[Seite 41↓]

4.  Diskussion

Maligne leukämische B-Zell-Neoplasien exprimieren Membranantigene in typischen Konstellationen, die analog zu den Differenzierungsstufen normaler B-Zellen sind (58). Diese Zell-Marker dienen sowohl der Unterscheidung von den anderen hämatologischen Entitäten als auch der Subklassifizierung der B-Zell-Neoplasien, welche spezifische biologische und klinische Besonderheiten aufweisen (59;60).

Das CD20-Antikörper-basierte Therapiekonzept war für die Klinik von besonderem Interesse, da CD20 als Pan-B-Zellantigen von den meisten malignen Lymphomen exprimiert wird. Der zytotoxische Effekt des Antikörpers Rituximab (IDEC-C2B8) auf die CD20-exprimierenden Zellen wird im Wesentlichen über drei Mechanismen vermittelt: über eine Komplement-(CDC) und Antikörper-(ADCC)-vermittelte Zytolyse einerseits, und durch die Induktion Zell-intrinsischer apoptotischer Mechanismen andererseits (51;53;54).

Bei der Behandlung von Patienten mit refraktären indolenten B-Zell-Lymphomen innerhalb von klinischen Studien mit Rituximab ergab sich die Möglichkeit, umfassende durchflusszytometrische Untersuchungen der immunphänotypischen Veränderungen bei monoklonalen B-Zellpopulationen unter dem Effekt des CD20-Antikörpers vorzunehmen. Die Modulation anderer B-Zellantigene während dieses in vivo induzierten Prozesses der B-Zell-Depletion eignet sich zur Untersuchung dieser Moleküle, die auch bestimmte Rezeptor-Signal-Funktionen ausüben.

Der aus früher publizierten klinischen Studien bekannte hämatologische Effekt der Therapie war die schnelle und selektive B-Lymphozytendepletion (50). Bei den untersuchten Patienten war diese Reduktion mit einer wesentlichen Abnahme der malignen Zellpopulation verbunden, zu welcher im peripheren Blut vor Therapie mehr als 90% der Lymphozyten durchflusszytometrisch zuzuordnen waren. Die bei den kurzfristigen Kontrollen (24 Stunden) festgestellten Unterschiede zu den Ausgangswerten blieben während des gesamten Therapiezyklus erhalten.


[Seite 42↓]

Die Zellzahlen der anderen Leukozytenpopulationen wie Neutrophile, T-Lymphozyten, NK-Zellen und Monozyten blieben ohne signifikante Veränderungen. Diese Beobachtung ist auf die hoch spezifische Wirkung des eingesetzten Antikörpers zurückzuführen und stimmt mit den Untersuchungsergebnissen anderer klinischer Studien überein (61).

Der hämatologische Therapieeffekt mit einer 50%igen Lymphozytenzahlabnahme und einer erheblichen Reduktion der monoklonalen B-Zellpopulation, wie sie in den Auswertungskriterien der Studie definiert wurde (62) hielt bis zur 5. Woche nach Ende der Behandlung an. Die nachfolgenden Messungen (8. und nachfolgende Wochen) zeigten eine Rückkehr zu den Ausgangswerten bei allen untersuchten Zellpopulationen.

Obwohl stark reduziert, behielt die neoplastische B-Zellpopulation ihre wesentlichen immunphänotypischen Ausgangscharakteristika, wie die κ - oder λ -Leichtkettenrestrik-tion und/oder die gleichzeitige CD5- und CD19-Positivität, welche ihre durchflusszytometrische Abgrenzung von normalen polyklonalen B-Lymphozyten erlaubten (2;3;5).

Die immunphänotypische Untersuchung zeigte eine wesentliche Veränderung der Expressionsintensität von CD19. Dabei wurde das PE-Antikörperkonjugat bei allen Kombinationen für die Diskriminierung der B-Zell-Population eingesetzt. Die MFI-Reduktion dieses Pan-B-Zell-Antigens dauerte während des gesamten Behandlungszyklus an und zeigte einen Wiederanstieg ca. eine Woche nach Beendigung der Antikörpertherapie. Daten zur Wirkung der CD20-Ligation auf die Fluoreszenzintensität von CD19 liegen nicht vor. Das CD19-Molekül dient bei der B-Zell-Proliferation und -Differenzierung als funktioneller Korezeptor (75), wobei seine Expression während der B-Zell-Ontogenese genetisch streng konservativ reguliert wird. Es ist sehr wahrscheinlich, dass das CD19-Molekül an der Bildung supramolekularer Komplexe unterschiedlicher Zusammensetzung teilnimmt (CD19/CD21/MHC Klasse II) (76). Es ist nicht bekannt, ob ein solcher Komplex auch andere Zellmembran-Protein-Moleküle einschließen (CD19/CD20) und zu ihrer parallelen Modulation führen kann.

