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1.  EINLEITUNG

Die indolenten B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphome (B-Zell-NHL) sind durch maligne Proliferation reifer lymphoider Zellen charakterisiert und weisen bei der Diagnose vorwiegend eine nodale Lokalisation auf oder präsentieren sich als leukämischer Prozess (Chronische lymphatische Leukämie).

Die schnelle durchflusszytometrische Analyse und die gegenwärtige Vielfalt der spezifischen monoklonalen Antikörper (MAK) erlauben die Diagnosestellung am peripheren Blut oder Knochenmark und die präzise Subtypisierung der einzelnen Erkrankungen innerhalb der Gruppe, was prognostische und therapeutische Relevanz hat (1).

Es wurden standardisierte Protokolle und Consensus-Bestimmungskriterien für die immunphänotypische Differenzierung dieser Erkrankungen entwickelt, die auf der spezifischen Expression und/oder Koexpression bestimmter Zellmembranantigene beruhen (2-4). Eine solche vereinfachte Klassifikation ist in Tabelle 1.1 präsentiert (5).

Tabelle 1.1:Immunphänotypische Charakteristika der B-Zell-lymphoproliferativen Erkrankungen.

Antigen

CLL

PLL

HCL

FL

MCL

LP-IC

PCL

sIg

+/-w

+s

+s

+s

+s

+s

-

CD5

+

-/+w

-

-

+

+/-

-

CD10

-

-

-

+/-

-

-

-/+

CD11c

+/-w

-/+

+s

-

-

-/+

-

CD19

+

+

+

+

+

+

-

CD20

+

+

+

+

+

+

-

CD23

+

-/+

-

-/+

-

-/+

-

CD38

-

-

-/+w

-/+w

-

+/-

+s

CD103

-

-

+s

-

-

-

-

FMC7

-/+w

+

+

+

+

-/+

-

- Antigen nicht exprimiert; -/+ Antigen exprimiert bei weniger als 50% der Patienten; +/- Antigen exprimiert bei der Mehrheit der Patienten; + Antigen exprimiert; w schwache Expression; s starke Expression; FL Follikuläres Lymphoma; HCL Haar-Zell-Leukämie; LP-IC lymphoplasmozytäres Immunocytom; MCL Mantel-Zell-Lymphom; PCL Plasma-Zell Leukämie; PLL Prolymphozyten-Leukämie.


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Es existiert eine Überlappung zwischen den Immunphänotypen der verschiedenen nosologischen Entitäten dieser Gruppe bezüglich der Expression einzelner Antigene. Zum Beispiel wird CD5 bei CLL und MCL, Membran-Immunoglobuline (sIg), CD20 und CD19 bei allen lymphoproliferativen Erkrankungen, CD22 (in der Tabelle nicht dargestellt) und FMC7 bei den meisten dieser Lymphome exprimiert. Neben der Antigenexpression kann die Bestimmung der Expressionsintensität einzelner Antigene (sIg, CD20) als zusätzliches quantitatives Unterscheidungskriterium dienen (6).

Bei der relativ schwachen (dim) CD20-Expression wird in der Literatur ein Zusammenhang mit der Differenzierung typischer B-CLL im Gegensatz zu den anderen Non-CLL B-Zell-Lymphomen gesehen (7;8). Eine starke CD20-Fluoreszenzintensität wird mit atypischer morphologischer und klinischer Präsentation sowie dem zytogenetischen Befund einer Trisomie 12 als prognostisch ungünstiges Kriterium verbunden (3;9-11).

Die Expression eines anderen B-Zellmarkers, nämlich FMC7, wurde bei der B-CLL auch als eine Deviation von dem charakteristischen Phänotyp definiert (3;12-14) und damit auch als prognostisch ungünstiges Merkmal betrachtet (15-18). In allen diesen Studien wurden auch solche klinische Fälle als negativ bewertet, bei denen eine gewisse Fraktion der malignen Zellen, allerdings weniger als 30%, positiv für das FMC7-Antigen waren. Die fehlende FMC7-Expression wird als eines der wenigen immunphänotypischen Grundkriterien für die Differenzierung der typischen B-CLL in dem weit verwendeten Scoring-System der Londoner Royal Marsden Hospital-Gruppe empfohlen (s. Tab. 1.2).

