In dieser Studie wurden direkt konjugierte monoklonale Antikörper (MAK) benutzt, die in einem Inkubationsschritt an die jeweiligen Zellepitope binden. Die durch die Hersteller empfohlenen chargenbezogenen Antikörperkonzentrationen wurden vor Beginn der Studie laborintern durch Titration überprüft. Die benutzten MAK für die Färbung von etwa 1x10⁶ Leukozyten sind in Tabelle 2.4 aufgelistet. Die benötigten Mengen an Antikörpern pro Ansatz wurden in separaten Gefäßen gemischt und daraus pipettiert, womit die Gefahr des Pipettierens ungleicher Mengen an Antikörpern pro Aliquot im Verlauf der gesamten Untersuchungszeit minimiert wurde.

Es wurde der Anteil der B- (CD45/CD19-positiv) und T-Lymphozyten (CD45/CD3-positiv) als auch der T-Lymphozyten-Subpopulationen (CD4/CD3-positive T-Zellen, CD8/CD3-positive T-Zellen und CD56/CD16 positive und gleichzeitig CD3 negative NK-Zellen) bestimmt.

FITC – Fluoreszeinisothiozyanat, PE- Phycoerythrin; APC – Allophycoerythrin; B-C – Beckman-Coulter

Antigen

Klon

Klasse

Fluoro-chrom

Vol.

(µl)

Detektion von

Hersteller

CD3

SK7

IgG₁

PE

5

Pan-T-Zellen

BD, Heidelberg

CD3

UCHT1

IgG₁

APC

10

Pan-T-Zellen

B-C, München

CD4

13B8.2

IgG₁

FITC

10

T-Helferzellen

Fertigkombination – B-C

CD8

B9.11

IgG₁

PE

T-Supressorzellen

CD5

BL1a

IgG_2a

FITC

10

Pan-T-Zellen

B-C

CD3

UCHT1

IgG₁

FITC

15

NK-Zellen

Fertigkombination – B-C

CD16

3G8

IgG₁

PE

CD56

N901/NKH-1

IgG₁

PE

CD19

J4.119

IgG₁

PE

10

Pan-B-Zellen

B-C

CD20

B9E9 (HRC20)

IgG_2a

FITC

10

Pan-B-Zellen

B-C

CD22

SJ10.1H11

IgG₁

FITC

10

Pan-B-Zellen

B-C

CD23

9P25

IgG₁

FITC

10

B-Zellen

B-C

CD45

2D1

IgG₁

FITC

10

Pan-Leukozyten

BD

FMC7

FMC7

IgM

FITC

10

B-Zellen

B-C

λ-Kette

Polyklonal

IgG₁

FITC

20

B-Zellen, Leichtketten

Fertigkombination – B-C

CD19

J4.119

IgG₁

PE

κ-Kette

Polyklonal

IgG₁

FITC

20

B-Zellen, Leichtketten

Fertigkombination – B-C

CD19

J4.119

IgG₁

PE

Tabelle 2.4: Liste der verwendeten monoklonalen Antikörper.

Die B-Zellpopulation wurde durch die Expression des CD19-Antigens definiert, die Marker für die weitere immunphänotypische Charakterisierung der monoklonalen B-Zell-Population waren: CD5, CD20, CD22, CD23 und FMC7. Die Untersuchung wurde jeweils als Zweifarbenfluoreszenzmessung durchgeführt. Zur Zeit der Ausgangsuntersuchungen war der Anteil der durchflusszytometrisch nachweisbaren monoklonalen Zellen bei den meisten Proben höher als 90% der gesamten B-Zellpopulation. Der Anteil der monoklonalen B-Zell-Population wurde bei der Mehrheit der Patienten mit CLL oder MCL (s. Tab. 2.1), durch die charakteristische Koexpression von CD5 bestimmt. Bei allen Patienten wurde auch die Ig-Leichtkettenexpression (λ oder κ) als Merkmal der Monoklonalität ausgewertet. Die exakte Zusammensetzung des Panels ist in Tabelle 2.5 dargestellt:

Nr.

