Jürchott, Karsten: Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation und zu den Funktionen von YB-1, einem Y-Box-Protein in Säugerzellen

Aus dem Institut für Biologie der Humboldt-Universität Berlin


DISSERTATION
Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation und zu den Funktionen von YB-1, einem Y-Box-Protein in Säugerzellen

zur Erlangung des Dr. rer. nat.

der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

von Dipl.-Biochemiker Karsten Jürchott ,
geb. am 16.1.1968 in Schwedt/O.

Dekan: Prof. Dr. Jürgen P. Rabe

Gutachter:
Prof. Dr. Harald Saumweber
PD Dr. Hans-Dieter Royer
Prof. Dr. Udo Heinemann

eingereicht: 10.06.1999

Datum der Promotion: 23.11.1999


ii

Abstrakt

YB-1, ein Y-Box-Protein in Säugerzellen, konnte sowohl im Zytoplasma als auch in den Zellkernen von HeLa-Zellen nachgewiesen werden. Es wurde eine Abhängigkeit der intrazellulären Lokalisation von YB-1 vom Verlauf des Zellzyklus beobachtet. In jeder Phase des Zellzyklus war YB-1 im Zytoplasma zu finden. Eine Kernlokalisation von YB- 1 konnte nur in den HeLa-Zellen festgestellt werden, die sich im Übergang von der G1- in die S-Phase oder in der frühen S-Phase des Zellzyklus befanden. Die Abhängigkeit der Lokalisation von YB-1 vom Verlauf des Zellzyklus unterstützt die These, daß YB-1 und andere Y-Box-Proteine an der Regulation der Zellproliferation beteiligt sind.

Es wurden verschiedene Proteine identifiziert, die im Zytoplasma von HeLa-Zellen mit YB-1 assoziiert vorkommen. Alle identifizierten Proteine erfüllen Aufgaben im RNA-Metabolismus, was auf eine Beteiligung dieser Proteinkomplexe an der Regulation der mRNA hinweist. Die Interaktion von P32/SF2 (P35) mit YB-1 erwies sich als abhängig vom Zellzyklus, wobei eine maximale Assoziation dieser beiden Proteine beim Übergang der HeLa-Zellen von der G1- in die S-Phase zu beobachten war. In Multidrug-resistenten MCF7/ADR-Zellen konnte eine deutlich verstärkte Interaktion von P32/SF2 mit YB-1 im Vergleich zu den sensitiven MCF7-Zellen festgestellt werden.

Im Zytoplasma von HeLa-Zellen konnte YB-1 in Verbindung mit membrangebundenen Polysomen nachgewiesen werden. Eine Assoziation von YB-1 mit freien oder zytoskelettgebundenen Polysomen konnte nicht festgestellt werden. Damit wurde erstmalig gezeigt, daß YB-1 eine Spezifität für eine bestimmte Gruppe von Polysomen besitzt. Die Assoziation mit membrangebundenen Polysomen legte die Vermutung nahe, daß YB-1 an der Translationskontrolle von Polypeptiden beteiligt ist, die am rauhen endoplasmatischen Retikulum synthetisiert werden. Es konnte gezeigt werden, daß YB-1 die Translation von P-Glykoprotein, einem integralen Membranprotein, positiv reguliert. Ein Einfluß auf die Translation der untersuchten sekretorischen Proteine (alpha-Faktor und Präprolactin) konnte nicht beobachtet werden. Diese Ergebnisse belegen, daß YB-1 ein spezifischer Regulator der Translation bestimmter Membranproteine ist.

