Jürchott, Karsten: Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation und zu den Funktionen von YB-1, einem Y-Box-Protein in Säugerzellen

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Kapitel 4. Ergebnisse

4.1 Untersuchung der subzellulären Lokalisation von YB-1

4.1.1 Herstellung eines polyklonalen Peptidantiserums gegen YB-1

Für den Nachweis von YB-1 war es zunächst notwendig, ein polyklonales Antiserum herzustellen. Dazu wurde ein synthetisches Peptid (acetyl-MSSESETQQPPA-cys), das dem N-Terminus von YB-1 entspricht, an KLH ("keyhole limpet hemocyanin") und BSA ("bovine serum albumin") gekoppelt. Nach der mehrfachen Immunisierung der Kaninchen mit diesen beiden Konjugaten wurde das Antiserum mit Hilfe des Peptids affinitätsgereinigt. Die n-terminale Region der Y-Box-Proteine weist keine Übereinstimmungen zwischen den bislang bekannten Vertretern innerhalb einer Art auf. Daher kann davon ausgegangen werden, daß die erhaltenen Antikörper neben YB-1 keine weiteren Y-Box-Proteine erkennen.

Die Spezifität dieser Antikörper (alpha-YB-1) wurde zunächst in einem Immunoblot getestet. Dazu wurden 2 x 105 HeLa-Zellen in Probenpuffer lysiert und die Proteine auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Als Kontrolle wurde ein Lysat von Hundepankreasmikrosomen verwendet, da YB-1 in dieser Fraktion nach partieller Reinigung durch Peptidsequenzierung nachgewiesen wurde (Jürchott, 1994). Beide Proben ergaben im Immunoblot ein spezifisches Signal bei einem Molekulargewicht von 50.000 (Abbildung 1, Bahnen 1 und 2). Bei einem gleichzeitig dazu durchgeführten weiteren Immunoblot mit denselben Proben wurde alpha-YB-1 zunächst mit einem Überschuß des für die Immunisierung verwendeten Peptids vorinkubiert. Diese Inkubation bewirkt eine Blockierung aller spezifischen Bindungsstellen der Antikörper, was zum Verschwinden der spezifischen Signale im Immunoblot führt. In Abbildung 1 ist zu erkennen, daß das Signal bei einem Molekulargewicht von 50.000 nicht mehr nachzuweisen ist (Bahnen 3 und 4).


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Abbildung 1: Immunoblotanalyse mit einem polyklonalen Peptidantiserum gegen YB-1 (alpha-YB-1)
Hundepankreasmikrosomen (Bahnen 1 und 3) und HeLa-Zellen (Bahnen 2 und 4) wurden in SDS-Probenpuffer lysiert. Die Proteine der Lysate wurden in einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt, und auf Nitrozellulose transferiert. Die Membran wurde über Nacht mit alpha-YB-1 inkubiert. In einem parallel durchgeführten Kontrollexperiment wurde alpha-YB-1 zunächst mit einem Überschuß des für die Herstellung der Antikörper verwendeten Peptids vorinkubiert und danach für die Inkubation mit der Nitrozellulosemembran eingesetzt (Bahnen 3 und 4). Die gebundenen Antikörper wurden mit dem ECL-System (Amersham) nachgewiesen.

4.1.2 Untersuchung der subzellulären Verteilung von YB-1 in logarithmisch wachsenden HeLa- und MCF7-Zellen

Zu Beginn der Arbeiten gab es augenscheinlich widersprüchliche Hinweise auf die subzelluläre Lokalisation von YB-1. So wurde postuliert, daß YB-1 als Transkriptionsfaktor im Zellkern lokalisiert ist (Didier et al., 1988). Zellfraktionierungen, die vom Autor im Rahmen der Diplomarbeit durchgeführt wurden haben jedoch gezeigt, daß sowohl in Hundepankreas als auch in PC12-Zellen (Ratte) YB-1 hauptsächlich im Zytoplasma nachweisbar war (Jürchott, 1994). Aus diesem Grunde wurde versucht, die intrazelluläre Verteilung von YB-1 mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz aufzuklären.

Für die Untersuchung wurden exponentiell wachsende HeLa-Zellen fixiert und mit alpha-


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YB-1 in einer Verdünnung von 1:200 für 30 min inkubiert. Als zweite Antikörper wurden Anti-Kaninchen-IgG-F(ab')2-Fragmente verwendet, die mit Fluorescein markiert waren. Die Untersuchung der Proben im Fluoreszenzmikroskop ließ Signale im Zytoplasma der HeLa-Zellen erkennen. Etwa 5% der Zellen wiesen zusätzlich dazu auch Signale im Zellkern auf (Abbildung 2, A).

Für die Kontrolle der Spezifität dieser Färbung gibt es zwei Möglichkeiten:

1. Nach dem Weglassen des ersten Antikörpers sichtbare Signale resultieren im wesentlichen aus der unspezifischen Bindung der zweiten Antikörper in den Zellen.

2. Nach der Blockierung der Bindungsstellen von alpha-YB-1 durch eine Inkubation der Antikörper mit dem für die Immunisierung verwendeten Peptid werden alle spezifischen Signale unterdrückt, während unspezifische Signale bestehen bleiben.

Bei den beiden durchgeführten Kontrollen war jeweils eine sehr starke Reduktion der beobachteten Signale zu erkennen (Abbildung 2, B und C). Aus diesen Ergebnissen kann geschlußfolgert werden, daß YB-1 hauptsächlich im Zytoplasma, zu bestimmten Zeitpunkten jedoch auch im Zellkern zu finden ist. Die beobachteten Signale sind spezifisch, da beide Kontrollen zu einer drastischen Reduktion der Signale führten.

Abbildung 2: Immunfluoreszenzanalyse von unsynchronisierten HeLa-Zellen mit alpha-YB-1
Exponentiell wachsende HeLa-Zellen wurden 10 Minuten lang bei -20 oC in einem Gemisch von Aceton und Methanol (1:1) fixiert. Nach dem Vorblocken in PBS mit 1,5% Pferdeserum wurden die HeLa-Zellen für 30 Minuten mit alpha-YB-1 (A), ohne alpha-YB-1 (B) oder mit alpha-YB-1 und einem Überschuß des für die Immunisierung verwendeten Peptids (C) inkubiert. Als zweite Antikörper wurden mit Fluorescein markierte Anti-Kaninchen-IgG-F(ab')2-Fragmente verwendet.

In den dargestellten Fluoreszenzanalysen konnte YB-1 bei 5% der


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unsynchronisierten HeLa-Zellen außer im Zytoplasma auch im Zellkern nachgewiesen werden. Aus dieser Beobachtung ergab sich die Frage, wodurch die Lokalisation von YB-1 beeinflußt wird. Bei der Untersuchung dieses Problems stand zunächst die Abhängigkeit der Lokalisation von YB-1 vom Verlauf des Zellzyklus im Mittelpunkt. Es sollte geklärt werden, ob YB-1 zu bestimmten Phasen des Zellzyklus im Zellkern zu finden ist.

Der Zellzyklus ist durch mehrere Phasen gekennzeichnet. Die Phase der Replikation der DNA wird als S-Phase (Synthesephase), der Zeitraum der Zellteilung als M-Phase (mitotische Phase) bezeichnet. Beide Phasen werden durch die G1- und die G2-Phase (abgeleitet von dem englischen Wort "gap", Lücke) voneinander getrennt. Das Voranschreiten des Zellzyklus wird durch Komplexe von cyclinabhängigen Kinasen (CDK's) mit deren regulatorischen Untereinheiten, den Cyclinen, kontrolliert. Die Cycline werden nur zu bestimmten Phasen des Zellzyklus exprimiert, und können daher als Marker für diese Phasen genutzt werden.

Zunächst wurde mittels der doppelten Immunfluoreszenz die Expression von Cyclin E in unsynchronisierten MCF7-Zellen mit der Lokalisation von YB-1 verglichen. Der Komplex von Cyclin E mit der cyclinabhängigen Kinase CDK2 ist notwendig für den Übergang von Zellen von der G1- in die S-Phase des Zellzyklus. Zu diesem Zeitpunkt wird Cyclin E im Zellkern akkumuliert (Ohtsubo et al., 1995). Bei etwa 90% der MCF7-Zellen, die Cyclin E im Zellkern enthielten, konnte ebenfalls eine Kernlokalisation von YB-1 festgestellt werden (Abbildung 3B). Im Gegensatz dazu wiesen MCF7-Zellen, bei denen Cyclin E nicht im Kern nachweisbar war, eine zytoplasmatische Lokalisation von YB-1 auf (Abbildung 3A).


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Abbildung 3: Analyse von unsynchronisierten MCF7-Zellen in der doppelten Immunfluoreszenz mit alpha-YB-1 und monoklonalen Antikörpern gegen Cyclin E
Exponentiell wachsende MCF7-Zellen wurden 10 min lang bei -20 oC in Aceton/Methanol fixiert. Nach dem Vorblocken in PBS mit 1,5% Pferdeserum wurden die Zellen mit alpha-YB-1 (Verdünnung 1:200) und monoklonalen Antikörpern gegen Cyclin E (Verdünnung 1:50) inkubiert. Als zweite Antikörper wurden mit Fluorescein markierte Anti-Kaninchen-IgG-F(ab')2-Fragmente und mit Rhodamin markierte Anti-Maus-Ig-F(ab')2-Fragmente verwendet. Die Auswertung der Präperate erfolgte durch CLSM (Confocal Laser Scanning Mikroscopy).

Die oben dargestellten Ergebnisse der Immunfluoreszenzanalysen von unsynchronisierten MCF7-Zellen weisen auf eine Abhängigkeit der intrazellulären Verteilung von YB-1 vom Verlauf des Zellzyklus hin. Eine Kernlokalisation von YB-1 war in den MCF7-Zellen zu beobachten, die sich im Übergang von der G1- in die S-


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Phase, oder in der frühen S-Phase befanden.

4.1.3 Untersuchung der subzellulären Lokalisation von YB-1 in synchronisierten HeLa-Zellen

Um die Beziehung zwischen der Kernlokalisation von YB-1 und dem Verlauf des Zellzyklus näher zu untersuchen, wurden HeLa-Zellen vor den Immunfluoreszenzanalysen mit Hilfe verschiedener biochemischer Methoden synchronisiert. Diese Zellinie wurde für die weiteren Experimente ausgewählt, weil die Synchronisierung von HeLa-Zellen im Labor gut etabliert war.