Zwei-oder Dreiparameterkombination

Zellpopulation

1

CD45 vs CD19

B-Zellen

2

CD45 vs CD3

T-Zellen

3

CD16 und CD56 vs CD3

NK-Zellen

4

CD5 vs CD19

T-Zellen, maligne CLL/MCL-Zellen

5

CD20 vs CD19

B-Zellen

6

CD22 vs CD19

B-Zellen

7

CD23 vs CD19

B-Zellen

8

FMC7 vs CD19

B-Zellen

9

κ vs CD19

B-Zellen

10

λ vs CD19

B-Zellen

11

CD4 vs CD8 vs CD3

T-Helfer- und T-Suppressor-, T-Zellen

Tabelle 2.5: Antikörperkombinationen für die Charakterisierungder Zellpopulationen

Bei den Blutproben von Patienten der Kontrollgruppe (ohne hämatologisch-onkologische Erkrankungen) wurde ausschließlich die CD20- und FMC7-Expression der CD19-positiven Zellpopulation untersucht.

Bei den vorliegenden durchflusszytometrischen Experimenten wurden die Autofluoreszenzen der für den bestimmten Marker negativen mononukleären Zellen als „interne“ Negativkontrolle benutzt. Es wurden daher keine Isotypkontrollen verwendet.

Alle Vollblutproben der Patienten wurden in 2,7 ml K-EDTA S-Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht) abgenommen und bis zur Aufarbeitung für maximal 10 Stunden bei Raumtemperatur gelagert. Die Zellzahl und das Differentialblutbild wurden mit hämatologischen Analyseautomaten bestimmt (Cell-Dyn 3500, Abbott GmbH Diagnostics, Bayer Technicon H3, Bayer Diagnostics GmbH).

Alle Proben mit einer Leukozytenzahl über 10.000 Leukozyten/µl wurden vor der weiteren Verarbeitung durch PBS-Verdünnung (Dulbeco’s PBS, ohne Ca²⁺ und Mg²⁺, Gibco BRL) auf eine Zellkonzentration von ca. 10.000 Leukozyten/µl eingestellt (s. Punkt 2.2.1.1 zur Begründung).

Bei dem gesamten Vollblutmaterial wurde die „Lyse vor der Färbung“ - Präparationsmethode angewandt. Somit wurden die quantitativen Verhältnisse der einzelnen Zellpopulationen im Material gewahrt und eine Bestimmung der Leichtkettenexpression auf den B-Zellen ermöglicht.

Entsprechend des für die erwünschte Immunphänotypisierung ausgewählten Panels, wurden einzelne Röhrchen (4,5 ml, Falcon, BD) vorbereitet, beschriftet und mit jeweils 100 µl Blutvolumen pro Ansatz gefüllt (s. Punkt 2.2.1.1). Das pro Röhrchen anzusetzende Volumen an Untersuchungsmaterial mit einer absoluten Zellzahl von ca. 1x10⁶ Leukozyten pro Ansatz wurde während des ganzen Untersuchungsprozesses konstant gehalten.

Die Erythrozyten wurden wie folgt lysiert:

• Zugabe von 2 ml der Lyse-Gebrauchslösung (Ortho™ ad 100 ml mit Aqua dest. verdünnt, Ortho-Clinical Diagnostics, Johnson & Johnson Co.) zu jedem Ansatz;

• Vortexen und danach für 12 Min. bei Raumtemperatur Inkubieren;

• Zwei Waschschritte zur Entfernung der Lyselösung mittels Zentrifugation für 4 Min. bei 250 g und Raumtemperatur (Megafuge 1.0, Haereus Seratech), anschliessend Absaugen des Überstandes und Resuspendieren des Sediments mit 2 ml PBS (Dulbeco’s PBS, ohne Ca²⁺ und Mg²⁺, Gibco BRL);

• Erneute Zentrifugation unter den o.g. Bedingungen;

• Resuspendieren des Zellpellets mit 100 µl PBS (Dulbeco’s PBS, ohne Ca²⁺ und Mg²⁺, Gibco BRL).

