6 Diskussion

↓93

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Entstehung von Zellspuren detailliert untersucht. Dabei konnte deren Abhängigkeit von verschiedenen zellbiologischen Größen gezeigt werden. Es wurde der Zusammenhang zwischen Zellspurbildung und Adhäsion demonstriert, während gleichzeitig die Adhäsionsmuster auf dem Kultursubstrat mit der migratorischen Aktivität korrelierten. Diese Untersuchungen waren möglich, nachdem die technischen Anforderungen an den einzurichtenden Arbeitsplatz mittels eines Mikroskop-Aufbaus erfüllt waren, welcher die mehrtägige Beobachtung migrierender Zellen im evaneszenten Feld (TIRF) erlaubte.

6.1  Aufbau des TIRF-Zeitraffer-Arbeitsplatzes

↓94

Unter den möglichen Mikroskopie-Techniken, welche die Darstellung von Zell-Substrat-Wechselwirkungen optimal möglich machen, wurde in dieser Arbeit die TIRF-Mikroskopie ausgewählt. Mittels TIRF-Mikroskopie wird ausschließlich der substratnahe Bereich der Zelle abgebildet. Auf Grund des exponentiell abfallenden Anregungsfeldes erhält man nur eine sehr geringe Eindringtiefe in das Präparat (ca. 100 nm). Dabei ist die Diskriminierung in z-Richtung bis zu zehnfach besser, als beispielsweise bei der Verwendung der
CLS-Mikroskopie. Eine ähnlich gute Diskriminierung in z-Richtung wie die TIRF-Mikroskopie würde auch die Interferenz Reflexions (IR-) Mikroskopie bieten. Bei Verwendung dieser Mikroskopieform können allerdings spezifische Proteinmarkierungen nur mit hohem technischem Aufwand durchgeführt werden. Zudem war aus früheren Experimenten bekannt, dass bei der Verwendung der IRM Zellen in ihrem Migrationsverhalten beeinträchtigt wurden (Richter et al. 2000), so dass diese Methode für die vorliegenden Versuche nicht geeignet war. Die Verwendung eines evaneszenten Feldes zur Anregung von Fluoreszenzmarkern reduziert zusätzlich die Belastung der Zellen durch die Bestrahlung mit hochenergetischem Licht auf den Untersuchungsbereich, so dass die Beeinflussung der Zellen und damit mögliche Schädigungen durch die Messmethode möglichst gering sind.

Um auch Langzeitbeobachtungen von Zellen durchführen zu können und die Dynamik der Zelladhäsion und -migration sowie die Bildung von Zellspuren beobachten zu können, wurde der hier aufgebaute Mikroskopie-Arbeitsplatz mit einer Klimatisierungsvorrichtung ausgestattet. Lange TIRF-Zeitrafferstudien stellen an den mikroskopischen Aufbau und die Präparate hohe Ansprüche. Eine stabile Temperatur, CO2- und Feuchtigkeits-regulation sind die Grundvoraussetzungen für die Langzeitbeobachtung lebender Zellen. Da die bisher verfügbaren Systeme diese Bedingungen nur unzureichend erfüllten, war die Entwicklung des „Cell Incubator“ von Olympus nötig. Die Umgebungsbedingungen im „Cell Incubator“ konnten über einen Zeitraum von mehreren Tagen stabil gehalten werden und ermöglichten eine weitgehend physiologische Kultivierung der Zellen während der mikroskopischen Beobachtung. Der Einsatz eines Filtersystems für die eingehende Luft gewährleistet zudem die Sterilität der Präparate während der Beobachtungszeit. In Zusammenarbeit mit der Firma Evotec Technologies GmbH wurde das Gerät im Rahmen dieser Arbeit getestet und optimiert.

Beim Einsatz von Fluoreszenzverfahren mussten zusätzlich die zytotoxischen Einflüsse der Beleuchtung und der Farbstoffe auf die Zellen minimiert werden, um die Beeinflussung der Zellen durch den Messprozess möglichst gering zu halten. Daher wurde die Gesamtbeleuchtungsintensität des TIRF-Feldes für Langzeitbeobachtungen minimiert, in dem ein automatisches Verschlusssystem in den Aufbau integriert wurde, mit dem die Beleuchtungszeiten auf die reine Aufnahmezeit reduziert werden konnten.

↓95

Ein weiteres Problem stellte die Wahl des Farbstoffes zur Anfärbung der Zellen dar. Es ist zu erwarten, dass bei blau anregbaren Farbstoffen auf Grund der höheren Energie des Anregungslichtes größerer Stress auf die Zellen wirkt und nicht jede Zelle gleich robust ist. Im Gegenzug musste allerdings die Signalintensität ausreichend hoch sein, um bei Anregung mit einem evaneszenten Feld Signale zu erhalten. Für die Beobachtung von Adhäsionsmustern bot sich zuerst ein einfacher zytosolischer Farbstoff an. Bei der Fülle der verschiedenen Adhäsionskomplexe erhält man so einen Überblick über die substratnahen Bereiche der Zelle. Die kommerziell erhältlichen Farbstoffe Calcein und Dihydrocalcein ermöglichten für Einzelaufnahmen deutliche Bilder, eigneten sich aber nicht für Langzeitversuche, da die zytotoxischen Nebenprodukte der Esterasereaktion die Zelle auf Dauer zu schwer belasteten. Auch das grün anregbare Calcein Red Orange war z. B. für L929-Fibroblasten innerhalb kürzester Zeit tödlich.

Daher bot sich für Langzeitstudien die Transfektion mit einem DsRed-Vektor an. So wurde ein stabiles, zytosolisch vorliegendes Fluorophor erhalten, das grün anregbar ist und keine auffälligen Zellschäden verursacht. Ebenso erfolgreich war die Transfektion mit Plasmid-DNA für ein GFP-Aktin-Fusionsprotein. In diesem Falle stellte die Anregung mit dem höherenergetischen Licht für die Zellen kein Problem dar. Diese Tatsache könnte darauf zurückgeführt werden, dass bei der Verwendung von Fusionsproteinen als Fluorophor keine toxischen Nebenprodukte entstehen und nur das Anregungslicht die Zelle belastet. Bei der Verwendung von Farbstoffen hingegen addieren sich scheinbar die zytotoxischen Belastungen aus Farbstoff und Beleuchtung.

Alle verwendeten Zellen waren unter Zeitraffer-Bedingungen und TIRF-Feld Anregung in der Lage, sich zu teilen. Ebenso wurden keine Unterschiede im Differenzierungsverhalten der C2C12 Muskelzellen beobachtet. Ein Großteil der Zellen zeigte zudem ein unverändertes Migrationsverhalten. Diese Tatsache ist als Fortschritt zu werten, da bei bisherigen Untersuchungen mittels IR- (Richter et al. 2000) oder TIRF-Mikroskopie (Geggier und Fuhr 1999) keine Migration beobachtet werden konnte. Um die Belastung möglichst gering zu halten, wurden große Zeitabstände (vier Bilder pro Stunde) für die Bildaufnahme gewählt. Dabei nimmt man allerdings in Kauf, dass beispielsweise schnelle Umbauprozesse im Zytoskelett nicht abgebildet werden können. Die Wahl des Beobachtungsintervalls stellt also einen Kompromiss dar, der aber die Beobachtung von Zellen im TIRF-Mikroskop über mehrere Tage möglich machte.