Abbildung 4: Schema der Zellzyklussynchronisierung von Zellen

Zunächst wurden die HeLa-Zellen durch eine Inkubation mit 20 µM Lovastatin in der G1-Phase arretiert. Lovastatin ist ein Inhibitor des Mevalonat-Biosynthesewegs, und verhindert damit unter anderem die Modifikation der Ras-Proteine mit einem Farnesylrest. Diese Modifikation ist der einleitende Schritt der posttranslationalen Veränderungen der Ras-Proteine, die zu einer Assoziation dieser Proteine mit der Plasmamembran führt. Die Lokalisation an der Plasmamembran ist sowohl für die Aktivierung der Ras-Proteine durch externe Faktoren als auch für die Übertragung der Signale auf die folgenden Proteine der Signaltransduktionskaskaden (wie zum Beispiel Raf und Ral) notwendig. Eine Störung der Farnesylierung der Ras-Proteine unterbricht diese Proteinkaskaden und führt somit zur Blockade des Zellzyklus. Diese Arretierung läßt sich bei HeLa-Zellen durch Entfernen des Lovastatins und Zugabe


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von einem Überschuß Mevalonat wieder aufheben (Keyomarsi et al., 1991; Pardee et al.; 1992; Malumbres + Pellicer, 1998). Proben der HeLa-Zellen wurden zum Zeitpunkt der Blockade und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Mevalonatzugabe fixiert und durch die indirekte Immunfluoreszenz analysiert. Die Morphologie der Zellen zum Zeitpunkt der Blockade war stark verändert, so daß mit Hilfe der Immunfluoreszenz keine klare Aussage über die Lokalisation von YB-1 gemacht werden konnte. Vier Stunden nach der Mevalonatzugabe war das normale Aussehen der Zellen wiederhergestellt, und YB-1 konnte im Zytoplasma nachgewiesen werden (Abbildung 5, A). Etwa sieben Stunden nach dem Aufheben der Blockade war bei einem großen Teil der Zellen YB-1 auch im Zellkern lokalisiert. Der Nachweis von Cyclin E in diesen Zellkernen belegte, daß zu diesem Zeitpunkt der Übergang der Zellen von der G1- in die S-Phase stattfand (Abbildung 5, B).

Abbildung 5: Immunfluoreszenzanalyse von mit Lovastatin synchronisierten HeLa-Zellen
HeLa-Zellen wurden auf Objektträgern kultiviert, und für 24 Stunden mit Lovastatin (20 µM) inkubiert. Nach dem Wechsel des Mediums wurden die HeLa-Zellen weiter kultiviert und nach den in der Abbildung angegebenen Zeiten 10 Minuten lang in Aceton/Methanol bei -20 oC fixiert. Die fixierten HeLa-Zellen wurden dann wie oben beschrieben mit alpha-YB-1 und monoklonalen Antikörpern gegen Cyclin E gefärbt.


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Für Untersuchungen in der S-Phase des Zellzyklus wurden die HeLa-Zellen mit Hilfe von Aphidicolin (Endkonzentration 3 µM) synchronisiert. Aphidicolin hemmt die DNA-Polymerase alpha und arretiert dadurch reversibel den Zellzyklus in der frühen S-Phase. Die Blockade kann durch das einfache Entfernen des Aphidicolins durch einen Wechsel des Kulturmediums aufgehoben werden (Pedrali-Noy et al., 1980). Die synchronisierten Zellen wurden zum Zeitpunkt der Blockade und zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Entfernen des Aphidicolins untersucht. Zunächst wurde der Verlauf der S-Phase durch eine FACS-Analyse ("fluorescence activated cell sorting") bestimmt. Dazu wurden die fixierten Zellen mit Propidiumiodid inkubiert, einem Molekül, das in die DNA interkaliert. Die Komplexe von Propidiumiodid mit der DNA können durch eine Fluoreszenz nachgewiesen werden. Da die Stärke des Fluoreszenzsignales jeder Zelle von der DNA-Menge abhängt, kann mit Hilfe der FACS-Analyse der DNA-Gehalt der Zellen bestimmt und damit der Prozeß der DNA- Replikation verfolgt werden.

In Abbildung 6 A ist die FACS-Analyse von unsynchronisierten HeLa-Zellen dargestellt. M1 kennzeichnet dabei den Anteil der HeLa-Zellen, die sich in der G1-Phase des Zellzyklus befinden. M2 repräsentiert die in der S-Phase befindlichen HeLa-Zellen, während M3 die HeLa-Zellen umfaßt, die sich in der G2-Phase befinden. Die Verteilung der HeLa-Zellen zwischen den verschiedenen Zellzyklusphasen wurde durch das Wechseln des Kulturmediums nicht beeinflußt (Abbildung 6, B).

Bei den mit Aphidicolin behandelten HeLa-Zellen war eine Veränderung der Verteilung der Zellen zwischen den einzelnen Zellzyklusphasen zu erkennen. Eine Stunde nach dem Mediumwechsel befanden sich 26% der HeLa-Zellen in der S-Phase (Abbildung 6, C). Etwa vier Stunden nach dem Aufheben der Blockade durch Aphidicolin konnten etwa 50% der HeLa-Zellen in der S-Phase nachgewiesen werden (Abbildung 8, D). Nach rund sieben Stunden befanden sich etwa 70% der


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HeLa-Zellen in der späten S-Phase bzw. in der G2-Phase (Abbildung 6, E).

Abbildung 6: FACS-Analyse der mit Aphidicolin synchronisierten HeLa-Zellen
Die HeLa-Zellen wurden für 24 Stunden in einem Medium mit 3 µM Aphidicolin kultiviert. Nach dem Aufheben der Blockade durch einen Mediumwechsel wurden die HeLa-Zellen zu den in der Abbildung angegebenen Zeiten geerntet und mit Hilfe der FACS-Analyse untersucht.


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Wie aus den FACS-Analysen ersichtlich ist, durchlief ein großer Teil der mit Aphidicolin behandelten HeLa-Zellen die S-Phase gleichzeitig. Um den Verlauf der S-Phase auch in der Immunfluoreszenz verfolgen zu können, wurde PCNA als Marker verwendet. Die aktivierte Form dieses Proteins, die im Gegensatz zur inaktiven Form durch die Fixierung mit organischen Lösungsmitteln nicht aus den Zellen entfernt wird, ist mit den Startpunkten der DNA-Replikation assoziiert. Dabei ändert sich innerhalb der S-Phase das in der Fluoreszenz erkennbare Muster (Celis + Celis, 1985). In der frühen S-Phase überwiegt eine diffuse Färbung des Zellkerns, wobei die Nucleoli ungefärbt bleiben (Abbildung 7, A). Im weiteren Verlauf bestimmen dann diskrete Punkte im Zellkern das Bild (Abbildung 7, C). Im mittleren Bereich der S-Phase erscheinen die Nucleoli stark gefärbt, während die Signale in den anderen Regionen des Kerns kaum noch sichtbar sind (Abbildung 7, E). Danach sind wieder einzelne Punkte im Zellkern zu erkennen, die beim Übergang zur G2-Phase verschwinden (Abbildung 7, G).

Zu Beginn der S-Phase war YB-1 im Zellkern und im Zytoplasma nachzuweisen (Abbildung 7, B und D). Im weiteren Verlauf der S-Phase war eine Abnahme des Signals von YB-1 im Zellkern sowie eine Akkumulation von YB-1 in der kernnahen Region zu beobachten (Abbildung 7, F). In der späten S-Phase war YB-1 im wesentlichen im Zytoplasma lokalisiert (Abbildung 7, H).


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Abbildung 7: Immunfluoreszenzanalyse der mit Aphidicolin synchronisierten HeLa-Zellen
Die HeLa-Zellen wurden für 24 Stunden mit 3 µM Aphidicolin behandelt. Nach dem Austausch des Mediums wurden die HeLa-Zellen zu den angegebenen Zeiten 10 Minuten lang in Aceton/Methanol bei -20 oC fixiert, und anschließend mit alpha-YB-1 (B, D, F, H) und monoklonalen Antikörpern gegen PCNA (A, C, E, G) gefärbt.

Die Ergebnisse der Immunfluoreszenzanalysen wurden durch Zellfraktionierungen überprüft. Dazu wurden HeLa-Zellen mit Lovastatin oder Aphidicolin synchronisiert und zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet. Mit diesen Zellen wurde eine Zellfraktionierung durchgeführt und die Verteilung von YB-1 in den Kernfraktionen


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(Kerneluat und -pellet) in einem Immunoblot bestimmt. Der Einsatz gleicher Proteinmengen bei den Kernfraktionen wurde durch eine Färbung des SDS-Polyacrylamidgels mit Comassieblau überprüft. Bei den unsynchronisierten HeLa-Zellen sowie bei den HeLa-Zellen, die durch Lovastatin in der G1-Phase arretiert wurden, konnte YB-1 in den Kernfraktionen nicht nachgewiesen werden (Abbildung 8, Bahnen 11 und 12; Bahnen 1 und 2). Dagegen waren vier und sieben Stunden nach dem Aufheben der Lovastatinblockade deutliche Signale in den Kernfraktionen zu erkennen (Abbildung 8, Bahnen 3 und 4; Bahnen 5 und 6). Ebenfalls in den Kernfraktionen wurde YB-1 in den mit Aphidicolin behandelten Zellen gefunden (Abbildung 8, Bahnen 7 und 8). Diese Signale nahmen vier Stunden nach dem Entfernen des Aphidicolins stark ab (Abbildung 8, Bahnen 9 und 10). Die Zellfraktionierungsexperimente haben somit ebenfalls bestätigt, daß YB-1 im Verlauf des Übergangs von der G1- in die S-Phase und in der frühen S-Phase im Zellkern lokalisiert ist.

Abbildung 8: Immunoblot der Kernfraktionen von synchronisierten HeLa-Zellen
HeLa-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 20 µM Lovastatin (Bahnen 1 bis 6) oder 3 µM Aphidicolin (Bahnen 7 bis 10) inkubiert und nach dem Mediumwechsel zu den angegebenen Zeiten geerntet. Als Kontrolle wurden zusätzlich unbehandelte HeLa-Zellen verwendet (Bahnen 11 und 12). Die HeLa-Zellen wurden einer Zellfraktionierung unterzogen und das Kerneluat sowie das Kernpellet auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine auf Nitrozellulose transferiert und über Nacht mit alpha-YB-1 in TBT (1:2500) inkubiert. Die gebundenen Antikörper wurden mit dem ECL-Systems (Amersham) nachgewiesen.