Es ist bekannt, dass die leukämischen Zellen bei indolenten B-Zell-Lymphomen mit Ausnahme der HCL das CD19-Antigen schwächer im Vergleich zu den polyklonalen B-Lymphozyten exprimieren (8). Die CD19-Fluoreszenzintensität der polyklonalen B- [Seite 43↓] Lymphozyten in den Kontrollblutproben der vorliegenden Arbeit war wesentlich höher (MFI von 260 in Median, 161-376) als bei den malignen B-Zellen im Patientenmaterial (MFI von 80,1 in Median, 31,6-212,9).

Eine ebenso signifikante Veränderung wurde beim CD23-Antigen festgestellt. Dieses Antigen ist für den Phänotyp der klassischen CLL charakteristisch und sein Fehlen gilt als prognostisches Kriterium bei der Erkrankung (77). Die von uns in vivo beobachteten CD23-Antigen-Veränderungen unter Rituximab-Einwirkung werden durch die In-vitro -Experimente von Bourget et al. bestätigt. Die Autoren haben eine Unterdrückung sowohl der konstitutiven als auch der IL-4-induzierten CD23-Expression bei CESS-Zell-Linie nach CD20(B1)-MAK-Präinkubation festgestellt (57). Diese Arbeitsgruppe konnte nachweisen, dass der Effekt einerseits mit einer Erhöhung der sekretorischen Fraktion des Antigens im zellfreien Überstand verbunden und andererseits nicht auf eine inhibierte Biosynthese, sondern auf ein erhöhtes Spalten (cleavage) des Antigens zurückzuführen ist.

Unter der spezifischen Antik ö rpertherapie waren die beobachteten Veränderungen des CD20-Targetantigens schnell und signifikant und betrafen die CLL- und die Non-CLL-Patientengruppe. Auf den CLL-Zellen wird das CD20-Antigen prinzipiell mit einer überwiegend mässigen Dichte exprimiert (7;8). Der größere Anteil maligner Zellen liegt im Intravasalraum vor, so dass diese rasch von dem intravenös applizierten Antikörper erreicht werden können. Bei den untersuchten Non-CLL-Patienten wurde auch eine große Fraktion leukämischer, stark CD20-exprimierender Zellen im Intravasalraum festgestellt. Die anfänglichen signifikanten Unterschiede zwischen den CLL- und Non-CLL-Zellen bezüglich der CD20-Fluoreszenzintensität verschwanden vollständig kurz nach Therapiebeginn. Die wenigen verbliebenen CD20-positiven Zellen zeigten eine wesentlich schwächere mittlere Fluoreszenzintensität (MFI), die sich im Rahmen der langfristigen Untersuchung bis zu einer kompletten Negativierung des Antigens entwickelte. Der Effekt hielt bis zur 5. Woche nach Therapieende an. Danach stieg der Prozentsatz der CD20-positiven Zellen parallel zur Erhöhung der Fluoreszenzintensität an.

Die Reduktion der Expressionsintensit ä ten der erw ähnten Antigene - CD19 und CD23 - war an keinem Untersuchungszeitpunkt so ausgepr ä gt wie die Ver änderungen des [Seite 44↓] FMC7-Antigens. Die FMC7- Expression wurde durch die Rituximab-Anwendung sogar schneller und effektiver als die Expression des CD20-Targetantigens unterdrückt. Ähnlich dem CD20 wurden auch hier Ausgangsunterschiede zwischen der CLL- und Non-CLL-Patientengruppe bezüglich der FMC7-Expression festgestellt, die schon eine Stunde nach Therapiebeginn kaum mehr nachweisbar waren.

Die Expressionskinetik des FMC7-Antigens folgte der des CD20-Antigens (r=0,85, p<0,001, n=97) während des gesamten Therapiezyklus. Die Regeneration der CD20-positiven Zellpopulation nach der Therapie war von einer langsameren und weniger effektiven Wiederherstellung der FMC7-Expression begleitet.

