Jürchott, Karsten: Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation und zu den Funktionen von YB-1, einem Y-Box-Protein in Säugerzellen

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Kapitel 3. Methoden

3.1 Zellkultur

3.1.1 Allgemeines

Die zur Kultivierung verwendeten Medien enthielten immer 10% fetales Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 100 IU/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin. Die Zellen wurden bei 37 oC in einer mit 5% CO2 angereicherten und mit Wasserdampf gesättigten Atmosphäre inkubiert.

Als Medien wurden für HeLa-Zellen DMEM, für HBL100-Zellen RPMI jeweils ohne weitere Zusätze verwendet. Stabile Transfektanten von HBL100-Zellen wurden durch die Zugabe von Hygromycin und Puromycin (H1000) zum Medium erreicht. MCF-7-Zellen wurden, wenn nicht anders gekennzeichnet, in DMEM mit beta-Estradiol kultiviert. Chemotherapeutikaresistente MCF-7-Zellen (MCF7/ADR-Zellen) wurden durch die ständige Anwesenheit von 0,25 mg/ml Doxorubicin selektiert (Labor von Prof. M. Dietel).

Soweit nicht anders beschrieben, wurden die Zellen nach einer kurzen Behandlung mit einer Trypsin/EDTA-Lösung geerntet, zweimal mit PBS gewaschen und entweder gleich weiter verarbeitet oder bei - 20 oC bzw. - 80 oC eingefroren.

3.1.2 Zellzyklussynchronisierung der HeLa-Zellen

Um logarithmisch wachsende HeLa-Zellen in der G1-Phase des Zellzyklus zu arretieren, wurde dem Medium Lovastatin bis zu einer Endkonzentration von 20 µM zugesetzt, und die Zellen 24 Stunden lang inkubiert. Für Untersuchungen der weiteren Wachstumskinetik wurde anschließend das Medium ausgetauscht, wobei das neue Medium für eine schnellere Aufhebung der Blockade 2 mM Mevalonat enthielt.

Für Untersuchungen in der S-Phase des Zellzyklus wurden HeLa-Zellen mit Hilfe von Aphidicolin synchronisiert. Dazu wurde eine logarithmisch wachsende Kultur für 24 Stunden mit 3 µM Aphidicolin behandelt. Das Medium wurde nach dieser Zeit gewechselt und die Zellen für die entsprechende Zeit weiter inkubiert.


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Für Untersuchungen in der M-Phase des Zellzyklus wurden logarithmisch wachsende HeLa-Zellen 18 Stunden mit 10 µg/ml Nocodazole inkubiert. Die in der M-Phase blockierten HeLa-Zellen wurden anschließend durch starkes Schütteln vom Boden der Kulturflaschen gelöst und durch Zentrifugation (2000 U/min, 5 Minuten, 4 oC, Beckmannzentrifuge) sedimentiert.

3.2 Zellysate und -fraktionierungstechniken

3.2.1 Gesamtzellysat

106 Zellen wurden in 100 ml PBS resuspendiert und einer TCA-Fällung unterworfen. Die jeweiligen Pellets wurden in 200 µl Probenpuffer 10-20 min bei 70 oC gelöst und Äquivalente von 2x105 Zellen auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen.

3.2.2 Zellaufschluß

107 Zellen wurden in 1 ml Lysepuffer resuspendiert und 10 min auf Eis inkubiert. Die Suspension wurde dann 10 min bei 4 oC und 6100 U/min in einer Eppendorfzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand ( = Zytoplasma) wurde abgenommen und das Pellet erneut in 1 ml Lysepuffer resuspendiert. Nach der Zentrifugation unter den gleichen Bedingungen wurde der Überstand ( = Waschschritt) abgenommen und das Pellet in 1 ml Kernelutionspuffer resuspendiert. Nach einer 15-20 min minütigen Inkubation auf Eis wurde die Zentrifugation wiederholt, und Überstand ( = Kerneluat) und Pellet ( = Kernpellet) voneinander getrennt.