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4.2 Identifikation eines durch YB-1 regulierten Genes

4.2.1 Regulation der Transkription von mdr1 durch YB-1

Wie im vorangegangenen Abschnitt gezeigt wurde, ist YB-1 hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert. Während des Übergangs von der G1- in die S-Phase kann YB-1 jedoch auch im Zellkern nachgewiesen werden. Die nucleäre Lokalisation ist Voraussetzung dafür, daß YB-1 als Transkriptionsfaktor wirken kann. Für die weitere funktionelle Charakterisierung von YB-1 sollte daher untersucht werden, ob YB-1 in vivo an der Regulation von Genen beteiligt ist. Aus der Literatur war bekannt, daß das Gen mdr1 ein Y-Box-Bindungsmotiv im Promotor enthält, welches essentiell für die basale Expression dieses Gens ist (Goldsmith et al., 1993). Das Produkt von mdr1, P-Glykoprotein, ist für die Biomedizin von höchstem Interesse. P-Glykoprotein ist ein Transmembranprotein, das zur Familie der ABC-Transporter gehört. Es ist in der Lage, zahlreiche hydrophobe Verbindungen, zu denen auch viele Chemotherapeutika gehören, die in der Tumorbehandlung eingesetzt werden, aus Zellen zu exportieren. Das bedeutet, daß Zellen, die dieses Protein exprimieren, eine Resistenz gegen verschiedene Chemotherapeutika aufweisen ("multiple drug resistance"). Aus diesem Grunde ist das Vorhandensein von P-Glykoprotein in malignen Tumoren in der Regel mit einer negativen Prognose für den Patienten verbunden (Verelle, 1991; Gottesman + Pastan, 1993).

Der Einfluß von YB-1 auf die Expression von P-Glykoprotein wurde in einem Kooperationsprojekt mit Prof. M. Dietel (Charité, Berlin) und Prof. B. Dörken (Robert-Rössle-Klinik, MDC, Berlin) untersucht.

Zunächst wurden im Labor von Prof. M. Dietel MCF7-Zellen, die resistent gegenüber


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einer Behandlung mit Chemotherapeutika sind, durch die ständige Präsenz von Doxorubicin im Kulturmedium selektiert. Die Ausgangszellen und die resistenten MCF7-Zellen (im folgenden mit MCF7/ADR bezeichnet) wurden dann in der indirekten Immunfluoreszenz miteinander verglichen. Bei den MCF7-Zellen wurde YB-1 im wesentlichen im Zytoplasma gefunden. P-Glykoprotein konnte in diesen Zellen nicht nachgewiesen werden (Abbildung 9, A). Die MCF7/ADR-Zellen zeigten im Gegensatz dazu neben einer stärkeren YB-1-Expression einen wesentlich höheren Anteil von YB-1 im Zellkern und eine deutliche Expression von P-Glykoprotein (Abbildung 9, B).

Abbildung 9: Analyse von MCF7- und MCF7/ADR-Zellen mittels der doppelten Immunfluoreszenz
MCF7- (A) und MCF7/ADR-Zellen (B) wurden auf Objektträgern kultiviert und 10 Minuten lang bei -20 oC in Aceton/Methanol fixiert. Nach dem Vorblocken in PBS mit 1,5% Pferdeserum wurden die Zellen mit alpha-YB-1 (Verdünnung 1:200) und monoklonalen Antikörpern gegen P-Glykoprotein (JSB-1; Verdünnung 1:20) inkubiert. Als zweite Antikörper wurden mit Fluorescin markierte Anti-Kaninchen-IgG-F(ab')2-Fragmente und mit Rhodamin markierte Anti-Maus-Ig-F(ab')2-Fragmente verwendet. Die Zellkerne wurden zur Darstellung mit DAPI gefärbt.


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Die Kernlokalisation von YB-1 in den MCF7/ADR-Zellen wurde mit Hilfe einer Zellfraktionierung überprüft. Dazu wurden MCF7- und MCF7/ADR-Zellen lysiert und das Zytoplasma durch Zentrifugation von den Zellkernen getrennt. Nach dem Kernelutionsschritt wurden alle Fraktionen durch eine Immunoblotanalyse untersucht. YB-1 konnte bei den MCF7-Zellen nur in der zytoplasmatischen Fraktion (Abbildung 10A, Bahn 1), bei den MCF7/ADR-Zellen jedoch auch im Kernpellet nachgewiesen werden (Abbildung 10B, Bahn 4).

Abbildung 10: Immunoblotanalyse der Zellfraktionierung von MCF7- und MCF7/ADR-Zellen
MCF7- (A) und MCF7/ADR-Zellen (B) wurden in einer Zellfraktionierung aufgeschlossen, und die Fraktionen durch einen Immunoblot mit alpha-YB-1 untersucht.

Der vorangegangene Versuch ergab eine Korrelation zwischen der Kernlokalisation von YB-1 und der Expression von P-Glykoprotein. Um zu beweisen, daß YB-1 an der Regulation von mdr1 beteiligt ist, wurde versucht, gezielt die Aktivität von YB-1 zu erhöhen. Dazu wurden im Labor von Prof. B. Dörken HBL100-Zellen mit einem Plasmid transfiziert, das das EcoRI-Fragment der mRNA von YB-1 unter der Kontrolle des CMV-Promotors enthält (Christian Wagener, persönliche Mitteilung). Diese Transfektanten (im folgenden als H1000-Zellen bezeichnet) repräsentieren somit eine Zellinie, die YB-1 konstitutiv überexprimiert. In Gelshiftexperimenten konnte bei den H1000-Zellen im Zellkern eine erhöhte Menge YB-1 nachgewiesen werden (Stephan Bergmann, persönliche Mitteilung). Daher sollte untersucht werden, ob sich die gefundene Korrelation zwischen der Kernlokalisation von YB-1 und der Expression von P-Glykoprotein in diesem Zellsystem bestätigen läßt.

HBL100-Zellen und H1000-Zellen wurden unter gleichen Bedingungen kultiviert und 10 Minuten lang bei -20 oC in Aceton/Methanol fixiert. Die Verteilung von YB-1 sowie die Expression von P-Glykoprotein wurden mittels der indirekten doppelten


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Immunfluoreszenz analysiert. Bei den HBL100-Zellen war YB-1 vorwiegend im Zytoplasma lokalisiert. P-Glykoprotein konnte in diesen Zellen nicht nachgewiesen werden (Abbildung 11, A). Die H1000-Zellen wiesen im Gegensatz dazu einen höheren Anteil von YB-1 im Zellkern auf, und es war eine deutliche Expression von P-Glykoprotein zu erkennen (Abbildung 11, B). Dieses Experiment bestätigt den direkten Zusammenhang zwischen der Kernlokalisation von YB-1 und der Expression von P-Glykoprotein. Somit beweist dieses Experiment auch die Funktion von YB-1 als Transkriptionsfaktor.

Abbildung 11: Immunfluoreszenzanalyse von HBL100-Zellen und H1000-Zellen
HBL100-Zellen (A) und H1000-Zellen (B) wurden auf Objektträgern kultiviert und 10 Minuten lang bei -20 oC in Aceton/Methanol fixiert. Nach dem Vorblocken in PBS mit 1,5% Pferdeserum wurden die Zellen mit alpha-YB-1 (Verdünnung 1:200) und monoklonalen Antikörpern gegen P-Glykoprotein (JSB-1; Verdünnung 1:20) inkubiert. Als zweite Antikörper wurden mit Fluorescein markierte Anti-Kaninchen-IgG-F(ab')2-Fragmente und mit Rhodamin markierte Anti-Maus-Ig-F(ab')2-Fragmente verwendet. Die Zellkerne wurden zur Darstellung mit DAPI gefärbt.


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4.2.2 Immunhistochemischer Nachweis von YB-1 in Mammakarzinomen

Bei etwa 20 bis 40 Prozent primärer Mammakarzinome ist eine spontane Expression von P-Glykoprotein nachweisbar (Verelle et al., 1991). In den untersuchten Zellkulturen konnte festgestellt werden, daß die Expression von P-Glykoprotein durch eine Kernlokalisation von YB-1 hervorgerufen wurde. Daher wurde im nächsten Schritt untersucht, ob diese Korrelation auch in P-Glykoprotein-positiven Mammakarzinomen nachweisbar ist.

Zunächst wurden Paraffinschnitte von primären Mammakarzinomen mit Hilfe des APAAP-Systems mit alpha-YB-1 gefärbt. Das APAAP-System dient dem immunhistochemischen Nachweis von Proteinen in Paraffin- oder Kryoschnitten. Bei diesem System wurden die Gewebeschnitte zunächst mit den gegen die zu untersuchenden Protein gerichteten Antikörper inkubiert. Die im zweiten Schritt verwendeten Antikörper sind gegen den Fc-Teil der ersten Antikörper gerichtet. Die zweite antigene Bindungsstelle dieser Antikörper ist in der Lage, die im dritten Schritt verwendeten markierten Antikörper zu binden. Die im dritten Schritt verwendeten Antikörper sind mit einer alkalischen Phosphatase gekoppelt. Die Reaktion dieser alkalischen Phosphatase mit einer Neufuchsin-Entwicklerlösung ergibt einen roten Farbstoff. Zur besseren Sichtbarkeit werden schließlich die Zellkerne in den Schnitten mit Hämalaun blau gefärbt.

Entsprechend dem oben beschriebenen Protokoll wurden Paraffinschnitte von primären Mammakarzinomen mit alpha-YB-1 untersucht. Zur Kontrolle wurden Färbungen von Schnitten der gleichen Karzinome zum einen ohne alpha-YB-1 und zum anderen nach dem Inkubieren von alpha-YB-1 mit dem für die Immunisierung verwendeten Peptid durchgeführt. Bei der immunhistochemischen Untersuchung der Mammakarzinomschnitte mit alpha-YB-1 war eine deutliche Färbung von Zellen zu beobachten (Abbildung 12, A). In den Ansätzen ohne alpha-YB-1 (ohne Abbildung) und nach der Vorinkubation der Antikörper mit dem für die Immunisierung verwendeten Peptid (Abbildung 12, B) konnte im Gegensatz dazu keine Färbung mehr gefunden werden. Die beiden Ansätze sind, wie schon bei den Immunfluoreszenzversuchen erläutert, Kontrollen für die Spezifität der verwendeten Antikörper. Daher kann geschlußfolgert werden, daß die Antikörper gegen YB-1 in dem verwendeten APAAP-System keine unspezifischen Wechselwirkungen eingehen.


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Abbildung 12: Immunhistochemischer Nachweis von YB-1 in primären Mammakarzinomen
Paraffinschnitte von primären Mammakarzinomen wurden mit Hilfe der APAAP-Methode mit alpha-YB-1 gefärbt (A). Zur Kontrolle der Spezifität der Immunreaktion wurde in einem Parallelversuch alpha-YB-1 mit dem für die Immunisierung verwendeten Peptid vorinkubiert (B).