Zu keinem Untersuchungszeitpunkt f ü hrte jedoch der Abfall der CD19- und CD23- Expressionsintensit ä ten zu einer vollen Negativierung, wie es bei FMC7- und CD20-Antigen beobachten werden konnte. Die ausgepr ä gten Ver ä nderungen von FMC7 und der hohe Korrelationskoeffizient mit dem CD20 unterst ü tzte die Annahme, dass die beiden Antigene verwandt sind.

Dieselbe Antigene wurden bei polyklonalen B-Zellen von h ä matologisch gesunden Probanden untersucht. Der Befund einer gleichzeitigen CD20- und FMC7-Expression auf der Mehrzahl (97,2% und 90,0%) der B-Zellfraktion entsprach der Feststellung der B-Zell-Sektion auf dem „Leucocyte Typing Workshop V“ (13): 80 bis 100% der peripheren B-Lymphozyten reagieren mit dem monoklonalen FMC7-Antikörper. Allerdings liegen auch Veröffentlichungen vor, welche die FMC7-exprimierende Zellfraktion als wesentlich kleiner beschrieben (23-25).

Bei den polyklonalen B-Lymphozyten wurde auch eine signifikante Korrelation zwischen CD20- und FMC7-Expression (r=0,9, p<0,0001) gefunden. In Übereinstimmung damit berichten Hübl et al. von einer solchen Korrelation bei mono- und polyklonalen B-Zellpopulationen (28). Diese Ergebnisse wurden im Prinzip auch von D’hautcourt und Isaac bestätigt, wobei zusätzlich gezeigt wurde, dass beide Antikörper einen gegenseitigen Blockierungseffekt ausüben (29) Bei den Messungen unserer mit FMC7–FITC und CD20-PE gefärbten Proben wurde auch eine signifikante gegenseitige Inhibition der An [Seite 45↓] tigen-Expressionsstärke (13% für FMC7, p<0,0001 und 23% für CD20, p<0,0001) festgestellt.

Ein gegenseitiger Inhibitionseffekt beider Antikörper wurde bei In-vitro- Blockierungsexperimenten mit lymphoblastoiden B-Zell-Linien best ä tigt. Die Präinkubation mit dem Prototyp-CD20(B1)-MAK unterdrückte nahezu vollständig die FMC7-Expression bei der FMC7-positiven CESS-Zell-Linie. Bei den sehr schwach FMC7-exprimierenden JVM- und DAUDI-Zell-Linien wurde die Bindung des FMC7-FITC-MAK nach der Präinkubation mit CD20(B1)-MAK komplett blockiert. Der Blockierungseffekt von CD20-MAK war der Wirkung des für das Epitop spezifischen unkonjugierten FMC7-MAK gleichrangig.

Das FMC7-Inhibitionsphänomen unter der CD20(B1)-MAK-Wirkung war in vitro im Einklang mit den in vivo beobachteten FMC7-Veränderungen nach Rituximab-Behandlung.

Interessant war die Auswirkung der FMC7-Präinkubation auf die Expression des CD20-Antigens bei den untersuchten Zell-Linien. Die CD20-Bindung wurde nicht nur bei der FMC7-positiven CESS-Linie unterdrückt, sondern auch bei den schwach FMC7-exprimierenden JVM- und DAUDI-Zell-Linien. Diese Tatsache kann in einer räumlichen (sterischen) Inhibition oder auch in der Affinität des unkonjugierten FMC7-MAK zu dem Epitop des klassischen CD20(B1)-MAK begründet sein. Bei der Durchführung ähnlicher co-capping-Experimente für die Identifikation des intrazellulären Targets des CD20(L26)-MAK beschreiben auch Mason et al. eine Unterdrückung der Färbung mit L26 (dotlike reactivity) nach Präinkubation mit FMC7-MAK. Der Effekt war mit der blockierenden Wirkung des CD20(B1)-MAK vergleichbar, obwohl die Autoren diesen als unspezifisch eingeschätzt haben (56).

Die Fragen bezüglich der Natur der beobachteten Wechselwirkungen zwischen beiden Antikörpern und der Wahrscheinlichkeit einer Überlappung der Epitope waren Anlaß für zusätzliche Experimente, darunter z.B. die Untersuchung des Verhaltens anderer B-Zellmembran-Antigene nach FMC7-Blockierung (CD23), Experimente zur Identifizierung des FMC7-Antigens, immunchemische Blotting-Untersuchungen und Transfektionsexperimente mit einer CD20-Gensequenz.


