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2.  MATERIAL und METHODEN

2.1. Material

2.1.1. Untersuchte Proben

In dieser Arbeit wurden Proben aus Patientenblut und humanen malignen B- und non-B-Zell-Linien bearbeitet. Die Blutzellen wurden einer durchflusszytometrischen Analyse unterzogen, um unter Rituximab-Therapie aufgetretene Veränderungen des Immunphänotyps zu erfassen. Für In-vitro-Blockierungsexperimente mit unkonjugierten CD20- und FMC7-Antikörpern, die Aktivierung mit PMA (phorbol12-myristate13-acetate) und für die Untersuchung der De-novo-CD20-und -FMC7-Expression nach Transfektion mit CD20-cDNA wurden permanente Zell-Linien eingesetzt.

2.1.2. Patienten

2.1.2.1. Charakteristika

In der vorliegenden Arbeit wurden 12 Patienten mit B-CLL und 10 Patienten mit refraktären indolenten B-NHL, die im Rahmen der Therapie-Studien mit dem humanisierten CD20 Antikörper Rituximab (MabThera®, Hoffman-La Roche, Grenzach-Wyhlen, Deutschland) behandelt wurden, untersucht. Die detaillierte Patientenbeschreibung ist in Tabelle 2.1 dargestellt. Im Laufe ihrer Erkrankung waren diese Patienten mit einer Chemotherapie behandelt worden, ohne dabei andere immunmodulierende Medikamente erhalten zu haben. Alle Patienten hatten vor der Immuntherapie mit Rituximab durchflusszytometrisch nachweisbare monoklonale B-Zellen im peripheren Blut.

Nach Genehmigung durch die Ethik-Kommission wurden die Patienten mit B-CLL im Rahmen der klinischen Studie “B-CLL und MabThera” (Virchow-Klinikum) behandelt (62). Außerhalb dieser Studie wurden auch Patienten mit progredienten CD20-positiven B-Lymphomen, die auf vorangegangene Chemo- und Strahlentherapien nicht angesprochen oder ein Rezidiv hatten, mit Rituximab behandelt. Die Behandlung erfolgte mit "informed consent".


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Tabelle 2.1

Nr.

Patient

Geschl.

Alter

Diagnose

Immunphänotyp (positive Marker)

1.

Z. J. 1, 2

M

58

B-CLL

CD19, CD20+, FMC7 +, λ, CD5, CD23

2.

W. H. 1, 2

F

64

B-CLL

CD19, CD20++, FMC7+, λ, CD5, CD22, CD23

3.

St. H. 1

M

65

MZL

CD19, CD20++, FMC7+, κ, CD5, CD22, CD23

4.

P. W. 1, 2

M

57

B-CLL

CD19, CD20+, FMC7neg, λ, CD5, CD23

5.

K. I. 1, 2

F

62

B-CLL

CD19, CD20+, FMC7 neg, λ, CD5, CD23

6.

H. W. 1, 2

M

62

B-CLL

CD19, CD20 +, FMC7+, λ, CD5, CD23

7.

H. A. 1, 2

M

49

B-CLL

CD19, CD20+, FMC7+, κ, CD5, CD23

8.

C. B. 1, 2

M

51

B-CLL

CD19, CD20+, FMC7+, λ, CD5, CD23

9.

E. A. 2

F

63

B-CLL

CD19, CD20+, FMC7+, κ, CD5, CD23

10.

F. C. 2

F

53

B-CLL

CD19, CD20+, FMC7 neg, λ, CD5, CD23

11.

Z. A. 2

F

64

B-CLL

CD19, CD20+, FMC7+, λ, CD5, CD23

12.

S. B. 2

M

54

B-CLL

CD19, CD20+, FMC7 neg, κ, CD23

13.

S. E. 1, 2

M

51

B-CLL

CD19, CD20+, FMC7+, λ, CD5, CD23

14.

B. G. 1

M

59

NHL

CD19, CD20++, FMC7++, κ, CD5, CD22

15.

C. K. 1

M

58

FL

CD19, CD20+++, FMC7+++, λ, CD5, CD22

16.

G. H. 1, 2

M

71

MCL

CD19, CD20+++, FMC7+++, λ, CD5, CD22

17.

J. D. 1, 2

M

50

MCL

CD19, CD20+++, FMC7+++, κ, CD5, CD22, CD23

18.

Z. G. 1

F

69

FL

CD19, CD20+++, FMC7+++, λ, CD22

19.

W. G. 1, 2

M

65

MCL

CD19, CD20+++, FMC7+++, κ, CD5, CD22

20.

E. S. 1, 2

F

60

IC

CD19, CD20+++, FMC7++, κ, CD22

21.