4.2.3 Korrelation der Kernlokalisation von YB-1 mit der Expression von P-Glykoprotein in primären Mammakarzinomen

Im nächsten Schritt wurden die Expressionen von YB-1 und P-Glykoprotein in 27 primären Mammakarzinomen miteinander verglichen. Der Nachweis von YB-1 wurde, wie im vorangegangenen Abschnitt beschrieben, mit der APAAP-Methode durchgeführt. Für den Nachweis von P-Glykoprotein wurde ein Peroxidasesystem der Firma "Vectastain" verwendet. Bei diesem System ergibt die Reaktion der Peroxidase mit dem Substrat einen braunen Farbstoff.

Die Unterscheidung von malignen und nichtmalignen Regionen der Schnitte wurde auf Grund histologischer Merkmale getroffen (H.-D. Royer, persönliche Mitteilung). Bei der Auswertung der Färbungen war eine unterschiedliche Ausprägung der Signalstärke von YB-1 zu beobachten. In nichtmalignem Brustgewebe konnte YB-1 nicht nachgewiesen werden (Abbildung 13, A). Im Gegensatz dazu war YB-1 in allen malignen Bereichen der Schnitte zu finden. Dabei waren Tumore mit entweder schwachen zytoplasmatischen (Abbildung 13, C), starken zytoplasmatischen (Abbildung 13, E) oder gleichzeitig zytoplasmatischen und nuclearen Färbungen (Abbildung 13, G) zu erkennen.

In dem untersuchten nichtmalignen Gewebe war P-Glykoprotein nicht nachweisbar (Abbildung 13, B). Bei einer ausschließlich zytoplasmatischen Expression von YB-1 konnte P-Glycopotein ebenfalls nicht gefunden werden (Abbildung 13, D und F). Im Gegensatz dazu war in allen Schnitten, die eine Kernlokalisation von YB-1 aufwiesen, eine deutliche Expression von P-Glykoprotein zu erkennen (Abbildung 13,


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H).

Dieser Vergleich belegt somit, daß auch in den untersuchten Tumoren die Expression von P-Glykoprotein mit der nuclearen Lokalisation von YB-1 korreliert. Es kann daher geschlußfolgert werden, daß YB-1 ein wichtiger Faktor bei der Regulation von mdr1 und damit auch bei der Ausprägung einer Chemotherapeutikaresistenz von Mammakarzinomen ist.

Abbildung 13: Immunhistochemischer Nachweis von YB-1 und P-Glykoprotein in primären Mammakarzinomen
Paraffinschnitte wurden mit Hilfe der APAAP-Methode mit alpha-YB-1 (A, C, E, G) und mit einem Peroxidasesystem (Vectastain) mit JSB-1 (B, D, F, H) gefärbt.


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4.3 Charakterisierung von zytoplasmatischen Bindungspartnern von YB-1

4.3.1 Koimmunpräzipitation mit alpha-YB-1

Die im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit dargestellten Immunfluoreszenzanalysen haben gezeigt, daß YB-1 hauptsächlich im Zytoplasma der untersuchten Zellen lokalisiert war. Über die Funktion, die YB-1 im Zytoplasma der Zellen erfüllt, ist wenig bekannt. Aus diesem Grunde wurde versucht, auf zwei verschiedenen Wegen weitere Kenntnisse über die Regulation und die Aufgaben von YB-1 zu erhalten. Zunächst wurde versucht, Proteine zu identifizieren, die im Zytoplasma mit YB-1 assoziiert sind. In einem späteren Kapitel wird dann die Beteiligung von YB-1 an der Translationskontrolle von Proteinen näher untersucht.

Eine Möglichkeit, assoziierte Proteine zu identifizieren, ist die Koimmunpräzipitation. Für den Nachweis der mit YB-1 koimmunpräzipitierten Proteine war es zunächst notwendig, das Zytoplasma von HeLa-Zellen zu markieren. In der vorliegenden Arbeit wurde dazu die Biotinylierung ausgewählt. Bei dieser Markierung reagiert ein aktivierter Biotinester mit freien Aminogruppen der Proteine unter der Ausbildung einer kovalenten Bindung. Die so markierten Proteine lassen sich dann über einen Streptavidin-Peroxidase-Komplex detektieren. Um die optimalen Bedingungen für diese Markierung zu bestimmen, wurden mehrere Ansätze mit unterschiedlichen Reaktionszeiten und Biotinesterkonzentrationen durchgeführt. Nach der Markierung wurden die Ansätze über Nacht mit alpha-YB-1 inkubiert und die Komplexe mit Hilfe von Protein-A-Agarose sedimentiert. Die Präzipitate wurden in Probenpuffer gelöst und die Proteine in einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Nach dem Transfer auf Nitrozellulosemembranen konnten die präzipitierten Proteine mit Hilfe eines Streptavidin-Peroxidasekonjugats sichtbar gemacht werden.


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Abbildung 14: Nachweis von interagierenden Proteinen durch Koimmunpräzipitation mit alpha-YB-1
Das Zytoplasma von HeLa-Zellen wurde entsprechend den angegebenen Zeiten entweder mit 0,5 mg/ml (Bahnen 1-4) oder 1 mg/ml (Bahnen 5-8) Biotinester inkubiert. Anschließend wurden die Proben in einer Koimmunpräzipitation mit alpha-YB-1 verwendet (Bahnen 2, 4, 6 und 8) Als Kontrolle wurde zu den Ansätzen statt der Antikörper nur die Protein-A-Agarose zugegeben (Bahnen 1, 3, 5 und 7). Die Präzipitate wurden auf einem 10%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf Nitrozellulose transferiert. Die präzipitierten Proteine wurden mittels eines Konjugats von Strepavidin mit Peroxidase durch das ECL-System (Amersham) nachgewiesen.

In der Abbildung 14 sind mehrere Proteinbanden zu erkennen. Neben einem Protein mit dem Molekulargewicht von 50.000 (P50), das gut mit dem Laufverhalten von YB-1 übereinstimmt, sind noch ein Protein mit einem Molekulargewicht von 35.000 (P35) und zwei schwächere Proteine mit ca. 30.000 (P30) und 45.000 (P45) nachzuweisen. Das bei 80.000 erkennbare Protein (P80) wurde auch durch die alleinige Zugabe der Protein-A-Agarose präzipitiert (Abbildung 14, Bahnen 1, 3, 5 und 7). Damit ist es kein spezifisch mit YB-1 assoziiertes Protein und wurde in der vorliegenden Arbeit nicht näher untersucht. Der Einfluß der Markierungszeit und der Konzentration des Biotinesters auf die Signalintensitäten der präzipitierten Proteine ist in der Abbildung 14 ebenfalls ersichtlich. Bei einer Konzentration des Biotinesters von 1 mg/ml und einer dreistündigen Inkubation wurde eine optimale Markierung der Proteine erreicht


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(Abbildung 14, Bahn 8). Diese Werte wurden deshalb auch für die weiteren Experimente verwendet.

Wie P80 veranschaulicht (Abbildung 14), ist es bei der Koimmunpräzipitation möglich, daß auch Proteine nachgewiesen werden, die nicht mit YB-1 assoziiert sind. Aus diesem Grund wurde eine weitere Kontrolle durchgeführt. Die vorherige Inkubation der Antikörper mit dem für die Immunisierung verwendeten Peptid führt zur Blockierung der spezifischen Bindungsstellen der Antikörper (Abbildung 15, Bahn 2). Das bedeutet, daß diese blockierten Antikörper YB-1 nicht mehr binden können und damit weder YB-1 noch die mit YB-1 assoziierten Proteine präzipitiert werden. Alle danach sichtbaren Signale stammen dementsprechend von Proteinen, die unabhängig von YB-1 an die Protein-A-Agarose oder die Antikörper binden (Abbildung 15).

Abbildung 15: Kontrollen zur Immunpräzipitation mit alpha-YB-1
Das Zytoplasma von HeLa-Zellen wurde drei Stunden lang mit 1 mg/ml Biotinester inkubiert. Mit dem markierten Zytoplasma wurden Präzipitationen mit Protein-A-Agarose allein (Bahn 1), mit alpha-YB-1 und dem für die Immunisierung verwendeten Peptid (Bahn 2) und alpha-YB-1 (Bahn 3) durchgeführt. Die Präzipitate wurden auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf Nitrozellulose transferiert. Die präzipitierten Proteine wurden mittels eines Konjugats von Strepavidin mit Peroxidase durch das ECL-System (Amersham) nachgewiesen.


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Die Signale von P50, P35 und P30 waren nach der Inkubation des Antikörpers mit dem entsprechenden Peptid nicht mehr zu sehen (Abbildung 15, Bahn 2). Auf Grund dieser Eigenschaften und des Laufverhaltens wurde geschlossen, daß das P50 mit YB-1 identisch ist. In den nächsten Experimenten wurde untersucht, welche Faktoren die Interaktion der Proteine mit YB-1 beeinflussen. Da eine Reihe von Wechselwirkungen zwischen Proteinen abhängig vom Salzgehalt der Umgebung ist, wurden Immunpräzipitationen mit verschiedenen Salzkonzentrationen durchgeführt. Bei nucleinsäurebindenen Proteinen besteht des weiteren die Möglichkeit, daß eine Kopräzipitation nicht auf Grund von Wechselwirkungen zwischen den Proteinen erfolgt, sondern durch die Bindung der Proteine an ein gemeinsames DNA- oder RNA-Fragment. Um diesen Aspekt zu überprüfen, wurden die Proben vor der Immunpräzipitation entweder mit RNase A oder DNase I vorinkubiert. Die Zugabe von Ethidiumbromid zu dem Präzipitationsansatz wurde als alternative Möglichkeit beschrieben, um Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA-Molekülen zu verhindern (Lai + Herr, 1992). Ergänzt wurden diese Kontrollen noch durch ein Experiment, bei dem EDTA zum Ansatz dazugegeben wurde. EDTA ist in der Lage, mit verschiedenen mehrwertigen Ionen stabile Komplexe zu bilden. Dadurch kann die Abhängigkeit der Wechselwirkungen zwischen Proteinen von solchen Ionen dargestellt werden. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der Abbildung 16 zusammengefaßt.