Lysepuffer : 50 mM Hepes (pH = 7,6), 250 mM Saccharose, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1% NP 40, 1% DOC, 1 mM DTT, PI

Kernelutionspuffer: 20 mM Hepes (pH=7,6), 500 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 25 % Glycerol, 1 mM DTT, PI


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3.2.3 Sequentielle Extraktion von HeLa-Zellen

Die sequentielle Extraktion von Zellen wurde nach Vedeler et al., 1991, durchgeführt. Alle Zentrifugationen wurden bei 4 oC in einer Eppendorfzentrifuge durchgeführt.

1,4x107 Zellen wurden in 1 ml B1-Puffer resuspendiert, 5 min auf Eis inkubiert, und danach für 5 min mit 4000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und der Extraktionsschritt noch einmal wiederholt. Anschließend wurde das Pellet in 1 ml B2-Puffer resuspendiert, 10 min auf Eis inkubiert und für 5 min mit 5000 U/min zentrifugiert. Nach dem Abnehmen des Überstands wurde auch dieser Extraktionsschritt wiederholt. Das Pellet wurde in 1 ml B3-Puffer resuspendiert, 10 min auf Eis inkubiert und für 5 min mit 6100 U/min zentrifugiert. Nach der Wiederholung dieses Schrittes wurde das Pellet in 1 ml Kernelutionspuffer resuspendiert, 15-20 min auf Eis inkubiert und dann für 10 min mit 6100 U/min zentrifugiert.

B1-Puffer: 10 mM Hepes (pH = 7,6), 250 mM Saccharose, 25 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,05% NP40, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF, PI

B2-Puffer: wie B1, aber mit 130 mM KCl

B3-Puffer: wie B2, aber mit 1% NP40 und 1% DOC

3.2.4 Präparation von Hundepankreasmikrosomen

Nach einer im Labor etablierten Methode wurden rauhe Mikrosomen aus einem Hundepankreas präpariert. Dazu wurde der Pankreas gesäubert, gewogen, mit einer Rasierklinge gründlich zerkleinert und in 3 Vol Puffer A (50 mM Hepes (pH 7,5), 50 mM Kaliumacetat, 6 mM Magnesiumacetat, 1 mM EDTA, 250 mM Saccharose, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF, 1:1000 PI) homogenisiert. Das Homogenat wurde 10 min bei 3000 U/min (Rotor GS-3, Sorvall-Zentrifuge) zentrifugiert, der Überstand durch Mull abgegossen und auf Eis gelagert. Das Pellet wurde erneut in 1 Vol Puffer A homogenisiert und der Zentrifugationsschritt wiederholt. Die Überstände wurden vereinigt und 10 min bei 10.000 g zentrifugiert (Sigma- oder Hereus-Zentrifuge). Die Überstände dieses Schrittes wurden mit 20 ml eines Saccharosekissens unterschichtet (wie Puffer A, jedoch mit 1,3 M Saccharose und ohne PMSF) und 3,5


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Stunden bei 45.000 U/min in einem Ti 45 Rotor zentrifugiert. Die Membranpellets wurden in einer Konzentration von 1-2 eq/ml in Membranpuffer (50 mM Hepes (pH 7,5), 250 mM Saccharose, 1 mM DTT, 1:1000 PI) aufgenommen. Ein eq/ml entspricht einer Absorption von 50 bei einer Wellenlänge von 280 nm. Dabei enthält ein Äquivalent rauher Mikrosomen ca. 5 mg Lipid und 1,5 pmol membrangebundene Ribosomen.

3.3 Immunologische Methoden

3.3.1 Affinitätsreinigung des Peptidantiserums gegen YB-1

Ein synthetisches Peptid (acetyl-MSSESETQQPPA-cys), das dem N-Terminus von YB-1 entspricht, wurde an BSA und KLH gekoppelt. Das gewonnene Antiserum wurde durch eine Peptidsäule affinitätsgereinigt. Dazu wurde das Peptid mit 2 ml einer 50%igen Suspension von Sulfolink inkubiert. Die Säule wurde mit 0,1 M Glycin/HCl (pH = 2,2) gewaschen und anschließend äquilibriert (20 mM Tris/ HCl, 500 NaCl). Das mit 1/100 Vol 0,5 M EDTA und 1/100 Vol 0,1 M PMSF versetzte Serum wurde mehrmals über die Säule gegeben. Nach dem Waschen wurden die gebundenen Antikörper mit 0,1 M Glycin (pH = 2,2) eluiert und über eine Hydroxylappatitsäule (Elutionspuffer 0,5 M Na2HPO4/NaH2PO4; pH = 7,5) konzentriert. 1 µl jeder Fraktion wurde auf eine Nitrocellulosemembran aufgetragen. Durch die Färbung mit Amidoschwarz wurden die Fraktionen identifiziert, die Antikörper enthielten. Diese Fraktionen wurden zusammengefaßt und nach der Zugabe des gleichen Volumens Glycerol bei -20 oC gelagert.