[Seite 46↓]

Die Ergebnisse der bei der vorliegenden Arbeit durchgeführten vier Experimente zeigen einen Modulationseffekt des FMC7-MAK auf die CD23-Expression, die mit der Wirkung des CD20(B1)-Antikörpers vergleichbar ist. Der Befund deutet darauf hin, dass beide Antikörper als Target eine analoge Struktur haben, die mindestens bei der untersuchten CESS-Zell-Linie den gleichen funktionellen Effekt auf B-Zell-Membranstrukturen ausübt. Mit dem Patientenmaterial konnte keine Bestimmung der sekretorischen CD23-Fraktion durchgeführt werden, da unter der Wirkung des therapeutischen CD20-Antikörpers die Zell-Lyse allzu schnell war.

Eine der zuverlässigsten Methoden zur Untersuchung monoklonaler Antikörper mit unbekannter Spezifität besteht in ihrer Anwendung bei transfizierten ektopischen Zell-Linien. Die für die Transfektionen verwendete cDNA kodiert für das angenommene membranständige Antigen des getesteten Antikörpers. Diese Methode wurde schon beim „III Workshop on Leucocyte Differentiation Antigens“ angewandt und hat beim „IV Workshop“ nach der Identifizierung der Gen-Sequenzen der meisten Antigene, die in den sogenannten „clusters of differentiation“ (CD) eingeordnet sind, eine noch breitere Anerkennung erfahren (56).

Um die Zielstruktur des FMC7-Antikörpers näher zu definieren, wurde in der vorliegenden Arbeit eine transiente Transfektion der myeloischen Zell-Linie K562 mit einer CD20-kodierenden Gen-Sequenz durchgeführt. Die eingesetzte cDNA wurde in einen pCDM8-Vektor kloniert (von Prof. Mason, Oxford University, UK). Aus der Literatur war bereits bekannt, dass dieses Gen-Konstrukt bei der Transfektion von T-Zell-Linien (COS-1) effektiv ist (56). Die Elekroporationsmethode, die bei der Transfektion angewandt wurde, führte zu wesentlichen Zellverlusten. Allerdings wurde die durchflusszytometrisch festgestellte De-novo- CD20-Antigenexpression bei den transfizierten Zellen von einer FMC7-Expression begleitet. 48 Stunden nach der Transfektion waren ca. 15-18% der Zellen CD20-positiv (CD20 als PE-Konjugat) und ein wesentlich niedrigerer Prozentsatz (ca. 5–7 %) FMC7-positiv (FITC-Konjugat). Die CD20-negativen und -schwach positiven Zellen blieben auch FMC7-negativ.


[Seite 47↓]

Der Befund lieferte eindeutige Hinweise dafür, dass der FMC7-Antikörper an eine Struktur bindet, die Teil des CD20-Antigens ist. Die Ergebnisse der Transfektionsexperimente bestätigten auch den schon bei den Untersuchungen mit Patientenmaterial und Zell-Linien gezeigten Zusammenhang zwischen den Expressionsintensitäten beider Antigene.

Ungeklärt blieben die Fragen zu:

Die Analyse der CD20-Gen-Promotor-Region weist eine majore und eine Mehrzahl minorer Transkriptions-Startloci für CD20-mRNA auf. Es ist durch Northern-Blot-Analyse festgestellt worden, dass grundsätzlich 3 Varianten der CD20 mRNA existieren: zwei dominante (2.6 und 2.8 kb), eine dritte (3.4 kb) mit wesentlich niedrigerer Expression und daneben eine Reihe weiterer Varianten mit viel seltenerer Expression. Die unterschiedlichen Varianten sind auf „splicing events“ zurückzuführen, die die CD20-Gen-Expression nicht beeinflussen. Keine der bekannten CD20-mRNA-Varianten führt zur Synthese eines CD20-Translationsproduktes mit geändertem Molekulargewicht oder geänderter Struktur (31;32).

Die B-Lymphozyten exprimieren drei Isoformen des klassischen CD20(B1)-Moleküls: eine dominante Variante mit einer Molekülgröße von 33 kDa und zwei seltener vorkommenden Formen, entsprechend mit 34.5 und 36 kDa. Es ist nachgewiesen worden, dass sich die unterschiedlichen Formen aus der Post-Translationsphosphorylierung der Aminosäurereste des CD20-Proteins ergeben (35;36).

