Morphologie vergrößert dargestellt. Die zweite Spur ist insgesamt größer. Das „transitional field“ ist etwas verzweigter als bei der ersten Spur (A), in beiden Fällen aber recht kurz.

Die Zellspuren der beiden anderen Zelllinien unterscheiden sich deutlich von Zellspuren der L929-Zellen (Abbildung 21 C-F). Die Zellspur von C2C12-Muskelzellen ist nicht so reich verzweigt und besteht aus parallelen Schläuchen (D). In diesem Fall sind drei Ansätze zu erkennen, die jeweils ein- bis zweimal verzweigt sind. Weder an den Verzweigungs- noch an den Endpunkten sind Verdickungen zu beobachten. Das „near field“ am Übergang zur Zelle (C) zeigt eine Möglichkeit auf, wie diese Unterschiede zu Stande kommen. Die C2C12-Zelle besitzt ihr typisches riefenförmiges Adhäsionsmuster (C). Die Zellmembran ist von Riefe zu Riefe leicht nach innen gekrümmt, wie das bereits bei der Retraktion von C2C12-Zellen beobachtet wurde (s. Abbildung 17). Als Verlängerung jeder Riefe ist der Ansatz einer Zellspur zu erkennen. Zwar endet normalerweise jede Riefe in einer Spur, jedoch sind bei der mittleren Riefe zwei Spuransätze zu erkennen (Abbildung 21 C). Die Spuransätze sind noch sehr kurz und nicht als vollständige Spur anzusehen. 3T3-Fibroblasten hinterlassen ähnliche Zellspuren wie C2C12-Muskelzellen. Die Spur ist nahezu unverzweigt und beginnt in mehreren parallelen Ursprungsorten (F). Der direkte Übergangsbereich zeigt kurze Spuransätze, die in den Adhäsionsriefen beginnen (E).

5.4.2 Korrelation der Adhäsionsmuster mit der Morphologie der Zellspur

Die bisherigen Untersuchungen der Unterschiede im Adhäsionsmuster der Zelllinien vermitteln den Eindruck, dass die zellspezifischen Adhäsionsmuster Einfluss auf die Zellspurmorphologie haben. Um diese Annahme zu untersuchen wurde der Prozess der Zellspurentstehung bei den drei wandernden Zelllinien direkt mittels Zeitraffer-TIRF-Mikroskopie verfolgt. Es konnte ein direkter Zusammenhang zwischen den zellspezifischen Adhäsionsmustern und der Zellspurmorphologie hergestellt werden. Abbildung 22 stellt die Dynamik des Adhäsionsmusters einer L929-Zelle während der Entstehung einer Zellspur dar.

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Abbildung 22 : Zeitrafferstudie der Zellspurentstehung aus dem Adhäsionsmuster einer DsRed-transfizierten L929-Zelle mittels TIRF-Mikroskopie. Die Einzelbilder ergeben sich aus der Farbkodierung (s. Abbildung 13). Die Zelle adhäriert 4 Stunden an einer Stelle und fluktuiert (A-E). Dann beginnt sie zu migrieren und wandert nach oben aus dem Bildfeld (F-L). Währenddessen wird eine Zellspur zurückgelassen. Die Morphologie des „far field“ ist mit dem Adhäsionsmuster identisch (A und L). Ein charakteristischer Bereich wurde vergrößert dargestellt (A, roter Rahmen).

Im Bildfeld sind zwei Zellen zu erkennen. Die linke Zelle ist abgerundet und bewegt sich nicht. Lediglich am Ende des Beobachtungszeitraums sind kleine Fluktuationen zu erkennen (Abbildung 22 J-L). Daher wird diese Zelle nicht weiter betrachtet. Der weitaus interessantere L929-Fibroblast hat eine dreieckige Form. Die Adhäsion ist in der Mitte der Zelle punktförmig, an den Ecken flächig. Die Zelle adhärierte in den ersten 3 Stunden der Beobachtung auf einer Stelle und bildete in den drei Ecken abwechselnd flächige Adhäsionsbereiche aus (A-D). Danach wanderte sie nach oben aus dem Bildfeld und hinterließ eine Zellspur. Im zentralen Bereich der Zelle sind über die gesamte Fläche stabile Adhäsionspunkte zu erkennen (A, weiße Punkte).

Um das zentrale Adhäsionsmuster besser analysieren zu können wurde ein charakteristischer Bereich vergrößert dargestellt (Abbildung 22 A, rotes Quadrat). Dort befinden sich vier Adhäsionspunkte in einer Reihe übereinander (A, Pfeil). Diese Punkte sind das zentrale Element einer Anordnung von mehreren Adhäsionspunkten (2 hinter dem Pfeil, 4 vor dem Pfeil und 2 unterhalb der ersten 2 Punkte aus der Vierergruppe), die über den gesamten Beobachtungszeitraum erhalten bleiben.

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Zuerst wurde die Adhäsion von der Zelle in der rechten Ecke verstärkt (rot), während in der linken Ecke nur die Adhäsionspunkte zu erkennen sind (Abbildung 22 A). Der Zellkörper liegt außerhalb des TIRF-Anregungsfelds. Daran schließt sich ein Bereich an, der gelb gefärbt ist, also in den letzten beiden Bildern fluoresziert hat. Die obere Zellecke erscheint türkis-blau auf Grund von verminderter Adhäsion. Ein ähnliches Adhäsionsbild zeigt sich in den nächsten 3 Stunden (B-D). Die rechte untere Ecke der Zelle ist ein Bereich, der sehr stark adhärent ist. Zu den ersten drei gewählten Zeitpunkten ist er konstant weiß gefärbt (A-C). Nach 3 Stunden begann die Zelle nach oben aus dem Bildausschnitt zu wandern. Die beiden unteren Ecken erscheinen daher grün und blau (D). Dieser Prozess setzte sich über die nächsten 2 Stunden fort, bis die Zelle das Bildfeld komplett verlassen hatte. In der Farbkodierung spiegelt sich dieser Vorgang in türkis-blauen Tönen wieder (E-H).

Die charakteristischen Adhäsionspunkte (rotes Quadrat) blieben während der ersten 3 Stunden vollkommen unverändert (Abbildung 22 A-D, weiße Punkte). Die im Bildausschnitt zu erkennende Farbe rührt daher, dass die Hintergrundfluoreszenz des Zellkörpers über den Adhäsionspunkten nicht stabil ist und daher verschieden farbig eingefärbt wird. Nach 4 Stunden Beobachtung zog sich der Zellkörper immer weiter zurück und der farbige Hintergrund verschwindet (F-L). Die Zelle bewegte sich in den ersten Stunden um die stabilen Adhäsionspunkte herum. Dabei wurden neue Adhäsionspunkte gebildet (A, C; rote Punkte) und alte teilweise abgebaut (A-C; blaue Punkte). Nachdem die Zelle ihre ursprüngliche Position verlassen hatte, blieb ein Punktmuster aus Adhäsionen zurück, die dem originalen Umriss der Zelle entsprechen (H-L). Im Laufe der beobachteten folgenden 2 Stunden verschwanden noch einige Adhäsionspunkte, der größte Teil blieb aber erhalten (rotes Quadrat). Allerdings erscheinen die Adhäsionspunkte farbig (I-K). Das bedeutet, dass die detektierten Signale sich zeitlich änderten, obwohl die Zelle diese Stelle bereits verlassen hatte. Die erwartete weiße Färbung ist erst wieder im letzten Bild des Beobachtungszeitraums zu sehen (L, rotes Quadrat).

