Jürchott, Karsten: Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation und zu den Funktionen von YB-1, einem Y-Box-Protein in Säugerzellen

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Kapitel 1. Einführung

1.1 Definition der Familie der Y-Box-Proteine

In den letzten Jahren haben Untersuchungen zur Beschreibung einer neuen Gruppe von nucleinsäurebindenden Proteinen in Pro- und Eukaryonten geführt. Die ersten untersuchten Vertreter dieser Proteinfamilie wiesen eine hohe Spezifität für ein DNA-Bindungsmotiv, das als Y-Box bezeichnet wird, auf. Aus diesem Grunde wurde der Begriff "Y-Box-Proteine" für diese Proteinfamilie eingeführt. Die Konsensussequenz der Y-Box lautet T(T/G)CTGATTGG(T/C)T(A/C)(A/C). Sie enthält eine inverse CCAAT-Box (siehe unterstrichene Basen) und stellt ein regulierendes Element bei einer Reihe von Genen dar.

Es wurde beobachtet, daß einige prokaryontische Y-Box-Proteine als Antwort auf einen Kälteschock induziert werden. Auf Grund dieser Eigenschaft erhielten die prokaryontischen Y-Box-Proteine die Bezeichnung "cold shock proteins" (Kälteschockproteine), kurz Csp (Goldstein et al., 1990).

1.2 Prokaryontische Y-Box-Proteine

1.2.1 Struktur der prokaryontischen Y-Box-Proteine

Prokaryontische Y-Box-Proteine haben ein Molekulargewicht von ungefähr 7.000. In E. coli sind 7 Proteine (CspA - CspG) bekannt, die eine hohe Homologie (~ 70 %) zueinander aufweisen (Lee et al., 1994; Nakashima et al., 1996). Die Struktur von CspA in E. coli und von CspB in B. subtilis wurde mittels NMR-Spektroskopie (Schnuchel et al., 1993; Newkirk et al., 1994) und Röntgenkristallographie (Schindelin et al., 1993; Schindelin et al., 1994) bestimmt. Die Sekundärstruktur der Proteine besteht aus 5 beta-Faltblättern, die in ihrer Anordnung zueinander eine offene Röhre bilden. NMR-Analysen der RNA-bindenden Domäne des Proteins Rho in E. coli (Briercheck et al., 1996), der S1-Domäne des ribosomalen Proteins S1 (Bycroft et al., 1997) sowie weiterer Proteine, die RNA bzw. einzelsträngige DNA binden können, ergaben eine auffallende Übereinstimmung mit der Struktur von CspA (Folmer et al., 1995; Sette et al., 1997). Die Faltblätter 2 und 3 enthalten Sequenzen, die ebenfalls bei einer Reihe RNA-bindender Proteine zu finden sind, das RNP-1-


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und das RNP-2-Motiv (Landsman, 1992).

1.2.2 Expression der prokaryontischen Y-Box-Proteine

Prokaryontische Y-Box-Proteine konnten in psychrophilen, mesophilen und thermophilen Bakterienstämmen nachgewiesen werden (Schroder et al., 1993; Ray et al., 1994). Bei einem Kälteschock stellt CspA mit rund 13% einen Hauptbestandteil der neu synthetisierten Proteine dar (Goldstein et al., 1990). Neben CspA können auch CspB und CspG durch einen Kälteschock induziert werden (Jones et al., 1994; Lee et al., 1994; Etchegaray et al., 1996; Nakashima et al., 1996).

Die Expression von CspA wird durch verschiedene Mechanismen kontrolliert. Die Verringerung der Wachstumstemperatur führt zu einer Steigerung der Transkription des Gens (Jiang et al., 1993). DNA-Bindungsanalysen haben gezeigt, daß ein unter niedrigen Temperaturen neu synthetisierter Faktor spezifisch an eine Sequenz zwischen den Basen -63 und -92 im Promotorbereich von CspA binden kann (Tanabe et al., 1992). Ein weiterer Effekt des Kälteschocks ist die zeitweilige Stabilisierung der sonst mit einer Halbwertszeit von 10 Sekunden sehr labilen mRNA von CspA. Diese Stabilisierung entfällt, nachdem sich die Zellen an die niedrigen Temperaturen angepaßt haben (Goldenberg et al., 1996; Fang et al., 1997). Zusätzlich ist CspA selbst in der Lage, die Translation der eigenen mRNA zu stimulieren (Brandi et al., 1996).

