[Seite 25↓]

3.  ERGEBNISSE

3.1. Mit Rituximab-behandelte Patienten

3.1.1. Leukozytenzahl, Differentialblutbild und Lymphozytenpopulationen

3.1.1.1. Kurzzeit-Verlauf (24 Stunden)

Schon 60 Min. nach Beginn der Rituximab-Infusion war eine erhebliche Reduktion der Leukozytenzahl festzustellen, die über die nachfolgenden Messintervalle bis zur 24. Stunde signifikant blieb (s. Abb. 3.1).

Die Auswertung der Differentialblutbilder zeigte, dass diese Zelldepletion am stärksten die Lymphozytenpopulation betraf, deren Prozentanteil von 60% auf 16,6% (p=0,01) nach 2 Stunden fiel und am Infusionsende um 33,1% niedriger als vor der Therapie war (s. Abb. 3.2).

Abb. 3.1: Veränderungen der Leukozytenzahl (Median, Streuung) während der Kurzzeit-Beobachtung.
* - signifikante Veränderungen zum Ausgangswert (p<0,05)


[Seite 26↓]

Abb. 3.2: Veränderungen der Lymphozytenzahl (Median, Streuung) während der Kurzzeit-Beobachtung.
* - signifikante Veränderungen zum Ausgangswert (p<0,05)

Zu denselben Zeitpunkten wurde entsprechend des veränderten Differentialblutbildes ein relativer Anstieg im Prozentanteil der Neutrophilen festgestellt, wobei sich die Werte nach der 2. Stunde verdoppelten (p=0,02), nach der 4. Stunde noch signifikant erhöht waren (p=0,02) und bis zum Endpunkt der Untersuchung um 17% (n.s.) erhöht blieben. Der prozentuale Anteil der Monozyten verringerte sich auf weniger als die Hälfte bis zur 2. Stunde (p=0,007) und kehrte danach wieder zu den Ausgangswerten zurück.

Die signifikante Lymphozytenreduktion war vor allem auf eine B-Zelldepletion zurückzuführen, wie die durchflusszytometrische Zellpopulationsanalyse bewies. Der Prozentanteil der CD19-positiven Zellen (41,3%) verringerte sich nach einer Stunde auf weniger als die Hälfte (14,5%) und blieb 24 Stunden nach der Applikation fast zehnfach niedriger (4,22%, p=0,044) als der Ausgangswert (s. Abb. 3.3).

Der T-Lymphozytenanteil (CD3-positive Zellen) zeigte zu jedem Untersuchungszeitpunkt einen relativen Anstieg innerhalb der gesamten Lymphozytenpopulation. Die CD4:CD8-Ratio blieb im Referenzinterval stabil (0,8-2,7). Die NK-Zellbestimmung (CD56/16-positiv und CD3-negativ) zeigte eine geringe Abnahme im Prozentanteil, die


[Seite 27↓]

Abb. 3.3: Veränderungen der B-Lymphozytenzahl (Median, Streuung) während der Kurzzeit-Beobachtung.
* - signifikante Veränderungen zum Ausgangswert (p<0,05)

nach der 2. und 4. Stunde am stärksten ausgeprägt war (p=0,013 und p=0,001). Die Werte blieben bis zum Ende dieser Beobachtung reduziert.

3.1.1.2. Langzeit - Verlauf (4 Applikationen und 8 Wochen danach)

Nach der anfänglichen Leukozytenabnahme während der ersten Applikation, blieben die Leukozytenwerte über die nachfolgenden 3 Applikationen und bis zu 5 Wochen nach Ende der Therapie annähernd konstant. Die Kontrollmessungen nach 8 Wochen ergaben einen Wiederanstieg der Leukozytenzahl (s. Abb. 3.4).

Wie schon die Ergebnisse der Kurzzeituntersuchung gezeigt haben, betrafen auch hier die Zellzahl-Veränderungen überwiegend die Lymphozytenpopulation. (s. Abb. 3.5) Die absoluten Zellzahlen sowohl der Neutrophile als auch der Monozyten blieben nahezu unverändert. Entsprechend des veränderten Differentialblutbildes wurde aber eine relative Erhöhung ihrer Prozentanteile beobachtet.