↓96

Hochauflösende Mikroskopie über längere Zeiträume erfordert eine sehr stabile Fokus-lage. Im Zusammenhang mit einer Klimatisierung des experimentellen Aufbaus kommt es dabei durch die entstehenden Temperaturgradienten zu zusätzlichen Problemen. Auf Grund des Temperaturunterschieds zwischen der Inkubationskammer (37 °C) und der Raumluft (20-25 °C) bilden sich Temperaturgradienten aus. Dabei stellt der Gradient zu den Außenwänden nur im Bezug auf Kondenswasserbildung ein Problem dar, die leicht durch Reduzierung der Gesamtfeuchtigkeit auf 65-70 Prozent verhindert werden kann. Die geringere Feuchtigkeit gegenüber den herkömmlichen Zellkulturbedingungen stellt bei geschlossenen Reaktionsgefäßen kein Problem dar. Hingegen wirkt sich der Gradient, der sich entlang des Mikroskopstativs und damit auch entlang der Fokussiereinheit ausbildet, deutlich auf die Fokusstabilität aus. Zusätzlich unterliegen Mikroskoptisch und Objektiv unterschiedlichen klimatischen Bedingungen, da sie an verschiedenen Stellen Kontakt zum Mikroskopstativ haben.

Ein Software-Autofokussystem, bei dem in einem iterativen Prozess Bilder aufgenommen werden und die Software den Schärfegrad des Bildes erkennt, stellt für dieses Problem keine Lösung dar. Weder ist ein Bleichen der zu beobachtenden Stelle gewünscht, noch ist die zusätzliche Strahlungsbelastung für die Zellen zu tolerieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher ein Spezialtisch eingesetzt, bei dem Objektiv und Mikroskoptisch mechanisch gekoppelt sind und somit den gleichen Schwankungen unterliegen. Eine zylindrische Halterung im Objektivrevolver nimmt das Objektiv auf. Der magnetisch fixierte Präparathalter ist relativ zum Objektiv fixiert und nicht weiter mit dem Mikroskopstativ verbunden. Die Fokussierung erfolgt rein mechanisch über ein Feingewinde. Ein bedeutender Nachteil dieses Systems ist, dass keine Automatisierung der x-y-Bewegung des Tisches möglich ist. In Zukunft wird sich das Fokusproblem mittels eines seit neuestem auf dem Markt erhältlichen Hardware-Autofokus lösen lassen. Dabei wird durch einen zusätzlichen Laserstrahl vor jeder Bildaufnahme die aktuelle Position der Präparatunterseite bestimmt und entsprechend nachfokussiert. Diese technische Neuerung ermöglicht es, den bisher rein mechanischen Mikroskopaufbau in Zukunft zu automatisieren. Dadurch wird es möglich sein, mit einer Routine zur sequentiellen Ansteuerung verschiedener x-y-Positonen in einem Experiment mehrere Zellen parallel zu untersuchen. Geht man nun beispielsweise von einer kurzen Belichtungszeit und Zeiten von 1-2 Sekunden für jeweils x-y-Weg und Fokussierung aus, kann man überschlagen, dass auf jeden Fall die Aufnahme von 10 Zellen pro Minute (also 150 Zellen im üblichen Beobachtungsintervall von 15 Minuten) möglich sein sollte. Durch diese Art der Bildaquisition wird eine genaue statistische Auswertung der Daten möglich gemacht, so dass die gewonnenen Erkenntnisse auf einem soliden Fundament stehen.

TIRF-Beleuchtung kann sowohl mittels eines Laserstrahls, als auch mittels einer
Hg-Dampflampe realisiert werden. Die Lampenbeleuchtung hat den Vorteil, dass mehrere Wellenlängen zur Anregung von Fluorophoren zur Verfügung stehen. Als Nachteil ist das nichthomogene TIRF-Feld zu nennen, das auf Grund der Tatsache entsteht, dass es sich bei einer Lampe um eine ausgedehnte statt punktförmiger Lichtquelle handelt, die nicht kollineares Licht aussendet. Daher ist es nicht möglich, komplett parallele Strahlengänge zu erzeugen. Das mit der Hg-Dampflampe erzeugte evaneszente Feld war allerdings für die hier untersuchten Fragestellungen völlig ausreichend.

6.2 Datenauswertung

↓97

Um die dynamischen Prozesse der Zelladhäsion und -migration sowie der Zellspurbildung auswerten zu können war es notwendig, eine Darstellungsform zu entwickeln, die die Dynamik in statischen Bildern sichtbar machen kann. Dabei sollte ein möglichst einfacher Algorithmus zur Anwendung kommen und wenn möglich auf Spezialsoftware verzichtet werden. Die in Abschnitt 4.2.4.3 beschriebene Farbkodierung erfüllt diese Anforderungen. Sie ermöglicht es Aufnahmen einer Zeitrafferstudie so in Farbbilder umzusetzten, dass die entstehenden Farben Auskunft über Auftreten und Stabilität des detektierten Fluoreszenzsignals geben. Mit dieser Übertragung eines zeitlichen Verlaufes in eine Farbinformation wird die Auswertung der Bilder vereinfacht, da nicht mehr Helligkeits-unterschiede ausgewertet werden müssen, sondern nur noch eine Farbinformation.

Mit Hilfe dieser Farbkodierung kann man dynamischen Prozessen eine Richtung zuordnen. Beispielsweise lässt sich die Migrationsrichtung einer Zelle an der Farbverteilung ablesen. Ebenso lassen sich Aussagen über die Langlebigkeit von Signalen und damit über die dahinter stehenden Strukturen, wie z. B. über das Aktinzytoskelett oder die Stabilität von Adhäsionsmustern, treffen. Diese Tatsache hat die Auswertung der dynamischen Aufnahmen bei der Entstehung von Zellspuren erleichtert und interessante Zusammenhänge zwischen Zellspurentstehung und Adhäsionsmustern aufgedeckt.

6.3 Untersuchung der Adhäsionsmuster und Migrationsformen

Für die technische Nutzung von Zellspuren zur Analyse von Einzelzellen ist es bedeutend den Prozess der Zellspurablage zu verstehen und kontrollieren zu können. Die in diesem Zusammenhang wichtigen biologischen Prozesse sind die Zellmigration und die Zelladhäsion. In beiden Fällen spielt neben den zellspezifischen Eigenschaften die Wechselwirkung der Zelle mit der Substratoberfläche eine wichtige Rolle. Zur Analyse dieser Prozesse unter der Berücksichtigung der Frage nach Kontrolle der Migration, der Zellspurbildung oder auch der Zellspurmorphologie, wurde in der hier vorliegenden Arbeit dem dynamischen Verhalten unstimulierter Zellen in den Bereichen der Zelladhäsion und der Zellmigration besondere Aufmerksamkeit geschenkt.