Am Hand von P-Glykoprotein konnte des weiteren demonstriert werden, daß YB-1 sowohl die Transkription als auch die Translation dieses Proteins positiv reguliert. Die in den Zellkulturen beobachtete Korrelation von YB-1 mit der Expression von P-


iii

Glykoprotein konnte auch in primären Mammakarzinomen nachgewiesen werden. Somit ist YB-1 ein entscheidender Faktor bei der Ausbildung einer intrinsischen multiplen Resistenz von Mammakarzinomen gegen die Behandlung mit Chemotherapeutika. Aus diesem Grunde könnte YB-1 einen Ansatzpunkt für die künftige Diagnose und Therapie von Mammakarzinomen und eventuell auch von anderen Tumoren bieten.

Schlagwörter:
YB-1, MDR1, Genregulation, Mammakarzinom


iv

Abstract

YB-1, a mammalian Y-box protein was detected in the cytoplasm as well as in the nuclei of HeLa cells. The intracellular localisation of YB-1 depends on the cell cycle. In every part of the cell cycle, YB-1 was found in the cytoplasm. A nuclear localisation of YB-1 was only detectable in the G1- to S-phase transition and in the early S-phase. These observations underline the hypothesis, that Y-box proteins are envolved in the regulation of cell proliferation.

Different proteins interacting with YB-1 were identified in the cytoplasm of HeLa cells. All identified proteins are envolved in the RNA metabolism, indicating a role of these protein complexes in the regulation of mRNA. The interaction of P32/SF2 (P35) with YB-1 alternates during the cell cycle with a maximum at the G1- to S-phase transition. A remarkable increase of the association of YB-1 and P32 was observed in the multidrug-resistant MCF7 cells compared with the parental cell line.

Furthermore, YB-1 was detected in association with membrane-bound polysomes, suggesting a role of YB-1 at the translational regulation of the synthesis of polypeptides at the rough endoplasmic reticulum. It was shown, that YB-1 stimulate the translation of P-glycoprotein. This influence is specific, beause the translation of a set of control proteins (alpha factor, preprolactin, luciferase) was not effected by YB-1.

It was shown, that YB-1 stimulate the expression of P-glycoprotein at the level of transcription as well as at the level of translation. This indicates a central role of YB-1 in the regulation of the biosynthesis of this protein. The correlation of the nuclear expression of YB-1 and the expression of P-glycoprotein was demonstrated in primary breast cancers. Taken together, YB-1 is a important factor for the development of a resistant phenotyp and therefore a possible new target for anti-cancer therapy.