1.2.3 Funktion der prokaryontischen Y-Box-Proteine

CspA bindet bevorzugt an einzelsträngige DNA-Sequenzen, die eine Y-Box oder eine CCAAT-Box enthalten (Graumann et al., 1994). Zwei Gene, deren Transkription von CspA stimuliert wird, sind bisher bekannt: hns und gyrA (La Teana et al., 1991, Brandi et al., 1994). Das H-NS-Protein, das vom Gen hns kodiert wird, ist ein neutrales, hitzestabiles Protein, das vorzugsweise im Nucleoid der Bakterien lokalisiert ist. Unter den Bedingungen des Kälteschocks wird die Expression dieses Gens um den Faktor drei bis vier erhöht. Es wird vermutet, daß das H-NS-Protein an der Organisation des Nucleoids beteiligt ist, da bei Zellen, die dieses Protein überexprimieren, eine starke Kondensation der DNA zu beobachten ist (La Teana et al., 1991).


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CspA ist in vitro in der Lage, an denaturierte einzelsträngige RNA zu binden, wenn diese mehr als 74 Basen lang ist. Eine Spezifität für bestimmte RNA-Sequenzen konnte dabei nicht beobachtet werden. Die Zugabe von CspA zu einem 142 Basen langen Fragment des 5' nicht translatierten Bereiches der eigenen mRNA stimuliert deren Hydrolyse durch die Ribonucleasen A und T1. Es wird vermutet, daß dieser Effekt dadurch zustande kommt, daß CspA die Ausbildung von stabilen Sekundärstrukturen verhindert. Die Verhinderung von Sekundärstrukturen durch CspA könnte notwendig sein, um eine effiziente Translation bei niedrigen Temperaturen zu ermöglichen (Jiang et al., 1997).


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1.3 Eukaryontische Y-Box-Proteine

1.3.1 Struktur der eukaryontischen Y-Box-Proteine

Die Y-Box-Proteine der Eukaryonten sind mit einer Masse von rund 35 kd deutlich größer als ihre prokaryontischen Pendants. Sie bestehen aus einem variablen N-Terminus, einer hochkonservierten Domäne von etwa 70 Aminosäuren und im c-terminalen Bereich aus der abwechselnden Anordnung von jeweils 4 Clustern mit basischen/aromatischen bzw. sauren Aminosäuren. Bei der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese sind die eukaryontischen Y-Box-Proteine bei einem Molekulargewicht von 50.000 - 60.000 nachweisbar. Verantwortlich für dieses anormale Laufverhalten sind wahrscheinlich die starken Ladungsunterschiede der c-terminalen Cluster. Auf Grund der hohen Übereinstimmung der konservierten zentralen Domäne mit den prokaryontischen Kälteschockproteinen erhielt diese Domäne die Bezeichnung Kälteschockdomäne ("cold shock domain" - CSD). Diese Domäne wurde auch in Proteinen gefunden, die vom normalen Bauplan der Y-Box-Proteine abweichen. Bei NSEP-1, einem Protein, das in HeLa-Zellen charakterisiert wurde, kommt es durch mehrere Verschiebungen im Leserahmen zu einer Reduktion der c-terminalen Cluster (Kolluri et al., 1991). Die GRP2-Proteine in Pflanzen enthalten sowohl die CSD als auch CCHC-Zinkfingermotive (Kingsley et al., 1994). Das in Säugern gefundene Gen unr kodiert für ein Protein, das mehrere CSD enthält (Doniger et al., 1992).