H. K. 1

M

71

MCL

CD19, CD20+++, FMC7+++, κ, CD5, CD22

22.

E. M. 1, 2

F

56

FL

CD19, CD20++, FMC7++, κ, CD22

1 Patienten mit einer Kurzzeit-Untersuchung bis zur 24. Stunde nach Therapiebeginn; 2 Patienten mit einer langfristigen Untersuchung nach Rituximab-Behandlung.
+++ - Hauptpopulation mit starker CD20- oder FMC7-Fluoreszenzintensität. ++ - die Mehrzahl der Zellen exprimiert die Antigene in einer mittleren Stärke. + -schwache Fluoreszenzintensität oder kleine positive Population.
B-CLL – Chronische lymphatische B-Zell-Leukämie; MZL – Marginal-Zell-Lymphom; NHL – Non-Hodgkin Lymphom; FL Follikuläres Lymphom; IC – Immunocytom; MCL – Mantel-Zell-Lymphom.


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2.1.2.2.  Rituximab-Behandlung

Rituximab wurde in einer Dosis von 375 mg/m2 (bis zu maximal 500 mg absolut) einmal pro Woche in vier aufeinanderfolgenden Wochen eingesetzt. In der ersten Woche erfolgte die Therapie an drei aufeinander folgenden Tagen in steigender Dosierung. In den Wochen 2 bis 4 konnte die Dosis von 375 mg/m2 in einer Infusion über 4-5 Stunden unter ambulanten Bedingungen verabreicht werden (s. Tab. 2.2).

Tabelle 2.2: Applikationsschema für die erste Rituximab-Gabe

Tag

Stunde

Dosis (mg/Stunde)

Maximaldosis (mg)

1.

1. und 2.

5

50 mg

3. und 4.

10

5.

20

2.

Über mindestens 4 Stunden

150 mg

3.

Über mindestens 4 Stunden

Rest der Dosis (ad 500 mg)

2.1.2.3. Probenentnahme

Die durchflusszytometrische Untersuchung von Blutproben der behandelten Patienten erfolgte am ersten Tag vor Therapie sowie nach 1, 2, 4 und 24 Stunden (Kurzzeit-Verlauf). In den folgenden Wochen wurden die Proben jeweils vor Behandlungsbeginn entnommen (Langzeit-Verlauf) (s. Abb. 2.1).

Die Kurzzeitkinetik-Patientengruppe umfasste 18 Patienten, darunter 10 mit B-NHL und 8 mit B-CLL, bei denen insgesamt 19 Verlaufsuntersuchungen durchgeführt wurden. Bei einem CLL-Patienten (Nr.5 in der Tab.2.1) wurde die Untersuchung auch im zweiten Rituximab-Therapiezyklus nach 3 Monaten wiederholt.

Daten zum Langzeit-Verlauf liegen bei 17 Patienten vor. Hierbei wurden alle 4 Applikationen des Therapiezyklus sowie der Verlauf 1, 5 und 8 Wochen nach Ende der Therapie von durchflusszytometrischen Kontrollen begleitet. Die Anzahl der zu jedem Zeitpunkt gemessenen Proben ist bei der Ermittlung der Ergebnisse in Klammern gezeigt. [Seite 10↓]Die Zeitintervalle der durchflusszytometrischen Untersuchungen im Zusammenhang mit den Rituximab-Applikationen sind in Abbildung 2.1 schematisch dargestellt.

Abb. 2.1: Schematische Darstellung der Rituximab-Applikationen () und der Probenentnahmen ():
A - Kurzzeit-Beobachtung (bis 24 Std.)
B - Langzeit-Beobachtung (bis 8. Woche nach Therapie - W.n.T.)

2.1.3. Kontrollgruppe

Es wurden zusätzlich Blutproben von 40 zufällig ausgewählten Patienten untersucht, die keine onkologischen oder hämatologischen Erkrankungen hatten. Die Untersuchungen erfolgten an Restblut nach Routineblutbild. Zusätzliche Blutentnahmen ausschliesslich zu Forschungszwecken waren nicht erforderlich.

2.1.4. Zell-Linien

Für die In-vitro-Blockierungsexperimente mit unkonjugierten CD20- und FMC7-Antikörpern, die Aktivierung mit PMA sowie für die Untersuchung einer CD20-Expression nach Transfektion mit CD20-cDNA wurden folgende Zell-Linien eingesetzt (s. Tab. 2.3):


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Tabelle 2.3: Verwendete Zell-Linien

Bezeichnung

Zelltyp (alle human)

Expression*

Von

CD20

FMC7

Daudi

Burkitt-Lymphom

+

Neg.