Keywords:
YB-1, MDR1, gene regulation, mammacarcinom


Seiten: [ii] [iii] [iv] [ix] [x] [xi] [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [101] [102] [103] [104] [105] [106] [107]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteUntersuchungen zur subzellulären Lokalisation und zu den Funktionen von YB-1, einem Y-Box-Protein in Säugerzellen
Danksagung
Abkürzungsverzeichnis Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
1 Einführung
1.1Definition der Familie der Y-Box-Proteine
1.2Prokaryontische Y-Box-Proteine
1.2.1Struktur der prokaryontischen Y-Box-Proteine
1.2.2Expression der prokaryontischen Y-Box-Proteine
1.2.3Funktion der prokaryontischen Y-Box-Proteine
1.3Eukaryontische Y-Box-Proteine
1.3.1Struktur der eukaryontischen Y-Box-Proteine
1.3.2Expressionsmuster der eukaryontischen Y-Box-Proteine
1.3.3Bindung von eukaryontischen Y-Box-Proteinen an spezifische DNA-Sequenzen
1.3.4Regulation der Transkription durch eukaryontische Y-Box-Proteine
1.3.5Interaktion von eukaryontischen Y-Box-Proteinen mit RNA-Molekülen
1.3.6Regulation der Translation durch eukaryontische Y-Box-Proteine
1.3.6.1Aufbau und Funktion der mRNP (messenger ribonucleoprotein particle)
1.3.6.2Eukaryontische Y-Box-Proteine als Bestandteile der mRNP in Keimzellen
1.3.6.3Eukaryontische Y-Box-Proteine als Bestandteile der mRNP in somatischen Zellen
1.4Biologische Funktionen der Y-Box-Proteine
1.4.1Beteiligung von Y-Box-Proteinen an der Reaktion auf Streßreize
1.4.2Die Rolle von Y-Box-Proteinen bei der Zellproliferation
1.5Zielstellung der Arbeit
2 Materialien
2.1Chemikalien
2.2Molekulargewichtsmarker
2.3Antikörper
2.4Kits
2.5Filter und Membranen
2.6Filmmaterialien und Verstärkerfolien
2.7Technische Geräte
2.8Materialien für Zellkulturversuche
3 Methoden
3.1Zellkultur
3.1.1Allgemeines
3.1.2Zellzyklussynchronisierung der HeLa-Zellen
3.2Zellysate und -fraktionierungstechniken
3.2.1Gesamtzellysat
3.2.2Zellaufschluß
3.2.3Sequentielle Extraktion von HeLa-Zellen
3.2.4Präparation von Hundepankreasmikrosomen
3.3Immunologische Methoden
3.3.1Affinitätsreinigung des Peptidantiserums gegen YB-1
3.3.2Immunoblotanalyse
3.3.3Immunpräzipitation
3.3.3.1Biotinmarkierung von Proteinen
3.3.3.2Koimmunpräzipitation mit alpha-YB-1
3.3.4Indirekte Immunfluoreszenzanalysen
3.3.5Immunhistochemie
3.4RNA-Analyse
3.4.1Isolierung von RNA
3.4.2Elektrophoretische Auftrennung von RNA
3.4.3In-vitro-Transkription
3.5In-vitro-Translation
3.5.1Depletion des Retikulozytenlysates
3.5.2Hochsalzwaschen von rauhen Mikrosomen
3.5.3In-vitro-Translation
3.6Saccharosegradientenzentrifugation
3.7Proteinfällung und -konzentrationsbestimmung
3.7.1Proteinfällung mit TCA
3.7.2Bestimmung der Proteinkonzentration
3.8Proteinfärbungen
3.8.1Färbung mit Coomassieblau
3.8.2Färbung mit Silbernitrat
3.8.3Färbung mit Amidoschwarz
4 Ergebnisse
4.1Untersuchung der subzellulären Lokalisation von YB-1
4.1.1Herstellung eines polyklonalen Peptidantiserums gegen YB-1
4.1.2Untersuchung der subzellulären Verteilung von YB-1 in logarithmisch wachsenden HeLa- und MCF7-Zellen
4.1.3Untersuchung der subzellulären Lokalisation von YB-1 in synchronisierten HeLa-Zellen
4.2Identifikation eines durch YB-1 regulierten Genes