Zellspuren, bestehend aus Linienelementen und Verzweigungen, sind erst in der letzten halben Stunde des Beobachtungszeitraumes (Stunde 7 bis Stunde 7,5) zu erkennen. Nach 7 Stunden treten die ersten Schläuche auf, die die Adhäsionspunkte miteinander verbinden (Abbildung 22 K). Innerhalb der nächsten halben Stunde werden diese Signale stärker, so dass am Ende aus den Adhäsionspunkten das verzweigte „far field“ einer Zellspur entstanden ist (L). Dieser Prozess erfolgt mit einer hohen zeitlichen Korrelation. Über den gesamten ehemaligen Adhäsionsbereich der Zelle werden die Linienelemente der Zellspur zum gleichen Zeitpunkt detektiert.

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Die hier entstandene Zellspur entspricht von der Morphologie her den statisch aufgenommenen Zellspuren von L929-Zellen (s. Abbildung 21). Die stabilen Adhäsionspunkte geben den Ausschlag für die Morphologie der Zellspur. Wenn die Zelle einen Ort verlässt, an dem sie stark gehaftet hat, also viele Adhäsionen aufgebaut hatte, lässt sie einen Teil ihrer Adhäsionspunkte zurück, die dann von dünnen Membranschläuchen verbunden eine Zellspur ergeben. Im oberen Bereich der Zelle gibt es einen Bereich, an dem kaum Adhäsionspunkte zu sehen sind (Abbildung 22 B, weißer Pfeil). In diesem Bereich werden anschließend keine Adhäsionspunkte zurückgelassen. Die Zellspur besteht dort nur aus zwei Schläuchen, die den Bereich überspannen (L).

Die beobachtete Intensitätszunahme bei den Linienelementen der Zellspur ist ein unerwarteter interessanter Effekt, der daher näher untersucht wurde. Dazu wurde der optische Eindruck mittels ImageJ quantifiziert. In einem Bereich von 3 x 3 Pixeln bei Adhäsionspunkten und 2 x 5 Pixeln bei Linienelementen wurden die Fluoreszenz-intensitäten vermessen und anschließend gemittelt. Um nur die Änderung der Fluoreszenzintensität zu betrachten, wurden die so erhaltenen Absolutwerte auf den Faktor 1 normiert. Es ist zu klären ob die Intensitätszunahme bei den Linienelementen ein Artefakt beispielsweise verursacht durch Schwankungen in der Beleuchtungsintensität darstellt. Daher wird die Intensitätsänderung bei den Adhäsionspunkten als Kontrolle untersucht. Die folgenden Diagramme zeigen an Beispielen, wie sich die Fluoreszenzintensität in der Zellspur ändert. Es wurden immer Adhäsionspunkte mit in der Nähe liegenden bzw. direkt anschließenden Linienelementen der Zellspur verglichen. In Abbildung 23 sind an Hand von Beispielen aus den verschiedenen Bereichen der Zellspur die Ergebnisse dieser Untersuchung gezeigt.

Abbildung 23 : Vergleich der normierten Intensitätsänderung in Adhäsionspunkten und anschließenden bzw. benachbarten Linienelementen der in Abbildung 22 von einem L929-Fibroblasten hinterlassenen Zellspur. In Abbildung 23 A ist die Zuordnung der Graphen zu den einzelnen Adhäsionspunkten und Linienelementen aus den verschiedenen Bereichen der Zellspur gezeigt.

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In Abbildung 23 erkennt man, dass nicht nur die Linienelemente der Zellspur einer Intensitätsänderung unterliegen, sondern auch die Adhäsionspunkte. Allerdings ist die Änderung der Intensität bei den Linienelementen um den Faktor zwei oder mehr größer, als bei benachbarten Adhäsionspunkten. Teilweise ist sogar eine leichte Verringerung der Intensität bei den Adhäsionspunkten zu beobachten (Abbildung 23 C, Punkt 2). Zudem ist festzustellen, dass die Intensitätsänderung an verschiedenen Orten in der Zelle unterschiedlich stark ist. Daher ist ein Artefakt durch Zunahme der Beleuchtungsintensität als Erklärung für diese Beobachtung auszuschließen. In diesem Fall müsste an verschiedenen Bereichen der Zelle und bei Adhäsionspunkten und Linienelementen der Zellspur die gleiche Intensitätsänderung gemessen werden. Demgegenüber kann die Intensitätszunahme auf die Anregung mit dem evaneszenten Feld zurückgeführt werden. Auf Grund des exponentiellen Abfalls der Feldintensität mit steigendem Abstand von der Substratoberfläche kann die Intensitätszunahme durch ein Absinken der Struktur im evaneszenten Feld verursacht werden. Bei der Zellspur des L929-Fibroblasten ist zu beachten, dass die Intensität der Linienelemente stärker zunimmt, als die der Adhäsionspunkte. Auf Grund des TIRF-Feldes kann man daraus schließen, dass beide Strukuren sich der Substratoberfläche nähern, die Linienelemente der Zellspur aber stärker absinken als die Adhäsionspunkte. Interessant ist, dass dieser Prozess in allen Bereichen der Zellspur zum gleichen Zeitpunkt stattfindet.

Die Morphologie der Zellspuren von L929-Zellen konnte direkt mit dem punktförmigen Adhäsionsmuster korreliert werden. Handelt es sich bei dieser Beobachtung um ein generelles Prinzip, müsste auch die Morphologie von Zellspuren der Zelllinien 3T3 und C2C12 mit dem riefenförmigen Adhäsionsmuster der Zellen im Zusammenhang stehen. In Abbildung 21 wurde bereits gezeigt, dass ein morphologischer Unterschied zwischen den Spuren von L929-Fibroblasten und den Spuren der Zellen mit riefenförmigem Adhäsionsmuster besteht. Die Zellspuren von 3T3- und C2C12-Zellen sind unverzweigt und bestehen aus parallelen Schläuchen. Daraus ergibt sich die Frage, wie die Zellspurbildung bei den Zellen mit Adhäsionsriefen erfolgt. In Abbildung 24 ist ein
3T3-Fibroblast bei der Zellspurbildung dargestellt.

Abbildung 24 : Zeitrafferstudie der Zellspurentstehung aus dem Adhäsionsmuster einer DsRed-transfizierten 3T3-Zelle mittels TIRF-Mikroskopie. Die Einzelbilder B-D ergeben sich aus einer modifizierten Farbkodierung (Bildabstand 3 Minuten). Damit zeigt ein Bild 6 Minuten Zeitintervall. Das Riefenmuster der Adhäsion ist der Ausgangspunkt für die Zellspuren, die als parallele Schläuche zurückgelassen werden, während die Zelle sich zurückzieht (B). Eine untransfizierte Zelle stört die Beobachtung (C, D).