Die Zellen wurden mit den entsprechenden MAK-Kombinationen wie folgt markiert:

• Pipettieren der entsprechenden Mengen Antikörper aus den vorbereiteten Kombinationen in die jeweiligen Röhrchen (s. Tabelle 5);

• Mischen für ca. 2 Sek. mittels Vortex-Gerät;

• Inkubieren für 20 Min. bei Raumtemperatur;

• Ein Waschschritt zur Entfernung der ungebundenen Antikörper unter den beschriebenen Bedingungen (s. Punkt. 2.2.1.3);

• Resuspendieren des Zellpellets mit 200 µl PBS zum Messen.

Die Proben wurden innerhalb von 2 Stunden nach der Aufbereitung, ohne Fixation, gemessen.

Die Datenakquisition bestand aus einer gleichzeitigen Messung von Forward-Scatter (FSC), Side-Scatter (SSC) und von bis zu 3 getrennten Fluoreszenzsignalen der gebundenen Fluorochrom-konjugierten MAK. Für die Immunfluoreszenzanalysen stand ein Durchflusszytometer vom Typ FACSCalibur™ (BD) zur Verfügung. Das Durchflusszytometer war mit zwei Lasern ausgestattet: ein 488 nm Argonlaser für die Fluorochrome FITC und PE und ein 635 nm Red-diode Laser für das Fluorochrom APC. Dadurch wurde eine simultane Messung dieser Dreifarben-Kombinationen ermöglicht.

Die Grundeinstellung der Fluoreszenzsignalverstärkung und der Fluoreszenzkompensation wurde durch Messung von standardisierten herstellerspezifischen Testpartikeln (CaliBRITE™ 3 und CaliBRITE™ APC, BD) mit einem automatisierten Software-Programm (FACSComp™, BD), d.h. Software-gesteuert, regelmässig überprüft. Dadurch wurde das Gerät kalibriert.

Die korrekte Einstellung der FSC- und SSC-Detektoren (im linearen Modus) ermöglichte die Erfassung aller Leukozyten und die deutliche Abgrenzung ihrer Subpopulationen (Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten). Die Verstärkung der Fluoreszenzdetektoren (im logarithmischen Modus) war anhand der Autofluoreszenzintensität nicht gefärbter Lymphozyten so gewählt, dass alle negativen Zellen sich innerhalb der ersten Dekade der Verstärkung befanden. Die Farbkompensation erfolgte durch die Messung einer zweifarbigen, sich gegenseitig ausschließenden Zellmarkerkombination (CD3-FITC/CD19-PE). Die Kompensation wurde für die Fluoreszenz des CD19-Antigens optimiert. Da das Gerät eine gute Stabilität der Messcharakteristika zeigte, blieben die ausgewählten Verstärkungs- und Kompensationsparameter über die Periode der Untersuchungen gleich. Dadurch ließen sich die Akquisitionsdaten der verschiedenen Patienten zu unterschiedlichen Zeitpunkten weitgehend miteinander vergleichen.

Die Messungen wurden mit CellQuest™ (Version 3.1, BD), bei einer mittleren Durchflussrate und einer 256 Kanal-Auflösung durchgeführt.

Während der Datenaufnahme wurden 4 Akquisitions-Standardfenster (Aquisition Dot-plots) auf dem Bildschirm präsentiert: FSC/SSC, FL1/FL2, SSC/FL1, SSC/FL2. Anhand des FSC konnte die diskriminierende Grenze (threshold) zwischen den in die Auswertung eingehenden Zellen (Leukozyten) und dem Debris so gesetzt werden, dass mit Sicherheit alle Lymphozyten in die Messung eingeschlossen wurden, ohne dabei zu viel Verunreinigungsereignisse aufzunehmen. Bei jeder Messung wurden die Daten von 25.000 Zellen registriert, ohne einen Vorauswahl-Speicherparameter zu benutzen, und in Listenmodus gespeichert.