4.2.1Regulation der Transkription von mdr1 durch YB-1
4.2.2Immunhistochemischer Nachweis von YB-1 in Mammakarzinomen
4.2.3Korrelation der Kernlokalisation von YB-1 mit der Expression von P-Glykoprotein in primären Mammakarzinomen
4.3Charakterisierung von zytoplasmatischen Bindungspartnern von YB-1
4.3.1Koimmunpräzipitation mit alpha-YB-1
4.3.2Untersuchungen zur Assoziation von P35 mit YB-1
4.3.3Reinigung von YB-1 bindenden Proteinen mittels Affinitätschromatographie
4.4Untersuchung der Rolle von YB-1 bei der Translationskontrolle
4.4.1Untersuchung der polysomalen Assoziation von YB-1
4.4.2Die Rolle von YB-1 bei der Kontrolle der Translation der mRNA von P-Glykoprotein
5 Diskussion
5.1Zellzyklusregulation der subzellulären Lokalisation von YB-1
5.2Regulation der Transkription des mdr1-Gens durch YB-1
5.3Deregulation von YB-1 in primären Mammakarzinomen: Ein molekularer Mechanismus der intrinsischen Multidrug-Resistenz
5.4YB-1 als Bestandteil zytoplasmatischer Proteinkomplexe
5.5Identifikation von YB-1-bindenden Proteinen
5.6Die Rolle von YB-1 bei der Translationskontrolle von P-Glykoprotein
Bibliographie Literaturverzeichnis
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Immunoblotanalyse mit einem polyklonalen Peptidantiserum gegen YB-1 (alpha-YB-1)
Hundepankreasmikrosomen (Bahnen 1 und 3) und HeLa-Zellen (Bahnen 2 und 4) wurden in SDS-Probenpuffer lysiert. Die Proteine der Lysate wurden in einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt, und auf Nitrozellulose transferiert. Die Membran wurde über Nacht mit alpha-YB-1 inkubiert. In einem parallel durchgeführten Kontrollexperiment wurde alpha-YB-1 zunächst mit einem Überschuß des für die Herstellung der Antikörper verwendeten Peptids vorinkubiert und danach für die Inkubation mit der Nitrozellulosemembran eingesetzt (Bahnen 3 und 4). Die gebundenen Antikörper wurden mit dem ECL-System (Amersham) nachgewiesen.
Abbildung 2: Immunfluoreszenzanalyse von unsynchronisierten HeLa-Zellen mit alpha-YB-1
Exponentiell wachsende HeLa-Zellen wurden 10 Minuten lang bei -20 oC in einem Gemisch von Aceton und Methanol (1:1) fixiert. Nach dem Vorblocken in PBS mit 1,5% Pferdeserum wurden die HeLa-Zellen für 30 Minuten mit alpha-YB-1 (A), ohne alpha-YB-1 (B) oder mit alpha-YB-1 und einem Überschuß des für die Immunisierung verwendeten Peptids (C) inkubiert. Als zweite Antikörper wurden mit Fluorescein markierte Anti-Kaninchen-IgG-F(ab')2-Fragmente verwendet.
Abbildung 3: Analyse von unsynchronisierten MCF7-Zellen in der doppelten Immunfluoreszenz mit alpha-YB-1 und monoklonalen Antikörpern gegen Cyclin E
Exponentiell wachsende MCF7-Zellen wurden 10 min lang bei -20 oC in Aceton/Methanol fixiert. Nach dem Vorblocken in PBS mit 1,5% Pferdeserum wurden die Zellen mit alpha-YB-1 (Verdünnung 1:200) und monoklonalen Antikörpern gegen Cyclin E (Verdünnung 1:50) inkubiert. Als zweite Antikörper wurden mit Fluorescein markierte Anti-Kaninchen-IgG-F(ab')2-Fragmente und mit Rhodamin markierte Anti-Maus-Ig-F(ab')2-Fragmente verwendet. Die Auswertung der Präperate erfolgte durch CLSM (Confocal Laser Scanning Mikroscopy).
Abbildung 4: Schema der Zellzyklussynchronisierung von Zellen
Abbildung 5: Immunfluoreszenzanalyse von mit Lovastatin synchronisierten HeLa-Zellen