DSMZ

JVM-2

B-CLL

+

+

DSMZ

CESS

lymphoblastoide

+

+

DSMZ

K-562

myeloische

Neg

Neg

ATCC

PB-697

Prä-B-ALL

Neg

Neg

ATCC

* konstitutive CD20-Expression (vorgegebene Zellcharakteristik). Die FMC7-Expession wurde in den Vorexperimenten der Arbeit untersucht.

2.2. Methoden

Hauptuntersuchungsmethode bei allen quantitativen und qualitativen Untersuchungen an Patientenblut und Zell-Linien war die Durchflusszytometrie.

2.2.1. Untersuchungen an peripherem Blut

2.2.1.1. Antikörperpanel

In dieser Studie wurden direkt konjugierte monoklonale Antikörper (MAK) benutzt, die in einem Inkubationsschritt an die jeweiligen Zellepitope binden. Die durch die Hersteller empfohlenen chargenbezogenen Antikörperkonzentrationen wurden vor Beginn der Studie laborintern durch Titration überprüft. Die benutzten MAK für die Färbung von etwa 1x106 Leukozyten sind in Tabelle 2.4 aufgelistet. Die benötigten Mengen an Antikörpern pro Ansatz wurden in separaten Gefäßen gemischt und daraus pipettiert, womit die Gefahr des Pipettierens ungleicher Mengen an Antikörpern pro Aliquot im Verlauf der gesamten Untersuchungszeit minimiert wurde.

Es wurde der Anteil der B- (CD45/CD19-positiv) und T-Lymphozyten (CD45/CD3-positiv) als auch der T-Lymphozyten-Subpopulationen (CD4/CD3-positive T-Zellen, [Seite 12↓]CD8/CD3-positive T-Zellen und CD56/CD16 positive und gleichzeitig CD3 negative NK-Zellen) bestimmt.

Tabelle 2.4: Liste der verwendeten monoklonalen Antikörper.

Antigen

Klon

Klasse

Fluoro-chrom

Vol.

(µl)

Detektion von

Hersteller

CD3

SK7

IgG1

PE

5

Pan-T-Zellen

BD, Heidelberg

CD3

UCHT1

IgG1

APC

10

Pan-T-Zellen

B-C, München

CD4

13B8.2

IgG1

FITC

10

T-Helferzellen

Fertigkombination – B-C

CD8

B9.11

IgG1

PE

T-Supressorzellen

CD5

BL1a

IgG2a

FITC

10

Pan-T-Zellen

B-C

CD3

UCHT1

IgG1

FITC

15

NK-Zellen

Fertigkombination – B-C

CD16

3G8

IgG1

PE

CD56

N901/NKH-1

IgG1

PE

CD19

J4.119

IgG1

PE

10

Pan-B-Zellen

B-C

CD20

B9E9 (HRC20)

IgG2a

FITC

10

Pan-B-Zellen

B-C

CD22

SJ10.1H11

IgG1

FITC

10

Pan-B-Zellen

B-C

CD23

9P25

IgG1

FITC

10

B-Zellen

B-C

CD45

2D1

IgG1

FITC

10

Pan-Leukozyten

BD

FMC7

FMC7

IgM

FITC

10

B-Zellen

B-C

λ-Kette

Polyklonal

IgG1

FITC

20

B-Zellen, Leichtketten

Fertigkombination – B-C

CD19

J4.119

IgG1

PE

κ-Kette

Polyklonal

IgG1

FITC

20

B-Zellen, Leichtketten

Fertigkombination – B-C

CD19

J4.119

IgG1

PE

FITC – Fluoreszeinisothiozyanat, PE- Phycoerythrin; APC – Allophycoerythrin; B-C – Beckman-Coulter

Die B-Zellpopulation wurde durch die Expression des CD19-Antigens definiert, die Marker für die weitere immunphänotypische Charakterisierung der monoklonalen B-Zell-Population waren: CD5, CD20, CD22, CD23 und FMC7. Die Untersuchung wurde jeweils als Zweifarbenfluoreszenzmessung durchgeführt. Zur Zeit der Ausgangsuntersuchungen war der Anteil der durchflusszytometrisch nachweisbaren monoklonalen Zellen bei den meisten Proben höher als 90% der gesamten B-Zellpopulation. Der Anteil der [Seite 13↓] monoklonalen B-Zell-Population wurde bei der Mehrheit der Patienten mit CLL oder MCL (s. Tab. 2.1), durch die charakteristische Koexpression von CD5 bestimmt. Bei allen Patienten wurde auch die Ig-Leichtkettenexpression (λ oder κ) als Merkmal der Monoklonalität ausgewertet. Die exakte Zusammensetzung des Panels ist in Tabelle 2.5 dargestellt:

Tabelle 2.5: Antikörperkombinationen für die Charakterisierungder Zellpopulationen

Nr.