↓98

Zum Vergleich der verschiedenen Verhaltensweisen waren vier Zelllinien gewählt worden, deren Zellspurbildung teilweise bereits früher beobachtet worden war (Fuhr et al. 1998). Untersucht wurden eine nichtmigrierende Epithelzelle (CHO), zwei migrierende Fibroblastenlinien (L929 und 3T3) und eine ebenfalls migrierende Muskelzelllinie (C2C12). Im Gegensatz zu 3T3-Zellen hinterlassen L929-Fibroblasten ausgeprägte Zellspuren (Fuhr et al. 1998). Über die Muskelzelllinie lagen bezüglich des Zellspurbildungsverhaltens noch keine Ergebnisse vor. Im Folgenden wurde das zellspezifische Adhäsionsmuster mit dem Migrationsverhalten der Zellen verglichen und so Gesetzmäßigkeiten für die Ablage von Zellspuren gefunden.

6.3.1  Unterscheidung der Adhäsionsmuster

Es konnte gezeigt werden, dass die Adhäsionsmuster der Zellen nicht rein zufällig angeordnet waren, sondern sich in zwei Grundformen, "punktförmig" und "riefenförmig", einteilen lassen.

Die zytosolischen Färbungen zeigten, dass das punktförmige Adhäsionsmuster bei
L929-Fibroblasten in zwei Zuständen auftritt. Die nichtpolarisierten, runden Zellen zeigten gleichmäßig über die ventrale Membran verteilte Adhäsionspunkte, wohingegen bei polarisierten Zellen eine deutliche Zellfront zu erkennen war. Dieser Bereich war insgesamt heller und damit näher am Substrat lokalisiert als der Zellkörper und zeigte mehr Adhäsionspunkte. Die erhöhte Anzahl von Adhäsionsstellen kann mit einer stärkeren Adhäsion in Einklang gebracht werden (Hornung und Fuhr 1996; Hornung et al. 1996). Bei den anderen drei Zelllinien wurden lange parallele Riefen gefunden, die den kompletten Zellkörper durchspannten (Abbildung 11).

↓99

Die Strukturierung der ventralen Zellmembran wird durch das Zytoskelett der Zelle verursacht, wenn sichdie dort vorhandenen Strukturen nach unten in die Membran abformten. Die Färbung mit Phalloidin zeigte, dass die langen parallelen Riefen, die im Adhäsionsmuster von C2C12-, 3T3- und CHO-Zellen zu beobachten waren, durch parallel verlaufende Aktinfasern verursacht wurden. Es ist bemerkenswert, dass auch das punktförmige Adhäsionsmuster der L929-Fibroblasten im Aktinbild wieder zu finden war. Da die Strukturen sich mit Phalloidin anfärben ließen, musste es sich ebenfalls um filamentöses Aktin handeln. Das führte zu der Überlegung, dass die Punktstruktur im evaneszenten Feld dadurch zustande kommen muss, dass durch die begrenzte Fluoreszenzanregung nur jeweils die Enden von Aktinfasern mit Ausdehnung in höher gelegene Teile der Zelle sichtbar sind. Der Vergleich mit einem Epifluoreszenzbild zeigte, dass die Aktinfasern in L929-Zellen in leichten Bögen angeordnet waren und die im
TIRF-Feld zu erkennenden Punktmuster die Enden dieser Fasern darstellten. Dabei erstreckten sich die Fasern in der polarisierten Zelle von der zentralen sternförmigen Aktinanordnung bis nach hinten zum Zellausläufer. Im Vergleich dazu lag das Aktin bei den Zellen mit dem riefenförmigen Adhäsionsmuster parallel zum Substrat direkt über der ventralen Membran.

Um zu klären, ob sich diese Unterschiede auch Auswirkungen auf das Migrationsverhalten haben, wurde die Dynamik der Adhäsionsmuster im Zeitraffer untersucht. Abbildung 15 zeigt, wie sich das Adhäsionsmuster einer L929-Zelle veränderte, während sie eine Polarisationsrichtung aufbaute und zu migrieren begann. Dabei sind zwei Dinge besonders zu beachten. Zum einen blieben Adhäsionspunkte stabil erhalten und waren sowohl in der nichtpolarisierten Zelle als auch in der polarisierten Zelle zu erkennen. Diese Tatsache ist im Zusammenhang mit der Entstehung der Zellspuren interessant und wird später näher erläutert werden (s. Abschnitt 6.4.1). Zum anderen kann man erkennen, dass die Zelle mit dem Übergang zur Migrationsform die Adhäsionsfläche vergrößert hat. Es sind mehr Adhäsionspunkte zu erkennen und der gesamte Frontbereich ist näher am Substrat lokalisiert, erscheint also heller. Diese Beobachtung lässt sich dadurch erklären, dass die Zellen während der Migration im vorderen Bereich mehr Kraft auf das Substrat übertragen müssen, als zur reinen Adhäsion benötigt wird (Beningo et al. 2001; Dembo und Wang 1999). Gleichzeitig wurden die Adhäsionsstrukturen im Bereich des Zellkörpers und des Zellausläufers reduziert.

Im Gegensatz dazu scheint der Prozess bei den beiden riefenbildenden Zellen kontinuierlich zu verlaufen. Bei der Protrusion der C2C12-Muskelzellen erkennt man, wie bestehende Adhäsionsriefen verlängert wurden und sich die Zelle gleichzeitig darüber wegschob (Abbildung 17). Dabei blieb das Muster im Bereich des Zellkörpers unverändert erhalten. Die Änderungen sind deutlich geringer als bei den L929-Zellen und bleiben nur auf den reinen Protrusionsbereich beschränkt. Dasselbe ist zu beobachten, nachdem die Zelle ihre Richtung geändert hatte und den vorher vorgeschobenen Bereich wieder zurückzog. Auch bei diesem Prozess bleibt das Grundmuster erhalten und die Adhäsionsriefen wurden kontinuierlich verkürzt. Die 3T3-Fibroblasten verhielten sich analog zu den C2C12-Zellen und behielten ihr Riefenmuster während der Migration ebenfalls bei.

6.3.2 Zusammenhang zwischen Adhäsionsmustern und Migrationsverhalten

↓100

In der Literatur existieren zwei verschiedene Modelle, das Kontraktions- und das Transportmodell, die beschreiben, wie die Aktomyosin-Kontraktion in eine Bewegung der Zelle umgesetzt werden kann.

Das Kontraktionsmodell entspricht der ursprünglichen Beschreibung des Migrations-zyklusses für Fibroblasten-ähnliche Zellen (Sheetz et al. 1998). Die Zellen kontrahieren symmetrisch und die Vorwärtsbewegung erfolgt durch eine starke Adhäsion an der Front und eine schwache Adhäsion am Zellende (Mitchison und Cramer 1996). Dieses Modell wäre eine Erklärung für die beobachtete Adhäsionsveränderung beim Übergang der L929-Fibroblasten von der nichtpolarisierten in die polarisierte Form. Die Zellen verstärkten die Adhäsion an der Front und verringerten die Adhäsion im Bereich des Zellkörpers bzw. des Zellausläufers. Die beobachteten Aktinfasern, die vom Zentrum der Zelle bis nach hinten in den Zellausläufer gespannt waren, müssten dann dem Modell zufolge symmetrisch kontrahieren und die Kraft zur Vorwärtsbewegung der Zelle entwickeln. Eine Nettobewegung wird durch eine asymmetrische Verteilung der Adhäsionstärke, wie in Abbildung 15 bei L929-Fibroblasten beobachtet, erreicht. Die geeignete molekulare Struktur für diese Kontraktion ist die Aktin-Stressfasern, deren Filamente eine alternierende Polarität besitzen (Small 1988).