HeLa-Zellen wurden auf Objektträgern kultiviert, und für 24 Stunden mit Lovastatin (20 µM) inkubiert. Nach dem Wechsel des Mediums wurden die HeLa-Zellen weiter kultiviert und nach den in der Abbildung angegebenen Zeiten 10 Minuten lang in Aceton/Methanol bei -20 oC fixiert. Die fixierten HeLa-Zellen wurden dann wie oben beschrieben mit alpha-YB-1 und monoklonalen Antikörpern gegen Cyclin E gefärbt.
Abbildung 6: FACS-Analyse der mit Aphidicolin synchronisierten HeLa-Zellen
Die HeLa-Zellen wurden für 24 Stunden in einem Medium mit 3 µM Aphidicolin kultiviert. Nach dem Aufheben der Blockade durch einen Mediumwechsel wurden die HeLa-Zellen zu den in der Abbildung angegebenen Zeiten geerntet und mit Hilfe der FACS-Analyse untersucht.
Abbildung 7: Immunfluoreszenzanalyse der mit Aphidicolin synchronisierten HeLa-Zellen
Die HeLa-Zellen wurden für 24 Stunden mit 3 µM Aphidicolin behandelt. Nach dem Austausch des Mediums wurden die HeLa-Zellen zu den angegebenen Zeiten 10 Minuten lang in Aceton/Methanol bei -20 oC fixiert, und anschließend mit alpha-YB-1 (B, D, F, H) und monoklonalen Antikörpern gegen PCNA (A, C, E, G) gefärbt.
Abbildung 8: Immunoblot der Kernfraktionen von synchronisierten HeLa-Zellen
HeLa-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 20 µM Lovastatin (Bahnen 1 bis 6) oder 3 µM Aphidicolin (Bahnen 7 bis 10) inkubiert und nach dem Mediumwechsel zu den angegebenen Zeiten geerntet. Als Kontrolle wurden zusätzlich unbehandelte HeLa-Zellen verwendet (Bahnen 11 und 12). Die HeLa-Zellen wurden einer Zellfraktionierung unterzogen und das Kerneluat sowie das Kernpellet auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine auf Nitrozellulose transferiert und über Nacht mit alpha-YB-1 in TBT (1:2500) inkubiert. Die gebundenen Antikörper wurden mit dem ECL-Systems (Amersham) nachgewiesen.
Abbildung 9: Analyse von MCF7- und MCF7/ADR-Zellen mittels der doppelten Immunfluoreszenz
MCF7- (A) und MCF7/ADR-Zellen (B) wurden auf Objektträgern kultiviert und 10 Minuten lang bei -20 oC in Aceton/Methanol fixiert. Nach dem Vorblocken in PBS mit 1,5% Pferdeserum wurden die Zellen mit alpha-YB-1 (Verdünnung 1:200) und monoklonalen Antikörpern gegen P-Glykoprotein (JSB-1; Verdünnung 1:20) inkubiert. Als zweite Antikörper wurden mit Fluorescin markierte Anti-Kaninchen-IgG-F(ab')2-Fragmente und mit Rhodamin markierte Anti-Maus-Ig-F(ab')2-Fragmente verwendet. Die Zellkerne wurden zur Darstellung mit DAPI gefärbt.
Abbildung 10: Immunoblotanalyse der Zellfraktionierung von MCF7- und MCF7/ADR-Zellen
MCF7- (A) und MCF7/ADR-Zellen (B) wurden in einer Zellfraktionierung aufgeschlossen, und die Fraktionen durch einen Immunoblot mit alpha-YB-1 untersucht.
Abbildung 11: Immunfluoreszenzanalyse von HBL100-Zellen und H1000-Zellen
HBL100-Zellen (A) und H1000-Zellen (B) wurden auf Objektträgern kultiviert und 10 Minuten lang bei -20 oC in Aceton/Methanol fixiert. Nach dem Vorblocken in PBS mit 1,5% Pferdeserum wurden die Zellen mit alpha-YB-1 (Verdünnung 1:200) und monoklonalen Antikörpern gegen P-Glykoprotein (JSB-1; Verdünnung 1:20) inkubiert. Als zweite Antikörper wurden mit Fluorescein markierte Anti-Kaninchen-IgG-F(ab')2-Fragmente und mit Rhodamin markierte Anti-Maus-Ig-F(ab')2-Fragmente verwendet. Die Zellkerne wurden zur Darstellung mit DAPI gefärbt.