Zwei-oder Dreiparameterkombination

Zellpopulation

1

CD45 vs CD19

B-Zellen

2

CD45 vs CD3

T-Zellen

3

CD16 und CD56 vs CD3

NK-Zellen

4

CD5 vs CD19

T-Zellen, maligne CLL/MCL-Zellen

5

CD20 vs CD19

B-Zellen

6

CD22 vs CD19

B-Zellen

7

CD23 vs CD19

B-Zellen

8

FMC7 vs CD19

B-Zellen

9

κ vs CD19

B-Zellen

10

λ vs CD19

B-Zellen

11

CD4 vs CD8 vs CD3

T-Helfer- und T-Suppressor-, T-Zellen

Bei den Blutproben von Patienten der Kontrollgruppe (ohne hämatologisch-onkologische Erkrankungen) wurde ausschließlich die CD20- und FMC7-Expression der CD19-positiven Zellpopulation untersucht.

Bei den vorliegenden durchflusszytometrischen Experimenten wurden die Autofluoreszenzen der für den bestimmten Marker negativen mononukleären Zellen als „interne“ Negativkontrolle benutzt. Es wurden daher keine Isotypkontrollen verwendet.

2.2.1.2. Blutentnahme und Vorbereitung

Alle Vollblutproben der Patienten wurden in 2,7 ml K-EDTA S-Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht) abgenommen und bis zur Aufarbeitung für maximal 10 Stunden bei Raum[Seite 14↓]temperatur gelagert. Die Zellzahl und das Differentialblutbild wurden mit hämatologischen Analyseautomaten bestimmt (Cell-Dyn 3500, Abbott GmbH Diagnostics, Bayer Technicon H3, Bayer Diagnostics GmbH).

Alle Proben mit einer Leukozytenzahl über 10.000 Leukozyten/µl wurden vor der weiteren Verarbeitung durch PBS-Verdünnung (Dulbeco’s PBS, ohne Ca2+ und Mg2+, Gibco BRL) auf eine Zellkonzentration von ca. 10.000 Leukozyten/µl eingestellt (s. Punkt 2.2.1.1 zur Begründung).

2.2.1.3. Erythrozytenlyse

Bei dem gesamten Vollblutmaterial wurde die „Lyse vor der Färbung“ - Präparationsmethode angewandt. Somit wurden die quantitativen Verhältnisse der einzelnen Zellpopulationen im Material gewahrt und eine Bestimmung der Leichtkettenexpression auf den B-Zellen ermöglicht.

Entsprechend des für die erwünschte Immunphänotypisierung ausgewählten Panels, wurden einzelne Röhrchen (4,5 ml, Falcon, BD) vorbereitet, beschriftet und mit jeweils 100 µl Blutvolumen pro Ansatz gefüllt (s. Punkt 2.2.1.1). Das pro Röhrchen anzusetzende Volumen an Untersuchungsmaterial mit einer absoluten Zellzahl von ca. 1x106 Leukozyten pro Ansatz wurde während des ganzen Untersuchungsprozesses konstant gehalten.

Die Erythrozyten wurden wie folgt lysiert:

2.2.1.4. Färbung

Die Zellen wurden mit den entsprechenden MAK-Kombinationen wie folgt markiert:

Die Proben wurden innerhalb von 2 Stunden nach der Aufbereitung, ohne Fixation, gemessen.

2.2.1.5. Geräteeinstellung, Datenakquisition, Parameterdarstellung

Die Datenakquisition bestand aus einer gleichzeitigen Messung von Forward-Scatter (FSC), Side-Scatter (SSC) und von bis zu 3 getrennten Fluoreszenzsignalen der gebundenen Fluorochrom-konjugierten MAK. Für die Immunfluoreszenzanalysen stand ein Durchflusszytometer vom Typ FACSCalibur™ (BD) zur Verfügung. Das Durchflusszytometer war mit zwei Lasern ausgestattet: ein 488 nm Argonlaser für die Fluorochrome FITC und PE und ein 635 nm Red-diode Laser für das Fluorochrom APC. Dadurch wurde eine simultane Messung dieser Dreifarben-Kombinationen ermöglicht.

Die Grundeinstellung der Fluoreszenzsignalverstärkung und der Fluoreszenzkompensation wurde durch Messung von standardisierten herstellerspezifischen Testpartikeln (CaliBRITE™ 3 und CaliBRITE™ APC, BD) mit einem automatisierten Software-Programm (FACSComp™, BD), d.h. Software-gesteuert, regelmässig überprüft. Dadurch wurde das Gerät kalibriert.