[Seite 28↓]

Abb. 3.4: Veränderungen der Leukozytenzahl (Median, Streuung) während der Langzeit-Beobachtung.
Keine signifikante Veränderungen zum Ausgangswert

Abb. 3.5: Veränderungen der Lymphozytenzahl (Median, Streuung) während der Langzeit-Beobachtung.
Keine signifikante Veränderungen zum Ausgangswert


[Seite 29↓]

Abb. 3.6: Veränderungen der B-Lymphozytenzahl (Median, Streuung) während der Langzeit-Beobachtung.
Keine signifikante Veränderungen zum Ausgangswert

Wie die Kurzzeit-Untersuchung ergab auch die Langzeit-Beobachtung, dass die Lymphozytenreduktion mit einer Abnahme der CD19-postiven Zellen einhergeht. (s. Abb. 3.6) Eine Verringerung des Ausgangs-Prozentanteils (41,4%) war im Laufe aller Therapiezyklen (28,4%, 26,6%, 22,9%) und während des Therapie-freien Intervalls bis zur 5. Woche nachweisbar. In der 8. Woche nach Therapie-Ende wurde wieder ein Anstieg des Prozentanteils der B-Zellen (32,1%) festgestellt.

Der T-Lymphozytenanteil zeigte auch hier einen relativen Anstieg innerhalb der gesamten Lymphozytenpopulation mit einem unverändert normalen CD4:CD8-Verhältnis. Der NK-Prozentanteil blieb ohne relevante Veränderungen während des gesamten Therapiezyklus und der nachfolgenden Kontrollen.

3.1.2. Immunphänotypische Veränderungen der B-Zellpopulation

Während des gesamten Untersuchungszeitraums bestand die verbliebene, infolge der Therapie stark reduzierte B-Zellpopulation, in ihrem grössten Teil aus malignen B-Zellen. Die immunphänotypischen Marker (CD5/CD19-Koexpression und monoklonale [Seite 30↓]Leichtkettenexpression), die der Abgrenzung dieser malignen Population dienten, blieben erhalten. Vor Beginn der Behandlung betrug die maligne CD5-positive Zellpopulation bei den entsprechenden 18 Patienten 99,8% (86,9-99,99%) der gesamten B-Zellpopulation (s. Tab. 1, Mat. & Meth). Bei allen nachfolgenden Messungen (n=128) mit Zellmaterial dieser Patientengruppe blieb die CD5-Positivität der CD19-Zellen erhalten (99,79%, 60-100%).

Bei den 4 Patienten mit einem CD5-negativen B-Zellphänotyp (Nr.12, 18, 20, 22 in der Tab. 2.1) wurde die maligne Zellpopulation nur durch die Leichtkettenexpression analysiert. Es wurde keine wesentliche Veränderung der Leichtkettenexpression im Untersuchungszeitraum festgestellt.

3.1.2.1. Kurzzeit-Verlauf

Die Analyse des CD20-Antigens, Target der eingesetzten Antikörpertherapie, zeigte eine signifikante Abnahme bzw. eine komplette Depletion der positiven Zellen nach der 4. Stunde. (s. Abb. 3.7 und 3.8). Nach 24 Stunden wurden 0,4% CD20-positive Zellen nachweisbar. Die Expressionsstärke zeigte ebenso eine signifikante Verminderung über den gesamten Untersuchungszeitraum (p<0,002).

Bei den Non-CLL-Lymphomen wurde das CD20-Antigen deutlich einheitlicher und stärker als bei der CLL exprimiert, was auch die signifikanten Unterschiede in den Ausgangswerten für die Fluoreszenzintensität (249 vs 40 MFI, p=0,001) erklärte. Die unterschiedliche Expressionsintensität persistierte bis zur 4. Stunde (p=0,041). Die danach aufgetretene CD20-Negativierung verlief ähnlich bei allen Patienten.