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Der 3T3-Fibroblast zeigt ein typisches Adhäsionsmuster mit Riefen (Abbildung 24 A). Zur besseren Visualisierung wurde nur der dynamische Bereich der Zelle dargestellt. Die Membran ist von Riefe zu Riefe nach innen gekrümmt (A), wie das bereits mehrfach bei der Retraktion von Zellen beobachtet wurde (s. Abbildung 17 und Abbildung 21). In der Farbdarstellung erkennt man den zurückgezogenen Teil der Zelle in blau, während die Zellspur in weiß zurückbleibt (Abbildung 24 B). Da die Zelle nicht nur nach rechts, sondern auch gleichzeitig nach unten aus dem Bildfeld heraus wanderte, überlagerten sich zwei Bewegungen (C, D). Die Zelle verschwand sprunghaft nach unten, so dass die waagerecht gebildeten Spuransätze aus den Riefen nur sehr kurz blieben (C, D). Zusätzlich störte eine nicht transfizierte Zelle die Beobachtung und verdeckte Signale, so dass man in allen Bildern nur den Randbereich der Zelle erkennen kann, in dem Zellspuransätze als Verlängerung der Reifen zu sehen sind (C). Nach 1,5 Stunden hatte die Zelle das Bildfeld fast vollständig verlassen. Die entstandenen Spuren sind zum Teil von der nicht transfizierten Zelle überdeckt (D). Auf Grund der Kürze der Spur handelt es sich hier noch nicht um die Ablage einer vollständigen Spur, sondern eher um die Entstehung der Spur im „near field“.

Wie eben in Ansätzen beim 3T3-Fibroblasten gezeigt wurde, entstehen die Zellspuren als Verlängerung aus den Adhäsionsriefen. Abbildung 25 stellt nun den vollständigen Prozess der Zellspurentstehung bei C2C12-Muskelzellen dar.

Abbildung 25 : Zeitrafferstudie der Zellspurentstehung aus dem Adhäsionsmuster einer DsRed-transfizierten C2C12-Zelle mittels TIRF-Mikroskopie. A zeigt die Zelle im Überblick. Der Retraktionsbereich der Zelle (A, rotes Quadrat) wird vergrößert dargestellt. Die Einzelbilder ergeben sich aus der Farbkodierung (s. Abbildung 13 ). Die Zelle besitzt ein riefenförmiges Adhäsionsmuster (A). Aus den Enden der Riefen entstehen die Zellspuren (B-F).

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Die beobachtete C2C12-Zelle zeigt ein typisches, riefenförmiges Adhäsionsmuster, das parallel zur Wanderungsrichtung verläuft. In diesem Falle entsprach die Wanderungsrichtung nicht der Längsachse der Zelle, sondern die Zelle migrierte über ihre Querachse (Abbildung 25 A). Zum Ende des Beobachtungszeitraumes hin änderte die Zelle ihre Bewegungsrichtung und migrierte in Richtung des unteren Bildrandes. Am hinteren Ende des Zellkörpers ist, vergrößert dargestellt, bereits als Verlängerung der Adhäsionsriefen das „near field“ einer Zellspur zu erkennen (B). Die Zelle zeigt die typische Farbgebung einer Retraktion, wobei die Zellmembran von Riefe zu Riefe nach innen gekrümmt ist. Der Zellsaum erscheint türkis-blau (B-D) und viele parallele Ansätze von Zellspuren werden beim Zurückziehen der Zelle zurückgelassen. Aus der obersten Riefe bilden sich hier ausnahmsweise zwei Zellschläuche, obwohl üblicherweise immer nur ein Zellschlauch gebildet wird. Die unterste Zellspur ist im Gegensatz zu sonst nicht gleich weiß gefärbt, sondern erscheint erst rot (B), dann türkis (C) und zum Schluss weiß (D). Dieser Farbverlauf wird beobachtet wenn sich die Lage der Riefe verändert hat, während die Zelle den Zellkörper zurückzog. Dabei wurde die Spur lateral leicht verschoben. In den folgenden 2 Stunden zog sich die Zelle weiter zurück, wodurch die Spuren weiter verlängert wurden (E-H).

Die Beobachtung dieses Prozesses wurde dadurch erschwert, dass von unten eine zweite Zelle ins Bild gewandert war (B-H). Die zweite Zelle wanderte ebenfalls parallel zur Lage ihrer Adhäsionsriefen (F-H). Zusätzlich verbreiterte sie sich über die Querseite leicht, so dass die begrenzenden Fasern erst rot und anschließend gelb erscheinen (G, H). Die zweite Zelle wanderte über den unteren Teil der von der ersten Zelle hinterlassenen Zellspur, der somit am Ende des Beobachtungszeitraums nicht mehr sichtbar ist (F-H). Eine Ausnahme bildet der unterste Zellschlauch, der länger als die zweite Zelle ist und daher rechts von der Zelle wieder zu sehen ist (E-H). Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass die Zellspur nicht zerstört wurde, während die zweite Zelle darüber hinweg wanderte. Die oberste Riefe hinterlässt eine gut sichtbare Spur von fast 50 μm Länge. Dieser Spurteil ist sehr stabil und auch nach 3 Stunden noch deutlich zu erkennen.

C2C12-Zellen bilden Zellspuren, indem der Zellkörper zurückgezogen wird und die Riefe bzw. das darin lokalisierte Aktin auf dem Substrat zurückbleiben. Das führt zu den bogenförmigen Zellrändern und ist darauf zurückzuführen, dass am Ende der Adhäsionsriefen Adhäsionsstrukturen mit dem Substrat verbunden bleiben. Die Riefen bleiben dadurch in ihrer Position zum Substrat unverändert und werden von der Zelle während der Retraktion nicht mitgenommen oder abgebaut. Die Adhhäsionsriefen gehen dabei direkt in die Zellspur über, im Gegensatz zur Zellspur von L929-Fibroblasten, bei denen die Linienelemente erst nachträglich zu sehen waren.

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In allen drei Zelltypen konnte gezeigt werden, dass das Adhäsionsmuster die Morphologie der Zellspur bestimmt und an ihrer Entstehung elementar beteiligt ist. Während des aufgenommenen Beobachtungszeitraums blieben alle Zellspuren als kontinuierliche Spuren erhalten und unterlagen keinen typischen Degradierungsprozessen, wie z. B. dem durch Entnetzung verursachten Auftreten von kugelförmigen Strukturelementen.

5.4.3 Aktindynamik während der Entstehung von Zellspuren

Abbildung 11 belegt, dass das Adhäsionsmuster einen Abdruck des Aktinzytoskeletts darstellt. Dieses Ergebnis wird untermauert durch frühere Untersuchungen in denen gezeigt wurde, dass Zellspuren in ihren kontinuierlichen Bereichen Aktin enthalten (Fuhr et al. 1998). Diesem Ansatz folgend wurde die Aktindynamik während der Zellspurbildung beobachtet. Die Transfektion mit Aktin-GFP-DNA war in allen drei Zelltypen möglich. Jedoch konnte nur bei C2C12-Muskelzellen die Entwicklung des Aktinzytoskeletts während der Zellspurbildung mittels TIRF-Mikroskopie beobachtet werden, da L929- und 3T3-Fibroblasten nach der Transfektion nicht mehr migrierten. Dieser Prozess ist in Abbildung 26 dargestellt.