Obwohl die Faktoren, die die CD20-Transkription regeln, nicht vollständig geklärt sind, wurde beobachtet, dass bei der humanen CD20-negativen prä-B-Zell-Linie PB-697 die Synthese der CD20-mRNA und des CD20-Proteins unter der Wirkung von Phorbol-Estern induziert werden kann (55). Dabei wurden auch zwei CD20-mRNA-Varianten gefunden (2.8- und 3.4 kb) (63). Wegen des schnell eintretenden Effektes vermuten die [Seite 48↓] Autoren, dass sich eine direkte Induktion der CD20-Transkription abspielt (J.W. Sleasman and T.F. Tedder, unveröffentlichte Ergebnisse) (31).

Ergebnisse einer anderen Arbeitsgruppe mit derselben Zell-Linie bewiesen die Induktion von CD20 durch ein nur bei den B-Zellen vorkommendes Oct-2 Transkriptionsprotein (64). Dieselbe Arbeitsgruppe publizierte 1997 Daten von zwei weiteren, die CD20-Transkription regulierenden Proteinen (PU.1/Pip and Basic Helix Loop Helix Zipper Transcription Factors), die die spezifische CD20-Expression abhängig von der Differenzierungsstufe der B-Lymphozyten kontrollieren (65).

Unsere Experimente nach 24-stündiger Inkubation der PB-697-Zell-Linie mit Phorbol12-myristate13-acetate (5 ng PMA/1 x 10 6 Zellen) zeigten eine De-novo- Expression sowohl des klassischen CD20(B1)-Epitops, als auch des FMC7. Es kann zusammengefasst werden, dass zumindest bei der untersuchten Zell-Linie die Transkription des klassischen CD20(B1)- und des CD20(FMC7)-Gen-Produktes durch denselben Mechanismus induziert werden kann.

Zusätzliche Untersuchungen sollten durchgeführt werden, um die Vorgänge aufzuklären, die die Transkription und die Translation der Expressionsvarianten des CD20-Gens sowie auch die Induktion dieser Expression regeln. Die Probleme bei solchen Experimenten könnten teilweise in den Schwierigkeiten bei der genauen immunchemischen Identifizierung der CD20-Molekül-Konformationsvarianten begründet sein. Für eine solche Variante halten wir das FMC7-Epitop. Unsere Versuche, eine reproduzierbare Methode für die immunchemische Identifizierung der FMC7-Variante des CD20-Antigens mittels Westernblotting zu etablieren, blieben ohne Erfolg. Es kann von der Annahme ausgegangen werden, dass die CD20-Mutimer-Variante eine tertiäre oder quaternäre Proteinstruktur voraussetzt. Daher ist es möglich, dass der Misserfolg durch eine Zerstörung dieser Proteinstruktur durch die angewandten chemischen Agenzien begründet ist. Ein indirekter Beweis für die Sensibilität des FMC7-Epitops sind die Probleme, die bei der immunhistochemischen Anwendung des Antikörpers auftreten. Die einzige veröffentlichte Abbildung eines erfolgreichen Immunoblottings mit FMC7 stammt von der Gruppe, die den Antikörper entwickelt hat (22). Darauf beruhen alle im folgenden publizierten Daten, welche von einer Molekülgröße des Antigens von 105 kDa ausgehen. [Seite 49↓] Auf diese Abbildung können jedoch zwei weitere Bänder unterschieden werden, eines von ca. 30 kDa Molekülgewicht und ein weiteres von ca. 65-70 kDa. Diese Tatsache wurde von den Autoren nicht erörtert.

In der Literatur finden sich Hinweise darauf, dass das CD20-Molekül in der Zell-Membran der Homo- oder Heterooligomer-Komplexe bildet. Bubien et al. (41) zeigen in-situ drei Protein-Banden bei nicht-reduzierenden Bedingungen (non-reducing conditions) durch chemische Querbindung (chemical crosslinking) von Plasma-Membran-Proteinen mit nachträglicher Immunpräzipitation von CD20. Die Banden haben eine Molekülgröße von je 33, 70 und 140 kDa, und migrieren bei reduzierenden Bedingungen (reducing conditions) in Richtung der Basis-33 kDa-Bande. Die von den Autoren vorgeschlagene Erklärung ist, dass die Membran-Komplexe, die aus zwei oder vier homologen Einheiten bestehen, eine funktionelle Konfiguration des CD20-Proteins darstellen. Diese Konfiguration ähnelt den gut charakterisierten Membranstrukturen, die als Ionen-Kanäle wirken (der GABA-A-Rezeptor Cl -Kanal, die Glutamat-Rezeptor-Ionen-Kanal-Familie, der Azelylcholin-Rezeptor).