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Die korrekte Einstellung der FSC- und SSC-Detektoren (im linearen Modus) ermöglichte die Erfassung aller Leukozyten und die deutliche Abgrenzung ihrer Subpopulationen (Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten). Die Verstärkung der Fluoreszenzdetektoren (im logarithmischen Modus) war anhand der Autofluoreszenzintensität nicht gefärbter Lymphozyten so gewählt, dass alle negativen Zellen sich innerhalb der ersten Dekade der Verstärkung befanden. Die Farbkompensation erfolgte durch die Messung einer zweifarbigen, sich gegenseitig ausschließenden Zellmarkerkombination (CD3-FITC/CD19-PE). Die Kompensation wurde für die Fluoreszenz des CD19-Antigens optimiert. Da das Gerät eine gute Stabilität der Messcharakteristika zeigte, blieben die ausgewählten Verstärkungs- und Kompensationsparameter über die Periode der Untersuchungen gleich. Dadurch ließen sich die Akquisitionsdaten der verschiedenen Patienten zu unterschiedlichen Zeitpunkten weitgehend miteinander vergleichen.

Die Messungen wurden mit CellQuest™ (Version 3.1, BD), bei einer mittleren Durchflussrate und einer 256 Kanal-Auflösung durchgeführt.

Während der Datenaufnahme wurden 4 Akquisitions-Standardfenster (Aquisition Dot-plots) auf dem Bildschirm präsentiert: FSC/SSC, FL1/FL2, SSC/FL1, SSC/FL2. Anhand des FSC konnte die diskriminierende Grenze (threshold) zwischen den in die Auswertung eingehenden Zellen (Leukozyten) und dem Debris so gesetzt werden, dass mit Sicherheit alle Lymphozyten in die Messung eingeschlossen wurden, ohne dabei zu viel Verunreinigungsereignisse aufzunehmen. Bei jeder Messung wurden die Daten von 25.000 Zellen registriert, ohne einen Vorauswahl-Speicherparameter zu benutzen, und in Listenmodus gespeichert.

2.2.1.6. Auswertung – logische Verknüpfungen

Die gespeicherten Messdaten wurden mit dem gleichen Software Programm (CellQuest™) ausgewertet. Bei der Analyse der Ergebnisse wurde die Expression der untersuchten B-Zellantigene ausschliesslich auf der pathologischen Lymphomzellpopulation berücksichtigt. Es wurde ein graphisches Auswerteprotokoll ausgearbeitet, in dem die [Seite 17↓]Streulicht- und Fluoreszenzsignale der Ziel-Zellpopulation in Form von zweiparametrigen Dot-Plots präsentiert und durch die im Programm definierten Analyseregionen und Quadrantenstatistik ausgewertet wurden (s. Abb. 2.2). Die statistische Angabe der % positiver Zellen bezog sich sowohl auf die Gesamtzahl der gemessenen Zellen, als auch auf die Population der eingegrenzten („Gate“) Zielzellen. Das geometrische Mittel wurde für die Darstellung der Prozentanteile genommen. Zusätzlich wurde die mittlere Floureszenzintensität (MFI auf Anzahl Kanäle bezogen) für den Vergleich der verschiedenen Expressionsstärken benutzt.

Abb. 2.2: Schematische Darstellung der Probenauswertung. R1 - Lymphozyten, bzw. mononukleäre Zellen (A); R2 - CD19-positive Zellen (B); R1+R2 - CD19-positive Zellen mit Lymphozytenage; CD5-Koexpression von CD19-positiven Zellen im Lymphozytengate (C - oberer rechter Quadrant)

Die maligne Zellpopulation ließ sich durch ihre lymphozytenähnlichen Streulichtcharakteristika und die gleichzeitige Expression mehrerer B-Zellantigene identifizieren. Daraufhin wurde zuerst eine Region als Lymphozytengate (R1) hinsichtlich der beiden Streulichtparameter definiert. Da die deutliche Abgrenzung der lymphoiden Population nicht immer möglich war, wurde diese Region zunächst hinsichtlich des SSC z.T. breiter gesetzt, so dass sie die ganze mononukleäre Zellpopulation erfasste.

Die Definition einer zweiten B-Lymphozytenregion (“Region 2” – R2) auf den CD19-positiven Zellen erfolgte bei der graphischen Wiedergabe der Fluoreszenzen der CD5/CD19-Messung. Bei den meisten untersuchten Patienten, die die Diagnosen "CLL" oder "MCL" hatten, ließ sich die maligne Zellpopulation anhand der CD5-Koexpression am besten unterscheiden (2).