Die gespeicherten Messdaten wurden mit dem gleichen Software Programm (CellQuest™) ausgewertet. Bei der Analyse der Ergebnisse wurde die Expression der untersuchten B-Zellantigene ausschliesslich auf der pathologischen Lymphomzellpopulation berücksichtigt. Es wurde ein graphisches Auswerteprotokoll ausgearbeitet, in dem die Streulicht- und Fluoreszenzsignale der Ziel-Zellpopulation in Form von zweiparametrigen Dot-Plots präsentiert und durch die im Programm definierten Analyseregionen und Quadrantenstatistik ausgewertet wurden (s. Abb. 2.2). Die statistische Angabe der % positiver Zellen bezog sich sowohl auf die Gesamtzahl der gemessenen Zellen, als auch auf die Population der eingegrenzten („Gate“) Zielzellen. Das geometrische Mittel wurde für die Darstellung der Prozentanteile genommen. Zusätzlich wurde die mittlere Floureszenzintensität (MFI auf Anzahl Kanäle bezogen) für den Vergleich der verschiedenen Expressionsstärken benutzt.

Abb. 2.2: Schematische Darstellung der Probenauswertung. R1 - Lymphozyten, bzw. mononukleäre Zellen (A); R2 - CD19-positive Zellen (B); R1+R2 - CD19-positive Zellen mit Lymphozytenage; CD5-Koexpression von CD19-positiven Zellen im Lymphozytengate (C - oberer rechter Quadrant)

Die maligne Zellpopulation ließ sich durch ihre lymphozytenähnlichen Streulichtcharakteristika und die gleichzeitige Expression mehrerer B-Zellantigene identifizieren. Daraufhin wurde zuerst eine Region als Lymphozytengate (R1) hinsichtlich der beiden Streulichtparameter definiert. Da die deutliche Abgrenzung der lymphoiden Population nicht immer möglich war, wurde diese Region zunächst hinsichtlich des SSC z.T. breiter gesetzt, so dass sie die ganze mononukleäre Zellpopulation erfasste.

Die Definition einer zweiten B-Lymphozytenregion (“Region 2” – R2) auf den CD19-positiven Zellen erfolgte bei der graphischen Wiedergabe der Fluoreszenzen der CD5/CD19-Messung. Bei den meisten untersuchten Patienten, die die Diagnosen "CLL" oder "MCL" hatten, ließ sich die maligne Zellpopulation anhand der CD5-Koexpression am besten unterscheiden (2).

Nach einer elektronischen Verknüpfung der beiden bereits definierten Regionen (R1 und R2), wurde ein drittes logisches Fenster („Gate 3“ – R1+R2) erstellt, so dass die Zielzellpopulation über mehrere Eingrenzungskriterien (Streulichtparameter der Lymphozyten, CD19-Expression, CD5-Expression) zugeordnet werden konnte. So sollten alle durchflusszytometrisch nachweisbaren B-Zellen innerhalb von R3 erfasst werden. Die durch R3 definierten Messergebnisse wurden auf einem neuen FSC-SSC-Dot-Plot durch sog. “Back-Gating” präsentiert und mußten eine einheitliche Population im Bereich der mononukleären Zellen bilden.

Die Bestimmung des relativen Anteils der B-, T- und NK-Zellen, und auch der T-Lymphozytensubpopulationen (T-Helfer- und T-Suppressorzellen) erfolgte bezogen auf die gesamte gemessene Leukozytenpopulation. Die Lymphozytenpopulation wurde in den Messungen CD45-FITC/CD19-PE und CD45-FITC/CD3-PE als CD45-positiv definiert. Die T-Zellsubpopulationen wurden innerhalb der CD3-positiven Zellen mit einer Dreifarben-Kombination (CD4-FITC/CD8-PE/CD3-APC) bestimmt. Die NK-Zellen wurden mit dem CD3-FITC/CD16-PE/CD56-PE Ansatz als CD3-negativ und CD16/CD56-positiv quantifiziert.

Die absolute Zellzahl der verschiedenen Populationen wurde anhand der mit dem Zellzahlautomaten gemessenen Leukozytenzahl und dem Differentialblutbild ermittelt.

Bei der Analyse der untersuchten B-Zellantigene wurden nur solche Ereignisse berücksichtigt, die innerhalb von Gate 3 lagen.

Die Fluoreszenzen der jeweiligen Antigene auf der B-Zellpopulation wurden in korrelierenden Zweiparameter-Dot-Plots präsentiert. Die Positionierung der Quadrantendiskriminatoren zur Abgrenzung doppelt positiver Zellen orientierte sich generell an der Verteilung der Autofluoreszenz der für den jeweiligen Marker negativen Zellen (s. Abb. 2.2). Für alle Messanalysen des gleichen Patienten wurde die Position der Quadrantenmarker während der Verlaufsbeobachtung beibehalten.