Abbildung 26 : Zeitrafferstudie der Zellspurentstehung einer Aktin-GFP-transfizierten C2C12-Zelle mittels TIRF-Mikroskopie. A zeigt die Zelle im Überblick. Der Retraktionsbereich der Zelle (A, rotes Quadrat) wird vergrößert dargestellt. Die Einzelbilder ergeben sich aus der Farbkodierung (s. Abbildung 13). Die Aktinfasern verlaufen parallel entlang der Migrationsrichtung der Zelle (A). Während der Retraktion des Zellendes entsteht eine Zellspur (B-F).

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Das Aktinskelett der C2C12-Zelle besteht aus langen, parallelen Fasern, die sich entlang der Zelllängsachse durch die ganze Zelle erstrecken (Abbildung 26 A). Die Zelle wanderte durch das Beobachtungsfeld und hinterließ dabei eine Zellspur aus Aktin (F). Der vergrößerte Bereich (A, rotes Quadrat) zeigt den Retraktionsbereich der Zelle, in dem die Zellspur entstanden ist (B-F). Die Position der einzelnen Aktinfasern bleibt dabei stabil
(B-D, weiße Fasern.) Werden die Fasern zurückgezogen oder verkürzt, erscheinen sie türkis und blau (B-F). Allerdings sind bei einigen Fasern auch rote, d. h. neue Bereiche zu erkennen (E, F). Das erklärt sich daraus, dass die Zelle nicht diagonal durch das Bild migrierte, sondern sich leicht nach links orientiert hat. Diese Drehung führte zu einer leichten Verlagerung der Aktinfasern, die dadurch rot erscheinen. Aktin wird während der Retraktion des Zellkörpers nicht vollständig abgebaut, sondern ein Teil bleibt als Zellspur zurück (F). Dabei entsteht eine Spur, die aus langen, unverzweigten und parallelen Fasern besteht. Die abgelegte Zellspur ist sehr stabil und verändert sich nach der Ablage innerhalb von 24 Stunden nicht mehr (Aufnahmen nicht gezeigt). Die Morphologie der Aktinzellspur entspricht der genauen Lage des Aktinskeletts in der Zelle, bevor sie mit der Migration begonnen hat (B, F).

5.4.4 Beeinflussung der Morphologie von Zellspuren mittels einer modifizierten Oberfläche

Bei der Beobachtung der Mechanismen, die zur Bildung einer Zellspur führen, wurde die Morphologie eindeutig mit der Form des Adhäsionsmusters in Verbindung gebracht. Das legt die Vermutung nahe, dass eine Veränderung des Adhäsionsmusters auch die Morphologie der Zellspuren beeinflusst. Im Rahmen der technischen Nutzung von Zellspuren wäre es beispielsweise wünschenswert für alle Zelltypen lange parallele Zellspuren zu erzeugen, so dass je ein Membranschlauch für verschiedene Parallel-Analysen verwendet werden könnte. Eine Modifikation der Substratoberfläche bietet sich zur Änderung des Adhäsionsverhaltens der Zellen an. Es wurde bereits gezeigt, dass eine Beschichtung mit dem ECM Protein Fibronektin (FN) die Morphologie einer Zellspur von L929-Fibroblasten ändern kann (Fuhr et al. 1998). Hier konnte gezeigt werden, dass der Einfluss der Beschichtung zu einem riefenförmigen Adhäsionsmuster bei L929-Fibroblasten führt.

Bevor näher auf die Ergebnisse eingegangen wird, werden kurz die leicht veränderten Versuchsbedingungen beschrieben. Aus anderen Experimenten war bekannt (hier nicht gezeigt), dass das Ausbreiten der Zellen auf FN sehr schnell geschieht und die Zellen nach 2 Stunden zu migrieren beginnen. Da Kontrollexperimente ergaben, dass sich die Adhäsionsmuster nach 2 Stunden, 6 Stunden und 24 Stunden nicht unterscheiden, konnten die Adhäsionsmuster auf FN-beschichteten Oberflächen bereits nach 2 Stunden untersucht werden. In Abbildung 27 sind die beobachteten Änderungen im Adhäsions-muster der Zellen und bei der Morphologie der Zellspuren dargestellt. Als Detektions-marker wurde aus Gründen der einfacheren Handhabung auf Calcein zurückgegriffen.

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Die Beschichtung der Substratoberfläche mit FN führte in allen Fällen dazu, dass die Zellen schneller hafteten. Bei C2C12-Zellen änderte sich aber am Grundmotiv der Adhäsionsmuster nichts. Die Zellen bildeten auf Glas wie auf FN parallele Riefen über die gesamte basale Zellmembran aus. Die Zellspuren bestanden in beiden Fällen aus langen parallelen Schläuchen und waren nicht verzweigt (Abbildung 27 B, D). Ein ähnliches Bild zeigte sich auch bei den 3T3-Fibroblasten. Es wurden keine Unterschiede zwischen der Adhäsion auf Glas und auf FN beobachtet. Die Zellen bildeten in beiden Fällen ein riefenförmiges Adhäsionsmuster aus (E, G). Somit ist auch keine Veränderung bei der Morphologie der Spuren zu erkennen. Auf Glas wie auf FN bildeten sich lange, parallele und unverzweigte Spuren (H).

Im Gegensatz dazu hatte die Beschichtung bei L929-Zellen einen großen Einfluss. Insgesamt stieg die Anzahl der hinterlassenen Spuren bei L929-Fibroblasten stark an. Auf dem Glassubstrat erkennt man einen L929-Fibroblasten in der typischen Migrationsform (Abbildung 27 I). Die breite Zellfront ist stark adhärent und der Zellausläufer adhäriert punktförmig. Von der Zellmitte aus führen kurze Riefen sternförmig nach vorne in die Front (Abbildung 27 I). Diese Struktur entspricht der im Aktinskelett gefundenen stern-förmigen Anordnung (s. Abbildung 12 D). Die korrespondierende Zellspur beginnt in einem Punkt und ist reich verzweigt. An den Endpunkten erkennt man Verdickungen, die heller fluoreszieren (Abbildung 27 J).

Abbildung 27 : Einfluss der FN-Beschichtung auf die Adhäsionsmuster und die Spurmorphologie der Zellen nach Calceinfärbung detektiert mit TIRF-Mikroskopie. C2C12- und 3T3-Zellen zeigen auf Glas und FN das gleiche Adhäsionsmuster (C2C12: A, C; 3T3: E, G). Die Zellspurmorphologie ist unverändert (C2C12: B, D; 3T3: F, H). L929-Zellen zeigen im Gegensatz zur punktförmigen Adhäsion auf Glas (I) ein riefenförmigen Adhäsionsmuster auf FN (K). Die L929-Spur auf Glas ist reich verzweigt (J), die Zellspur auf FN besteht aus langen parallelen Schläuchen und ist weniger verzweigt (L).

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Bei der Adhäsion auf FN stellt sich ein anderes Bild dar. Die typische Migrationsmorphologie ist verschwunden und die Zelle ähnelt von der Form her einer C2C12- oder 3T3-Zelle. Eine eindeutige Front ist nicht mehr zu erkennen, die Zelle hat eine rechteckige Form angenommen (Abbildung 27 K). Zusätzlich ist auch das Adhäsionsmuster verändert. L929-Fibroblasten bilden auf FN ein riefenförmiges Adhäsionsmuster aus (K). Die Riefen fluoreszieren nicht sehr hell, sondern sind sehr fein und nur schwach abgehoben gegen den Hintergrund. Das deutet daraufhin, dass die Zelle dicht am Substrat haftet. Es konnten sogar Zellen beobachtet werden, die kaum noch eine Adhäsionsstruktur aufwiesen. Die Zellspuren von L929-Zellen auf FN beginnen in den Adhäsionsriefen und sind parallel und relativ unverzweigt (L). Die Änderung der Adhäsionsmuster bei L929-Fibroblasten durch die Adhäsion auf FN, änderte ebenfalls die Morphologie der Zellspuren.