Tabelle 1.2: Scoring System für die B-CLL* (19)

Zelloberflächenmarker

Punkte

1

0

sIg

schwach positiv

mäßig / stark positiv

CD5

positiv

negativ

CD23

positiv

negativ

FMC7

negativ

positiv

CD22

schwach positiv / negativ

mäßig / stark positiv

* Score von maximal 5 bis minimal 0 Punkte


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Der Name des Markers FMC7 ist eine Abkürzung von Flinders-Medical-Center, (Bedford Park, South Australia), wo der Antikörper entwickelt und 1981 erstmals beschrieben wurde (20). Dieser Antikörper bindet an ein von der B-Lymphozyten-Linie exprimiertes Antigen, welches noch nicht bis ins letzte Detail charakterisiert ist. Die gleiche Arbeitsgruppe hat das Antigen als ein Membran-Glykoprotein identifiziert, das Rezeptorfunktionen ausübt (21). Das Molekulargewicht des Antigens wurde auf 105 kDa geschätzt, wobei der Nachweis mittels Immunoblotting von der gleichen Arbeitsgruppe erbracht wurde (22). Veröffentlichungen anderer Arbeitsgruppen hierzu liegen nicht vor. Der Marker wird sowohl von einem Teil der normalen zirkulierenden B-Lymphozyten als auch bei den indolenten B-Zell-Erkrankungen exprimiert, wobei die Daten bezüglich des Anteils der FMC7-positiven peripheren polyklonalen B-Lymphozyten äußerst widersprüchlich sind. Diese sind einerseits als Minor-Fraktion in mehreren Publikationen beschrieben worden (23-25), andererseits hat man den Marker auf 50% der peripheren sIg-exprimierenden B-Zellen gefunden (26). In dem Übersichtsartikel der B-Zell-Sektion des V. Leucocyte Typing Workshops wurde dargestellt, dass 80 bis 100% der peripheren B-Lymphozyten mit dem FMC7-Antikörper reagieren (13).

Die mögliche Rolle des Antigens als Differenzierungsmerkmal oder Aktivierungsmarker wurde in Zusammenhang mit der Expression der B-Zellantigene CD22 und CD23 untersucht (22;27). Die erste Arbeitsgruppe, die eine klare Korrelation zwischen der Expression von CD20 und FMC7 auf der B-Zellpopulation, sowohl bei reaktiven Lymphozytosen, als auch bei neoplastischen Prozessen feststellte, hat die genaue Art des gegenseitigen Einflusses beider Epitope nicht näher erläutert (28). Andere Forscher beobachteten eine Reduktion der Bindung vom FMC7 bei gleichzeitiger Inkubation mit CD20-Antikörper (29).

Im Vergleich zum FMC7 ist das CD20-Antigen ausführlicher beschrieben. CD20 ist ein 33-37 kDa großes, nicht glykosiliertes, 297-Aminosäuren beinhaltendes, integrales Membran-Phosphoprotein, welches ausschließlich von der B-Lymphozytenreihe exprimiert wird. Die B-Zell-Differenzierung wird charakterisiert durch eine konstante CD20-Expression von den prä-B-Vorstufen bis zu Plasmazellen (30).

Abb. 1.1: Schematische Darstellung der CD20-Antigenstruktur (31)


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Die Aminosäurensequenz des Proteins und die molekulargenetische Sequenzierungs-Analyse der isolierten CD20-cDNA weist auf die Struktur und die Position des Moleküls auf der Zellmembran hin (31-33). Das Antigen hat zwei extensive intrazytoplasmatische Carboxy- und Amino-Termini (50% des Moleküls), vier hydrophobe Transmembranregionen (TMR 1-4), eine kurze und eine lange Schleife (35%) und nur eine relativ kurze extrazelluläre Domäne zwischen TMR3 und TMR4 (15%, s. Abb.1.1).

Die CD20-Epitope, die auf der relativ kurzen extrazellulären Domäne liegen, wurden zum ersten mal mit dem B1-MAK (Prototyp-Antikörper) identifiziert (34). Der CD20-Cluster wurde entsprechend beim „Leukocyte Typing Workshop II“ etabliert.