Abbildung 16: Charakterisierung der mit YB-1 interagierenden Proteine
Das dialysierte Zytoplasma von HeLa-Zellen wurde drei Stunden lang mit 1 mg/ml Biotinester inkubiert und für die folgenden Koimmunpräzipitationen mit alpha-YB-1 verwendet. Die Ansätze wurden mit 300 mM NaCl (Bahn 1), 500 mM NaCl (Bahn 2), 1000 mM NaCl (Bahn 3), EDTA (Bahn 4), RNase A (Bahn 5), DNase I (Bahn 6) oder Ethidiumbromid (Bahn 7) vorinkubiert. Die Präzipitate wurden auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf Nitrozellulose transferiert. Die präzipitierten Proteine wurden mittels eines Konjugats von Strepavidin mit Peroxidase durch das ECL-System (Amersham) nachgewiesen.


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Das Signal von P35 blieb bis zu einer Salzkonzentration von 500 mM NaCl konstant, nahm dann aber bei einer Konzentration von 1000 mM NaCl stark ab (Abbildung 16, Bahnen 2 und 3). Ein geringere Reduktion dieses Signals war ebenfalls beim Vorhandensein von EDTA zu beobachten (Abbildung 16, Bahn 4), während die Inkubationen mit RNase A, DNase I und Ethidiumbromid keine Veränderungen ergaben (Abbildung 16, Bahnen 5-7). Wie bei P35 nahm auch die Signalstärke von P30 mit zunehmendem Salzgehalt ab (Abbildung 16, Bahnen 1-3). Nach der Inkubation mit RNase A konnte P30 nicht mehr nachgewiesen werden (Abbildung 16, Bahn 5). Im Gegensatz zu P30 und P35 nahmen die Signale von P25 und P45 bei einem hohen Salzgehalt zu (Abbildung 16, Bahn 3). Die Inkubationen mit DNase I und mit Ethidiumbromid führten zur Verringerung des Signals von P45 (Abbildung 16, Bahnen 6 und 7).

4.3.2 Untersuchungen zur Assoziation von P35 mit YB-1

Die Koimmunpräzipitation von P35 ließ sich durch eine Erhöhung des Salzgehalts, nicht jedoch durch Inkubationen mit RNase A, DNase I oder Ethidiumbromid beeinflussen. Dieses Charakteristikum deutet somit auf echte Protein-Protein-Wechselwirkungen hin. Aus diesem Grunde wurde die Aufmerksamkeit in den weiteren Untersuchungen auf dieses Protein gerichtet.

Zunächst wurde untersucht, ob die Assoziation von P35 mit YB-1 vom Zellzyklus abhängig ist. Dazu wurden HeLa-Zellen synchronisiert und in verschiedenen Phasen des Zellzyklus geerntet. Die Zellen wurden lysiert und die Proteine des Zytoplasma mit Biotin markiert. Die Assoziation von P35 mit YB-1 wurde dann durch die Koimmunpräzipitation analysiert.


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Abbildung 17: Assoziation von P35 mit YB-1 im Zytoplasma von synchronisierten HeLa-Zellen
Die HeLa-Zellen wurden synchronisiert (siehe Methoden) und geerntet. Die Zellen wurden lysiert, und das Zytoplasma wurde drei Stunden mit 1 mg/ml Biotinester inkubiert. Die markierten Proben wurden dann in der Koimmunpräzipitation mit alpha-YB-1 eingesetzt. In der Abbildung sind folgende Behandlungen der HeLa-Zellen dargestellt: 18 Stunden lang mit 10 µg/ml Nocodazole (Bahn 1), 24 Stunden lang mit 20 µM Lovastatin (Bahn 2) sowie fünf Stunden nach dem Aufheben der Blockade (Bahn 3), 24 Stunden lang mit 3 µM Aphidicolin (Bahn 4) sowie vier (Bahn 5) bzw. acht Stunden (Bahn 6) nach dem Aufheben der Blockade.

Es ist deutlich zu erkennen, daß sich die Assoziation von P35 mit YB-1 im Verlauf des Zellzyklus ändert. Die stärkste Assoziation war fünf Stunden nach dem Aufheben der Lovastatinblockade zu beobachten (Abbildung 17, Bahn 3). Zu diesem Zeitpunkt befinden sich die HeLa-Zellen in der G1-Phase, kurz vor dem Übergang in die S-Phase des Zellzyklus.

In einem weiteren Experiment wurde dann die Assoziation von P35 mit YB-1 in MCF7- und den MCF7/ADR-Zellen verglichen. Dazu wurden diese Zellen kultiviert, geerntet und lysiert. Die Proteine der zytoplasmatischen Fraktionen wurden mit Biotin markiert und in der Koimmunpräzipitation untersucht.

Abbildung 18: Assoziation von P35 mit YB-1 in MCF7- und MCF7/ADR-Zellen
Das Zytoplasma von MCF7- (Bahn 1) und MCF7/ADR-Zellen (Bahn 2) wurde drei Stunden lang mit 1 mg/ml Biotinester markiert und anschließend in der Koimmunpräzipitation mit alpha-YB-1 verwendet. Die präzipitierten Proteine wurden auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt, auf Nitrozellulose transferiert und mit einem Streptavidin-Peroxidasekonjugat nachgewiesen.


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Dabei konnte beobachtet werden, daß im Zytoplasma der resistenten MCF7/ADR-Zellen die Assoziation von P35 mit YB-1 drastisch verstärkt ist.

4.3.3 Reinigung von YB-1 bindenden Proteinen mittels Affinitätschromatographie

P35 und andere mit YB-1 interagierende Proteine wurden über eine Affinitätssäule gereinigt, um diese Proteine anschließend über die Sequenzierung von Peptiden identifizieren zu können. Dazu wurden zunächst 400 µg des gereinigten Peptidantiserums gegen YB-1 mit 400 µl Protein-A-Agarose bei 4 oC inkubiert. Die Antikörper-Protein-A-Agarose-Komplexe wurden nach dem Waschen mit 9 ml HeLa-Zytoplasma auf einem Überkopfschüttler inkubiert. Nach dem erneuten Waschen des Säulenmaterials wurden die gebundenen Proteine mit 200 µg des für die Herstellung der Antikörper verwendeten Peptids eluiert und mittels TCA gefällt. Das Proteinpellet wurde in SDS-Probenpuffer gelöst und auf ein 10%iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine mittels einer Färbung mit Coomassieblau sichtbar gemacht (Abbildung 19).

Abbildung 19: Reinigung von interagierenden Proteinen durch Affinitätschromatographie
Das Zytoplasma von HeLa-Zellen wurde mit einer Antikörpersäule (alpha-YB-1) inkubiert und die gebundenen Proteine mittels des für die Immunisierung verwendeten Peptids eluiert. Die Proteine wurden mit TCA gefällt, in SDS-Probenpuffer gelöst und auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt.

In der Abbildung 19 sind neben einem Hauptprotein mit dem scheinbaren Molekulargewicht von 50.000 noch weitere Proteine zu erkennen. Die


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Übereinstimmung des Proteins von 50 kd mit YB-1 konnte durch eine Peptidsequenzierung bestätigt werden (Regina Kraft, persönliche Mitteilung). Es ist auffallend, daß durch die Affinitätschromatographie Proteine gereinigt wurden, die in der Immunpräzipitation nicht nachgewiesen werden konnten (zum Beispiel Abbildung 19, Proteinbanden 5 und 6). Das könnte unter anderem daran liegen, daß diese Proteine nur über wenige oder keine freien Aminogruppen verfügen, so daß sie nur schlecht oder gar nicht mit Biotin zu markieren sind.

Sechs weitere Proteinbanden wurden ausgeschnitten, mit Trypsin gespalten, und die Sequenz ausgewählter Peptide durch einen Edmann-Abbau bestimmt (Regina Kraft, persönliche Mitteilung). Durch einen Vergleich der erhaltenen Peptidsequenzen mit der Datenbank „SwissProt“ konnten diese Proteine identifiziert werden (Abbildung 20).

Abbildung 20: Zusammenfassung der sequenzierten Peptide

Proteinbande (entsprechendAbbildung 19)

Peptidsequenzen

Proteinname

Datenbank-nummer

1

GDKAFVDFLSD

MSGGWELELN

pre-mRNA splicing factor SF2

Untereinheit P32

Q07021

2

VEEQEPELTSTPNFV

AFVXFLSXEIK

EVSFQSTGESEXK

pre-mRNA splicing factor SF2

Untereinheit P32

Q07021

 

3

SSGPYGGGGQYFAKP

DYFEQYGK

IEVIEIMTDR

GFAFVTFDDHDS

hnRNP Protein A1

P09651

4

GGNFGFGDSR

GGYGGGGPGYGNQGG

hnRNP Protein A2/B1

P22626

5

IITITGTQXQIQNAQ

GSYGDLGGPIITTQV

TDYNASVSVP

hnRNP Protein K

Q07244

L31961

X72727

A54143

6

VAEKLDEIYVAGLVA

AGPIWDLR

VTEGLTDVILYXQ

RRM-RNA bindendes Protein mit G,R,Y-reichem C-Terminus

AF037448


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Die Peptide der Proteinbanden 1 und 2 ließen sich ein und demselben Protein zu ordnen. Das Laufverhalten dieses Proteins entspricht dabei am besten dem des charakterisierten P35. Daraus kann geschlußfolgert werden, daß es sich bei P35 um die P32-Untereinheit des „pre-mRNA splicing factor SF2“ handelt. Auch die anderen identifizierten Proteine gehören zu den RNA-bindenden Proteinen. Bis auf ein Protein (Proteinbande 6), dessen Funktion noch nicht aufgeklärt wurde, besteht ein Zusammenhang zwischen all diesen Proteinen und dem RNA-Metabolismus. Die Beobachtung, daß YB-1 mit diesen Proteinen assoziiert vorkommt, deutet darauf hin, daß YB-1 auch bei diesem Prozeß eine Rolle spielen könnte.