Fest steht, dass das CD20-Antigen zur sogenannten MS4A-Genfamilie (membrane-spanning 4A family) gehört. Zur Letzteren zählt auch die β -Kette des hochaffinen-IgE-Rezeptors (Fc ε RI β ) und HTm4, die auch von hämatopoietischen Zellen exprimiert wird (66) Die Mitglieder dieser Familie sind strukturell verwandt und zeigen eine hohe Homologie in der Aminosäuresequenz. Ihre kodierende Gene liegen nah beieinander auf Chromosom 11 (11q12-q13.1) (66;67). Die drei Proteine beinhalten je vier streng definierte hydrophobe Transmembran-Regionen mit je einem N- und COOH-intrazytoplas-matischen Ende. Fc ε RI β bildet tetramere Komplexe mit α - und β - Ketten (68). Die anderen Proteine, die zur Genfamilie gehören, nehmen höchstwahrscheinlich auch an der Bildung solcher Komplexe teil. Die Autoren, die sich mit der Untersuchung der Eigenschaften dieser Proteine beschäftigen, sind der Auffassung, dass die multimeren CD20-Komplexe tatsächlich heterolog sind und sogar andere Mitglieder der MS4A-Familie einschließen können, da sie sowohl in ihrer Struktur als auch in ihrer Größe ähnlich sind. Solche heterologe Komplexe bilden auch die GABA-A-Rezeptor-Proteine (47). Die homologen Aminosäurensequenzen der Transmembrandomäne der MS4A-Proteine, ihre Strukturähnlichkeit und ihre Position auf der Zellmembran bedingen verwandte [Seite 50↓] funktionelle Eigenschaften. Sie wirken entweder als Ligand-empfindliche Ionen-Kanäle (ligand-gated ion channels), oder als essentielle Komponenten eines Rezeptor-Komplexes (69).

Die gegenwärtig bekannten Daten bestätigen die These, dass der CD20-Protein-Komplex einen Cа 2+ -Kanal darstellt, dessen Eigenschaft, die intrazelluläre Cа 2+ -Konzentration zu steigern, den Übergang der B-Lymphozyten von der G 1 in die S-Phase des Zellzyklus blockiert (36). Die Anwendung der CD20-Antikörper hält diesen Kalzium-Kanal dauerhaft durchlässig, wobei sich wahrscheinlich ein Membran-Komplex Typus „pore“ (ähnlich den Purin-Rezeptoren) bildet (70) und damit eine weitere Proliferation verhindert (71). In diesem Sinne konnte die Identifikation der CD20(FMC7)-Komplexstruktur neue Felder für die CD20-Immuntherapie eröffnen.

Durch den Umstand, dass in seltenen Fällen T-Zell-Neoplasien endogen CD20 exprimieren, gewinnen die unterschiedlichen Varianten des CD20-Antigens an biologischer Bedeutung. Im peripheren Blut und Knochenmark von Patienten ohne maligne Erkrankungen sind auch CD20-positive reife T-Lymphozyten nachgewiesen worden (72-74).

Solange die Untersuchung der CD20- und FMC7-Antigene Bestandteil der meisten immunphänotypischen Panels zur Charakterisierung lymphoproliferativer maligner B-Zell-Erkrankungen ist, hat der definitive Nachweis eines gemeinsamen Membranprotein-Substrats eine konkrete diagnostische Bedeutung. Die FMC7-Positivität ist eine der Grundlagen für die immunphänotypische Differenzierung der nosologischen Entitäten CLL und Non-CLL innerhalb der Gruppe der indolenten malignen lymphoproliferativen B-Zell-Erkrankungen.

Die erste Veröffentlichung über FMC7 als Unterscheidungskriterium der typischen CLL von der B-PLL, stammt von 1981 und der Arbeitsgruppe, die den Antikörper herstellte (Catovsky et al.) (12). Spätere Publikationen anderer Autoren weisen auf das Spektrum der FMC7-positiven Erkrankungen hin (PLL, HCL und andere NHL), indem sie diese von den typischen CLL-Fällen abgrenzten.