Abbildung 12: Immunhistochemischer Nachweis von YB-1 in primären Mammakarzinomen
Paraffinschnitte von primären Mammakarzinomen wurden mit Hilfe der APAAP-Methode mit alpha-YB-1 gefärbt (A). Zur Kontrolle der Spezifität der Immunreaktion wurde in einem Parallelversuch alpha-YB-1 mit dem für die Immunisierung verwendeten Peptid vorinkubiert (B).
Abbildung 13: Immunhistochemischer Nachweis von YB-1 und P-Glykoprotein in primären Mammakarzinomen
Paraffinschnitte wurden mit Hilfe der APAAP-Methode mit alpha-YB-1 (A, C, E, G) und mit einem Peroxidasesystem (Vectastain) mit JSB-1 (B, D, F, H) gefärbt.
Abbildung 14: Nachweis von interagierenden Proteinen durch Koimmunpräzipitation mit alpha-YB-1
Das Zytoplasma von HeLa-Zellen wurde entsprechend den angegebenen Zeiten entweder mit 0,5 mg/ml (Bahnen 1-4) oder 1 mg/ml (Bahnen 5-8) Biotinester inkubiert. Anschließend wurden die Proben in einer Koimmunpräzipitation mit alpha-YB-1 verwendet (Bahnen 2, 4, 6 und 8) Als Kontrolle wurde zu den Ansätzen statt der Antikörper nur die Protein-A-Agarose zugegeben (Bahnen 1, 3, 5 und 7). Die Präzipitate wurden auf einem 10%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf Nitrozellulose transferiert. Die präzipitierten Proteine wurden mittels eines Konjugats von Strepavidin mit Peroxidase durch das ECL-System (Amersham) nachgewiesen.
Abbildung 15: Kontrollen zur Immunpräzipitation mit alpha-YB-1
Das Zytoplasma von HeLa-Zellen wurde drei Stunden lang mit 1 mg/ml Biotinester inkubiert. Mit dem markierten Zytoplasma wurden Präzipitationen mit Protein-A-Agarose allein (Bahn 1), mit alpha-YB-1 und dem für die Immunisierung verwendeten Peptid (Bahn 2) und alpha-YB-1 (Bahn 3) durchgeführt. Die Präzipitate wurden auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf Nitrozellulose transferiert. Die präzipitierten Proteine wurden mittels eines Konjugats von Strepavidin mit Peroxidase durch das ECL-System (Amersham) nachgewiesen.
Abbildung 16: Charakterisierung der mit YB-1 interagierenden Proteine
Das dialysierte Zytoplasma von HeLa-Zellen wurde drei Stunden lang mit 1 mg/ml Biotinester inkubiert und für die folgenden Koimmunpräzipitationen mit alpha-YB-1 verwendet. Die Ansätze wurden mit 300 mM NaCl (Bahn 1), 500 mM NaCl (Bahn 2), 1000 mM NaCl (Bahn 3), EDTA (Bahn 4), RNase A (Bahn 5), DNase I (Bahn 6) oder Ethidiumbromid (Bahn 7) vorinkubiert. Die Präzipitate wurden auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf Nitrozellulose transferiert. Die präzipitierten Proteine wurden mittels eines Konjugats von Strepavidin mit Peroxidase durch das ECL-System (Amersham) nachgewiesen.
Abbildung 17: Assoziation von P35 mit YB-1 im Zytoplasma von synchronisierten HeLa-Zellen
Die HeLa-Zellen wurden synchronisiert (siehe Methoden) und geerntet. Die Zellen wurden lysiert, und das Zytoplasma wurde drei Stunden mit 1 mg/ml Biotinester inkubiert. Die markierten Proben wurden dann in der Koimmunpräzipitation mit alpha-YB-1 eingesetzt. In der Abbildung sind folgende Behandlungen der HeLa-Zellen dargestellt: 18 Stunden lang mit 10 µg/ml Nocodazole (Bahn 1), 24 Stunden lang mit 20 µM Lovastatin (Bahn 2) sowie fünf Stunden nach dem Aufheben der Blockade (Bahn 3), 24 Stunden lang mit 3 µM Aphidicolin (Bahn 4) sowie vier (Bahn 5) bzw. acht Stunden (Bahn 6) nach dem Aufheben der Blockade.