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Nach einer elektronischen Verknüpfung der beiden bereits definierten Regionen (R1 und R2), wurde ein drittes logisches Fenster („Gate 3“ – R1+R2) erstellt, so dass die Zielzellpopulation über mehrere Eingrenzungskriterien (Streulichtparameter der Lymphozyten, CD19-Expression, CD5-Expression) zugeordnet werden konnte. So sollten alle durchflusszytometrisch nachweisbaren B-Zellen innerhalb von R3 erfasst werden. Die durch R3 definierten Messergebnisse wurden auf einem neuen FSC-SSC-Dot-Plot durch sog. “Back-Gating” präsentiert und mußten eine einheitliche Population im Bereich der mononukleären Zellen bilden.

2.2.1.7. Auswertung der Lymphozytenpopulationen

Die Bestimmung des relativen Anteils der B-, T- und NK-Zellen, und auch der T-Lymphozytensubpopulationen (T-Helfer- und T-Suppressorzellen) erfolgte bezogen auf die gesamte gemessene Leukozytenpopulation. Die Lymphozytenpopulation wurde in den Messungen CD45-FITC/CD19-PE und CD45-FITC/CD3-PE als CD45-positiv definiert. Die T-Zellsubpopulationen wurden innerhalb der CD3-positiven Zellen mit einer Dreifarben-Kombination (CD4-FITC/CD8-PE/CD3-APC) bestimmt. Die NK-Zellen wurden mit dem CD3-FITC/CD16-PE/CD56-PE Ansatz als CD3-negativ und CD16/CD56-positiv quantifiziert.

Die absolute Zellzahl der verschiedenen Populationen wurde anhand der mit dem Zellzahlautomaten gemessenen Leukozytenzahl und dem Differentialblutbild ermittelt.

2.2.1.8. Auswertung der malignen B-Zellpopulation

Bei der Analyse der untersuchten B-Zellantigene wurden nur solche Ereignisse berücksichtigt, die innerhalb von Gate 3 lagen.

Die Fluoreszenzen der jeweiligen Antigene auf der B-Zellpopulation wurden in korrelierenden Zweiparameter-Dot-Plots präsentiert. Die Positionierung der Quadrantendiskriminatoren zur Abgrenzung doppelt positiver Zellen orientierte sich generell an der Ver[Seite 19↓]teilung der Autofluoreszenz der für den jeweiligen Marker negativen Zellen (s. Abb. 2.2). Für alle Messanalysen des gleichen Patienten wurde die Position der Quadrantenmarker während der Verlaufsbeobachtung beibehalten.

Die simultane graphische Präsentation der Fluoreszenzsignale sowohl auf der B-Zellpopulation im Gate 3, als auch auf den gesamten Zellereignissen im Lymphozytengate (R1) erlaubte einen Vergleich der Fluoreszenzintensitäten für bestimmte Antigene zwischen den verschiedenen Zellpopulationen in diesem Bereich (T-Lymphozyten, Monozyten, Zielzell-Population).

2.2.2. Untersuchungen mit Zell-Linien

Die Zell-Linien wurden für In-vitro-Blockierungsexperimente mit unkonjugiertem CD20- und FMC7-Antikörper, für Aktivierungsversuche mit PMA und für Untersuchungen zur De-novo-Antigen-Expression nach CD20-Transfektion benutzt. Bei den Blockierungsexperimenten wurde die stark CD20- und FMC7-exprimierende B-Zell-Linie CESS verwendet. Für die Transfektionsuntersuchungen wurde die myeloische K-562-Zell-Linie gewählt, die keine endogene CD20-Expression aufweist. Die PMA-Akitivierungsexperimente wurden mit der CD20-/FMC7-negativen prä-B-Zell-Linie PB-697 durchgeführt. Die Medium-Herstellung, Aliquotierung und Kultivierung der Zell-Linien wurden unter Sterilbedingungen durchgeführt (Sterile Werkbank – Cytoperm, Heraeus Instruments).

2.2.2.1. Kultivieren der Zellen

Die Zell-Linien wurden für die Untersuchungsperiode in komplettem Medium (s.u.) und in exponentieller Wachstumsphase gehalten. Das Medium hatte folgende Zusammensetzung (alles von Gibco BRL): RPMI-1640 mit GlutaMax™; 10% FKS (fötales Kälberserum), 1% Penicillin-G/Streptomycin Sulfat (10 µg/ml und 25 µg/ml Endkonzentration) und 1% Natriumpyruvat. Die Zellen wurden wie folgt kultiviert:

Dabei wurde die Zellzahl mittels Analyseautomat und die Vitalität mittels Trypanblau-Färbung unter Lichtmikroskop kontrolliert. Die für die einzelnen Experimente benötigten Zellmengen wurden nach Zellzahlbestimmung, einem Waschschritt mit Medium und Resuspendieren des Pellets in der entsprechenden Menge Medium vorbereitet.