Im Gegensatz dazu geht das Transportmodell davon aus, dass die Zelle direkt vom Myosin entlang der Aktinfasern nach vorne transportiert wird. Dafür müssen die Aktinfasern einheitlich orientiert sein, wie es z. B. in Herzfibroblasten beschrieben wurde, in denen die Orientierung der Fasern zur Front hin immer homogener wurde (Cramer 1997). Ein solches Modell kann mit dem Adhäsionsmuster der riefenbildenden
C2C12-Zellen in Einklang gebracht werden. Das kontinuierliche Vorschieben und Verlängern der Riefen spricht für einen direkten kontinuierlichen Transport der Zellen über das substratnahe Aktin. Das Aktinzytoskelett dient beim Transportmodell als ortsfester Untergrund über den die Zelle transportiert wird. Die Beobachtung, dass das substratnahe Aktin in C2C12-Zellen parallel zum Substrat ausgerichtet ist und planar in der Zelle liegt, ist ebenfalls mit dieser Modelvorstellung vereinbar.

↓101

Auf Grund der Ähnlichkeiten im Adhäsionsmuster ist auch bei den 3T3-Fibroblasten die Zuordnung zum Transportmodell bezüglich der Migration zu erwarten. Dem widerspricht allerdings die Tatsache, dass bei Kompetitionsexperimenten mit RGD festgestellt wurde, dass der Verlust der Adhäsion am Zellende keine Auswirkung auf die Migration hat, aber beim Verlust der Adhäsion an der Zellfront die Zelle Ausbreitung und Polarisation verliert (Munevar et al. 2001b). Diese Experimente deuten auf eine asymmetrische Adhäsionsstärke hin, wie es beim Kontraktionsmechanismus zu finden ist. Allerdings wurden diese Experimente auf Kollagen I-beschichteten Polyacrylamidsubstraten durchgeführt. Wie in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, hat die Beschaffenheit der Substratoberfläche großen Einfluss auf die Adhäsionsmuster (s. Abbildung 27) und eventuell auch auf den verwendeten Migrationsmechanismus. Zudem ist bei den in der vorliegenden Arbeit untersuchten 3T3-Zellen keine klassische Migrationsmorphologie zu erkennen, so dass eine direkte Vergleichbarkeit mit den Kompetitionsexperimenten schwierig ist. Denkbar sind auch Mischformen zwischen den beiden Modellen. Aufschluss über die den Adhäsionsmustern zu Grunde liegenden Migrationsmechanismen könnte die Untersuchung der Aktinorientierung geben, die mit Hilfe der Ausrichtung der Myosinköpfe bestimmt werden könnte.

Der Vergleich der Adhäsionsmuster mit den RC-Zeitrafferaufnahmen zeigt einen Unterschied im Migrationsverhalten zwischen den beiden Zelltypen, die ein riefenförmiges Adhäsionsmuster zeigen, und den L929-Fibroblasten mit ihrem punktförmigen Adhäsionsmuster (Abbildung 10). L929-Fibroblasten wanderten individuell und vermieden jeglichen Kontakt zu benachbarten Zellen. Im Einzelfall führte das dazu, dass die Zellen sich auswichen, wenn sie aufeinander trafen und nach einer Zellteilung in entgegen gesetzte Richtungen liefen. Dieses Verhalten blieb bis zum Erreichen der vollständigen Konfluenz erhalten. Im Gegensatz dazu bildeten C2C12- und 3T3-Zellen relativ zügig kleine Gruppen und hielten den Kontakt zu Nachbarzellen aufrecht. Im Zusammenhang mit der Migration führte das dazu, dass sich Zellen parallel bewegten, oder Spannungen auftraten, wenn die Zellen einer Gruppe in unterschiedliche Richtungen migrierten. Man hat den Eindruck, dass es sich um eine schiebende / ziehende und kontinuierliche Bewegungsform handelt wobei die Zellen sehr stark ausgebreitet und damit recht flach waren. Im Gegensatz dazu schienen die L929-Fibroblasten sich ruckartiger vorwärts zu bewegen und nicht so flach auf dem Substrat ausgebreitet zu sein.

Die Zuordnung der unterschiedlichen Migrationsverhalten zu einem der beiden Translokationsmodellen ist hier spekulativ. Zellen mit riefenförmigem Adhäsionsmuster weisen auch bzg. ihres Migrationsverhaltens Gemeinsamkeiten auf (tendieren zur Bildung von Zellverbänden), wohingegen die L929-Fibroblasten mit ihrem punktfömigen Adhäsionsmuster auch bei der Migration eine Sonderrolle einnahmen.

6.4 Entstehung von Zellspuren

↓102

Bei der Betrachtung der Adhäsionsmusterdynamik der L929-Fibroblasten fiel auf, dass vereinzelte Punkte aus dem Muster der nichtpolarisierten Zelle auch in der polarisierten Form erhalten blieben. Diese Punkte befanden sich im Bereich des Zellkörpers bzw. des Zellausläufers. Die Tatsache, dass Adhäsionspunkte in nichtmigrierenden
L929-Fibroblasten über einen langen Zeitraum stabil bleiben können, ist bereits beobachtet worden (Geggier und Fuhr 1999). Interessant war hier die Feststellung, dass ein Teil der Adhäsionen auch erhalten blieb, wenn die Zelle polarisiert wurde und zu migrieren begann. Dabei könnte es sich um Adhäsionspunkte handeln, die von der Zelle nicht mehr gelöst werden können und daher auf der Oberfläche zurückbleiben (Bard und Hay 1975; Chen 1981a; Chen 1981b). Es konnte gezeigt werden, dass diese stabilen Adhäsionspunkte für die Entstehung von Zellspuren von besonderer Bedeutung sind.

6.4.1  Entstehung der Verzweigungen in L929-Zellen

Es zeigte sich, dass Adhäsionspunkte in L929-Fibroblasten, die eine Zeit ortsfest auf dem Substrat adhärierten, als Startpunkte der Zellspuren zurückblieben und während der Zellspurbildung kaum verändert wurden (Abbildung 20 und Abbildung 22).

Dabei bestimmte das Muster der stabilen Adhäsionspunkte die Morphologie der Zellspur. Die Verbindungen zwischen den einzelnen Adhäsionspunkten bildeten die Linienelemente der Zellspur, die Adhäsionspunkte die Verzweigungen. In diesem Zusammenhang ist auch die bei der ursprünglichen Beschreibung der Zellspuren gefundene Beobachtung zu erklären, dass der Bereich zu Beginn der Spur immer den größten Verzweigungsgrad aufweist (Fuhr et al. 1998).