1.3.2 Expressionsmuster der eukaryontischen Y-Box-Proteine

Die eukaryontischen Y-Box-Proteine werden sowohl entwicklungs- als auch gewebespezifisch exprimiert. Einige Vertreter sind hauptsächlich in den Keimzellen und den frühen Entwicklungsstadien der Embryogenese nachweisbar. Ein Beispiel für ein solches keimzellspezifisches Y-Box-Protein ist FRGY2 aus Xenopus laevis. Dieses Protein wurde im erwachsenen Tier nur in den Ovarien und den Testes gefunden. Die hohe Expression von FRGY2 in den Oozyten der Stadien I und II nimmt während der Embryogenese sprunghaft ab, so daß in den weiteren Entwicklungsstadien dieses Protein kaum oder gar nicht mehr zu beobachten ist (Tafuri + Wolffe, 1990). Ein etwas anderes Expressionsmuster besitzt das Mausprotein


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MSY1. Eine hohe Expression dieses Proteins ist nur in den Testes, nicht jedoch in den Ovarien oder anderen Geweben zu finden. Des weiteren sind nur geringe Mengen der mRNA von MSY1 bei Mäusen nachzuweisen, die jünger als fünfzehn Tage sind. Ab dem fünfzehnten Tag erfolgt eine starke Erhöhung der Expression dieses Proteins, die in der weiteren Entwicklung beständig bleibt (Tafuri et al., 1993).

Neben den keimzellspezifischen Y-Box-Proteinen gibt es auch solche, die in verschiedenen Geweben zu finden sind. Dabei sind häufig deutliche Unterschiede in der Expression zwischen den einzelnen Geweben oder auch in unterschiedlichen Entwicklungsstadien zu beobachten. Die mRNA von FRGY1 aus X. laevis konnte beispielsweise außer in den Ovarien und den Testes auch in der Leber, im Herz, in der Niere und mit einer geringeren Menge auch in der Haut nachgewiesen werden (Tafuri + Wolffe, 1990).

Die Expression von YB-1 in Säugetieren wurde vom Autor durch Immunoblotanalysen mit einem peptidspezifischen polyklonalen Antikörper untersucht. Dabei wurde das Protein in Hundepankreas, Hundeleber, Rattenleber sowie in Retikulozyten von Kaninchen gefunden (Jürchott, 1994).

1.3.3 Bindung von eukaryontischen Y-Box-Proteinen an spezifische DNA-Sequenzen

Wie ihre prokaryontischen Verwandten, sind auch eukaryontische Y-Box-Proteine in der Lage, an doppel- und einzelsträngige DNA-Sequenzen spezifisch zu binden. Sowohl für FRGY1 und FRGY2 aus X. laevis, als auch für YB-1 aus Säugetieren konnte hohe Spezifität für das Y-Box-Motiv nachgewiesen werden. Weitere Untersuchungen haben ergeben, daß andere Y-Box-Proteine ein davon abweichendes Bindungsverhalten. CHKYB1, ein Y-Box-Protein aus Hühnern, bindet ohne erkennbare Abhängigkeit von der Sequenz an pyrimidinreiche DNA-Stränge (Grant et al., 1993). NSEP-1 aus HeLa-Zellen bevorzugt eine Sequenz, die eine Asymmetrie in der Verteilung von Purinen und Pyrimidinen zwischen den Strängen aufweist. Diese asymmetrische Sequenz stammt aus dem Promotor von c-myc und ist in der Lage, in vitro eine H-DNA-Struktur zu bilden (Kolluri et al., 1991; Firulli et al., 1992). Das Sequenzmotiv GTACCACC wird von RSV-EF-II erkannt, einem Y-Box-Faktor, der an die Enhancerregion des Rous-Sarkom-Virus bindet (Cleavinger et al., 1996).