2.2.2.2. CD20-Plasmid und Transfektion

Das bei den beschriebenen Transfektionsexperimenten verwendete CD20-Plasmid wurde von Prof. David Mason (Dept. of Cellular Science, University of Oxford, John Radcliffe Hospital, UK) zur Verfügung gestellt. Es hatte die Struktur des bekannten CD20-cDNA Klones pB1-21A-29 (33).

Das 1,2-kb CD20-cDNA Insert ist unter Kontrolle eines CMV-Promotors in dem Plasmid-Vektor pCDM8 subkloniert. Das Konstrukt hat eine Größe von 8000 bp, ist Kanamycin resistent und wurde in der Literatur als effektiv bei der Transfektion von T-Zell-Linien (COS-1) beschreiben (56).

Bei den vorliegenden Experimenten mit der myeloischen K-562-Zell-Linie wurde eine transiente CD20-cDNA-Transfektion mittels Elektroporation erreicht. Diese Transfektionsmethode basiert auf der Möglichkeit, die Zellmembran mittels hochintensiver elektrischer Pulse kurzfristig zu destabilisieren und so eine Permeabilität für die exogenen DNA-Moleküle zu erzielen. Die optimalen DNA-Mengen wurden im Laufe der Experimente anhand der durchflusszytometrisch gemessenen Transfektionseffizienz bestimmt, sie lagen zwischen 2 und 5 µg Plasmid-DNA/1x106 myeloische Zellen.


[Seite 21↓]

Die benötigte Zellsuspension wurde sedimentiert, in 500 µl Medium resuspendiert und in 4 mm-Elektroporationsküvetten (ECU-104, PEQLAB) überführt. Zu jeder Probe wurde die entsprechende Menge vom Plasmid oder dem pCDM8 Mock-Vektor als Kontrolle zugegeben. Die Elektroporation erfolgte durch das EquiBio-System (Boughton Monchelsea Kent, UK) unter folgenden technischen Bedingungen: 1050 microfarads (µF), 260V.Anschließend wurden die Zellen schnell in 10 ml komplettem Medium resuspendiert, für 120-Stunden weiter inkubiert und analysiert.

Die De-novo-CD20-Expression wurde in 24-Stunden-Intervalen durchflusszytometrisch überprüft, wobei die transfizierten Zellen zunächst sedimentiert, in RPMI 1640 mit 10% FKS zu einer Konzentration von 1x106 Zellen/mL resuspendiert und schließlich mit der entsprechenden Antikörperkombination gefärbt wurden.

Die benutzten Mengen an Antikörper sowohl bei der Transfektionseffizienz-Überprüfung als auch bei den Blockierungsexperimenten sind in Tabelle 2.6 aufgelistet. Es wurden die gleiche Färbetechnik und die gleichen Prinzipien der Geräteeinstellung bei den durchflusszytometrischen Messungen wie in Punkt 2.2.1.4 beschrieben, verwendet.

2.2.2.3. Blockierungsexperimente mit B-Zell-Linien

Bei den B-Zell-Linien CESS, JVM und DAUDI wurden die Veränderungen der CD20- und FMC7-Antigenexpression nach einer Präinkubation mit den entsprechenden unkonjugierten Antikörpern untersucht.

Die benötigte Zellsuspension wurde sedimentiert und in einer Zellkonzentration von 1x106/ml in RPMI-1640 Medium resuspendiert. Nach der Messung der für jede Zell-Linie charakteristischen konstitutiven CD20- und FMC7-Expression (CD20-FITC/CD19-PE, FMC7-FITC/CD19-PE) wurden im ersten Schritt die Zellen mit unkonjugiertem CD20(B1)- und FMC7-Antikörper, sowie mit irrelevantem MAK (5 μg des unkonjugierten MAK pro 1x106 Zellen) für 60 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Im zweiten Inkubationsschritt folgte eine separate Färbung von je drei 100 μl Ansätzen jeder vorinkubierten [Seite 22↓]B-Zell-Linie mit den folgenden Antikörperkombinationen: CD45-FITC/CD20-PE, FMC7-FITC/CD19-PE und irrelevanten IgM-Antikörpern (s. 2.2.1.4).

Bei der CESS-Zell-Linie, die eine konstitutive CD23-Expression aufwies, wurden zusätzlich 4-stündige Blockierungsversuche bei 37°C im Wasserbad mit den Prototyp CD20(B-1), FMC7 und irrelevanten Kontrollantikörpern, entsprechend der von Borget et al. beschriebenen Methode durchgeführt. (57) Bei den Experimenten wurden die Modulationseffekte der Vorinkubation auf die CD23-Expression mit der MAK-Kombination CD23-FITC/CD19-PE untersucht. Die Ergebnisse der MFI von vier solchen Experimenten wurden analysiert.