↓103

Bevor Zellen anfangen zu migrieren, müssen sie für eine gewisse Zeit auf einer Stelle adhäriert haben. In dieser Zeit sind mehr oder weniger viele stabile Adhäsionen entstanden, die von der Zelle nicht mehr gelöst werden. Ein größerer Anteil an stabilen Adhäsionen müsste somit, zu einem höheren Verzweigungsgrad der Zellspur führen. Während der Migration ist die Anzahl der festen Adhäsionen geringer, so dass der Verzweigungsgrad der Zellspur kleiner wird. Der von Richter et al. (2000) gefundene Zusammenhang zwischen der Geschwindigkeit der migrierenden Zelle und dem Verzweigungsgrad der Spur lässt sich mit der hier gemachten Beobachtung erklären.

Die in Abbildung 22 entstandene Zellspur entspricht genau diesen Prinzipien. Im Adhäsionsmuster der Zelle ist in der oberen Ecke ein kleiner Bereich zu sehen, in dem keine Adhäsionspunkte zu erkennen sind (B, weißer Pfeil). In diesem Teil ist später bei der Zellspur auch keine Verzweigung zu sehen. Diese Stelle wird nur von Linienelementen überbrückt. Ansonsten lassen sich die Adhäsionspunkte als Verzweigungspunkte in der fertigen Spur wiederfinden.

Interessanterweise sind, nachdem die Zelle ihre ursprüngliche Adhäsionsposition verlassen hat, zunächst nur die Verzweigungspunkte zu erkennen. Die verbindenden Linienelemente sind erst ungefähr eine Stunde später zu sehen und nehmen dann kontinuierlich an Intensität zu. Bei dieser Beobachtung handelt es sich nicht um ein Artefakt, welches beispielsweise durch eine Zunahme der Beleuchtungsintensität der Lampe verursacht wird. In diesem Falle müsste die lokale Signaländerung in allen Bereichen der Zellspur homogen sein. Das ist hier nicht der Fall, so dass die Intensitätszunahme auf einen anderen Effekt zurückgeführt werden muss (Abbildung 23). Möglich wäre eine Änderung des Farbstoffsgehalts in den Spuren oder eine Zunahme der Fluoreszenz des vorhandenen Farbstoffs. In diesem Experiment handelte es sich um DsRed-transfizierte Zellen. Daher kann eine Zunahme an Fluorophoren ausgeschlossen werden, sobald der Zellkörper und damit die Proteinsynthesemaschinerie außerhalb des Diffusionsbereichs lokalisiert oder von der Zellspur getrennt sind. Eine Zunahme der Quantenausbeute ist ebenso nicht möglich. Ein kontinuierliches Absinken der Spuren in das TIRF-Anregungsfeld stellt somit die wahrscheinlichste Lösung für die Intensitätszunahme dar. Diese Beobachtung wurde in ähnlicher Form mit IR-Mikroskopie bereits früher gemacht (Richter et al. 2000). Als Erklärung wurde von den Autoren ebenfalls vorgeschlagen, dass die Spuren sich zuerst noch außerhalb des anregbaren Bereiches befanden und anschließend absanken.

↓104

Bei der quantitativen Auswertung wurde festgestellt, dass nicht nur die Spuren, sondern auch die Adhäsionspunkte an Intensität zunehmen, also in Richtung des Substrats absinken. Allerdings ist in der Literatur beschrieben, dass auch der Abstand von Fokalen Adhäsionen (FA) zum Substrat noch 10-20 Nanometer beträgt (Zamir et al. 2000). Würde die Struktur, die diesen Abstand stabilisiert, kollabieren, müssten die FA näher an die Oberfläche gelangen und im TIRF-Feld heller fluoreszieren. Interessant ist, dass der Effekt bei den Linienelementen signifikant größer ist, so dass diese Tatsache hier ausführlicher dikutiert werden muss. Um ein solches Absinken zu ermöglichen, könnte die Zellspur vorher in einer Art Bogen vorgelegen haben, der dann an Spannung verliert und kollabiert.

Die Lage des Aktinzytoskeletts in L929- Zellen lässt ein solches Szenario zu.
Abbildung 12 zeigt, dass die Stressfasern, die das Zellzentrum mit dem Zellende verbinden, normalerweise in Bögen und damit außerhalb des TIRF-Feldes liegen. Bei der Erstbeschreibung der Zellspuren wurde je nach Alter der Spuren F-Aktin oder G-Aktin nachgewiesen (Fuhr et al. 1998). Im Rahmen dieser Arbeit konnte zusätzlich die Entstehung einer Zellspur von einer GFP-Aktin transfizierten C2C12-Zelle beobachtet werden (Abbildung 26). Dabei wurde zwischen zytosolischer Färbung und dem Aktinbild kein Unterschied festgestellt, so dass davon ausgegangen werden kann, dass auch die Zellspuren der anderen Zelllinien Aktin enthalten und die Bilder den mit zytosolischer Färbung aufgenommenen entsprechen. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die Linienelemente von Zellspuren zwischen zwei Verzweigungspunkten mittels einer
AFM-Spitze verschoben werden können (Westphal et al. 2004). Es wäre also möglich, das Zellspuren von L929-Zellen auf Grund der Lage des Aktinzytoskeletts in kleinen Bogen angeordnet sind.

Zu klären ist, warum diese Bögen nach einer gewissen Zeitspanne absinken. Dabei sind folgende Punkte zu bedenken. Die Linienelemente tauchen alle gemeinsam im TIRF-Feld auf, unabhängig von ihrer räumlichen Entfernung zueinander oder ihrem Abstand zur Zelle. Würde dieses Absinken mit dem Alterungsprozess der Spuren in Zusammenhang stehen, wie z. B. bei einem Zusammenbruch des F-Aktinskeletts, sollte dieser Prozess einer zeitlichen Chronologie gehorchen. Das ist allerdings nicht der Fall, da hier die linke Seite des Adhäsionsmusters früher von der Zelle verlassen wird als die rechte
(Abbildung 22, E, F). Zudem ist das F-Aktin in der C2C12-Spur deutlich länger stabil (Abbildung 26), als die Spur der L929-Zellen für das Absinken benötigt. Eine Trennung des F-Aktins von der Fokalen Adhäsion (FA) kommt ebenfalls nicht in Frage, da auch für dieses Szenario gilt, dass es bei älteren Bereichen eher einsetzen müsste. Ein aktiver Prozess ist ebenso unwahrscheinlich, da es sich bei der gesamten Zellspurentstehung offenbar um einen passiven Prozess handelt. Um diese Frage abschließend zu beantworten, müsste eine parallele Zeitrafferaufnahme mit TIRF- und Epifluoreszenzbeleuchtung von einer Zellspurentstehung durchgeführt werden. Die dafür nötigen technischen Voraussetzungen waren allerdings in der vorliegenden Arbeit nicht gegeben.

6.4.2 Entstehung der parallelen Zellspuren in C2C12-und 3T3-Zellen

↓105

Zellspuren, die aus dem punktförmigen Adhäsionsmuster der L929-Fibroblasten entstanden, sind reich verzweigt. Ganz anders stellte sich die Morphologie der Zellspuren von den beiden Zelllinien dar, die ein riefenförmiges Adhäsionsmuster aufwiesen. Zellspuren von C2C12-Muskelzellen und 3T3-Fibroblasten bestehen aus mehreren parallelen, unverzweigten einzelnen Linienelementen (Abbildung 21). Überträgt man nun den Mechanismus der Zellspurentstehung von L929-Fibroblasten so erwartet man, dass die Zellspuren bei C2C12- und 3T3-Zellen aus den Riefen entstehen. Das konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden.