Da der Einfluss des Aktinzytoskeletts auf die Adhäsionsmuster bereits gezeigt wurde (s. Abbildung 12), wurde ergänzend die Lage des Aktinzytoskeletts auf der
FN-beschichteten Oberfläche mittels TIRF-Mikroskopie untersucht.

Abbildung 28 : Einfluss der FN-Beschichtung auf die Anordnung des Aktinzytoskeletts in L929-Zellen. Das Aktinskelett wurde mit Phalloidin-Alexa 546 gefärbt und mittels TIRF-Mikroskopie analysiert. A: L929-Zelle auf Glas in Migrationsmorphologie. Aktinfasern aus der sternförmigen Anordnung in der Zellmitte führen in die Front. Der Zellausläufer erscheint punktförmig. Bei der Adhäsion auf FN ist das Aktinskelett in langen parallelen Fasern angeordnet (B). Die Form der Zelle ist quadratisch. Ansätze einer Zellspur sind als Verlängerung der Aktinfasern zu erkennen (B).

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Das Aktinbild bei der Adhäsion auf Glas zeigt bis auf den zentralen Bereich nur Punkte. Im Zellschwerpunkt befindet sich eine sternförmige Anordnung von Aktinfasern, die in die Zellfront führt (Abbildung 28 A). Dieses Bild entspricht der Anordnung des Aktinzytoskeletts bei L929-Zellen während der Migration mit der typischen Migrationsmorphologie. Bei Adhäsion auf einer FN beschichteten Oberfläche ist das Aktinzytoskelett deutlich verändert. Die Zelle ist morphologisch nicht mehr dreieckig, sondern quadratisch, das Aktin durchspannt in langen parallelen Fasern die Zelle. Am hinteren Ende der Zelle befinden sich deutliche Ansätze von Zellspuren, die die Verlängerung des zellulären Aktins bilden (Abbildung 28 B, unten). Hier handelt es sich um fünf parallele Aktinfasern, die nicht weiter verzweigt sind. Die aus diesem Ansatz entstehende Zellspur wäre unverzweigt und würde aus parallelen Schläuchen bestehen.

5.5 Beeinflussung von Zelladhäsion und Zellmigration mittels strukturierter Oberflächen

Im Zusammenhang mit der Morphologie der Zellspuren wurde bereits die Glasoberfläche biochemisch durch die Beschichtung mit dem Protein FN aus der ECM verändert. Dadurch konnte Einfluss auf die Adhäsionsmuster und die Morphologie der Zellspuren genommen werden. Im Folgenden wird gezeigt, wie die Zellen auf eine Veränderung der Topographie der Oberfläche reagieren. In ersten Experimenten wurden verschiedene Strukturformen getestet. Die Größe der einzelnen Strukturelemente ist dem Größenbereich einzelner Adhäsionen angepasst. Bei den gezeigten Strukturen handelt es sich um Goldstrukturen (Ausnahme: Abbildung 30 A: Winkel aus Titan) auf der Standardglasoberfläche. Die Oberflächen wurden nicht weiter verändert. In Abbildung 29 ist gezeigt, welchen Einfluss die strukturierten Oberflächen auf die Zellen nach 48 Stunden Adhäsion ausübten.

Abbildung 29:Verhalten von adhärenten Zellen auf topographisch strukturierten (80 nm Gold auf Glas) Substraten nach 48 Stunden im Relief-Contrast-Durchlichtverfahren. A: L929-Zellen richten sich an Linien aus. B: C2C12-Zellen wandern gerichtet über Strukturfelder. C: L929-Zellen adhärieren bevorzugt auf Strukturfeldern und übernehmen die Form der Strukturfelder.

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Zellen reagieren auch auf eine topographische Strukturierung der Oberfläche. Bei der einfachsten Strukturform, mehreren parallelen Linien, ist zu erkennen, dass die
L929-Fibroblasten (Abbildung 29 A) sich entlang der Linien ausrichten. Dabei nehmen die Zellen eine spindelförmige Form an. Zellen, die nicht auf der Struktur, sondern auf der Glasoberfläche adhärieren sind im Gegensatz dazu nicht ausgerichtet und dienen als Kontrolle.

Abbildung 29 B und C zeigen den Einfluss von Strukturfeldern. Die Form der Strukturfelder wurde einer migrierenden Zelle nachempfunden. Dabei ist zu erkennen, dass die Zellen die Strukturfelder zur Adhäsion bevorzugen. Die Fibroblasten adhärieren hauptsächlich auf den Strukturfeldern und nehmen dabei die Form der Struktur an (Abbildung 29 C). Bei den Muskelzellen konnte ebenfalls beobachtet werden, dass die Zellen bevorzugt auf den Strukturfeldern adhärieren. Da die C2C12-Zellen allerdings etwas größer als die L929-Fibroblasten sind, adhärieren sie auf mehreren Feldern gleichzeitig. Zusätzlich konnte beobachtet werden, dass C2C12-Zellen entlang der Strukturfelder migrieren. Dabei bildet sich ein langer, schlauchförmiger Zellausläufer, der von Strukturfeld zu Strukturfeld gespannt ist (B).

Mit einer nicht symmetrischen Anordnung von Winkelstrukturen konnte auch die Anordnung des Aktinzytoskeletts beeinflusst werden. Abbildung 30 zeigt die Aufnahmen aus dem CLS-Mikroskop.

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Abbildung 30 : Einfluss von topographisch strukturierten Oberflächen (A: 80 nm Titanwinkel auf Glas, B: 80 nm Goldstruktur auf Glas) auf das Zytoskelett nach 48 Stunden Adhäsion der Zellen. Detektion des F-Aktin (rot), der FAK (grün) und der Kerne (blau) mittels CLS-Mikroskopie. A: Das F-Aktin von C2C12-Zellen wird entlang der Winkel ausgerichtet. B: L929-Zellen richten sich um eine Radstruktur aus.