Die Bindung von MAK an CD20-Epitope moduliert die B-Zell-Proliferation und Differenzierung und beweist damit die Rolle des Moleküls als Transmembran-Signal-Transmitter. Diese Funktion wird der Aktivierung einer Reihe membran-subordinierter, intrazellulärer Kinasen (Phosphokinase C (PKC), Serin/Threonin-Kinasen Src-Familie: Lyn, Fyn, Lck), sowie nachgewiesenen intrazellulären Ca2+ Konzentrationsveränderungen zugeschrieben (35-40). Immunpräzipitationsexperimente und elektrophysiologische Untersuchungen legen nahe, dass der Ca2+-Influx durch Konformationsveränderungen des CD20-Moleküls, das größere Membran-Oligomer-Komplexe bilden kann, reguliert wird (41;42). Das Startereignis der CD20-Signalkaskade nach der Antikörper-Bindung ist die schnelle Umverteilung der CD20-Moleküle zu Plasma-Membran-Mikroinvagintionen (DIGS – detergent-insoluble glycolipid-enriched structures) (37). Diese Membran-Mikrodomänen, wie die bekannten "caveolae", sind reich an Tyrosin-Kinasen, ATP-asen, G-Protein-vebundenen Rezeptoren und GPI-linked Proteinen (43-[Seite 5↓]45). Durch Mutagenese- und Transfektionsexperimente haben Deans et al. nachgewiesen, dass die dynamische CD20-Translokation von der proximalen Membran-Sequenz des zytoplasmatischen Carboxy-Terminus des Moleküls abhängig ist. Dasselbe Segment kann auch einen Steuerungseffekt bei der von CD20-Antikörpern induzierten Assoziation mit anderen Membran-Proteinen ausüben und eine induzierende Rolle bei dem Oligomerisationsprozess des CD20-Moleküls spielen (46).

Sowohl die CD20-Antigenstruktur als auch die Eigenschaft, in Multimerform als Ionen-Kanal zu funktionieren, sind anderen Ionenkanalformationen ähnlich (47). Ihre Umverteilungsfähigkeit ist mit anderen Rezeptorstrukturen vergleichbar (Muscarin-Acetylcholin- und Bradykinin-Rezeptors, GPI-verbundene Proteine, hochaffiner IgE-Rezeptor-Fc ε RI β ) (48;49).

Die einheitliche, stabile und dichte Membran-Expression des CD20-Antigens während der B-Zell-Differenzierung und ihr Nachweis bei mehr als 90% der B-Zell-NHL machte das Molekül zum geeigneten Target der ersten zugelassenen Antikörpertherapie dieser Erkrankungen (50;51).

Rituximab (MabThera) ist ein gentechnisch hergestellter chimärer CD20-Antikörper mit einer variablen Maus-Region (Schwer- und Leichtkette) und einer konstanten humanen Region (IgG1-Schwer- und κ-Leichtkette (52).

Die Behandlung mit Rituximab verursacht eine unmittelbare B-Zell-Depletion durch antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) und komplementvermittelte Zytolyse (CDC) (51). Der prolongierte Antitumor-Effekt der Antikörperbindung kann zugleich einer Induktion intrinsischer Mechanismen der Apoptose zugeschrieben werden (53). Die Schlüsselmechanismen der CD20-induzierten Apoptose wurden von mehreren Arbeitsgruppen untersucht: eine Vielzahl von intrazellulären Transmittern, Enzymsystemen und Targetproteinen (Protein-Tyrosin-Kinasen Lck und Fyn, Caspase-3-Kaskade, Bcl-2-Familie-Mitglieder Bad, Bax-α und Bax-xL u.a.) sind Teil dieser Signalkaskade. Es ist nachgewiesen, dass die Rituximab-induzierte Apoptose von den gleichen intrazellulären Signalwegen wie der BCR-modulierte Zelltod abhängig ist (54).

[Seite 6↓]Ziele der vorliegenden Arbeit:

Rituximab wird in der Medizinischen Klinik mit Schwerpunkt Hämatologie/Onkologie, Campus Virchow Klinikum seit 1998 bei der Behandlung von Patienten mit B-NHL eingesetzt.

Die Fragestellungen der vorliegenden Arbeit sind:


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22.07.2004