Abbildung 18: Assoziation von P35 mit YB-1 in MCF7- und MCF7/ADR-Zellen
Das Zytoplasma von MCF7- (Bahn 1) und MCF7/ADR-Zellen (Bahn 2) wurde drei Stunden lang mit 1 mg/ml Biotinester markiert und anschließend in der Koimmunpräzipitation mit alpha-YB-1 verwendet. Die präzipitierten Proteine wurden auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt, auf Nitrozellulose transferiert und mit einem Streptavidin-Peroxidasekonjugat nachgewiesen.
Abbildung 19: Reinigung von interagierenden Proteinen durch Affinitätschromatographie
Das Zytoplasma von HeLa-Zellen wurde mit einer Antikörpersäule (alpha-YB-1) inkubiert und die gebundenen Proteine mittels des für die Immunisierung verwendeten Peptids eluiert. Die Proteine wurden mit TCA gefällt, in SDS-Probenpuffer gelöst und auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt.
Abbildung 20: Zusammenfassung der sequenzierten Peptide
Abbildung 21: Analyse der Fraktionen der sequentiellen Extraktion von HeLa-Zellen
Die HeLa-Zellen wurden nacheinander mit 0,05% NP40, 25 mM KCl (Bahnen 1 und 2), 0,05% NP40, 150 mM KCl (Bahnen 3 und 4) und 1% NP40, 1% DOC, 150 mM KCl (Bahnen 5 und 6) extrahiert. Die RNA der erhaltenen Fraktionen wurde extrahiert und auf einem denaturierenden Formaldehydgel aufgetrennt (A). Des weiteren wurden Proben der Fraktionen mit TCA gefällt und nach der Elektrophorese im Immunoblot mit alpha-YB-1 untersucht (B).
Abbildung 22: Saccharosegradientenzentrifugation zytoplasmatischer Fraktionen nach der sequentiellen Extraktion von HeLa-Zellen
Die HeLa-Zellen wurden geerntet und, wie in Abbildung 21 beschrieben, einer sequentiellen Extraktion unterzogen. Die zytoplasmatischen Extrakte (Abbildung 21, Bahnen 1, 3 und 5), die freie (A und D), zytoskelettgebundene (B und E) oder membrangebundene (C und F) Ribosomen enthalten, wurden auf lineare Saccharosegradienten aufgetragen. Nach der Zentrifugation wurden jeweils 14 Fraktionen eines jeden Gradienten gesammelt. Die RNA der Fraktionen wurde isoliert, und in einem denaturierenden Formaldehydgel analysiert (A, B und C). Die Proteine der Fraktionen wurden mit TCA gefällt und auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Nach dem Transfer auf Nitrocellulose wurden die Membranen vorgeblockt und über Nacht mit alpha-YB-1 (Verdünnung 1:2500) inkubiert. Die gebundenen Antikörper wurden mit dem ECL-System (Amersham) nachgewiesen (D, E und F).
Abbildung 23: Analyse der in den folgenden Versuchen verwendeten mRNA auf einem denaturierenden Formaldehydgel
In einem denaturierenden Formaldehydgel wurden die mRNA der Luciferase (Bahn 2), die mRNA von P-Glykoprotein (Bahn 3), die mRNA des alpha-Faktors (Bahn 4) und die mRNA von Präprolactin (Bahn 5) analysiert. Zum Vergleich ist in Bahn 1 ein RNA-Größenstandard aufgetragen.
Abbildung 24: In-vitro-Translation der mRNA von P-Glykoprotein und der Luciferase