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1.3.4 Regulation der Transkription durch eukaryontische Y-Box-Proteine

Y-Box-Proteine können die Transkription von Genen sowohl stimulieren, als auch hemmen. Die Proteine FRGY1 und FRGY2 aus X. laevis stimulieren in vitro die Transkription von Genen, deren Promotoren Y-Box-Motive enthalten (Wolffe et al. 1992). Bei einer Reihe von Genen, die spezifisch in Oozyten exprimiert werden, wurden Y-Boxen als regulierende Elemente nachgewiesen. So enthält zum Beispiel der Promotor des Gens hsp70 in X. laevis zwei Kopien der Y-Box, von denen eine für die spezifische Expression in Oozyten unbedingt notwendig ist (Bienz, 1986).

In verschiedenen Zellinien ist eine gegenläufige Korrelation der Mengen der mRNA von YB-1 und den Genen der Klasse II des Haupthistokompatibilitätskomplexes zu beobachten. Die Stimulation der Expression von diesen Genen in U937-Zellen mittels gamma-Interferon und Phorbol-12-myristat-13-acetat ist mit einer deutlichen Reduktion der mRNA von YB-1 verbunden. Die Überexpression von YB-1 führte dementsprechend zur Reprimierung der Aktivierung durch gamma-Interferon (Didier et al., 1988; Ting et al., 1994). Die Expression des Thyrotropinrezeptors (Ohmori et al., 1996) und der beta-Untereinheit des Nikotinacetylcholinrezeptors wird ebenfalls durch Y-Box-Proteine negativ reguliert (Sapru et al., 1996).

Y-Box-Proteine sind auch an der Regulation der Transkription verschiedener viraler Proteine beteiligt. So wurde festgestellt, daß die basale Genexpression des HTLV-I-Virus in T-Lymphozyten durch YB-1 stimuliert wird (Kashanchi et al., 1994). Obwohl die Kontrollregion der späten Gene des neurotropen JC-Virus keine Y-Box enthält, ist YB-1 in der Lage, die Expression dieser Gene zu erhöhen. Dabei bindet das Y-Box-Protein an ein C/T-reiches Sequenzmotiv, die B-Box (Kerr et al., 1994).

Untersuchungen am Promotor eines Gens der HLA-Klasse II (dra) ergaben erste Hinweise auf den molekularen Mechanismus, durch den YB-1 die Transkription steuert. Es wurde beobachtet, daß durch die Bindung von YB-1 an diese Region einzelsträngige Bereiche induziert bzw. stabilisiert wurden. Es wird vermutet, daß diese offene DNA-Struktur die Bindung weiterer Transkriptionsfaktoren verhindert, so daß es zur Reprimierung der Aktivität des Promotors kommt (MacDonald et al., 1995).


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1.3.5 Interaktion von eukaryontischen Y-Box-Proteinen mit RNA-Molekülen

Eukaryontische Y-Box-Proteine sind in der Lage, neben DNA- auch RNA-Moleküle zu binden. Bei Experimenten mit FRGY2 konnte jedoch nie eine gleichzeitige Bindung des Proteins an DNA- und RNA-Moleküle beobachtet werden. Daraus wurde geschlußfolgert, daß FRGY2 in verschiedenen Konformationen vorkommt. Entsprechend der jeweiligen Konformation ist FRGY2 in der Lage, entweder an DNA oder an RNA zu binden (Murray, 1994).

Mit der Selex-Methode wurde eine sechs Basen lange Konsensussequenz ermittelt, die in vitro von FRGY1 und FRGY2 mit hoher Spezifität gebunden wird. Diese Sequenz lautet AACAUC. An der RNA-Bindung sind sowohl die CSD, als auch die c-terminalen Cluster beteiligt. Das in der CSD vorkommende RNP1-Motiv spielt dabei eine zentrale Rolle, während die flankierenden Regionen die Bindung an die RNA zusätzlich stabilisieren (Bouvet et al., 1995).