Ähnlich ausgeprägt waren die Veränderungen der FMC7-Antigenexpression (s. Abb. 3.7 und 3.8). Die FMC7-positiven Zellpopulationen bei den beiden Erkrankungsgruppen unterschieden sich bezüglich Prozentanteil und Expressionsstärke des Antigens, wobei die Proben der Non-CLL-Patienten, ähnlich wie beim CD20-Antigen, einen höheren Prozentanteil FMC7-positiver Zellen (89,3 vs 19,1%, p<0,001) und auch eine entsprechend stärkere Fluoreszenzintensität aufwiesen (61 vs 14 MFI, p=0,001). Die starken Therapie-assoziierten Veränderungen betrafen gleichermassen beide Gruppen, wobei


[Seite 31↓]

Abb. 3.7: Veränderungen des Prozentanteils CD20- und FMC7-positiver B-Lymphozyten während der Kurzzeit-Beobachtung. Korrelationskoeffizient r=0,73; p<0,0001.

die signifikanten Ausgangsunterschiede nach der 1. Stunde nivelliert waren. Unmittelbar nach Therapie-Beginn nahmen die Expressionsintensität und der Anteil der FMC7-exprimierenden Population bei allen Proben ab, bis zu einer kompletten Negativierung nach der 4. Stunde (von p=0,02 bis p<0,0001).

Die beobachteten Veränderungen verliefen für die CD20- und FMC7-Antigene parallel. Folgende Korrelationen wurden nachgewiesen: r=0,73 (p<0001, n=89) für die Prozentanteile positiver Ereignisse und r =0,79 (p<0001, n=89) für die MFI.

Infolge der Antikörpertherapie traten Antigen-Veränderungen auch beim Pan-B-Zellantigen CD19 und bei der für die CLL charakteristischen CD23-Antigenexpression auf.

Die CD19-Expressionsstärke nahm während der Kurzzeitbeobachtung nach Therapiebeginn deutlich ab, wobei signifikante Veränderungen ab der 2. Stunde an allen Untersuchungszeitpunkten und bei allen CD19-Probenansätzen beobachtet wurden (von


[Seite 32↓]

Abb. 3.8: Veränderungen der MFI CD20- und FMC7-positiver B-Lymphozyten während der Kurzzeit-Beobachtung. Korrelationseffizient r=0,79; p<0,0001.

p=0,047 bis p=0,001). Nach 24 Stunden wurde wieder eine Tendenz zur Zunahme der Expressionsstärke von CD19 beobachtet.

Die CD23-Expression nahm bei 11 Patienten (76,5%, 33,4-84,4% positive Zellen und 20, 11-29 MFI vor Therapie) ab, wobei sowohl der Anteil CD23-positiver Ereignisse als auch ihre Fluoreszenzintensität reduziert wurden (Abb. 3.9a und b). Wesentliche Unterschiede blieben bei allen nachfolgenden Untersuchungen bis zur 24. Stunde bestehen.

Die Veränderungen des CD23-Antigens zeigten Analogien zu CD20- (r=0,47, p=0,001, n=52) und FMC7-Antigenen (r=0,41, p=0,002, n=52) bezüglich Reduktion und Wiederherstellung der Expressionsstärke und des Subpopulationsanteils.

Der in der Abb. 3.10 an einem Patientenbeispiel demonstrierte Untersuchungsverlauf illustriert die am häufigsten beobachteten Veränderungen von CD20- und FMC7-Antigenexpression.


[Seite 33↓]

Abb. 3.9a: Veränderungen des Prozentanteils CD23-positiver B-Lymphozyten während der Kurzzeit-Beobachtung.

Abb. 3.9b: Veränderungen der MFI der CD23-positiver B-Lymphozyten während der Kurzzeit-Beobachtung.


[Seite 34↓]

Die restlichen untersuchten Marker der B-Zellpopulation (CD5, CD22, κ- oder λ-Leichtketten) zeigten für die Dauer der gesamten Experimente keine relevanten kinetischen Veränderungen bezüglich der Positivität und/oder Fluoreszenzintensität.

Abb. 3.10: Kurzzeit-Untersuchungsverlauf bei einem der behandelten Patienten. In den ersten zwei Reihen ist die unter Rituximab-Behandlung eintretende typische Reduktion der CD20- und FMC7-Expression gezeigt. Die dritte Reihe zeigt die CD-22-Expression, welche keine Veränderungen aufweist.


[Seite 35↓]

3.1.2.2.  Langzeit-Verlauf

Die Negativierung des CD20-Antigens war komplett nach der 3. Applikation und blieb so während des ganzen folgenden Therapiezyklus und bei den Kontrollen 7 Tage danach. Die Untersuchungen nach der 5. und 8. Woche zeigten eine erneute CD20-Expression. (s. Abb 3.11). Die Fluoreszenzintensitäten blieben bis zur 5. Wochen nach Therapie signifikant niedriger als die Ausgangswerte und danach (8. Woche) wurde eine Tendenz zur Steigerung bis zu 64% des Ausgangswertes beobachtet (s. Abb. 3.12).

