Veränderungen von B-Zellantigenen unter Rituximab-Therapie:FMC7 ist Teil des CD20-Antigenkomplexes Maya Jordanova1.1234562.72.1.2.1.1.2.1.2.2.1.2.1.82.1.2.2.92.1.2.3.102.1.3.2.1.4.112.2.2.2.1.2.2.1.1.12132.2.1.2.142.2.1.3.152.2.1.4.2.2.1.5.162.2.1.6.17182.2.1.7.2.2.1.8.192.2.2.2.2.2.1.202.2.2.2.212.2.2.3.22232.2.2.4.2.3.243.253.1.3.1.1.3.1.1.1.26273.1.1.2.28293.1.2.303.1.2.1.313233343.1.2.2.35363.2.373.3.383.4.3.4.1.393.4.2.403.5.4.4142434445464748495051525.5354 Schriftenverzeichnis555657585960Erklärung an Eides StattDanksagungdeInhaltsverzeichnisHilfeAus der Medizinischen Klinik
mit Schwerpunkt Hämatologie und Onkologie, CVK
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin DISSERTATION <strong>Veränderungen von B-Zellantigenen unter Rituximab-Therapie:<br/>FMC7 ist Teil des CD20-Antigenkomplexes</strong> Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)Vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlinvon Maya Jordanova aus Sofia, Bulgarien Prof. Dr. Joachim Dudenhausen Prof. Dr. B. Dörken Prof. Dr. I. Schmidt-Wolf Prof. Dr. H. Stein eingereicht: 09.07.2003Datum der Promotion: 25.06.2004 Zusammenfassung

Das FMC7-Antigen, eine unbekannte B-Zell-Membranstruktur, dient als eines der immunphänotypischen Grundkriterien zur Diagnose der typischen B-CLL. Die unterschiedliche CD20-Expressionsintensität ist auch ein charakteristisches Merkmal bei der Subtypisierung der Lymphomentitäten. In der vorliegenden Arbeit wurde die Modulation des CD20- und des FMC7-Antigens während einer Therapie mit CD20-Antikörper (Rituximab) bei Patienten mit indolenten B-Zell-Lymphomen untersucht. Bei der durchflusszytometrischen Untersuchung quantitativer und qualitativer Charakteristika der monoklonalen B-Zell-Population bei CLL- (n=12) und Non-CLL-Patienten (n=10) unmittelbar nach der Antikörperinfusion und bis zur 8. Woche nach der Therapie wurden parallele Veränderungen von FMC7 und CD20 festgestellt. Die Anzahl und die Fluoreszenzintensitäten der für die beiden Antigene positiven Zellen korrelierten signifikant sowohl bei der malignen Zell-Population (Kurzzeitbeobachtung: n=89; r=0,9; p<0,001 und Langzeitbeobachtung: n=97; r=0,7; p<0,001), als auch bei polyklonalen B-Lymphozyten in Kontroll-Blutproben von hämatologisch gesunden Probanden (n=40; r=0,9; p<0,0001). Blockierungsexperimente mit unkonjugierten CD20- und FMC7-Antikörpern zeigten, dass CD20-MAK die Bindung von FMC7-MAK ebenso blockiert wie FMC7-MAK in der Lage ist, die Bindung von CD20-MAK zu hemmen. Dieser Effekt wurde bei den B-Zell-Linien CESS, DAUDI und JVM beobachtet. Bei der CD20(B1)-negativen prä-B-Zell-Linie PB-697 ist nach Induktion einer CD20- Expression durch PMA (Phorbol12-myristate13-acetate) auch eine parallele FMC7-Antigenexpression zu beobachten. Die mittels Elektroporation durchgeführte Transfektion der myeloischen K-562 Zell-Linie mit für CD20 kodierender cDNA induzierte sowohl eine De-novo-Expression des CD20(B1)-Antigens, als auch eine Expression des vom FMC7-Antikörper erkannten Epitops. Diese Experimente erbrachten Hinweise dafür, dass die Membranstruktur, an die der FMC7-Antikörper bindet, von der CD20-Gensequenz kodiert wird.