1.3.6 Regulation der Translation durch eukaryontische Y-Box-Proteine

1.3.6.1 Aufbau und Funktion der mRNP (messenger ribonucleoprotein particle)

Die Untersuchung von zytoplasmatischen Extrakten früher Fisch- und Seegurkenembryonen hat zur Entdeckung von Partikeln geführt, die mRNA und verschiedene Proteine enthielten. Diese Partikel wurden als mRNP ("messenger ribonucleoprotein particle") bezeichnet (Spirin + Nemer, 1965). Die mRNP lassen sich entsprechend ihrer intrazellulären Lokalisation in Kern- (hnRNP) und zytoplasmatische mRNP unterteilen. Die mRNP im Zellkern enthalten oftmals mehr als zwanzig Hauptproteine, die für die weitere Prozessierung der mRNA oder für den Transport aus dem Zellkern ins Zytoplasma notwendig sind. So konnten in hnRNP Aktivitäten von Poly(A)-Synthetasen, Endonucleasen, Proteinkinasen, Proteinphosphatasen sowie Enzymen für das "Capping" der mRNA nachgewiesen werden (Piñol-Roma et al., 1989).

Bei den zytoplasmatischen mRNP werden drei Gruppen unterschieden. Ein Teil der zytoplasmatischen mRNP ist mit aktiv translatierenden Polysomen assoziiert. Diese enthalten unter anderem die Faktoren für die Initiation und Elongation der


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Translation. Das Verhältnis vom Protein zur RNA beträgt in diesen Partikeln etwa 2:1. Die nicht an Polysomen gebundenen "freien" mRNP lassen sich im weiteren danach unterteilen, ob sie für die Translation zugänglich sind oder nicht. Das Verhältnis von 4:1 vom Protein zur RNA dieser Partikel weicht deutlich von dem der polysomal gebundenen mRNP ab. Während die für die Translation zugänglichen freien mRNP in allen somatischen Zellen zu finden sind, kommen die translationsinaktiven ("maskierten") Partikel im wesentlichen in Keimzellen und den Zellen der frühen Entwicklungsstadien von Embryonen vor (Spirin, 1994).

1.3.6.2 Eukaryontische Y-Box-Proteine als Bestandteile der mRNP in Keimzellen

Im Verlauf der Reifung der Oozyten in X. laevis wird ein Großteil der mRNA in Form translationsinaktiver mRNP akkumuliert. Nach der Befruchtung der Oozyten (siehe oben) wird in der frühen Embryogenese die gespeicherte mRNA zeitlich gesteuert der Translation zugänglich gemacht. Der molekulare Mechanismus dieses Prozesses ist bislang noch weitestgehend ungeklärt.

Zwei Y-Box-Proteine, mRNP3 und mRNP4 (identisch mit FRGY2), konnten als wesentliche Bestandteile dieser mRNP identifiziert werden (Murray et al., 1992; Deschamps et al., 1992). Es wird daher angenommen, daß Y-Box-Proteine eine zentrale Rolle bei der Maskierung und Speicherung der mRNA spielen. Verschiedene Beobachtungen belegen diese These. So ergab die Überexpression von FRGY2 in Oozyten von X. laevis eine starke Hemmung der Translationseffizienz von in vivo synthetisierter mRNA. Auf die Translation von injizierter mRNA hatte diese Überexpression jedoch nur einen geringen Einfluß. Dieses Ergebnis verdeutlicht, daß der Prozeß der Maskierung der mRNA funktionell eng mit der Transkription verknüpft ist (Bouvet + Wolffe, 1994; Wolffe + Meric, 1996). Für die effiziente Hemmung der Translation sind sowohl die CSD als auch die c-terminalen Cluster notwendig (Matsumoto et al., 1996).

Auch in den Spermatozyten der Maus wurde ein Y-Box-Protein in der Verbindung mit translationsinaktiven mRNP gefunden. Die direkte Bindung von MSY1 an die mRNA wurde durch cross-linking mit UV-Licht nachgewiesen (Tafuri et al., 1993).