Die Strukturierung der Substratoberfläche hat auch Einfluss auf die Anordnung des Aktinzytoskeletts. C2C12-Zellen adhärieren auf Winkelstrukturen. Bei den Winkelstrukturen ist zu beachten, dass es sich um eine gerichtete Struktur handelt. Da der Abstand zwischen den einzelnen Strukturteilen unterschiedlich groß ist, kommt eine pfeilförmige Struktur zu Stande, die mehrnals nebeneinander wiederholt wird. Durch diese Anordnung sollte eine Orientierung von rechts nach links für die Zellen vorgegeben werden. Der Einfluss der Winkelstruktur auf die Zellen richtet das F-Aktin in parallelen Fasern aus (Abbildung 30 A, rote Fasern). Die Zellen in den nichtstrukturierten Randbereichen dienen als Kontrolle. Bei der Adhäsion auf dem reinen Glas ist keine Vorzugsrichtung in der Anordnung des F-Aktins zu erkennen. Zusätzlich zum F-Aktin wurde als Protein der Adhäsionsstruktur die Fokale Adhäsions Kinase (FAK) gefärbt (Abbildung 30 A, grüne Signale). Die FAK ist meistens an den Enden der Aktinfasern lokalisiert. Die grüne Färbung der Struktur ist als Artefakt anzusehen und könnte beispielsweise durch Reflexionsphänomene zu erklären sein. Abbildung 30 B zeigt die Reaktion von Fibroblasten auf eine Radstruktur. Hier ordnen sich die Zellen entlang der Enden der Struktur kreisförmig an. Dabei fällt auf, dass die begrenzenden Aktinfasern der Zellen in den Randbereichen der Zelle häufig direkt auf den Strukturen enden (Abbildung 30 B, rote Fasern). Man erkennt, dass der Zellausläufer auf den Strukturen haftet oder die Zelle genau von zwei Strukturteilen begrenzt wird. Eine eindeutige Lokalisation der FAK ist nicht zu erkennen. Die Zellkerne erscheinen in blauer Färbung. In diesem Falle erscheint die Struktur in rot, was höchstwahrscheinlich ebenfalls auf Reflexions-phänomene zurück zu führen ist.

Mit den gezeigten Strukturen lassen sich Zellen in ihrem Adhäsions- und Migrations-verhalten gezielt beeinflussen. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt ist nicht zu klären, ob die rein topographische Veränderung des Substrates von den Zellen erkannt wird oder auch der chemische Kontrast zwischen den verschiedenen Oberflächen eine Rolle spielt.

5.6 Seltene Ereignisse im ventralen Aktinzytoskelett

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Während der Beobachtung von unstimulierten, mit Aktin-GFP-DNA transfizierten Zellen wurde eine interessante Entdeckung gemacht, die bisher noch nicht beschrieben ist. In den Zeitrafferaufnahmen tauchten immer wieder spontane Aktinakkumulationen auf. Die Häufigkeit ihres Auftretens unterlag starken Schwankungen. Innerhalb eines Tages konnten sie aber praktisch in jeder Aufzeichnung gefunden werden. Auf Grund ihrer optischen Erscheinung werden diese Aktinakkumulationen im weiteren Verlauf Aktinwolken und Aktinsterne genannt werden. Aktinwolken erschienen spontan in unterschiedlichen Bereichen der Zelle, wanderten durch die Zellen hindurch und verschwanden wieder. Dabei konnte eine Abnahme des Aktins in der lokalen Umgebung festgestellt werden. Die Aktinwolken waren in Größe und Form sehr vielfältig.

5.6.1  Entstehung von Aktinsternen aus Aktinakkumulation bei L929-Zellen

Ein Großteil der Aktinwolken verschwand allerdings nicht gleich wieder, sondern wurde in filamentöse Strukturen umgeformt. Dabei entstanden sehr helle Aktinzentren, von denen sternförmig Aktinfasern ausgingen. In Abbildung 31 ist die Entstehung einer solchen sternförmigen Aktinstruktur, im Folgenden Aktinstern genannt, dargestellt.

Abbildung 31 : Zeitrafferstudie einer Aktinstern-Entstehung in Aktin-GFP-transfizierten L929-Zellen mittels TIRF-Mikroskopie. A zeigt die Zelle im Überblick. Das rote Quadrat markiert den Bereich, in dem sich die Aktinwolke ausbildet. Die Einzelbilder ergeben sich aus der Farbkodierung (s. Abbildung 13). Die entstandene Aktinwolke kondensiert zu einem Stern (B-F). Vom Sternzentrum gehen in alle Richtungen Aktinfasern aus (E, F). Der beobachtete Stern wird anschließend wieder kleiner und verschwindet (G-L).

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Eine der beobachteten Aktinwolken wurde innerhalb von 1 Stunde zu einem Aktinstern umgebildet, der anschließend wieder verschwand. Abbildung 31 A zeigt die gesamte Zelle zum Zeitpunkt t = 0. Der rot markierte Bereich ist vergrößert dargestellt. Im Zentrum dieser Region entstand eine wolkenförmige, diffuse Aktinakkumulation. Auf Grund der Farbkodierung erscheint dieser Bereich rot (Abbildung 31 B). In der unteren linken Ecke erkennt man eine bläuliche Färbung, die anzeigt, dass die Umgebung der Aktinwolke an Aktin verarmt ist. 15 Minuten später hatte sich aus der Wolke ein Ring gebildet (B), der sich anschließend zusammenzog. Dabei erkennt man einen Farbwechsel von rot über gelb nach weiß (C-E). Dieser Farbwechsel bedeutet, dass die detektierte Signalintensität an dieser Stelle ab dem Zeitpunkt t = 0,5 Stunden (D) konstant geblieben ist. Während der Umfang des Ringes kleiner wird, erscheint das Zentrum jeweils rot als Hinweis darauf, dass das Aktinsignal in der Mitte der Ringstruktur zu diesem Zeitpunkt neu detektiert wurde (D, E). Nach einer halben Stunde sind die ersten Aktinfasern gebildet worden (D), die sternförmig die Akkumulation umgeben. Der Ring kondensierte und bildete das Zentrum des Sterns (Abbildung 31 F). Stern und Fasern erscheinen im Folgenden weiß, da sie länger als 30 Minuten mit konstanter Intensität detektiert wurden (E-F). Obwohl das Sternzentrum sehr symmetrisch erscheint, variieren die Fasern in Anzahl und Länge. Vom ersten Auftreten an werden die Fasern innerhalb von 30 Minuten immer deutlicher sichtbar (D-F). Die dabei erkennbaren blauen Schatten entlang der Fasern deuten auf eine Verarmung der Umgebung an Aktin hin.

In den folgenden 90 Minuten verschwand der Stern wieder (F-L). Die Anzahl der Fasern nahm dabei ab und das Zentrum verlor an Intensität. Die gesamte Struktur verkleinerte sich im Durchmesser von 4,1 Mikrometern auf 1,6 Mikrometer. Auf Grund der Farbkodierung erscheint dieser Prozess in blau. Nach 2,5 Stunden war der Stern vollständig verschwunden, die Struktur ist bis auf einen weißen Punkt in der Mitte nur noch in blau zu erkennen (L).

Die Bildung eines Aktinsterns aus einer Aktinwolke ist ein außergewöhnlicher Vorgang, der einer genaueren Untersuchung bedarf. So fiel auf, dass nicht alle Aktinwolken automatisch zu Sternen umgesetzt werden. Vielmehr wurden auch Aktinwolken beobachtet, die auftauchten, sofort wieder verschwanden und in einem Nachbarareal wieder akkumuliert wurden. Abbildung 32 zeigt eine solche Wolke und die Entstehung eines Aktinsterns im Nachbarareal. Anschließend wurde die Intensitätsverteilung über den Kondensationsprozess analysiert.