3.3.2 Immunoblotanalyse

Die Proteine wurden in 10%igen SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Der Transfer der Proteine auf die Nitrocellulosemembranen erfolgte 1,5 Stunden lang bei einer Stromstärke von 2 mA/cm2 im sogenannten semi-dry-Verfahren. Als Transferpuffer wurde der Laufpuffer der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese mit 20% Methanol verwendet. Die Nitrocellulosemembranen wurden 2-3 Stunden lang in TBT-Puffer mit 10% Trockenmilchpulver geblockt, und dann mit der entsprechenden Verdünnung


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des Antikörpers in TBT-Puffer über Nacht inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit TBT-Puffer erfolgte eine einstündige Inkubation mit dem entsprechenden Antikörper-Peroxidase-Konjugat und der Nachweis der gebundenen Antikörper mittels ECL (Amersham).

TBT-Puffer: 50 mM Tris/HCl (pH = 7,5 ), 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20

3.3.3 Immunpräzipitation

3.3.3.1 Biotinmarkierung von Proteinen

Für die Immunpräzipitationen wurden die Proteinfraktionen durch eine Biotinylierung markiert. Bei dieser Markierungsmethode reagiert ein aktivierter Biotinester unter milden Bedingungen mit den freien Aminogruppen der Proteine. Da Biotin eine hohe Affinität zu Strepavidin besitzt, können immunpräzipitierte Proteine durch Konjugate von Strepavidin mit verschiedenen Enzymen (z.B. Peroxidase) nachgewiesen werden.

Biotin-X-NHS (Boehringer, Mannheim) wurde mit einer Endkonzentration von 25 mg/ml in DMSO gelöst, und bei -20 oC gelagert. Zur Markierung von Proteinen wurden 40 µl dieser Lösung zu 1 ml der jeweiligen Fraktion gegeben und 3 Stunden lang auf Eis inkubiert. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 80 µl einer 1M NH4Cl-Lösung und einer Inkubation von 10 min auf Eis gestoppt.

3.3.3.2 Koimmunpräzipitation mit alpha-YB-1

Die markierten Proben wurden in 1 ml IP-Puffer mit 2% BSA gegeben und 1-3 Stunden lang auf Eis inkubiert. Die Ansätze wurden 10 min lang bei 4oC und 14.000 U/min in einer Eppendorfzentrifuge zentrifugiert und die Überstände vorsichtig abgenommen. Zu den Überständen wurden die Antikörper gegen YB-1 (3 µl) gegeben und im Überkopfschüttler über Nacht inkubiert. Nach der Zugabe von 30 µl einer 50%igen Protein-A-Agarosesuspension für eine Stunde wurden die Ansätze 5 min bei 4 oC und 2.000 U/min zentrifugiert. Die Überstände wurden vorsichtig


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abgenommen und verworfen. Die sedimentierten Partikel wurden einmal mit Immunopuffer mit 2% BSA, zweimal mit Immunopuffer und einmal mit bidestilliertem Wasser gewaschen. Die Pellets wurden in Probenpuffer aufgenommen, 10 min lang bei 60 oC erhitzt und auf ein 10%iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Der Transfer der Proteine auf Nitrocellulosemembranen erfolgte analog dem Protokoll für Immunoblotanalysen. Nach dem Transfer wurden die Membranen 30 min lang in TBT-Puffer mit 10% Trockenmilch auf einem Schüttler inkubiert. Nach der Zugabe des Streptavidin-Peroxidase-Konjugats wurden die Membranen weitere 2 Stunden lang inkubiert und anschließend dreimal für 10 min mit TBT-Puffer und einmal mit bidestilliertem Wasser gewaschen. Die gebundenen Komplexe wurden anschließend mit einem ECL-Detektionssystems (Amersham) nachgewiesen.