Man könnte sich die Entstehung der Zellspuren von C2C12- und 3T3-Zellen wie folgt vorstellen. Wenn die Zellmembran von den Zellen zurückgezogen wird und die FA an den Enden der Riefen nicht gelöst werden, bildet sich um die Aktinfilamente herum ein Membranschlauch. Dieser wird immer weiter ausgezogen und irgendwann von der Zelle getrennt. Dabei muss die Zellmembran noch eine gewisse Zeitspanne intakt sein, da die Zellspuren mit Calcein gefärbt werden können (s. Abbildung 21, Abschnitt 4.2.3.1).

Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass bei der Zellspurentstehung eine Korrelation zwischen der Morphologie der Zellspur, der Zelladhäsion, und dem Zellskelett, das ja der hauptsächliche Aktor bei der Migration ist, besteht. Am Beispiel der
C2C12-Zelle aus Abbildung 26 erkennt man deutlich, wie die parallel ausgerichtete, wenig verzweigte Zellspur direkt aus den parallel angeordneten Aktinfasern des Zellskellets hervorgeht, deren Anordnung auch in den riefenförmigen Adhäsionsmuster wieder zu finden ist (Abbildung 11).

6.5 Modifikation der Substratoberfläche

↓106

In einem Organismus ist die unmittelbare Umgebung der meisten Zellen nicht homogen sondern auf hochkomplexe Weise strukturiert (Abrams et al. 2000; Wezemann 1998). Diese Umgebung zusammen mit löslichen Faktoren bestimmt die vollständige Entwicklungsgeschichte der Zelle. Es liegt nahe, diese Tatsache zu nutzten und Oberflächen technologisch so zu modifizieren, dass definierte Reaktionen der Zellen ausgelöst werden können. Dafür stehen grundsätzlich zwei Möglichkeiten zur Verfügung, biochemische Modifikationen, die direkt die Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung ansprechen, oder topographische Veränderungen. Die interessante Frage, wie die intrazellulären Signalkaskaden von Oberflächenmodifikationen beeinflusst werden, ist überraschenderweise bis jetzt in der Literatur kaum diskutiert. Im Rahmen dieser Arbeit sollte jedoch das Augenmerk auf der direkten Beeinflussung der Zellmigration und Zelladhäsion durch Oberflächeneigenschaften liegen. Dabei war besonders deren technische Verwertung im Hinblick auf eine effiziente Zellspurerzeugung zu berücksichtigen.

Biochemisch modifizierte Oberflächen sind relativ einfach herzustellen, beispielsweise durch die Beschichtung der Oberfläche mit Proteinen der ECM. Ihr Einfluss auf das Verhalten der Zelle ist bereits in einer Reihe von Arbeiten untersucht worden Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine solche Modifikation des Substrats durchgeführt, um Einfluss auf die Zellspurbildung auszuüben. Die Strukturierung biochemisch modifizierter Oberflächen ist beispielsweise durch „Micro-Contact-Printing“ möglich. Dabei können die Strukturparameter in weiten Bereichen variiert werden (Lehnert et al. 2004). Technisch wesentlich komplizierter ist die topographische Strukturierung von Oberflächen. Allerdings birgt dieser Ansatz einige wichtige Vorteile, so dass das Augenmerk der vorliegenden Arbeit auf den topographischen Strukturen lag. Mithilfe topographischer Modifikation kann man einer Oberfläche beispielsweise relativ einfach einen Richtungssinn einprägen. Ein korrespondierender biochemischer Ansatz wäre nur mithilfe kompliziert zu erzeugender Gradienten möglich und ist technisch noch nicht ausgereift. Eine topographische Modifikation des Substrats eröffnet weiterhin einen praktikablen Zugang zum interessanten Größenbereich zwischen 100 Nanometern und 5 Mikrometern, der beim Aufbau der intrazellulären Strukturen eine wichtige Rolle spielt. Zudem bieten die Parameter topographischer Strukturen wie Höhe, Aspektverhältnis oder Materialkontrast ein breites Spektrum an experimentellen Variationsmöglichkeiten.

6.5.1  Veränderung der Zellspurmorphologie bei beschichteten Substraten

Für die biotechnologische Nutzung von Zellspuren ist es wichtig, aktiv auf die Parameter Einfluss nehmen zu können, welche Qualität und Quantität der Zellspur bestimmen. Durch die biochemische Modifikation der Substratoberfläche mittels Fibronektin (FN-) Beschichtung konnte die Zellspurmorphologie verändert werden.

↓107

Bei der Adhäsion auf FN entsprachen die riefenförmigen Adhäsionsmuster der entsprechenden Zellen denen auf unbeschichteten Glassubstraten. Das Adhäsionsmuster von L929-Fibroblasten hingegen war jetzt nicht mehr punktförmig wie auf Glas, sondern bestand auf FN ebenfalls aus Riefen. Da ein Zusammenhang zwischen Adhäsionsmuster und der Organisation von Aktinzytoskelett und Zellspurmorphologie besteht, musste für beide ebenfalls mit Änderungen durch die Oberflächenmodifikation gerechnet werden. Diese Erwartungen konnten bestätigt werden. Das Aktin war nun ebenso parallel entlang der ventralen Zellmembran angeordnet wie in den anderen Zelltypen mit riefenförmigem Adhäsionsmuster (Abbildung 28). Die beobachteten Spuren verliefen dem entsprechend parallel und unverzweigt. (Abbildung 27).

Insgesamt hinterließen die L929-Fibroblasten auf FN zusätzlich deutlich mehr Spuren. Das könnte durch eine verstärkte Adhäsion erklärt werden, die durch eine Erhöhung der Ligandenanzahl im Substrat aufgrund der FN-Beschichtung verursacht wurde (Palecek et al. 1997). Zudem erscheint die Gesamtzelle im TIRF-Bild deutlich heller, was darauf zurückgeführt wird, dass sie sich näher am Substrat befindet. Die Tatsache, dass die Zellspurbildung auf einem physiologischen Substrat verstärkt wird, bestärkt die Annahme, dass es sich bei Zellspuren nicht um ein Artefakt der Zellkultur handelt.

Diese Befunde zeigen, dass unter dem Einsatz verschiedener Oberflächen die Morphologie von Zellspuren beeinflussbar ist. Zusätzlich sollte eine Verstärkung der Zell-Substrat-Haftung die Gesamtzahl der Spuren deutlich erhöhen. Allerdings ist dabei zu beachten, dass sich die Erhöhung der Zell-Substrat-Haftung negativ auf die Migrationsgeschwindigkeit auswirkt (Palecek et al. 1997). Diese gegensätzlichen Auswirkungen der Hafteigenschaft von Oberflächen müssen bei der technischen Nutzung von Zellspuren für jeden Anwendungsfall optimiert werden. Im Hinblick auf eine spätere Kommerzialisierung können beispielsweise kurze Laufzeiten der Zellen wichtig werden. Die kontrollierte Ablage von größeren Mengen an Zellspuren wäre hingegen beispielsweise unter dem Ansatz einer weiterführenden Analytik interessant, da die Übereinstimmung der Oberflächenmarker von Zellspur und Zelle bisher nur exemplarisch gezeigt wurde (Zimmermann et al. 2001). „High Performance Liquid Chromatography“ (HPLC) oder andere chromatographische Analyseverfahren wie auch spektroskopische Methoden würden eine umfassende Untersuchung der genauen Zusammensetzung der Zellspuren ermöglichen. Ebenso ist zu klären, inwieweit sich Änderungen zellulärer Zustände wie z. B. Differenzierung oder Malignität auf die Zusammensetzung der Zellspur auswirken.