Die simultane graphische Präsentation der Fluoreszenzsignale sowohl auf der B-Zellpopulation im Gate 3, als auch auf den gesamten Zellereignissen im Lymphozytengate (R1) erlaubte einen Vergleich der Fluoreszenzintensitäten für bestimmte Antigene zwischen den verschiedenen Zellpopulationen in diesem Bereich (T-Lymphozyten, Monozyten, Zielzell-Population).

Die Zell-Linien wurden für die Untersuchungsperiode in komplettem Medium (s.u.) und in exponentieller Wachstumsphase gehalten. Das Medium hatte folgende Zusammensetzung (alles von Gibco BRL): RPMI-1640 mit GlutaMax™; 10% FKS (fötales Kälberserum), 1% Penicillin-G/Streptomycin Sulfat (10 µg/ml und 25 µg/ml Endkonzentration) und 1% Natriumpyruvat. Die Zellen wurden wie folgt kultiviert:

• Auftauen der eingefrorenen Zell-Linien bei 37°C im Wasserbad;

• Zwei Waschschritte zur Entfernung des Kryoprotektors (DMSO) durch Resuspendieren in Medium und Zentrifugation für 10 Min. bei Raumtemperatur und 400 g;

• Resuspendieren des Zellpellets in Medium;

• Überführen in Zellkulturflaschen (BD, Heidelberg) und Inkubation bei 37°C, 5% CO₂, 95% Luftfeuchtigkeit im Brutschrank

• Weiterhin permanentes Aussäen – in einer den optimalen Aussaatbedingungen entsprechenden Zelldichte.

Dabei wurde die Zellzahl mittels Analyseautomat und die Vitalität mittels Trypanblau-Färbung unter Lichtmikroskop kontrolliert. Die für die einzelnen Experimente benötigten Zellmengen wurden nach Zellzahlbestimmung, einem Waschschritt mit Medium und Resuspendieren des Pellets in der entsprechenden Menge Medium vorbereitet.

Das bei den beschriebenen Transfektionsexperimenten verwendete CD20-Plasmid wurde von Prof. David Mason (Dept. of Cellular Science, University of Oxford, John Radcliffe Hospital, UK) zur Verfügung gestellt. Es hatte die Struktur des bekannten CD20-cDNA Klones pB1-21A-29 (33).

Das 1,2-kb CD20-cDNA Insert ist unter Kontrolle eines CMV-Promotors in dem Plasmid-Vektor pCDM8 subkloniert. Das Konstrukt hat eine Größe von 8000 bp, ist Kanamycin resistent und wurde in der Literatur als effektiv bei der Transfektion von T-Zell-Linien (COS-1) beschreiben (56).

Bei den vorliegenden Experimenten mit der myeloischen K-562-Zell-Linie wurde eine transiente CD20-cDNA-Transfektion mittels Elektroporation erreicht. Diese Transfektionsmethode basiert auf der Möglichkeit, die Zellmembran mittels hochintensiver elektrischer Pulse kurzfristig zu destabilisieren und so eine Permeabilität für die exogenen DNA-Moleküle zu erzielen. Die optimalen DNA-Mengen wurden im Laufe der Experimente anhand der durchflusszytometrisch gemessenen Transfektionseffizienz bestimmt, sie lagen zwischen 2 und 5 µg Plasmid-DNA/1x10⁶ myeloische Zellen.

Die benötigte Zellsuspension wurde sedimentiert, in 500 µl Medium resuspendiert und in 4 mm-Elektroporationsküvetten (ECU-104, PEQLAB) überführt. Zu jeder Probe wurde die entsprechende Menge vom Plasmid oder dem pCDM8 Mock-Vektor als Kontrolle zugegeben. Die Elektroporation erfolgte durch das EquiBio-System (Boughton Monchelsea Kent, UK) unter folgenden technischen Bedingungen: 1050 microfarads (µF), 260V.Anschließend wurden die Zellen schnell in 10 ml komplettem Medium resuspendiert, für 120-Stunden weiter inkubiert und analysiert.