IP-Puffer : 50 mM Hepes/KOH (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1% Chaps

3.3.4 Indirekte Immunfluoreszenzanalysen

Bei der indirekten Immunfluoreszenz werden die Zellen zunächst auf Objektträgern fixiert, permeabilisiert und mit der entsprechenden Verdünnung der ersten Antikörper inkubiert. Das ermöglicht die Bindung der ersten Antikörper an die gesuchten Proteine. Die zweiten, mit einem Marker (z.B. Fluorescein, Rhodamin) versehenen, Antikörper sind gegen die ersten Antikörper gerichtet. Die Lokalisation der gebundenen Antikörper kann im Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. Dabei sind bei der Verwendung von Fluorescein grüne, bei der von Rhodamin rote Fluoreszenzsignale zu erkennen.

Die auf Objektträgern kultivierten Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und anschließend in einer vorgekühlten Aceton-Methanol-Mischung (Verhältnis 1:1) bei -20 oC 10 min lang fixiert. Anschließend wurden die Objektträger an der Luft getrocknet und entweder direkt weiter bearbeitet oder in Aluminiumfolie bei -20 oC gelagert.

Die fixierten Zellen wurden zunächst in PBS äquilibriert und anschließend 30 min lang in PBS mit 1,5% Pferdeserum vorinkubiert. Der gleiche Puffer wurde für alle weiteren Inkubationen verwendet. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und dann 30-60 min lang mit der entsprechenden Antikörperverdünnung inkubiert.


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Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und dann 30 min lang mit einer Verdünnung von 1:200 des Anti-Kaninchen-IgG-Fluorescein-F(ab')2-Fragments bzw. einer Verdünnung von 1:100 des Anti-Maus-IgG-Rhodamin-F(ab')2-Fragments inkubiert. Für die Färbung der Zellkerne wurde DAPI verwendet. Nach einem letzten Waschschritt wurden die Zellen in Mowiol (Harlow + Lane, 1989) eingebettet.

3.3.5 Immunhistochemie

Die immunhistologischen Färbungen der Paraffinschnitte wurden entsprechend den Herstellerprotokollen des APAAP Dual System Kits und des ABC Vectastain Elite Kits durchgeführt.

3.4 RNA-Analyse

3.4.1 Isolierung von RNA

Eine Suspension von 106 Zellen in PBS wurde in 500 µl Lösung D lysiert. Zu dem Lysat wurden 50 µl einer 2M Natriumacetatlösung, 500 µl Phenol und 100 µl CIA gegeben, und 10 Sekunden lang auf einem Vortex-Gerät gemischt. Der Ansatz wurde 15 min lang auf Eis inkubiert, und dann für 20 min bei 4 oC und 5000 U/min in einer Eppendorfzentrifuge zentrifugiert. Die wäßrige Phase wurde vorsichtig abgenommen und mit dem gleichen Volumen Isopropanol vermischt. Nach der Inkubation über Nacht bei -20 oC wurde die RNA durch eine 20minütige Zentrifugation bei 4 oC und 5000 U/min pelletiert, mit 70%igem Ethanol gewaschen und in Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser gelöst. Die Konzentration der RNA-Lösungen wurde in einem Spektrometer bei 260 nm bestimmt (1 OD bei 260 nm entspricht etwa 40 µg/ml RNA). Bis zur weiteren Verwendung wurden die Proben bei -70 oC gelagert.

Lösung D : 4M Guanidiniumthiocyanat, 25 mM Natriumcitrat, 150 mM Natriumchlorid, 2% beta-Mercaptoethanol

CIA : Gemisch von Chloroform und Isoamylalkohol im Verhältnis 49:1


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3.4.2 Elektrophoretische Auftrennung von RNA

Für ein 1,2%iges Agarosegel wurden 1,56 g Agarose in 113 ml bidestilliertem Wasser aufgekocht. Nach dem Abkühlen auf etwa 60 oC wurden 13 ml 10xMops und 3,9 ml Formaldehyd zugegeben und die Lösung in eine Gelkammer gefüllt. Als Puffer für die Elektrophorese wurde 1xMops verwendet.