Das FMC7-Antigen zeigte eine ähnliche Kinetik unter der Therapie und bis zu einer Woche danach. Die FMC7-Fluoreszenzintensität verminderte sich parallel zu der CD20-Expressionsabnahme (r=0,85, p<0,001, n=97). Ab der 5. Woche wurde eine erneute Expression des FMC7-Antigens nachweisbar. Die Veränderungen im Prozentanteil der FMC7-positiven Population korrelierten mit denen der CD20-exprimierenden Fraktion (r=0,7, p<0,001, n=97). Die Reduktionsphase für die FMC7-positiven Zellen dauerte allerdings länger und die Werte stiegen langsamer an als beim CD20-Antigen (s. Abb. 3.11).
Abb. 3.11: Veränderungen des Prozentanteils CD20- und FMC7-positiver B-Lymphozyten während der Langzeit-Beobachtung. Korrelationskoeffizient r=0,7; p<0,0001.


[Seite 36↓]

Abb. 3.12: Veränderungen der MFI CD20- und FMC7-positiver B-Lymphozyten während der Langzeit-Beobachtung. Korrelationskoeffizient r=0,85; p<0,0001.

Über den gesamten Therapiezyklus persistierte die schon unter der ersten Applikation aufgetretene Verminderung der CD19-Expression mit signifikanten Unterschieden zu den Ausgangswerten (p=0,044 bis p=0,001). Dies wurde bei allen mit dem CD19-Antikörper angesetzten Kombinationen festgestellt. Ab der 1. Woche nach Therapie-Ende war allerdings wieder eine Steigerungstendenz festzustellen mit Werten, die sich nach 8 Wochen den Ausgangswerten näherten.

Die CD23-Antigenveränderungen folgten einer den CD20- und FMC7-Antigenen ähnlichen Kinetik, mit einer Verminderung der Fluoreszenzintensität, die bereits eine Woche nach Ende der Rituximab-Behandlung aufgehoben wurde. Die Prozentanteile wiesen unter der Therapie eine nicht signifikante Abnahme auf.

3.2. Kontrollgruppe

Die Leukozytenwerte (7,17 x 10 3 /µl; 4,45-11,89 x 10 3 /µl) und Lymphozytenprozentanteile (26,9%; 19-38,5%) der Kontrollgruppe (n=40) waren im Referenzbereich. Die durch [Seite 37↓] flusszytometrisch nachweisbare B-Zellpopulation (CD19-positive Ereignisse) betrug 3,11% (0,75-14,6%). Darunter waren 97,2% (52,1-99,8%) CD20- und 90,9% (55,9-99,9%) FMC7-positive Zellen zu finden. Die CD20- und FMC7-Antigenexpressionen korrelierten signifikant (r=0,9, p<0,0001), gemessen bei den Ansätzen beider Marker als FITC-Konjugate gegen CD19-PE. Bei den doppelt-gefärbten Probenmessungen (FMC7-FITC/CD20-PE) wurde ein typisches Bild klarer Korrelation beider Antigenexpressionen auf der B-Zellpopulation beobachtet, obwohl die Expressions-Intensitäten innerhalb des gesamten Probenmaterials unterschiedlich waren. Allerdings zeigte sich bei diesen Ansätzen im Vergleich zu den Färbungen von CD20- oder FMC7-FITC in Kombination mit CD19-PE eine gegenseitige Inhibition beider Antikörper: die mittlere Fluoreszenzintensität von FMC7 verringerte sich signifikant um 13% (p<0,0001) und von CD20 um 23% (p<0,0001).

Bei 6 der untersuchten Kontrollproben konnte ein relativ deutlicher Anteil von mehr als 10% CD20-negativen, bzw. schwach-positiven B-Zellen festgestellt werden. Bei diesen Proben waren die CD20-negativen Zellen ebenso für den FMC7-Marker negativ.

Bei allen restlichen 34 untersuchten Proben, bei denen eine messbare CD20-negative B-Zellpopulation vorhanden war, konnte dasselbe Phänomen nachgewiesen werden.

3.3. Transfektionsexperimente mit der myeloischen K-562 Zell-Linie

24 Stunden nach der transienten Transfektion der myeloischen K-562-Zellen mit dem CD20-Plasmid konnte eine De-novo-Expression sowohl des CD20- als auch des FMC7-Antigens durchflusszytometrisch nachgewiesen werden (s. Abb.3.13).