4.4 Untersuchung der Rolle von YB-1 bei der Translationskontrolle

4.4.1 Untersuchung der polysomalen Assoziation von YB-1

Vom Autor im Rahmen der Diplomarbeit durchgeführte Versuche legen eine polysomale Assoziation von YB-1 nahe (Jürchott, 1994). Des weiteren konnte YB-1 sowohl in freien als auch in polysomal gebundenen mRNP nachgewiesen werden (Evdokimova et al., 1995). Bislang ist jedoch nicht bekannt, ob YB-1 Bestandteil aller Polysomen ist, oder ob abhängig von der translatierten mRNA nur bestimmte Polysomen YB-1 enthalten. Durch eine etablierte Extraktionsmethode können drei Klassen von Polysomen unterschieden werden (Vedeler et al., 1991). Dabei werden die unterschiedlichen Bedingungen ausgenutzt, unter denen sich die Polysomen aus den Zellen extrahieren lassen. Im ersten Schritt werden die Zellen in einem Puffer mit geringem Salz- (25 mM KCl) und Detergensgehalt (0,05 % NP40) permeabilisiert. Bei diesem Schritt werden Ribosomen freigesetzt, die nicht mit zellulären Strukturen assoziiert sind. Sie werden daher als freie Ribosomen bezeichnet. Im zweiten Schritt werden durch eine Erhöhung des Salzgehaltes auf 130 mM KCl Ribosomen extrahiert, die an das Zytoskelett gebunden sind. Die Ribosomen dieser Fraktion werden als zytoskelettgebundene Ribosomen bezeichnet. Im dritten Schritt werden durch die Kombination eines nichtionischen (1% NP40) und eines ionischen (1%


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Natriumdeoxycholat, DOC) Detergens die Membranen des rauhen endoplasmatischen Retikulums solubilisiert. Diese Kombination ist notwendig, damit die Membranen des rauhen endoplasmatischen Retikulums vollständig aufgelöst werden. Die dabei freigesetzten Ribosomen werden als membrangebundene Ribosomen bezeichnet.

Exponentiell wachsende HeLa-Zellen wurden geerntet und der sequentiellen Extraktion unterzogen. Jeder Extraktionsschritt wurde zweimal nacheinander durchgeführt, um eine eindeutige Trennung der Polysomenklassen sicherzustellen. Der jeweils zweite Extraktionsschritt wird im folgenden als Waschschritt bezeichnet.

Von den zytoplasmatischen Fraktionen wurde die RNA extrahiert und auf einem denaturierenden Formaldehydgel analysiert. An Hand der gut sichtbaren Banden (18S- und 28S-rRNA) konnte die Verteilung der ribosomalen RNA verfolgt werden. In den Proben der verschiedenen Extraktionsschritte konnten große Mengen ribosomaler RNA nachgewiesen werden (Abbildung 21A, Bahnen 1, 3 und 5), während die Proben der Waschschritte (Abbildung 21A, Bahnen 2, 4 und 6) nur geringe oder gar keine ribosomale RNA enthielten. Die Verteilung von YB-1 in den Fraktionen wurde durch einen Immunoblot untersucht. Bei den HeLa-Zellen konnte YB-1 in allen zytoplasmatischen Fraktionen (Abbildung 21B, Bahnen 1 bis 6) nachgewiesen werden.


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Abbildung 21: Analyse der Fraktionen der sequentiellen Extraktion von HeLa-Zellen
Die HeLa-Zellen wurden nacheinander mit 0,05% NP40, 25 mM KCl (Bahnen 1 und 2), 0,05% NP40, 150 mM KCl (Bahnen 3 und 4) und 1% NP40, 1% DOC, 150 mM KCl (Bahnen 5 und 6) extrahiert. Die RNA der erhaltenen Fraktionen wurde extrahiert und auf einem denaturierenden Formaldehydgel aufgetrennt (A). Des weiteren wurden Proben der Fraktionen mit TCA gefällt und nach der Elektrophorese im Immunoblot mit alpha-YB-1 untersucht (B).

Um zwischen dem freien und dem polysomal gebundenen YB-1 unterscheiden zu können, wurden die zytoplasmatischen Extrakte von HeLa-Zellen auf lineare Saccharosegradienten (10%-40%) aufgetragen. Die Zentrifugationsbedingungen wurden so gewählt, daß die Polysomen bis zum Boden der Gradienten sedimentierten. Nach der Zentrifugation wurden jeweils 14 Fraktionen gesammelt. Der Nachweis der ribosomalen Untereinheiten erfolgte an Hand der ribosomalen


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RNA. Dazu wurde die RNA der Fraktionen isoliert und auf einem denaturierenden Formaldehydgel untersucht. In den Bahnen 7 und 8 (Abbildung 22, A) konnten jeweils entweder die 18S-rRNA oder die 28S-rRNA nachgewiesen werden. Die 18S-rRNA ist Bestandteil der kleinen ribosomalen Untereinheit, während die 28S-rRNA in der großen ribosomalen Untereinheit zu finden ist. Daraus kann geschlußfolgert werden, daß diese beiden Fraktionen keine vollständigen Ribosomen, sondern jeweils eine der ribosomalen Untereinheiten enthalten. Im Gegensatz dazu konnten sowohl die 18S-rRNA als auch die 28S-rRNA in den Bahnen 9-11 und im Pellet (Bahn 14) gefunden werden (Abbildung 22, A, B und C). Diese Fraktionen enthalten dementsprechend vollständige Ribosomen. Unter Einbeziehung der gewählten Zentrifugationsbedingungen kann geschlußfolgert werden, daß die Bahnen 9-11 Monosomen und das Pellet Polysomen enthält.

Um die Verteilung von YB-1 in diesen Gradienten zu bestimmen, wurden anschließend alle Fraktionen der Gradienten im Immunoblot mit alpha-YB-1 analysiert. In dem Gradienten mit den freien Ribosomen konnte YB-1 in den Bahnen 2-5 und 9-11 nachgewiesen werden (Abbildung 22, D). In den Bahnen 1-4 und in geringen Mengen im Pellet war YB-1 in dem Gradienten mit den zytoskelettgebundenen Ribosomen zu finden (Abbildung 22, E). Im Gradienten mit den membrangebundenen Ribosomen war YB-1 im wesentlichen im Pellet zu beobachten (Abbildung 22, F). Aus diesem Versuch ergeben sich mehrere Schlußfolgerungen. YB-1 kommt im Zytoplasma nicht nur mit Ribosomen oder mRNP assoziiert vor, sondern es gibt mindestens zwei weitere Komplexe (Abbildung 22, D, Fraktionen 2-5; Abbildung 22, E, Fraktionen 1-4), die sich durch den Salzgehalt, der für ihre Extraktion aus den HeLa-Zellen notwendig ist, voneinander unterscheiden lassen. Des weiteren konnte festgestellt werden, daß nicht alle Polysomen YB-1 enthalten. Es ist eine deutliche Akkumulation von YB-1 bei den membrangebundenen Polysomen zu erkennen.


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Abbildung 22: Saccharosegradientenzentrifugation zytoplasmatischer Fraktionen nach der sequentiellen Extraktion von HeLa-Zellen
Die HeLa-Zellen wurden geerntet und, wie in Abbildung 21 beschrieben, einer sequentiellen Extraktion unterzogen. Die zytoplasmatischen Extrakte (Abbildung 21, Bahnen 1, 3 und 5), die freie (A und D), zytoskelettgebundene (B und E) oder membrangebundene (C und F) Ribosomen enthalten, wurden auf lineare Saccharosegradienten aufgetragen. Nach der Zentrifugation wurden jeweils 14 Fraktionen eines jeden Gradienten gesammelt. Die RNA der Fraktionen wurde isoliert, und in einem denaturierenden Formaldehydgel analysiert (A, B und C). Die Proteine der Fraktionen wurden mit TCA gefällt und auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Nach dem Transfer auf Nitrocellulose wurden die Membranen vorgeblockt und über Nacht mit alpha-YB-1 (Verdünnung 1:2500) inkubiert. Die gebundenen Antikörper wurden mit dem ECL-System (Amersham) nachgewiesen (D, E und F).


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4.4.2 Die Rolle von YB-1 bei der Kontrolle der Translation der mRNA von P-Glykoprotein

Wie im vorangegangenen Abschnitt dargestellt, ist YB-1 bevorzugt mit membrangebundenen Polysomen assoziiert. Daher kann vermutet werden, daß YB-1 eine Rolle bei der Translationskontrolle von Proteinen spielt, die am rauhen endoplasmatischen Retikulum synthetisiert werden. Ein Protein, das am rauhen ER synthetisiert wird, ist P-Glykoprotein. Nachdem in einem vorangegangenen Kapitel die Beteiligung von YB-1 an der Transkriptionskontrolle dieses Proteins nachgewiesen wurde, sollte nun untersucht werden, ob YB-1 auch an der Kontrolle der Translation von P-Glykoprotein beteiligt ist.

Der Einfluß von YB-1 auf die Translation sollte in einem zellfreien In-vitro-Translationssystem untersucht werden. Für die Herstellung einer mRNA von P-Glykoprotein wurde das Plasmid "Bluescript" verwendet, das ein Fragment der cDNA von P-Glykoprotein, bestehend aus dem 5'-nichttranslatierten Bereich, dem kodierenden Teil sowie 156 Basen des 3'-nichttranslatierten Bereiches, unter der transkriptionellen Kontrolle eines Promotors der T3-Polymerase enthält (Ueda et al., 1987; Martin Janz, persönliche Mitteilung).

Um zu erreichen, daß die T3-Polymerase die Transkription an einem definierten Punkt beendet, wurde das Plasmid (pMDR1) zunächst durch eine Spaltung mit dem Restriktionsenzym Xho I linearisiert. Dieses Enzym schneidet die Plasmid-DNA am Ende des 3'-nichttranslatierten Bereiches der cDNA von P-Glykoprotein, so daß die


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volle Länge der verfügbaren cDNA transkribiert werden kann. 5 µg des gespaltenen Plasmids wurden in einem Ansatz von 100 µl verwendet. Nach einer zweistündigen Inkubationszeit wurde die Plasmid-DNA durch DNase I verdaut und der Reaktionsansatz nacheinander mit Phenol und Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert. Die mRNA wurde mittels Ethanol präzipitiert, mit 70%igem Ethanol gewaschen und nach kurzem Trocknen in destilliertem Wasser gelöst. Die mRNA von P-Glykoprotein sowie mRNA von verschiedenen Proteinen, die in den folgenden Experimenten als Kontrollen dienen, wurden auf einem denaturierenden Formaldehydgel analysiert (Abbildung 23). Nähere Informationen zu den Kontrollen sind bei der jeweiligen Beschreibung der Experimente zu finden.

Abbildung 23: Analyse der in den folgenden Versuchen verwendeten mRNA auf einem denaturierenden Formaldehydgel
In einem denaturierenden Formaldehydgel wurden die mRNA der Luciferase (Bahn 2), die mRNA von P-Glykoprotein (Bahn 3), die mRNA des alpha-Faktors (Bahn 4) und die mRNA von Präprolactin (Bahn 5) analysiert. Zum Vergleich ist in Bahn 1 ein RNA-Größenstandard aufgetragen.

Das Resultat der In-vitro-Transkription ist eine mRNA mit der Größe von rund 4100 Basen (Abbildung 23, Bahn 3), was einem Transkript der vollen Länge entspricht.