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Abbildung 32 : Zeitrafferstudie einer Aktin-GFP-transfizierten L929-Zelle mittels TIRF-Mikroskopie. A zeigt die Zelle im Überblick. Das rote Rechteck markiert den interessanten Bereich, der vergrößert dargestellt wird. Die Einzelbilder ergeben sich aus der Farbkodierung (s. Abbildung 13). Eine Wolke entsteht im Randbereich der Zelle und verschwindet wieder (B-D). Im Nachbarareal entsteht eine zweite Wolke (D, rot), die sich zusammenzieht und zu einem Stern mit 6 Fasern kondensiert (D-F). Die Länge der Fasern entspricht den Ausmaßen der ursprünglichen Wolke (F, weiße Kreise, gestrichelte Strahlen) Der fertige Stern wandert diagonal nach links oben (G-I Farbverlauf des Sternzentrums; D, G Versatz des Kreises). Die Fluoreszenzintensität wurde während des Prozesses in drei aufeinander folgenden Grauwertbildern gemessen (D-F, weiße Boxen).

Abbildung 32 zeigt eine Zelle, in der zweimal hintereinander eine Aktinwolke entstanden ist, wobei nur die zweite Wolke zu einem Stern kondensiert wurde. Im linken Teil der Zelle bildetete sich in den Grenzen des Zellmembran eine dreieckige Aktinwolke
(Abbildung 32 B, rot). An Hand der Farbkodierung kann man erkennen, dass diese Wolke eine Lebensdauer von unter 15 Minuten hatte. Bereits zum nächsten Zeitpunkt hatte sich die Akkumulation wieder aufgelöst (C, grün; D, blau). Im benachbarten Areal der Zelle entstand dann eine zweite Wolke (D, rot), die in ihrer Ausdehnung nicht begrenzt war und kreisrund erscheint (D, weißer Kreis). Im Zentrum dieser Wolke stieg die Aktinkonzentration an, wobei die Umgebung an Aktin verarmte. Die Farbe der Ursprungswolke wechselt dabei von rot direkt über grün zu blau (D-F). Im Zentrum hingegen ist ein entgegengesetzter Farbverlauf zu beobachten. Das Zentrum wird erst heller und behält dann die Intensität bei. Daraus ergibt sich ein Farbwechsel von rot über orange und gelb nach weiß (D-G). Um den Farbverlauf besser interpretieren zu können, wurde die Aktinkonzentration als Funktion der Signalintensität über die Gesamtbreite der Aktinwolke in den Grauwertbildern mittels ImageJ vermessen (D-F, weiße Boxen) und aufgetragen. In Diagramm 1 ist das Ergebnis dieser Untersuchung aufgetragen.

Diagramm 1 : Verteilung der Aktinkonzentration als Funktion der Fluoreszenzintensität während der Kondensation (Abbildung 32, C-E weiße Boxen). Die Intensität im Zentrum der Wolke steigt auf das 3-fache an.

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Das Aktin war in der diffusen Wolke (Abbildung 32 D, rot) gleichmäßig verteilt. Die Intensität schwankte um einen Mittelwert von ungefähr 40 Einheiten (Diagramm 1, rote Kurve). 15 Minuten später zeigt die Aktinverteilung einen zentralen Peak mit einem Maximum bei 145 Einheiten. Im Gegenzug ist die Intensität in den Randbereichen auf ungefähr 15 Einheiten abgesunken (Diagramm 1, grüne Kurve). Der Intensitätsanstieg ist nicht auf neu detektiertes Aktin zurückzuführen, sondern die Verteilung ist inhomogen geworden, die Aktinkonzentration wurde im Zentrum der Wolke angereichert
(Abbildung 32, E). Diese Anreicherung blieb über die nächsten 15 Minuten erhalten, was auch in der dritten Verteilungskurve zu erkennen ist (Diagramm 1, blaue Kurve). Flächenmäßig ist dieser Peak allerdings etwas kleiner. Das kann darauf zurückgeführt werden kann, dass ein Teil des Aktins zur Ausbildung der Fasern verbraucht wurde (Abbildung 32, F schwarze Linien). Das Intensitätsmaximum ist bei t = 1 Stunde etwas nach links verschoben, was sich auch bereits im farbkodierten Bild erkennen lässt (Abbildung 32 F). Diese Dezentralisierung ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass der Aktinstern sich im weiteren Verlauf der Beobachtung auf die Zellmembran zu bewegt.

Die Aktinkonzentration im Zentrum der Wolke ist während der Bildung des Sterns deutlich angestiegen, (Diagramm 1, grüne Kurve). Die gelb-weiße Färbung in den farbkodierten Bildern (Abbildung 32, F) zeigt, dass sich die gemessene Aktinsignalintensität dort anschließend nicht mehr veränderte (s. Diagramm 1, blaue Kurve). Das detektierte Aktin bildete das Zentrum des entstehenden Aktinsterns. Vom Zentrum aus bildeten sich im Bereich der vorherigen Wolke sechs Fasern aus (Abbildung 32, F schwarze Striche). 15 Minuten später war der Stern vollständig ausgebildet und die Fasern gut zu erkennen (G). Die Umgebung der Fasern ist bläulich gefärbt, was auf eine Verarmung an Aktin hindeutet, und möglicherweise durch die Bildung der Fasern verursacht wird.

Das Sternzentrum sollte sich jetzt weiß darstellen, da sich an der Aktinverteilung innerhalb der letzten 30 Minuten nichts mehr verändert hat. Die tatsächliche rote Färbung (Abbildung 32 G, H) beruht jedoch auf der Wanderung des Sternzentrums diagonal nach links oben in Richtung der Zellmembran (D, G; Versatz des Kreises). Entlang der Wanderungsstrecke ergibt sich daher für das Sternzentrum ein Farbverlauf von rot über gelb-weiß nach grün zu türkis blau. Die beiden oberen Fasern wurden während dieser Verschiebung verkürzt, wobei die unteren verlängert wurden. Die Aktinfasern überspannen den Bereich, der von der ursprünglichen Wolke begrenzt wurde (D, G weißer Kreis). Dabei ist das Sternzentrum nicht immer symmetrisch positioniert, bzw. seine Position kann sich verändern (F-H). Zum Ende der Beobachtung verschwand der Stern wieder (I). Dabei wurde die Struktur in ihrer Intensität schwächer und erscheint grün-blau.

5.6.2 Dynamik von Aktinsternen

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Aus Abbildung 32 ist neben der Kondensation einer Wolke zu einem Aktinstern abzulesen, dass es sich bei Aktinsternen um dynamische Strukturen handelt. Diese Beobachtung ist eine weitere Untersuchung wert. Abbildung 33 stellt einen weiteren Aspekt dieser Dynamik dar. Zwei Aktinsterne wandern aufeinander zu und fusionieren.

Abbildung 33 : Zeitrafferstudie der Dynamik von Aktinsternen in Aktin-GFP-transfizierten L929-Zellen mittels TIRF-Mikroskopie. Die Einzelbilder ergeben sich aus der Farbkodierung (s. Abbildung 13). Ein Aktinstern (A, rotes Quadrat) wandert durch die Zelle (B-E). Die Position des Sterns ist mit einem roten Kreis markiert (B). Diagonal links oben in der Zelle entsteht ein zweiter Stern (C, schwarzer Kreis). Der erste Stern wandert auf den zweiten Stern zu und fusioniert mit diesem (E). Die gestrichelten Kreise markieren die Ursprungsposition des ersten Sterns (C-E). Der neue Stern ist nicht größer als die beiden Vorläufer (E). Vom Ursprungsort des ersten Sterns aus, haben sich entlang der Wegstrecke des Sterns durch die Zelle Aktinfasern angeordnet (E).