6.5.2 Einfluss topographisch strukturierter Oberflächen

↓108

Die topographische Strukturierung von Oberflächen kann ebenfalls das Zellverhalten verändern. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Metallstrukturen (Gold oder Titan) auf Glassubstraten untersucht, deren Größe oberhalb der makromolekularen und unterhalb der zellulären Ebene gewählt wurde. Dieser Größenbereich ist besonders interessant, da sich in diesem wichtige Organisationsstrukturen der Zelle ausbilden. Beispiele hierfür aus dem Bereich der Zelladhäsion sind das „Integrinclustering“ im Nanometerbereich oder die Bildung von Adhäsionen im Bereich von einigen Mikrometern (Arnold et al. 2004; Zaidel-Bar et al. 2003; Zamir et al. 2000). In einem ersten Ansatz wurden zuerst verschiedene Motive von Strukturen auf ihren Einfluss auf das Zellverhalten untersucht. Eine Variation der Strukturparameter besonders wirksamer Muster ist technologisch aufwändig und bleibt weiterführenden Arbeiten vorbehalten.

Bei Experimenten mit den strukturierten Substraten in dieser Größenordnung ließ sich feststellen, dass die strukturierten Bereiche von den Zellen bevorzugt besiedelt wurden (Abbildung 29), obwohl die Glasoberfläche nicht passiviert war. Der Effekt ist also auf das Vorhandensein der Struktur zurückzuführen. Für diese gesteigerte Attraktivität könnte es neben der rein topographischen Veränderung weitere Erklärungen geben. Der chemische Kontrast, der dadurch zu Stande kommt, dass Metallstrukturen (Gold oder Titan) auf eine Glasoberfläche aufgebracht wurden, stellt dabei die wahrscheinlichste Lösung dar. In der Literatur gibt es Beispiele dafür, dass Ladungsunterschiede zwischen zwei Oberflächen Einfluss auf die Zellen ausüben können. Möglicherweise wird die weniger negativ geladene Oberfläche der Struktur von den Zellen bevorzugt (Healy 1994). Dieser Effekt kann sich an den Strukturkanten noch verstärken. Dort stoßen in einem sehr schmalen Bereich die beiden Oberflächen aufeinander.

Die Strukturhöhe ist im Vergleich zur Strukturbreite nur sehr gering. Umso erstaunlicher ist, dass die Zellen diese kleinen Unterschiede wahrnehmen und darauf reagieren. Abbildung 36 zeigt das Aspektverhältnis der Strukturen und die Schärfe der Kanten maßstabsgetreu.

↓109

Abbildung 36 : Maßstabsgetreue Darstellung des Aspektverhältnisses der Strukturen und der Steilheit der Kanten.

Bei der Adhäsion der Zellen auf den Strukturen konnte beobachtet werden, dass sich die Zellen an die vorgegebene Form anpassen. Dabei besaßen die Fibroblasten eine spindelförmige Morphologie auf den Linienstrukturen und eine trichterförmige auf den Strukturfeldern (Abbildung 29 A, C). Mit einer topographischen Strukturierung der Oberfläche im Maßstab einer Einzelzelle wurde bereits früher gezeigt, dass Veränderungen der Zellmorphologie möglich sind (Jungbauer et al. 2004). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass auch Strukturen im subzellulären Bereich solche Effekte auf Zellen ausüben können. Im Hinblick auf die geringe Höhe der hier verwendeten Strukturen ist diese Beobachtung sehr interessant. Die bevorzugte Adhäsion der Zellen auf den Strukturen könnte eventuell in Zukunft das gezielte Platzieren von Zellen vereinfachen.

Des Weiteren wurden Winkelstrukturen und eine radförmige Anordnung von Strukturpunkten auf ihren Einfluss getestet (Abbildung 30). Dabei konnten Veränderungen der Anordnung des Zytoskeletts der Zelle beobachtet werden. Mit Hilfe der Winkelstrukturen wurde das Aktinzytoskelett der Zellen durchgängig parallel ausgerichtet. Die Radstruktur führte zu einer kreisförmigen Ausrichtung der Zellen. Hier endete das Aktinzytoskelett vermehrt auf den Strukturen. Die gleichmäßige parallele Anordnung des Aktinzytoskeletts auf den Winkelstrukturen ist beachtlich. Bei den Winkelstrukturen handelt es sich um gerichtete Strukturen, die eine eindeutige Vorzugsrichtung aufweisen (Abbildung 9). Es ist zwar nicht eindeutig zu erkennen, ob diese Richtung von den Zellen erkannt worden ist, aber die Anordnung der Aktinfasern erfolgte entlang der Winkelpfeile. Offensichtlich hat die Symmetrie der Struktur Einfluss auf die Anordnung des Zytoskeletts der Zellen. In der Literatur ist die Reaktion von Zellen auf eine symmetrische Anordnung von adhäsiven Punkten aus FN auf einer Oberfläche beschrieben. Bei diesen Experimenten konnte gezeigt werden, dass das Aktinzytoskelett zwischen den FN-Punkten aufgespannt war (Lehnert et al. 2004). Auf Grund der gleichmäßigen Anordnung der FN-Punkte wurde mit dieser Anordnung den Zellen allerdings keinerlei Symmetrie aufgeprägt.

↓110

Morphologische Änderungen bei Zellen können sich also bis in die Anordnung der Zytoskelettbestandteile fortpflanzen. Das konnte sowohl bei biochemisch modifizierten (Abbildung 28) als auch bei topographisch strukturierten Oberflächen (Abbildung 30) beobachtet werden. Somit bleibt festzuhalten, dass sich die Veränderung der Substratoberflächen bis in das Grundgerüst der Zelle auswirken kann. Diese Erkenntnisse sind beispielsweise auch im Hinblick auf das „Tissue Engineering“ und das Feld der Implantationschirugie interessant, bei denen die Interaktion der Zellen mit artifiziellen Oberflächen eine große Rolle spielt.

6.6 Bildung von Aktinsternen

Bei den Untersuchungen der Dynamik des substratnahen Aktinzytoskeletts konnten in C2C12-Muskelzellen und L929-Fibroblasten spontan wolken- und ringförmige Aktinakkumulationen verschiedener Größen und Formen mit einer Lebensdauer von unter 15 Minuten beobachtet werden. Ein Teil dieser Akkumulationen kondesierte in L929-Zellen zu sternförmigen Aktinstrukturen. Die Größe der Aktinsterne entsprach dabei der Größe der vorherigen Aktinwolke und schwankte zwischen 5 und 20 Mikrometern. Die Aktinsterne bestanden aus einem Aktinzentrum und mehreren sternförmig angeordneten Strahlen und waren unterschiedlich lang stabil.