Die Translation von mRNA kann in einem zellfreien Translationssystem untersucht werden. Das in den folgenden Versuchen verwendete System basiert auf einem nucleasebehandelten Retikulozytenlysat. Dieses Lysat verfügt über alle für die Translation notwendigen Komponenten, enthält jedoch keine eigene mRNA. Zu diesem Lysat werden neben RNasin (ein RNase-Inhibitor) noch alle Aminosäuren außer Methionin sowie die mRNA gegeben. Für die Identifizierung des neu synthetisierten Proteins wird eine oder mehrere radioaktiv markierte Aminosäuren zugesetzt. In den folgenden Versuchen wurde dazu 35S-Methionin verwendet. Die Translationsansätze wurden 90 Minuten lang bei 30 oC inkubiert, und danach bis zur Analyse bei -20 oC gelagert. Jeweils 5 µl eines Translationsansatzes wurden mit 20


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µl SDS-Probenpuffer für 10 Minuten auf 70 oC erwärmt und auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel 30 Minuten lang fixiert (10% Essigsäure, 50% Methanol) und für 5 Minuten in einer Lösung von 7% Essigsäure, 7% Methanol und 1% Glycerol inkubiert. Das Gel wurde getrocknet und über Nacht mit einem Röntgenfilm exponiert.

Zunächst wurden jeweils 1 µg der mRNA von P-Glykoprotein (Abbildung 24, Bahnen 3 und 4) und der Luciferase (Abbildung 24, Bahnen 1 und 2) in diesem Translationssystem verwendet. Die Translation der mRNA der Luciferase dient als Kontrolle für die Funktionstüchtigkeit des Translationssystems. Es ist bekannt, daß die Translation von Proteinen, die am rauhen ER synthetisiert werden, in Abwesenheit von rauhen Mikrosomen in In-vitro-Translationssystemen gehemmt ist. Daher wurden den Translationsansätzen in parallel durchgeführten Experimenten rauhe Mikrosomen (Hundepankreas, siehe Methoden) zugesetzt (Abbildung 24, Bahnen 2 und 4). Die mRNA der Luciferase wurde in diesem System effizient translatiert (Abbildung 24, Bahn 1). Die Zugabe von rauhen Mikrosomen ergab keinen Einfluß auf die Translation dieser mRNA (Abbildung 24, Bahn 2). Im Gegensatz dazu zeigte das neu synthetisierte P-Glykoprotein im Ansatz mit den rauhen Mikrosomen (Abbildung 24, Bahn 4) eine geringere Mobilität im SDS-Polyacrylamidgel als im Ansatz ohne rauhe Mikrosomen (Abbildung 24, Bahn 3). Diese Differenz deutet auf die im rauhen ER stattfindende Glykosylierung des Proteins hin (Zhang + Ling, 1991).

Abbildung 24: In-vitro-Translation der mRNA von P-Glykoprotein und der Luciferase
0,5 µg der mRNA der Luciferase (1 und 2) und des P-Glykoproteins (3 und 4) wurden in einem zellfreien In-vitro-Translationssystem verwendet. Jeweils 5 µl jedes Ansatzes wurden in SDS-Probenpuffer aufgenommen und auf einem 10%igen (1 und 2) oder 7,5%igen (3 und 4) SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurden die Gele getrocknet und über Nacht mit einem Röntgenfilm exponiert.


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Kontrollversuche haben ergeben, daß YB-1 sowohl in Retikulozytenlysaten als auch in Präparationen von rauhen Mikrosomen zu finden ist (Jürchott, 1994). Um die Rolle von YB-1 bei der Translationskontrolle von P-Glykoprotein zu untersuchen, wurde daher zunächst versucht, YB-1 über eine Antikörpersäule aus dem Retikulozytenlysat zu entfernen. Dazu wurden 200 µg der affinitätsgereinigten Antikörper gegen YB-1 mit 200 µl Protein-A-Agarose in Puffer A (10 mM Hepes/KOH (pH = 7,6), 1 mM MgCl2, 100 mM KCl) bei 4 oC 30 lang Minuten inkubiert, und die Säule anschließend dreimal mit Puffer B (10 mM Hepes/KOH (pH = 7,6), 1 mM MgCl2, 500 KCl) und dreimal mit Puffer A gewaschen. Zu der Säule wurden 200 µl Retikulozytenlysat gegeben und der Ansatz 60 Minuten lang bei 4 oC auf einem Überkopfschüttler inkubiert. Das depletierte Retikulozytenlysat wurde durch eine Zentrifugation (5 Minuten, 2000 U/min, 4 oC) von der Säulenmatrix getrennt und im Immunoblot analysiert. Als Kontrolle wurden 200 µl Retikulozytenlysat entsprechend dem dargestellten Protokoll mit 200 µg IgG aus dem Präimmunserum der immunisierten Kaninchen inkubiert. Jeweils 12,5 µl von dem unbehandelten (Abbildung 25B, Bahn 1), dem mit Präimmunserum behandelten (Abbildung 25B, Bahn 2; mockdepletiertes Retikulozytenlysat ("mock" engl. = Schein) und dem mit alpha-YB-1 behandelten Retikulozytenlysaten (Abbildung 25B, Bahn 3; YB-1-depletiertes Retikulozytenlysat) wurden auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und im Immunoblot mit alpha-YB-1 analysiert. In dem YB-1-depletierten Retikulozytenlysat konnte im Gegensatz zu den Kontrollen kein YB-1 mehr im Immunoblot nachgewiesen werden.

In einem weiteren Schritt wurde versucht, das mit den rauhen Mikrosomen assoziierte YB-1 zu entfernen. Wie vom Autor bereits in einer früheren Arbeit nachgewiesen, ist nach dem Waschen mit 1000 mM KCl kein YB-1 mehr an den Mikrosomen zu finden (Jürchott, 1994). Daher wurden 100 Äquivalente von rauhen Mikrosomen (siehe Methoden) in 0,5 ml Hochsalzpuffer (50 mM Hepes/KOH, pH =


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7,5; 250 mM Saccharose; 1000 mM KCl; 10 mM MgCl2; 1 mM DTT; 1:1000 PI) für 10 Minuten auf Eis inkubiert und dann in einer Ultrazentrifuge (Optima TLX - Beckmann) bei 60.000 U/min, 4 oC, 20 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Membranpellet erneut in 0,5 ml Hochsalzpuffer resuspendiert. Nach einer erneuten Zentrifugation unter den gleichen Bedingungen wurde das Membranpellet in 45 µl Membranpuffer (50 mM Hepes/KOH, pH = 7,5; 250 mM Saccharose, 1 mM DTT, 1:1000 PI) resuspendiert und bei -70 oC gelagert. 5 Äquivalente der nicht behandelten Mikrosomen (Abbildung 25A, Bahn 1), sowie der mit einer hohen Salzkonzentration gewaschenen Mikrosomen (Abbildung 25A, Bahn 2) wurden auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und im Immunoblot mit alpha-YB-1 und polyklonalen Antikörpern gegen Sec61-alpha analysiert. Sec61-alpha ist ein integrales Transmembranprotein und kann daher nicht durch hohe Salzkonzentrationen von den Mikrosomen entfernt werden. Somit bestätigt der Nachweis von Sec61-alpha, daß gleiche Mengen von unbehandelten und mit hoher Salzkonzentration gewaschenen Mikrosomen im Immunoblot verwendet wurden. Bei den mit hoher Salzkonzentration gewaschenen Mikrosomen konnte kein YB-1 mehr im Immunoblot nachgewiesen werden (Abbildung 25A, Bahnen 1 und 2).

Abbildung 25: Immunoblotanalyse der rauhen Mikrosomen und der depletierten Retikulozytenlysate
A) Rauhe Mikrosomen aus Hundepankreas wurden mit 1M KCl gewaschen. Jeweils 5 eq der nicht gewaschenen Mikrosomen (1) sowie der gewaschenen Mikrosomen (2) wurden im Immunoblot mit polyklonalen Antikörpern gegen YB-1 und Sec61-alpha untersucht.
B) Unbehandeltes (1), mockdepletiertes (2) und YB-1-depletiertes Retikulozytenlysat (3) wurden im Immunoblot mit alpha-YB-1 analysiert.


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Im folgenden wurde der Einfluß der YB-1-Depletion auf die Translation der Luciferase-mRNA untersucht. Dieser Kontrollversuch sollte zum einen zeigen, ob die Translationsfähigkeit der Retikulozytenlysate durch die Depletionen beeinflußt wurde. Zum anderen sollte gleichzeitig überprüft werden, ob YB-1 universell für die Translation von Proteinen von Bedeutung ist. Dazu wurde in jeweils einem Translationsansatz das unbehandelte (Abbildung 26, Bahn 1), das mockdepletierte (Abbildung 26, Bahn 2) und das YB-1-depletierte (Abbildung 26, Bahn 3) Retikulozytenlysat verwendet. Je 5 µl eines jeden Translationsansatzes wurden auf einem 10%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel fixiert, getrocknet und über Nacht mit einem Röntgenfilm exponiert.

Abbildung 26: In-vitro-Translation der mRNA der Luciferase
Für die In-vitro-Translation der mRNA der Luciferase wurde unbehandeltes (1), mockdepletiertes (2) oder YB-1-depletiertes Retikulozytenlysat (3) verwendet. Jeweils 5 µl jedes Ansatzes wurden in SDS-Probenpuffer gelöst und auf ein 7,5%iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und über Nacht mit einem Röntgenfilm exponiert.


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Sowohl bei der Verwendung des mockdepletierten (Abbildung 26, Bahn 2) als auch des YB-1-depletierten Retikulozytenlysats (Abbildung 26, Bahn 3) war eine Reduktion der Translation zu beobachten. Da zwischen der Verwendung des mockdepletierten und des YB-1-depletierten Retikulozytenlysats kein Unterschied festzustellen war, kann angenommen werden, daß diese Reduktion ein unspezifischer Effekt ist, der auf eine Verdünnung des Retikulozytenlysats durch Reste des Äquilibrierungspuffers der Protein-A-Agarose zurückgeführt werden kann. Ein spezifische Einfluß von YB-1 auf die Translation der mRNA der Luciferase konnte in diesem Experiment nicht nachgewiesen werden.

Im nächsten Schritt wurde untersucht, ob die Depletionen der Retikulozytenlysate bzw. das Hochsalzwaschen der Mikrosomen generell die Translokation von Proteinen ins rauhe ER beeinflussen. Als Kontrollprotein dafür wurde Präprolactin verwendet. Dieses sekretorische Protein wird kotranslational in das Lumen des rauhen ER transportiert. Anschließend wird durch die Signalpeptidase die Signalsequenz von Präprolactin abgespalten. Dieser Prozeß kann durch die Verringerung der Größe des Proteins im SDS-Polyacrylamidgel nachgewiesen werden.