Abbildung 33 A zeigt eine Zelle mit einem ausgebildeten Aktinstern, der vergrößert dargestellt wurde (Abbildung 33  A, rotes Quadrat). Der beobachtete Stern war seit mehr als 30 Minuten stabil und erscheint daher gemäß der Farbkodierung in weißer Einfärbung. Der Stern besteht aus einem Zentrum mit verschieden langen Fasern, wobei diese asymmetrisch um das Zentrum verteilt sind. Die Position des Zentrums ist durch einen roten Kreis markiert (B). Diagonal nach links oben bildete sich im Verlauf der Beobachtung ein zweiter Stern aus (C, schwarzer Kreis), der über den gesamten Beobachtungszeitraum in Position, Größe und Form unverändert blieb (C-E). Der erste Stern wanderte auf den zweiten Stern zu und fusionierte mit diesem (C-E).

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Der beobachtete Prozess verlief sehr langsam. Der Beobachtungszeitraum betrug 5,25 Stunden (Abbildung 33 B-E). Während der Wanderung des ersten Sterns wurden die Fasern umorganisiert und ihre Anzahl erhöhte sich. Die Fasern sind nun bipolar entlang der Bewegungsrichtung angeordnet. Die Ursprungsposition des ersten Sterns ist rot markiert (C-E, gestrichelter Kreis). Die zurückgelegte Strecke betrug in den ersten 1,75 Stunden 4,7 Mikrometer. In derselben Zeit legte der Stern anschließend dieselbe Entfernung noch einmal zurück. Die beiden Sternzentren befanden sich danach auf einer Höhe und die Sterne waren direkt nebeneinander lokalisiert (D). Dann folgte die Fusion des ersten mit dem zweiten Stern. Dabei entstand ein neuer Aktinstern, der in Größe und Form seinen Vorläufern glich. Der Gesamtgehalt an Aktin eines Sterns konnte nicht aus den Bildern ermittelt werden, so dass dieser Eindruck nicht überprüft werden konnte. Das Zentrum des neuen Sterns ist mit der Position des zweiten Sterns identisch. Insgesamt legte der wandernde Stern eine Strecke von 11,4 Mikrometern zurück (E). Mehrere parallele Aktinfasern zeichnten die Wegstrecke nach.

5.6.3 Aktinakkumulationen bei C2C12-Zellen

In Analogie zu den Wolken und Sternen in den L929-Fibroblasten wurde in C2C12-Muskelzellen nach ähnlichen Strukturen gesucht. Auch bei diesen Zellen konnten wolkenförmige Aktinakkumulationen gefunden werden (Abbildung 34).

Abbildung 34 : Zeitrafferstudie einer Aktin-GFP-transfizierten C2C12-Zelle mittels TIRF-Mikroskopie. A zeigt die Zelle in der Übersicht. Das rote Quadrat markiert den vergrößerten Bereich, in dem mehrmals hinter einander Aktinwolken entstehen (B-H). Die Einzelbilder ergeben sich aus der Farbkodierung (s. Abbildung 13). Das Erscheinungsbild der Wolken ist granulär.

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In C2C12-Muskelzellen entstehen die Wolken in den Randbereichen der Zelle. Die gesamte Zelle erscheint leicht farbig, was darauf hindeutet, dass die Hintergrundintensität der Zelle schwankt. Trotzdem erkennt man eine wolkenförmige Aktinakkumulation von ovaler Form an der oberen Zellgrenze (Abbildung 34 B, rote Wolke). Im Gegensatz zu Aktinwolken in L929-Zellen (Abbildung 32) ist die Intensität nicht homogen verteilt, sondern das Aktin erscheint granuliert (Abbildung 34, B, F-H). Die Wolke hatte eine Lebensdauer von unter 15 Minuten und verschwand kurz nachdem sie aufgetaucht war wieder. Daraus ergibt sich der bekannte Farbverlauf von rot über grün nach blau (B-D). In den nächsten 1,5 Stunden konnte man alle 15 Minuten in benachbarten Arealen die Bildung einer neuen Aktinwolke beobachten (E-H, rote Wolken). Alle Wolken verschwanden gleich wieder und hatten keinen sichtbaren Effekt auf die Zelle. Wolken mit längerer Lebensdauer konnten nicht beobachtet werden.

Bei Betrachtung der Wolkenform fällt ein weiterer Unterschied auf. In L929-Zellen waren die Wolken rund wenn sie nicht von der Zellmembran begrenzt wurden (Abbildung 32). In C2C12-Zellen hingegen haben die Wolken in benachbarten Arealen unterschiedliche Formen. Es wurden ovale Wolken beobachtet, auch wenn keine sichtbare Struktur die Ausdehnung begrenzt hat (Abbildung 34 F). Alle beobachteten Wolken zeigten granuliertes Aktin, das an sich homogen verteilt war. Indessen konnten Abweichungen zu dieser Verteilung beobachtet werden. Nach 1,25 Stunden Beobachtungszeit bildete sich eine Wolke, die keine homogene Aktinverteilung mehr aufwies. Bei dieser Wolke zeigte das Zentrum der Wolke keine Signalintensität (G), entspricht also eher einer ringförmigen Aktinakkumulation, denn einer Wolke. In weiteren Versuchen konnten diese ringförmigen Strukturen mehrfach beobachtet werden (Abbildung 35).

Abbildung 35 : Zeitrafferstudie einer Aktin-GFP-transfizierten C2C12-Zelle mittels TIRF-Mikroskopie. A zeigt die Zelle in der Übersicht. Das rote Rechteck markiert den vergrößerten Bereich, in dem mehrfach hintereinander ringförmige Aktinakkumulationen entstehen (B-E). Die Einzelbilder ergeben sich aus der Farbkodierung (s. Abbildung 13). Die Lebensdauer der Ringe liegt unterhalb von 15 Minuten.

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Die hier gezeigte Zelle akkumulierte Aktin nicht in Wolken, sondern in Form eines Rings. Der Ring bildete sich ebenfalls im Randbereich der Zelle und ist fast kreisrund
(Abbildung 35 B). Die in Abbildung 34 beobachtete Granulierung der Wolken ist hier nicht so ausgeprägt, aber sichtbar. Der Aktinring hat eine Lebensdauer von unter 15 Minuten und zeigt daher den bekannten Farbverlauf von rot über grün nach blau
(Abbildung 35 B-D). Direkt im Anschluss (C) bildete sich wieder ein Ring. Der zweite Ring ist genauso groß wie der erste, ist aber leicht nach oben verschoben (C, D). Auch dieser Ring verschwand direkt wieder und erscheint daher in rot, grün und blau (C-E). Da die beiden Ringe am selben Ort entstanden sind, hat man den Eindruck ein einziger Ring würde pulsieren.

Im Unterschied zu den L929-Fibroblasten bei denen sich aus Aktinwolken langlebige Aktinsterne bildeten, konnten bei C2C12-Zellen in keinem Experiment Aktin-akkumulationen beobachtet werden, die eine größere Lebensdauer als 15 Minuten hatten oder zu Fasern umgebaut wurden.


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04.09.2007