[Seite 51↓]

Bei den seltenen Fällen von FMC7-positiven CLL sind Besonderheiten im morphologischen Befund, Varianten in der klinischen Präsentation, assoziierte zytogenetische Ano-malien, Verlaufs- und Überlebensunterschiede der Erkrankung bekannt. 1994 schlugen Matutes et al. ein Punktesystem für die präzise immunphänotypische Abgrenzung der klassischen CLL von den anderen indolenten B-Zell-Neoplasien vor. Der FMC7-Marker ist seither als eines der fünf diagnostischen Grundkriterien akzeptiert (19). Dieselbe Gruppe veröffentlichte 1996 Untersuchungen an 544 CLL-Patienten, bei denen ein höheres Trisomie12-Vorkommen unter den FMC7-positiven CLL-Fällen gefunden wurde (15). Geisler et al. publizierten Daten über eine niedrigere Überlebensrate bei den FMC7-positiven CLL-Fällen in einer Gruppe von 457 Patienten (17).

In fast allen veröffentlichten Auswertungen wurden unterschiedliche quantitative Kriterien für die Festlegung der FMC7-Positivität angewandt. In der ersten Publikation von Catovsky et al. über FMC7-Positivität bei der CLL-Diagnose wurde die FMC7-Fluoreszenz mikroskopisch untersucht. Es wurden nur qualitative Wertungen wie „strongly“- und „weakly“ als positiv angegeben, wobei Kriterien zur Abgrenzung negativer von positiven Befunden lagen nicht vor. In der Veröffentlichung von Scott et al. zeigten 121 von 150 CLL-Fällen nur weniger als 10% schwach FMC7-positive Zellen (78). In der zuvor zitierten Arbeit von Geisler et al. lag die Grenze für die prognostische Bedeutung der FMC7-Positivität bei 50%. Das Punktesystem von Matutes et al. zieht diese Grenze bei 30%. So beruhen die Vergleiche bei der Auswertung der FMC7-Positivität auf verschiedenen subjektiv eingeschätzten Kriterien.

Bei unseren mit Rituximab behandelten Patienten hatten die intensiv CD20-exprimierenden malignen Zellen bei den Non-CLL-Fällen auch eine wesentlich stärkere FMC7-Expression (MFI 61 vs 14 bei CLL, p=0,001). Diese Tatsache ist im Einklang mit den zitierten Literaturangaben bezüglich immunphänotypischer Unterschiede innerhalb der Gruppe indolenter B-Zell-Erkrankungen. Die schwächere CD20-Expression ist eine charakteristische Besonderheit der CLL, die diese Erkrankung von den anderen nosologischen Entitäten dieser Gruppe unterscheidet (6;7). Die festgestellte intensive FMC7-Expression erlaubte eine eindeutige Abgrenzung der FMC7-positiven Population bei den Non-CLL-Fällen im Unterschied zu denen bei CLL (89,3 vs 19,1%, p,0,001).

[Seite 52↓]Die charakteristische schwache FMC7-Expression bei den CLL-Fällen kann nur durch einen zweifarbigen Ansatz (dual-color staining) in Kombination eines anderen B-Zell-Markers (in unserem Panel gegen CD19-PE) zuverlässiger beurteilt werden. Bei der Auswertung eines monochromen Ansatzes (single-color staining) kommt es zu einer Überlappung der schwach exprimierenden Fraktion mit den für das Antigen negativen Zellen.

Die Anwendung eines PE-Konjugats des FMC7-MAK würde die Untersuchung und Analyse der FMC7-negativen oder sehr schwach exprimierenden Zellfraktionen objektiver machen und zu einer besseren Vergleichbarkeit der Fluoreszenzintensitäten beider Epitope des CD20-Antigens beitragen. Zur Zeit wird der FMC7-Antikörper allerdings kommerziell nur stabilisiert als IgM-Isotyp und als FITC-Konjugat angeboten.

Die Zusammenschau der Ergebnisse der Immunphänotypisierung, Zellkultur- und Transfektionsexperimente lässt den eindeutigen Schluss zu, dass FMC7 und CD20 zur gleichen B-Zell-Membranstruktur gehören. Die Expression dieser bisher als unterschiedlich definierten Epitope zeigt eine signifikante Korrelation und wird von derselben Gensequenz gesteuert.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
22.07.2004