 CD20, FMC7 B-CLL indolente B-Zell-Lymphome Abstract

The FMC7, although being an unknown structure of the B-cell membrane, represents one of the basic immunophenotypic criteria for the diagnosis of the typical B-CLL. A different CD20 expression is a characteristic sign for the sub-typing of lymphomas also. The underlying study investigated the qualitative and quantitative modulation of the CD20 and FMC7 antigens in patients with indolent B-cell lymphomas (CLL, n=12 and non-CLL, n=10) during the therapy with a CD20 antibody (rituximab). Concomitant changes of FMC7 and CD20 expression were found immediately after rituximab infusion and up to 8 weeks thereafter. A correlation was seen for the number of positive malignant cells and for the corresponding fluorescence intensity (short-time observation n=89; r=0.9; p<0.001 and long-time observation: n=97; r=0.7; p<0.001) of both antigens. Similar significant correlations were observed within the polyclonal B-cell subset of hematologically healthy individuals (n=40; r=0.9; p<0.0001). Blocking experiments with cold CD20 or FMC7 antibodies with the B-cell lines CESS, DAUDI and JVM revealed a mutual abrogation of binding for the corresponding counterpart. PMA (phorbol12-myristate13-acetate) induced simultaneous expression of CD20 and FMC7 antigens in the CD20(B1)-negative pre-B-cell line PB-697. Transient transfection with the coding sequence (cDNA) for CD20 via electroporation led to a de novo expression of both antigens, identified by the CD20(B1) or the FMC7 antibody, respectively. These experiments supplied evidences that the membrane structure, recognized by the FMC7 antibody, is encoded by the CD20 gene sequence.

 CD20 FMC7 B-CLL Indolent B-cell lymphomas In Memoriam

Herrn Prof. Dr. S. Serke danke ich für die Überlassung des Themas, seine Freundschaft und seine Unterstützung.

Inhaltsverzeichnis

  • 1.  EINLEITUNG

  • 2.  MATERIAL und METHODEN

    • 2.1. Material

      • 2.1.1. Untersuchte Proben

      • 2.1.2. Patienten

        • 2.1.2.1. Charakteristika

        • 2.1.2.2.  Rituximab-Behandlung

        • 2.1.2.3. Probenentnahme

      • 2.1.3. Kontrollgruppe

      • 2.1.4. Zell-Linien

    • 2.2. Methoden

      • 2.2.1. Untersuchungen an peripherem Blut

        • 2.2.1.1. Antikörperpanel

        • 2.2.1.2. Blutentnahme und Vorbereitung

        • 2.2.1.3. Erythrozytenlyse

        • 2.2.1.4. Färbung

        • 2.2.1.5. Geräteeinstellung, Datenakquisition, Parameterdarstellung

        • 2.2.1.6. Auswertung – logische Verknüpfungen

        • 2.2.1.7. Auswertung der Lymphozytenpopulationen

        • 2.2.1.8. Auswertung der malignen B-Zellpopulation

      • 2.2.2. Untersuchungen mit Zell-Linien

        • 2.2.2.1. Kultivieren der Zellen

        • 2.2.2.2. CD20-Plasmid und Transfektion

        • 2.2.2.3. Blockierungsexperimente mit B-Zell-Linien

        • 2.2.2.4. Aktivierungsexperimente mit PMA

    • 2.3. Statistik

  • 3.  ERGEBNISSE

    • 3.1. Mit Rituximab-behandelte Patienten

      • 3.1.1. Leukozytenzahl, Differentialblutbild und Lymphozytenpopulationen

        • 3.1.1.1. Kurzzeit-Verlauf (24 Stunden)

        • 3.1.1.2. Langzeit - Verlauf (4 Applikationen und 8 Wochen danach)

      • 3.1.2. Immunphänotypische Veränderungen der B-Zellpopulation

        • 3.1.2.1. Kurzzeit-Verlauf

        • 3.1.2.2.  Langzeit-Verlauf

    • 3.2. Kontrollgruppe

    • 3.3. Transfektionsexperimente mit der myeloischen K-562 Zell-Linie

    • 3.4. Blockierungsexperimente mit B-Zell-Linien

      • 3.4.1. Blockierungsexperimente mit den CESS-, DAUDI- und JVM-Zell-Linien unter der Wirkung von CD20- und FMC7-MAK

      • 3.4.2.  Antigen-Modulationsexperimente mit CESS- und JVM-Zell-Linien unter der Wirkung von CD20- und FMC7-MAK

    • 3.5. Aktivierungsexperimente mit der prä-B-Zell-Linie PB-697 unter PMA-Wirkung

  • 4.  Diskussion

  • 5.  Zusammenfassung

  • Schriftenverzeichnis
  • Erklärung an Eides Statt
  • Danksagung
Tabellen

  • Tabelle 1.1:Immunphänotypische Charakteristika der B-Zell-lymphoproliferativen Erkrankungen.

  • Tabelle 1.2: Scoring System für die B-CLL* (19)

  • Tabelle 2.1

  • Tabelle 2.2: Applikationsschema für die erste Rituximab-Gabe

  • Tabelle 2.3: Verwendete Zell-Linien

  • Tabelle 2.4: Liste der verwendeten monoklonalen Antikörper.

  • Tabelle 2.5: Antikörperkombinationen für die Charakterisierungder Zellpopulationen

  • Tabelle 2.6:Liste und Charakteristika der für die Blockierungsexperimente verwendeten MAK.