Die benötigte Menge RNA in 11 µl DEPC-behandeltem Wasser wurde mit 39 µl Puffer 1, 10 µl Puffer 2 und 1 µl Ethidiumbromid (1 mg/ml) gemischt und für 15 min auf 55 oC erwärmt. Nach einer kurzen Inkubation auf Eis wurden die Proben aufgetragen. Nach der Elektrophorese (1-2 Stunden bei 100 V) wurde das Gel unter UV-Licht fotografiert.

10xMops-Puffer: 200 mM Mops, 50 mM Natriumacetat, 10 mM EDTA, (pH = 7,0)

Puffer 1: (für 500 µl) - 64 µl 10xMops, 113 µl Formaldehyd, 322 µl Formamid (deionisiert)

Puffer 2: (für 10 ml) - 20 µl 0,5M EDTA, 25 µl einer gesättigten Lösung von Bromphenolblau, 25 µl einer gesättigten Lösung von Xylene-Cyanol, 6,25 ml 80 % Glyzerin, 3,68 ml DEPC-behandeltes Wasser

3.4.3 In-vitro-Transkription

Die In-vitro-Transkription von mdr1 wurde entsprechend dem Herstellerprotokoll des "Riboprobe in vitro Transcription System" (Promega) durchgeführt. Dabei wurden 5 µg des linearisierten Plasmids (pMDR1) eingesetzt. Nach zwei Stunden wurden 5 Einheiten DNase I dazugegeben und der Ansatz weitere 15 Minuten lang bei 37 oC inkubiert. Der Ansatz wurde nacheinander mit Phenol und mit Chloroform extrahiert. Die RNA wurde mittels Ethanol gefällt, nach dem Trocknen in bidestilliertem Wasser gelöst und bei -70 oC gelagert.


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3.5 In-vitro-Translation

3.5.1 Depletion des Retikulozytenlysates

200 µg alpha-YB-1 (YB-1-Depletion) bzw. 20 µl Präimmunserum (Mockdepletion) wurden zusammen mit 200 µl Protein-A-Agarose in 1 ml Puffer 1 (50 mM Hepes/KOH (pH 7,5), 100 mM KCl, 1 mM MgCl2) für eine Stunde auf einem Überkopfschüttler bei 4 oC inkubiert. Danach wurde die Protein-A-Agarose sedimentiert (5 min, 2000 U/min, 4oC, Eppendorf-Zentrifuge), der Überstand wurde abgenommen und verworfen. Die Protein-A-Agarose wurde dann dreimal mit Puffer 2 (50 mM Hepes/KOH (pH 7,5), 500 mM KCl, 5 mM Mg2Cl) und zweimal mit Puffer 1 gewaschen. Nach dem Entfernen der Überstände wurden 200 µl Retikulozytenlysat (Promega) zu den Säulen hinzugegeben. Die Ansätze wurden eine Stunde lang bei 4 oC auf einem Überkopfschüttler inkubiert und anschließend in "Polyprep"-Säulen überführt. Das Retikulozytenlysat wurde durch Zentrifugation (1000 U/min, 5 min, 4 oC, Beckmann-Zentrifuge) von der Protein-A-Agarose getrennt und in Aliquots von 14 µl bei - 70 oC gelagert.

3.5.2 Hochsalzwaschen von rauhen Mikrosomen

50 µl rauhe Mikrosomen (etwa 100 eq.) wurden in 500 µl Hochsalzpuffer resuspendiert und 10 min lang auf Eis inkubiert. Die Mikrosomen wurden sedimentiert (60,000 U/min, 20 min, 4 oC, Beckmann Optima TLX) und der Überstand vorsichtig abgenommen. Die Mikrosomen wurden erneut in 500 µl Hochsalzpuffer resuspendiert, und die Zentrifugation wurde wiederholt. Nach dem Entfernen des Überstands wurde das Pellet in 45 µl Membranpuffer resuspendiert und bei - 70 oC gelagert.