Zur Bildung von Aktinsternen aus Aktinwolken muss G-Aktin unter Energieaufwändung zu Fasern polymerisiert werden. Da schwer vorstellbar ist, dass sich ein zweckloser Energie verbrauchender Prozess evolutionär durchsetzen kann, muss man davon ausgehen, dass Aktinsterne eine physiologische Bedeutung haben. Dabei ist interessant, dass nicht jede Wolke zu einem Stern umgeformt wird.

↓111

Auf Grund der Tatsache, dass die Akkumulation des Aktins zu Wolken innerhalb von 15 Minuten geschah, kommt für diesen Prozess keine Neusynthese von Aktin in Frage. Zusätzlich spricht auch die Verarmung der Umgebung an Aktin (Abbildung 31) dafür, dass es sich um einen akkumulatorischen Prozess handelt. Wie dieser Prozess allerdings gesteuert wird, war im Rahmen dieser Arbeit nicht zu klären. Ähnliche Fragen wirft auch die Kondensation der Wolke zum Stern auf. Bei der Bildung des ersten Sterns
(Abbildung 31) bildete sich eine Ringstruktur aus, die dann immer kleiner wurde und das Zentrum des Sternes bildete. Bei der Bildung des zweiten Sterns wurde keine Ringstruktur mehr beobachtet, sondern das Aktin war gleich im Zentrum der Wolke lokalisiert (Abbildung 32). Bei der Auswertung dieser Aufnahmen muss man beachten, dass mittels der TIRF-Mikroskopie nur ein schmaler substratnaher Bereich betrachtet wird. Daher könnte die beobachtete Helligkeitszunahme grundsätzlich auch auf ein Artefakt zurückgeführt werden. Wenn sich beispielsweise die Zellmembran absenken und dem Substrat nähern würde, würde die Intensität ebenfalls zunehmen. Denkbar wäre z. B. die Bildung eines Adhäsionskomplexes, der dann die Membran nach unten an das Substrat zöge. Das würde allerdings in der Konsequenz bedeuten, dass die beobachteten Aktinfasern sternförmig in einem Adhäsionskomplex endeten. Eine solche Struktur ist bisher noch nicht beschrieben worden. Zusätzlich müssten bei der sich verkleinernden Ringstruktur in Abbildung 31 die Adhäsionen aufeinander zuwandern. Dagegen beruhen die in der Literatur beschriebenen Wanderungsprozesse von Adhäsionskomplexen auf der Aktomyosin-Kontraktion und müssten die Adhäsionen auseinander ziehen (Zamir et al. 2000).

In Abbildung 31 wurde außerdem gezeigt, wie ein gebildeter Stern langsam wieder verschwand. Dieser Prozess kann entweder dadurch verursacht werden, dass die Struktur sich auflöst oder den mit TIRF anregbaren Bereich verlässt. Der Stern könnte sich planar und gleichmäßig parallel nach oben bewegen, beispielsweise verursacht durch eine in höheren Ebenen der Zelle gelegen Struktur. Dafür müsste allerdings der Stern gleichmäßig dunkler werden. Da einzelne Fasern beobachtet werden konnten, die verkürzt wurden oder direkt verschwanden ist dies nicht der Fall. Auf Grund der geringen Anregungstiefe würde der Aktinnstern auch homogen dunkler werden, wenn der Stern asymmetrisch das TIRF-Feld verlassen würde. Somit kann man davon ausgehen, dass der Aktinstern abgebaut wird. Es bleibt zu bedenken, dass keine Aussagen darüber gemacht werden können, ob es in höheren Bereichen der Zelle Strukturen gibt, die mit der Bildung von Aktinwolken oder Sternen im Zusammenhang stehen.

Bemerkenswert ist die Tatsache, dass die Sterne bis zu 7 Stunden stabil sein konnten, auch wenn die eigentlichen Raten des Aktin „turn-over“ in den Fasern im Minutenmaßstab liegen (Wang 1985). In diesem Zusammenhang kann die Beobachtung von Bedeutung sein, dass sich die Sterne aufeinander zu (Abbildung 33) oder in Richtung der Membran (Abbildung 32) durch das Zytosol der Zelle bewegten. Da dort offensichtlich Kräfte wirken liegt die Überlegung nahe, dass die Funktion der Sterne etwas mit Kraftübertragung zu tun hat. Durch die radiale Anordnung der Fasern wäre eine Art Drehkreuzfunktion denkbar, mit der Kräfte in andere Richtungen als nur linear weiter- bzw. umgeleitet werden könnten.

↓112

Der Vergleich der in der vorliegenden Arbeit beobachteten Aktinsterne mit bereits beschriebenen sternförmigen Aktinstrukturen lässt auch keine Schlüsse auf die Bedeutung der Aktinsterne zu. Deutliche kleinere Aktinsterne wurden im Bereich zwischen Lamellipodium und Kern von Zellen beschrieben (Small 1998). Allerdings wurde diesen Strukturen keine weitere Bedeutung zugemessen. Eine größere sternförmige Aktinstruktur entsteht nach der Stimulierung von MDCK-Zellen mit 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Acetat (Imamura et al. 1998). Diese Sterne ähneln denen, die im Rahmen dieser Arbeit in migrierenden Fibroblasten beobachtet wurden (Abbildung 11). Im Bereich des Kerns befindet sich eine sternförmige Aktinstruktur, deren Strahlen bei migrierenden Zellen leicht in Richtung der Zellfront reichen. Allerdings handelt es sich bei der in der Literatur beschriebenen Beobachtung um ein stimuliertes System, bei dem die sternförmige Anordnung nicht spontan auftrat und die daher als reine Reaktion der Zelle angesehen werden muss. In der vorliegenden Arbeit hingegen trat die Bildung von Aktinsternen immer spontan auf und ist daher dem physiologischen Verhalten der Zelle zuzuordnen. Interessanter ist hingegen die Beobachtung, dass in In-vitro-Kultursystemen mit zytosolischen Extrakten unter Bedingungen, die die Filopodienbildung begünstigen, ebenfalls sternförmige Aktinstrukturen entstehen (Vignjevic et al. 2003). Allerdings waren die in der vorliegenden Arbeit beobachteten Aktinsterne nicht in der Zellperipherie lokalisiert und konnten aufeinander zu wandern. Diese Beobachtungen lassen eher auf Stressfasern, als auf eine Filopodien-ähnliche Struktur schließen (Abbildung 33).

Wolkenförmige Aktinakkumulationen sind bisher noch nicht beschrieben worden. Allerdings wurden bereits konzentrisch wachsende Aktinringe beobachtet, die ebenfalls als Aktinwolken bezeichnet wurden (Ballestrem et al. 1998). Die dort gefundenen Strukturen ähneln den Ringen, die in der vorliegenden Arbeit in C2C12-Muskelzellen beobachtet wurden. Es fällt auf, dass in beiden Fällen das Aktin leicht granulär erscheint, was diese Akkumulationen von den in L929-Zellen gefundenen Strukturen unterscheidet. Es bleibt also festzuhalten, dass die hier gefundenen wolken- und sternförmigen Aktinstrukturen mit keiner der in der Literatur beschriebenen Strukturen identisch sind und es sich um bisher noch nicht beobachtete Phänomene handelt.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
04.09.2007