Bei allen durchgeführten Transfektionsexperimenten konnte festgestellt werden, dass die Fluoreszenzintensitäten der beiden de-novo exprimierten Antigene korrelierten, wobei die schwach CD20-exprimierenden Zellen auch keine FMC7-Expression zeigten.

Die Elekroporationsmethode, die bei der Transfektion angewendet wurde, führte zu wesentlichen Zellverlusten. Die Ursache für die relativ niedrige Transfektionseffizienz blieb


[Seite 38↓]

Abbildung 3.13: De-novo-Koexpression von CD20- und FMC7-Antigen bei der K562-Zell-Linie nach Transfektion mit 5 μg CD20-Plasmid. A - Kontrolle, B - CD20-Expression (R1 ca. 15%), C - FMC7-Expression (R2 ca. 7%), D - Koexpression von CD20 und FMC7 (R3 ca. 7%)

unklar. Ein erheblicher Anteil der Zellen blieb negativ sowohl für das eine als auch für das andere Antigen.

3.4. Blockierungsexperimente mit B-Zell-Linien

3.4.1. Blockierungsexperimente mit den CESS-, DAUDI- und JVM-Zell-Linien unter der Wirkung von CD20- und FMC7-MAK

Die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Analyse bei den Blockierungsexperimenten mit B-Zell-Linien sind in der Abb. 3.14 dargestellt.

Die Reihen A und C der Abbildung zeigen den Phänotyp der drei Zell-Linien (JVM-links, CESS-in der Mitte, DAUDI-rechts). Reihe B zeigt die Inhibition der endogenen FMC7-Expression bei der CESS-Zell-Linie nach Vorinkubation mit CD20(B1)-MAK. Die viel schwächere FMC7-Fluoreszenzintensität der beiden anderen Zell-Linien wurden ebenfalls unterdrückt. Wie erwartet wurde die CD20-Expression nach dem Blockierungsschritt mit dem entsprechenden unkonjugierten MAK komplett negativiert (Reihe E).

Der unkonjugierte FMC7-MAK blockiert komplett die FMC7-Expression (Abb. 3.14, Reihe C) und inhibiert die Bindung des CD20-MAK sowohl bei der FMC7-positiven CESS (Reihe F in der Mitte), als auch bei den FMC7-negativen JVM- und DAUDI-Zell-Linien (Reihe F, links und rechts).


[Seite 39↓]

Abb. 3.14: Blockierungsexperimente bei den Zell-Linien: JVM (linke Spalte), CESS (mittlere Spalte) und DAUDI (rechte Spalte). In den Reihen A und D ist der Ausgangsphänotyp mit konstitutiver CD20- und FMC7-Antigenexpression, in den Reihen B und E der Phänotyp nach Blockierung mit dem unkonjugierten CD20(B1)-Antikörper und in den Reihen C und F der Phänotyp nach Blockierung mit dem unkonjugierten FMC7-Antikörper gezeigt.


[Seite 40↓]

3.4.2.  Antigen-Modulationsexperimente mit CESS- und JVM-Zell-Linien unter der Wirkung von CD20- und FMC7-MAK

Die 4 durchgeführten Experimente zu CD23-Expressionsveränderungen unter dem Blockierungseffekt von CD20 (B1) und FMC7 zeigten folgende Ergebnisse:

Tabelle 3.1: Medianwerte der CD23-MFI (Minima und Maxima)

Zelllinie

MOPC21

B-1

FMC7

CESS

409+/-56

357+/-55

312+/-46

JVM

212+/-14

132+/-13

146+/-9

3.5. Aktivierungsexperimente mit der prä-B-Zell-Linie PB-697 unter PMA-Wirkung

Die mit der PB-697-Zell-Linie nach 24-stündiger Inkubation mit Phorbol12-myristate13-acetate (5 ng PMA pro 5 x 10 5 Zellen) durchgeführten Experimente zeigten eine Induktion der Expression sowohl des klassischen B1-Epitops, als auch des FMC7 (Abb.3.15).

Abb. 3.15: Modulation der CD20- und FMC7-Antigenexpression bei PB697-Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit PMA (5ng auf 5x105 Zellen)


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
22.07.2004