Hochsalzpuffer : 50 mM Hepes/KOH (pH 7,5), 1000 mM KCl, 10 mM MgCl2, 250 mM Saccharose, 1 mM DTT, PI

Membranpuffer : 50 mM Hepes/KOH (pH 7,5), 250 mM Saccharose, 1 mM DTT, PI


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3.5.3 In-vitro-Translation

Für die In-vitro-Translationen wurde das "Rabbit Retikulocyte in vitro Translation"-System der Firma Promega verwendet. Die Reaktionen wurden in Ansätzen von 12 µl durchgeführt. Diese Ansätze enthielten 6 µl Retikulozytenlysat, 0,25 µl Aminosäuremix ohne Methionin, 0,25 µl RNaseinhibitor, 0,5 µl 35S-Methionin. Für die Untersuchung der Translokation von Proteinen durch das rauhe ER wurden 0,5 eq. rauhe bzw. mit hoher Salzkonzentration gewaschene Mikrosomen zu den Ansätzen gegeben. Von den Transkripten wurden folgende Mengen in den Ansätzen verwendet: Luciferase 0,5 µg, alpha-Faktor 0,12 µg, Präprolactin 0,5 µg, P-Glykoprotein 0,5 µg. Nach der Zugabe der mRNA wurden die Translationsansätze 90 Minuten lang bei 30 oC inkubiert. 5 µl eines jeden Ansatzes wurden in 20 µl SDS-Probenpuffer für 10 Minuten auf 70 oC erwärmt und dann auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und über Nacht mit einem Röntgenfilm exponiert.

3.6 Saccharosegradientenzentrifugation

Jeweils 3 ml der zytoplasmatischen Extrakte der sequentiellen Extraktion wurden auf 23 ml eines linearen 10%-40% Saccharosegradienten aufgetragen. Die Gradienten wurden bei 20 oC und 27.000 U/min in einem SW 27 Rotor 4,5 Stunden lang zentrifugiert. Es wurden Fraktionen von je 2 ml abgenommen und die Pellets in 2 ml der 10%igen Saccharoselösung resuspendiert. Für die Proteinanalyse wurden die Fraktionen mit Wasser verdünnt und die Proteine mit TCA präzipitiert.

Gradientenpuffer: 50 mM Hepes (pH = 7,6), 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% NP 40, PI

3.7 Proteinfällung und -konzentrationsbestimmung

3.7.1 Proteinfällung mit TCA

Die Proben wurden 1:1 mit 20% TCA versetzt und 10 Minuten lang auf Eis inkubiert.


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Anschließend wurden die Proben 10 Minuten lang bei 4 oC und 14.000 U/min in der Eppendorfzentrifuge sedimentiert, die Pellets mit Aceton gewaschen und in Probenpuffer bei 70 oC gelöst.

3.7.2 Bestimmung der Proteinkonzentration

Die Proteinkonzentrationen von Proben, die keine oder nur geringe Detergensmengen enthielten, wurden entsprechend dem Herstellerprotokoll des "Protein Assay"-Systems (BioRad) bestimmt. Für alle anderen Proteinproben wurde das "DC Protein Assay"-System (BioRad) verwendet.

3.8 Proteinfärbungen

3.8.1 Färbung mit Coomassieblau

SDS-Polyacrylamidgele wurden nach der Elektrophorese über Nacht bei Raumtemperatur in der Färbelösung inkubiert. Die Entfärbung erfolgte dann über mehrere Stunden in der Entfärberlösung.

Färbelösung: 10% Essigsäure, 40% Methanol, 0,15% Coomassieblau

Entfärber: 10% Essigsäure, 5% Methanol

3.8.2 Färbung mit Silbernitrat

Nach der Elektrophorese wurden die Gele in 10% Essigsäure, 40% Methanol fixiert, und dann entsprechend dem Herstellerprotokoll des Färbesystems (BioRad) weiterbehandelt.

3.8.3 Färbung mit Amidoschwarz

Von den Fraktionen wurden jeweils 1 µl direkt auf die Nitrocellulose aufgetragen. Nach dem Trocknen wurden die Membranen etwa 10 min lang in einer Amidoschwarzlösung inkubiert und anschließend mit bidestilliertem Wasser entfärbt.


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