0,5 µg der mRNA der Luciferase (1 und 2) und des P-Glykoproteins (3 und 4) wurden in einem zellfreien In-vitro-Translationssystem verwendet. Jeweils 5 µl jedes Ansatzes wurden in SDS-Probenpuffer aufgenommen und auf einem 10%igen (1 und 2) oder 7,5%igen (3 und 4) SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurden die Gele getrocknet und über Nacht mit einem Röntgenfilm exponiert.
Abbildung 25: Immunoblotanalyse der rauhen Mikrosomen und der depletierten Retikulozytenlysate
A) Rauhe Mikrosomen aus Hundepankreas wurden mit 1M KCl gewaschen. Jeweils 5 eq der nicht gewaschenen Mikrosomen (1) sowie der gewaschenen Mikrosomen (2) wurden im Immunoblot mit polyklonalen Antikörpern gegen YB-1 und Sec61-alpha untersucht.
B) Unbehandeltes (1), mockdepletiertes (2) und YB-1-depletiertes Retikulozytenlysat (3) wurden im Immunoblot mit alpha-YB-1 analysiert.
Abbildung 26: In-vitro-Translation der mRNA der Luciferase
Für die In-vitro-Translation der mRNA der Luciferase wurde unbehandeltes (1), mockdepletiertes (2) oder YB-1-depletiertes Retikulozytenlysat (3) verwendet. Jeweils 5 µl jedes Ansatzes wurden in SDS-Probenpuffer gelöst und auf ein 7,5%iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und über Nacht mit einem Röntgenfilm exponiert.
Abbildung 27: In-vitro-Translation der mRNA des Präprolactins
Für die In-vitro-Translation der mRNA des Präprolactins wurde unbehandeltes (Bahnen 1 bis 3), mockdepletiertes (Bahnen 4 bis 6) oder YB-1-depletiertes Retikulozytenlysat (Bahnen 7 bis 9) verwendet. Die Versuche wurden ohne die Zugabe von Mikrosomen (Bahnen 1, 4 und 7), nach der Zugabe von unbehandelten rauhen Mikrosomen (Bahnen 2, 5 und 8) und von mit hoher Salzkonzentration gewaschenen Mikrosomen (Bahnen 3, 6 und 9) durchgeführt. Je 5 µl jedes Ansatzes wurden in SDS-Probenpuffer gelöst und auf ein 15%iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und über Nacht mit einem Röntgenfilm exponiert.
Abbildung 28: In-vitro-Translation der mRNA des alpha-Faktors
Für die In-vitro-Translation der mRNA des alpha-Faktors wurde unbehandeltes (Bahnen 1 bis 3), mockdepletiertes (Bahnen 4 bis 6) oder YB-1-depletiertes Retikulozytenlysat (Bahnen 7 bis 9) verwendet. Die Versuche wurden ohne die Zugabe von Mikrosomen (Bahnen 1, 4 und 7), nach der Zugabe von unbehandelten rauhen Mikrosomen (Bahnen 2, 5 und 8) und von mit hoher Salzkonzentration gewaschenen Mikrosomen (Bahnen 3, 6 und 9) durchgeführt. Je 5 µl jedes Ansatzes wurden in SDS-Probenpuffer gelöst und auf ein 15%iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und über Nacht mit einem Röntgenfilm exponiert.
Abbildung 29: In-vitro-Translation der mRNA des P-Glykoproteins
Für die In-vitro-Translation der mRNA des P-Glykoproteins wurde unbehandeltes (Bahnen 1 bis 3), mockdepletiertes (Bahnen 4 bis 6) sowie YB-1-depletiertes Retikulozytenlysat (Bahnen 7 bis 9) verwendet. Die Versuche wurden ohne die Zugabe von Mikrosomen (Bahnen 1, 4 und 7), nach der Zugabe von unbehandelten rauhen Mikrosomen (Bahnen 2, 5 und 8) und von mit hoher Salzkonzentration gewaschenen Mikrosomen (Bahnen 3, 6 und 9) durchgeführt. Je 5 µl jedes Ansatzes wurden in SDS-Probenpuffer gelöst und auf ein 7,5%iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und über Nacht mit einem Röntgenfilm exponiert.

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