  • Tabelle 3.1: Medianwerte der CD23-MFI (Minima und Maxima)

Bilder

  • Abb. 1.1: Schematische Darstellung der CD20-Antigenstruktur (31)

  • Abb. 2.1: Schematische Darstellung der Rituximab-Applikationen () und der Probenentnahmen ():A - Kurzzeit-Beobachtung (bis 24 Std.)B - Langzeit-Beobachtung (bis 8. Woche nach Therapie - W.n.T.)

  • Abb. 2.2: Schematische Darstellung der Probenauswertung. R1 - Lymphozyten, bzw. mononukleäre Zellen (A); R2 - CD19-positive Zellen (B); R1+R2 - CD19-positive Zellen mit Lymphozytenage; CD5-Koexpression von CD19-positiven Zellen im Lymphozytengate (C - oberer rechter Quadrant)

  • Abb. 3.1: Veränderungen der Leukozytenzahl (Median, Streuung) während der Kurzzeit-Beobachtung.* - signifikante Veränderungen zum Ausgangswert (p<0,05)

  • Abb. 3.2: Veränderungen der Lymphozytenzahl (Median, Streuung) während der Kurzzeit-Beobachtung.* - signifikante Veränderungen zum Ausgangswert (p<0,05)

  • Abb. 3.3: Veränderungen der B-Lymphozytenzahl (Median, Streuung) während der Kurzzeit-Beobachtung.* - signifikante Veränderungen zum Ausgangswert (p<0,05)

  • Abb. 3.4: Veränderungen der Leukozytenzahl (Median, Streuung) während der Langzeit-Beobachtung.Keine signifikante Veränderungen zum Ausgangswert

  • Abb. 3.5: Veränderungen der Lymphozytenzahl (Median, Streuung) während der Langzeit-Beobachtung.Keine signifikante Veränderungen zum Ausgangswert

  • Abb. 3.6: Veränderungen der B-Lymphozytenzahl (Median, Streuung) während der Langzeit-Beobachtung.Keine signifikante Veränderungen zum Ausgangswert

  • Abb. 3.7: Veränderungen des Prozentanteils CD20- und FMC7-positiver B-Lymphozyten während der Kurzzeit-Beobachtung. Korrelationskoeffizient r=0,73; p<0,0001.

  • Abb. 3.8: Veränderungen der MFI CD20- und FMC7-positiver B-Lymphozyten während der Kurzzeit-Beobachtung. Korrelationseffizient r=0,79; p<0,0001.

  • Abb. 3.9a: Veränderungen des Prozentanteils CD23-positiver B-Lymphozyten während der Kurzzeit-Beobachtung.

  • Abb. 3.9b: Veränderungen der MFI der CD23-positiver B-Lymphozyten während der Kurzzeit-Beobachtung.

  • Abb. 3.10: Kurzzeit-Untersuchungsverlauf bei einem der behandelten Patienten. In den ersten zwei Reihen ist die unter Rituximab-Behandlung eintretende typische Reduktion der CD20- und FMC7-Expression gezeigt. Die dritte Reihe zeigt die CD-22-Expression, welche keine Veränderungen aufweist.

  • Abb. 3.11: Veränderungen des Prozentanteils CD20- und FMC7-positiver B-Lymphozyten während der Langzeit-Beobachtung. Korrelationskoeffizient r=0,7; p<0,0001.

  • Abb. 3.12: Veränderungen der MFI CD20- und FMC7-positiver B-Lymphozyten während der Langzeit-Beobachtung. Korrelationskoeffizient r=0,85; p<0,0001.

  • Abbildung 3.13: De-novo-Koexpression von CD20- und FMC7-Antigen bei der K562-Zell-Linie nach Transfektion mit 5 μg CD20-Plasmid. A - Kontrolle, B - CD20-Expression (R1 ca. 15%), C - FMC7-Expression (R2 ca. 7%), D - Koexpression von CD20 und FMC7 (R3 ca. 7%)

  • Abb. 3.14: Blockierungsexperimente bei den Zell-Linien: JVM (linke Spalte), CESS (mittlere Spalte) und DAUDI (rechte Spalte). In den Reihen A und D ist der Ausgangsphänotyp mit konstitutiver CD20- und FMC7-Antigenexpression, in den Reihen B und E der Phänotyp nach Blockierung mit dem unkonjugierten CD20(B1)-Antikörper und in den Reihen C und F der Phänotyp nach Blockierung mit dem unkonjugierten FMC7-Antikörper gezeigt.

  • Abb. 3.15: Modulation der CD20- und FMC7-Antigenexpression bei PB697-Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit PMA (5ng auf 5x105 Zellen)