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1.3.6.3 Eukaryontische Y-Box-Proteine als Bestandteile der mRNP in somatischen Zellen

In somatischen Zellen konnten Y-Box-Proteine ebenfalls als Grundbestandteil sowohl der freien als auch der polysomal gebundenen mRNP identifiziert werden. Die mRNA der polysomal gebundenen mRNP wird aktiv translatiert, was deutlich macht, daß die einfache Präsenz von Y-Box-Proteinen in den mRNP nicht zwingend zur Hemmung der Translation führt. Durch in vitro Versuche wurde festgestellt, daß das Mengenverhältnis von Y-Box-Proteinen zur mRNA für die Regulation der Translation entscheidend ist (Minich et al., 1992; Evdokimova et al., 1995). Diese Vermutung wird auch durch Untersuchungen an FRGY2 bestätigt. Die Expression dieses keimzellspezifischen Y-Box-Proteins in somatischen Zellen führte ebenfalls zur Akkumulation und zur Hemmung der Translation einer Kontroll-mRNA (Ranjan et al., 1993).

1.4 Biologische Funktionen der Y-Box-Proteine

1.4.1 Beteiligung von Y-Box-Proteinen an der Reaktion auf Streßreize

Die prokaryontischen Y-Box-Proteine sind an der Reaktion der Zellen auf verschiedene Streßreize beteiligt. Am genauesten untersucht sind die Prozesse, die durch einen Kälteschock ausgelöst werden. Prokaryontische Y-Box-Proteine begünstigen die Anpassung an die niedrigen Temperaturen auf zwei Wegen. Zum einen wird die Expression von Genen (z.B. h-ns) stimuliert, die die Zellen vor den Auswirkungen des Kälteschocks schützen. Zum anderen beeinflussen die prokaryontischen Y-Box-Proteine direkt die Stabilität und Translationsfähigkeit der mRNA und gewährleisten so die Proteinbiosynthese unter diesen Bedingungen.

Verschiedene Publikationen belegen, daß auch die eukaryontischen Y-Box-Proteine Aufgaben bei der Anpassung von Zellen an Umwelteinflüsse erfüllen. Es konnte gezeigt werden, daß die Expression des Gens mdr1 ("multiple drug resistance gen 1") durch Streßreize stimuliert wird. Zu diesen Streßreizen gehören neben der Einwirkung von Chemotherapeutika auch UV-Licht, sowie die Behandlung der Zellen mit Mitomycin C, Actinomycin D sowie Cisplatin. (Asakuno et al., 1994; Ohga et al.,


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1996). Für die Aktivierung der Transkription von mdr1 durch Actinomycin D ist ein Promotorbereich verantwortlich, der eine Y-Box enthält. Es konnte gezeigt werden, daß die Bindung von YB-1 an diesen Promotorbereich durch Actinomycin D verstärkt wird (Asakuno et al., 1994).

Auch bei der Reaktion der Zellen auf Redoxreize scheinen Y-Box-Proteine eine Schlüsselrolle zu spielen. In Bakterien ist ein Promotorelement bekannt, das durch die Veränderung des Redoxpotentials der Zelle aktiviert wird. Dieses Promotorelement wird als ORE ("OxyR response element") bezeichnet. Diese Sequenz beinhaltet ein Y-Box-Motiv und bewirkt auch in Säugerzellen eine redoxabhängige Stimulation der Transkription von Reportergenen. Wird die Expression von Y-Box-Proteinen in Säugerzellen durch die Anwendung von Antisensoligonucleotiden verringert, kann diese Stimulation nicht mehr beobachtet werden (Duh et al., 1995).

1.4.2 Die Rolle von Y-Box-Proteinen bei der Zellproliferation

Verschiedene Publikationen weisen auf eine Verbindung von Y-Box-Proteinen mit der Zellproliferation hin. Die Stimulation der Proliferation von T-Helfer-Lymphozyten durch Interleukin 2 führt zu einer Erhöhung der Expression von YB-1 unmittelbar vor dem Beginn der DNA-Synthese (Sabath et al., 1990). Bei der Leberregeneration in Ratten und der Serumstimulation von ruhenden Rattenfibroblasten wird RYB-a induziert. Die Blockierung des S-Phasen-Überganges von serumstimulierten Rattenfibroblasten durch die Verhinderung der Zelladhäsion oder durch die Behandlung der Fibroblasten mit Genistein führt zur vollständigen Hemmung der Expression von RYB-a. Es ist bekannt, daß Genistein die Aktivität von Tyrosinkinasen wie EGFR ("epidermal growth factor receptor") beeinflußt. Daher wird angenommen, daß Y-Box-Proteine als Bestandteile der Signaltransduktionskaskaden die Zellproliferation beeinflussen können (Ito et al., 1994; Ladomery + Sommerville, 1995).