In diesem Experiment wurden die Translation und der Transport von Präprolactin in unbehandeltem (Abbildung 27, Bahn 1 bis 3), mockdepletiertem (Abbildung 27, Bahn 4 bis 6) und YB-1-depletiertem (Abbildung 27, Bahn 7 bis 9) Retikulozytenlysat untersucht. Dazu wurden jeweils Ansätze ohne Mikrosomen (Abbildung 27, Bahn 1, 4 und 7), mit unbehandelten Mikrosomen (Abbildung 27, Bahn 2, 5 und 8) und mit mit hoher Salzkonzentration gewaschenen Mikrosomen (Abbildung 27, Bahn 3, 6 und 9) verwendet.

Abbildung 27: In-vitro-Translation der mRNA des Präprolactins
Für die In-vitro-Translation der mRNA des Präprolactins wurde unbehandeltes (Bahnen 1 bis 3), mockdepletiertes (Bahnen 4 bis 6) oder YB-1-depletiertes Retikulozytenlysat (Bahnen 7 bis 9) verwendet. Die Versuche wurden ohne die Zugabe von Mikrosomen (Bahnen 1, 4 und 7), nach der Zugabe von unbehandelten rauhen Mikrosomen (Bahnen 2, 5 und 8) und von mit hoher Salzkonzentration gewaschenen Mikrosomen (Bahnen 3, 6 und 9) durchgeführt. Je 5 µl jedes Ansatzes wurden in SDS-Probenpuffer gelöst und auf ein 15%iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und über Nacht mit einem Röntgenfilm exponiert.


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Wie in der Abbildung 27 (Bahn 2 und 3) zu erkennen ist, wird Präprolactin in unbehandelten und in mit hoher Salzkonzentration gewaschenen Mikrosomen mit annähernd der gleichen Effizienz transportiert. Eine Reduktion der Translation von Präprolactin konnte, wie auch im vorangegangenen Experiment mit der Luciferase, bei der Verwendung sowohl des mock- als auch des YB-1-depletierten Retikulozytenlysats bemerkt werden (Abbildung 27, Bahn 1, 4 und 7). Die Translokation von Präprolactin, verbunden mit der Signalsequenzspaltung war auch bei der Kombination von YB-1-depletiertem Retikulozytenlysat mit den mit hoher Salzkonzentration gewaschenen Mikrosomen zu beobachten (Abbildung 27, Bahn 9). Daraus kann geschlußfolgert werden, daß die Translokation und die Spaltung der Signalsequenz von YB-1 unabhängig ist.

Ein weiterer wichtiger Prozeß, der bei der Translation am rauhen ER stattfindet, ist die Glykosylierung. Daher war zu überprüfen, ob YB-1 die Glykosylierung von sekretorischen Proteinen beeinflußt. Als Kontrollprotein wurde für diese Versuche der alpha-Faktor verwendet. Dieses sekretorische Protein aus Hefe wird zunächst kotranslational durch die Membran transportiert und anschließend im Lumen des rauhen ER glykosyliert. Der Größenunterschied zwischen der nicht glykosylierten und der glykosylierten Form des alpha-Faktors ermöglicht es, diesen Prozeß zu verfolgen.

Für diesen Versuch wurde die Translation der mRNA des alpha-Faktor in unbehandelten (Abbildung 28, Bahnen 1-3), mockdepletierten (Abbildung 28, Bahnen 4-6) und YB-1-depletierten (Abbildung 28, Bahnen 7-9) Retikulozytenlysaten verglichen. Neben der Translation ohne die Zugabe von Mikrosomen (Abbildung 28, Bahnen 1, 4, 7) wurden auch die Translationen nach der Zugabe von unbehandelten Mikrosomen (Abbildung 28, Bahnen 2, 5, 8) und mit hoher Salzkonzentration gewaschenen Mikrosomen (Abbildung 28, Bahnen 3, 6, 9) mit einbezogen. Je 5 µl jedes Translationsansatzes


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wurden auf einem 15%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel fixiert getrocknet und über Nacht mit einem Röntgenfilm exponiert.

Abbildung 28: In-vitro-Translation der mRNA des alpha-Faktors
Für die In-vitro-Translation der mRNA des alpha-Faktors wurde unbehandeltes (Bahnen 1 bis 3), mockdepletiertes (Bahnen 4 bis 6) oder YB-1-depletiertes Retikulozytenlysat (Bahnen 7 bis 9) verwendet. Die Versuche wurden ohne die Zugabe von Mikrosomen (Bahnen 1, 4 und 7), nach der Zugabe von unbehandelten rauhen Mikrosomen (Bahnen 2, 5 und 8) und von mit hoher Salzkonzentration gewaschenen Mikrosomen (Bahnen 3, 6 und 9) durchgeführt. Je 5 µl jedes Ansatzes wurden in SDS-Probenpuffer gelöst und auf ein 15%iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und über Nacht mit einem Röntgenfilm exponiert.

Im Gegensatz zu den vorausgegangenen Versuchen (Translation der mRNA der Luciferase und des Präprolactins) konnte hier eine Steigerung der Translation des alpha-Faktors sowohl bei dem mockdepletierten als auch beim YB-1-depletierten Retikulozytenlysat festgestellt werden (Abbildung 28, Bahnen 1, 4 und 7). Kein Unterschied konnte hingegen bei der Glykosylierung des alpha-Faktors zwischen den unbehandelten und den mit hoher Salzkonzentration gewaschenen Mikrosomen festgestellt werden (Abbildung 28, Bahnen 2 und 3). Die Kombination von YB-1-depletiertem Retikulozytenlysat und mit hoher Salzkonzentration gewaschenen Mikrosomen ergab ebenfalls keine Veränderung im Transport und der Glykosylierung des alpha-Faktors (Abbildung 28, Bahn 9). Es kann daraus geschlußfolgert werden, daß


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die Translation und die Glykosylierung des alpha-Faktors von YB-1 unabhängig ist.

Nun wurde untersucht, ob die Translation von integralen Membranproteinen, wie z.B. P-Glykoprotein, durch YB-1 beeinflußt werden. Dazu wurden Translationen mit unbehandeltem (Abbildung 29, Bahnen 1 bis 3), mockdepletierten (Abbildung 29, Bahnen 4 bis 6) und YB-1-depletierten (Abbildung 29, Bahnen 7 bis 9) Retikulozytenlysaten durchgeführt. Dabei wurden entweder unbehandelte (Abbildung 29, Bahnen 2, 5 und 8) oder mit hoher Salzkonzentration gewaschene (Abbildung 29, Bahnen 3, 6 und 9) Mikrosomen zugegeben. Je 5 ml der Translationsansätze wurden auf einem 7,5%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel fixiert, getrocknet und über Nacht mit einem Röntgenfilm exponiert.

Abbildung 29: In-vitro-Translation der mRNA des P-Glykoproteins
Für die In-vitro-Translation der mRNA des P-Glykoproteins wurde unbehandeltes (Bahnen 1 bis 3), mockdepletiertes (Bahnen 4 bis 6) sowie YB-1-depletiertes Retikulozytenlysat (Bahnen 7 bis 9) verwendet. Die Versuche wurden ohne die Zugabe von Mikrosomen (Bahnen 1, 4 und 7), nach der Zugabe von unbehandelten rauhen Mikrosomen (Bahnen 2, 5 und 8) und von mit hoher Salzkonzentration gewaschenen Mikrosomen (Bahnen 3, 6 und 9) durchgeführt. Je 5 µl jedes Ansatzes wurden in SDS-Probenpuffer gelöst und auf ein 7,5%iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und über Nacht mit einem Röntgenfilm exponiert.

Die Zugabe von rauhen Mikrosomen zum Retikulozytenlysat führt zu einer Steigerung der Translationseffizienz der mRNA von P-Glykoprotein. Gleichfalls ist zu beobachten, daß ein Teil des neu synthetisierten Proteins eine geringere Mobilität in der SDS-PAGE besitzt. Diese Tatsache ist ein Beleg für die am rauhen ER stattfindende Glykosilierung (Abbildung 29, Bahn 2). Ein ähnliches Ergebnis ist nach


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der Zugabe der mit hoher Salzkonzentration gewaschenen Mikrosomen zu beobachten (Abbildung 29, Bahn 3). Das bedeutet, daß sowohl der Transport als auch die Glykosylierung von P-Glykoprotein durch das Waschen der Mikrosomen mit 1M KCl nicht beeinträchtigt werden.

Die Verwendung des mockdepletierten Retikulozytenlysates ergibt ohne die Zugabe von Mikrosomen eine deutliche Erhöhung der Translationseffizienz der mRNA von P-Glykoprotein (Abbildung 29, Bahn 4). Die Zugabe der rauhen bzw. der mit hoher Salzkonzentration gewaschenen Mikrosomen ergab eine geringfügige Verringerung der Translationseffizienz (Abbildung 29, Bahnen 5 und 6).

Im Gegensatz zum mockdepletierten Retikulozytenlysat war bei der Verwendung des YB-1-depletierten Retikulozytenlysats ohne die Zugabe von Mikrosomen eine deutliche Hemmung der Translation der mRNA von P-Glykoprotein zu beobachten (Abbildung 29, Bahn 7). Die Zugabe von rauhen Mikrosomen, die, wie nachgewiesen, YB-1 enthalten (Abbildung 25A), führte wieder zu einer Steigerung der Translationseffizienz (Abbildung 29, Bahn 8). Die Menge des Translationsprodukts ist dabei mit der bei der Verwendung des mockdepletierten Retikulozytenlysats vergleichbar (Abbildung 29, Bahnen 5 und 8). Nach der Zugabe von mit hoher Salzkonzentration gewaschenen Mikrosomen, also in einem YB-1-freien Translationssystem, konnte kaum noch ein Translationsprodukt nachgewiesen werden (Abbildung 29, Bahn 9). In den vorangegangenen Kontrollversuchen konnte in diesem YB-1-freien System weder eine generelle Hemmung der Translation noch der Translokation der Kontrollproteine beobachtet werden (Abbildungen 27 und 28). Somit ist anzunehmen, daß YB-1 nur die Translation von bestimmten Proteinen reguliert. Auf Grund der in Abbildung 29 dargestellten Ergebnisse kann geschlußfolgert werden, daß YB-1 ein positiver Regulator der Translation der mRNA von P-Glykoprotein ist.


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