Die durchflusszytometrische Analyse der Blockierungsexperimente erfolgte über alle 20000 Zellen, die ohne einen Vorauswahl-Speicherparameter bei jeder Messung registriert wurden. Es wurden die mittleren Fluoreszenzintensitäten ausgewertet.

Die verwendeten Klone und Antikörperkonjugate sowie die Antikörpermengen pro Ansatz sind in der nachfolgenden Tabelle 2.6 dargestellt.


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Tabelle 2.6:Liste und Charakteristika der für die Blockierungsexperimente verwendeten MAK.

Antigen

Klon

Klasse

Fluorochrom

Vol.

(µl)*

Katalog-Nr.

Hersteller

CD20

B1-Coulter Clone H299 (b1)

IgG2a

unkonjugiert

10

B-C, München

FMC7

FMC7

IgM

unkonjugiert

10

Biozol, Serotec, Oxford, UK

irrelevant

κ MOPC 21

IgG1

unkonjugiert

10

Sigma-Aldrich Chemie GmbH

irrelevant

GC323

IgM

FITC

10

B-C

irrelevant

u.727

IgG2a

PE

10

B-C

CD20

B9E9 (HRC20)

IgG2a

FITC

10

B-C

FMC7

FMC7

IgM

FITC

10

B-C

CD19

J4.119

IgG1

PE

10

B-C

CD19

J4.119

IgG1

FITC

10

B-C

CD45

2D1

IgG1

FITC

10

BD, Heidelberg

CD23

9P25

IgG1

FITC

10

B-C

CD20

B9E9

IgG2a

PE

10

B-C

CD20

IDEC-C2B6 MabThera®

Maus, humanisiert

unkonjugiert

5% (1:10 Verd.)

Hoffman la Roche, Bazel

*pro Ansatz von 105 Zellen; FITC – Fluoreszeinisothiozyanat, PE- Phycoerythrin;; B-C – Beckman-Coulter; BD – Beckton-Dickinson

2.2.2.4. Aktivierungsexperimente mit PMA

Die CD20/FMC7-negative prä-B-Zell-Linie PB-697 wurde in komplettem Medium mit und ohne Zugabe von 5 ng PMA (Phorbol12-myristate13-acetate; Sigma, Taufkirchen) pro ml (ca. 5x10 5 Zellen) kultiviert. 100μl-Aliquote der behandelten und der Kontroll-Suspension wurden mit den Antikörperkombinationen CD20B1-FITC/CD19-PE, FMC7-FITC/CD19-PE und Kontroll-IgM-Antikörper unter den beschriebenen Bedingungen inkubiert (2.2.1.4). Die gefärbten Proben wurden für eine induzierte Antigenexpression durchflusszytometrisch bis zur 36. Stunde der PMA-Inkubation analysiert.

2.3. Statistik

Die während der kurz- und langfristigen Patientenbeobachtung untersuchten Parameter wurden für die gesamte Gruppe der behandelten Patienten analysiert. Da es Unterschiede im Immunphänotyp und daher in der Positivität und Expressionsintensität für bestimmte Antigene (CD5, CD22, CD23) zwischen den verschiedenen Erkrankungen gab, wurden nur Antigen-positive Fälle für die folgende statistische Analyse herangezogen.

Es wurden die prozentualen Anteile der verschiedenen Zellsubpopulationen ermittelt.

Die Antigen-Expression wurde als relative Fluoreszenzintensität vom geometrischen Mittelwert der Kanalzahlen präsentiert.

Alle ermittelten Absolut- und Prozentenzahlen bei den entsprechenden Untersuchungen sind als Medianwerte mit entsprechenden Minima und Maxima dargestellt, da keine Normalverteilung vorlag.


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Für die statistische Bearbeitung des Datenmaterials wurden sowohl deskriptive als auch konfirmatorische Methoden verwendet. Die Daten wurden zuerst auf Normalverteilung (Gaus’sche) untersucht (Kolmogorov-Smirnov-Test). Da die überwiegende Mehrzahl der Variablen keine Normalverteilung aufwies, wurden für die Darstellung und den Vergleich folgende statistische Methoden eingesetzt: Median, Minimum und Maximum für die deskriptive Analyse; Mann-Whitney-U, Wilcoxon-W-Test für den Vergleich (p<0,05 wurde als signifikant gewählt) und der Pearson-Korrelationstest.


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22.07.2004