Es ist bemerkenswert, daß eine Reihe von wachstumsassoziierten Genen Y-Box-Motive in ihren Promotoren enthalten. Dazu zählen die Gene für die Thymidinkinase, PCNA, cdk2, Histon H2B und die DNA-Polymerase alpha (Lipson et al., 1989; Travali et al., 1989; Pearson et al., 1991; Olive et al., 1994). Konkrete Untersuchungen zum Einfluß von Y-Box-Proteinen auf die Expression dieser Gene wurden jedoch bisher


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nicht veröffentlicht.


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1.5 Zielstellung der Arbeit

1. YB-1, ein Y-Box-Protein in Säugerzellen, wurde ursprünglich als nukleäres Protein beschrieben (Didier et al, 1988). Auf Grund der sequenzspezifischen Bindung von YB-1 an DNA wurde vermutet, daß YB-1 ein Transkriptionsfaktor ist. In vorangegangenen Untersuchungen des Autors im Rahmen seiner Diplomarbeit konnte YB-1 jedoch im Zytoplasma nachgewiesen werden (Jürchott, 1994). Aus dieser scheinbar widersprüchlichen Lokalisation ergab sich zunächst die Zielstellung, eine exakte Bestimmung der subzellulären Lokalisation von YB-1 vorzunehmen, um auf diesem Wege Rückschlüsse auf seine Funktion ziehen zu können.

2. Die in der vorliegenden Arbeit dargestellten Untersuchungen zeigen, daß YB-1 sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern nachgewiesen werden kann. Die nukleäre Lokalisation unterstützt die Hypothese, daß YB-1 Aufgaben als Transkriptionsfaktor erfüllt. Eine Beteiligung von Y-Box-Proteinen an der Regulation von mdr1 wurde in verschiedenen Veröffentlichungen zwar diskutiert, konnte aber bis dahin nicht nachgewiesen werden. Daher sollte untersucht werden, ob mdr1 durch YB-1 reguliert wird.

3. Die Expression von mdr1 ist von besonderer Bedeutung für die Ausbildung eines multi-drug-resistenten Phänotyps bei Mammakarzinomen. Im Verlaufe dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, daß YB-1 ein Regulator der Expression von mdr1 in Zelllinienen ist. Daraus ergab sich die Fragestellung, ob YB-1 die Expression von mdr1 auch in Mammakarzinomen beeinflußt.

4. Im Zytoplasma wurden verschiedene Y-Box-Proteine in Verbindung mit mRNP beobachtet. Weitere Bindungspartner von YB-1 im Zytoplasma sind jedoch noch nicht bekannt. Daher wurde untersucht, ob und mit welchen anderen Proteinen YB-1 im Zytoplasma interagiert, um so Hinweise auf die Regulation von YB-1 zu erhalten.

5. Verschiedene Y-Box-Proteine in X. laevis sind an der Maskierung der mRNA beteiligt, und führen so zur Hemmung der Translation. Da YB-1 in Verbindung mit translationell aktiven Ribosomen am rauhen ER nachgewiesen wurde, ist davon auszugehen, daß YB-1 dort andere Funktionen erfüllt (Jürchott, 1994). Dieser Befund führte zu der Fragestellung, ob YB-1 an alle Ribosomen bindet oder spezifisch nur mit Ribosomen am rauhen ER interagiert. Eine solche spezifische Assoziation eines Y-Box-Proteins wurde bis jetzt noch nicht beschrieben. Desweiteren sollte untersucht werden, welche Aufgaben YB-1 bei der Translation von Proteinen am rauhen ER erfüllt.


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