Jürchott, Karsten: Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation und zu den Funktionen von YB-1, einem Y-Box-Protein in Säugerzellen

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Kapitel 5. Diskussion

5.1 Zellzyklusregulation der subzellulären Lokalisation von YB-1

Ursprünglich wurden Y-Box-Proteine auf Grund ihrer DNA-Bindungsaktivität als nukleäre Proteine beschrieben. Das Vorkommen von möglichen Kernlokalisationssignalen in der Primärsequenz der Y-Box-Proteine sowie der Einfluß auf die Transkription verschiedener Gene unterstützten diese Vermutung (Didier et al., 1988). Daß Y-Box-Proteine auch im Zytoplasma zu finden sind, ergaben unter anderem Untersuchungen an FRGY2. Dieses Protein wurde als ein wichtiger Bestandteil der zytoplasmatischen mRNP in Oozyten von Xenopus laevis identifiziert (Murray et al., 1992).

In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal eine Abhängigkeit der subzellulären Lokalisation eines Y-Box-Proteins in kultivierten HeLa-Zellen vom Verlauf des Zellzyklus nachgewiesen werden. Während eine zytoplasmatische Lokalisation von YB-1 zu jeder Phase des Zellzyklus zu beobachten war, konnte eine zusätzliche nukleäre Lokalisation nur in den Zellen nachgewiesen werden, die sich im Übergang von der G1- in die S-Phase befanden. Diese Abhängigkeit konnte sowohl durch Immunfluoreszenzanalysen als auch durch Zellfraktionierungen bestätigt werden. Die Untersuchungen von logarithmisch wachsenden HeLa-Zellen und von HeLa-Zellen, die durch verschiedene biochemische Verfahren synchronisiert wurden, erbrachten übereinstimmende Resultate.

Auf Grund der Ergebnisse dieser Arbeit kann geschlußfolgert werden, daß YB-1 ein zellzyklusregulierter Transkriptionsfaktor ist. YB-1 ist zu einem Zeitpunkt im Zellkern lokalisiert, der als "restriction point" bezeichnet wird (Pardee, 1974). Zu diesem Zeitpunkt wird entschieden, ob eine Zelle weiter den Zellzyklus durchläuft, oder in einen Ruhezustand übergeht. Der einleitende Schritt für die weitere Zellzyklusprogression ist die Aktivierung des Signaltransduktors Ras in der G1-Phase durch verschiedene extrazelluläre Faktoren wie zum Beispiel die Wachstumsfaktoren Insulin und EGF (Riddle et al., 1979). Die aktivierte Form von Ras ist in der Lage, GTP zu binden. Es wurde eine Reihe von Proteinen identifiziert, die mit dem Ras/GTP-Komplex interagieren und zur Aktivierung verschiedener Signaltransduktionswege beitragen können. Dazu zählen unter anderem die Raf-Proteine, die RalGDS-Proteinfamilie, PI3K, MEKK1 Rin1, AF-6 usw. Von zentraler


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Bedeutung für die Zellzyklusprogression ist die Aktivierung von Raf durch den Ras/GTP-Komplex. Der Raf/MAPK-Signalweg ist unter anderem für die Induktion von Cyclin D1 sowie für die Aktivierung des Cyclin E/CDK2-Komplexes verantwortlich. Beide Prozesse sind notwendig für den Übergang der Zellen von der G1- in die S-Phase des Zellzyklus (Malumbres + Pellicer, 1998). Es wird vermutet, daß YB-1 an der transkriptionellen Kontrolle verschiedener Gene beteiligt ist, deren Produkte zentrale Funktionen bei der Zellproliferation ausüben. Es konnte nachgewiesen werden, daß YB-1 in der Lage ist, Sequenzen in der Promotorregion des EGF-Rezeptors zu binden (Sakura et al., 1988). Somit ist es denkbar, daß YB-1 über die Regulation des EGF-Rezeptors die Zellzyklusprogression beeinflußt. Auch im Promotor weiterer Proteine, die wichtige Funktionen für die Zellzyklusprogression haben, konnten Y-Box-Motive nachgewiesen werden. Dazu gehören unter anderem die Gene für die Thymidinkinase, PCNA, die DNA-Polymerase alpha und CDK2 (Lipson et al., 1989; Travali et al., 1989; Pearson et al., 1991; Olive et al., 1994). Um die Rolle von YB-1 bei der transkriptionellen Regulation dieser Gene aufzuklären, sind weitere Untersuchungen notwendig. Die in dieser Arbeit nachgewiesene zellzyklusabhängige Lokalisation von YB-1 unterstützt jedoch die These, daß Y-Box-Proteine an der Regulation der Zellproliferation beteiligt sind (Ladomery + Sommerville, 1995).

5.2 Regulation der Transkription des mdr1-Gens durch YB-1

In verschiedenen Veröffentlichungen wurde eine mögliche Beteiligung von Y-Box- Proteinen an der Regulation von mdr1 diskutiert (Goldsmith et al., 1993; Asakuno et al. 1994). Das Produkt dieses Gens, das P-Glykoprotein, stellt ein Transmembranprotein der Superfamilie der ABC-Transporter dar. Es besitzt zwölf membrandurchspannende Helices und zwei ATP-bindende Kassetten. P-Glykoprotein ist in der Lage, Substanzen mit hydrophoben Regionen aus einer Zelle zu transportieren. Da zu diesen Substanzen auch viele in der Tumorbehandlung eingesetzte Chemotherapeutika gehören, besitzt P-Glykoprotein eine besondere Bedeutung für die klinische Behandlung von Tumorpatienten und für die biomedizinische Forschung.

Der Promotor des mdr1-Gens enthält neben einer Reihe von Erkennungssequenzen für verschiedene Transkriptionsfaktoren auch ein Y-Box-Motiv. Ein minimales


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Promotorfragment, daß diese Y-Box und eine GC-Box enthält, ist ausreichend, um in Transfektionsexperimenten die volle Promotoraktivität zu erreichen (Goldsmith et al., 1993).

Im Verlauf dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, daß die Expression von P- Glykoprotein mit der nukleären Lokalisation von YB-1 korreliert. Diese Korrelation konnte in selektierten Multidrug-resistenten MCF7/ADR-Zellen beobachtet werden. Der überzeugendste Nachweis gelang jedoch mit Transfektanten von HBL100-Zellen, die konstitutiv YB-1 exprimierten (H1000-Zellen). Wie durch Immunfluoreszenzanalysen festgestellt wurde, sind diese H1000-Zellen durch eine erhöhte, vom Zellzyklus unabhängige Kernlokalisation von YB-1 gekennzeichnet. In Gelshiftexperimenten war in Kerneluaten von H1000-Zellen eine verstärkte Bindung von YB-1 an Y-Box-Motive zu beobachten (Bargou et al., 1997). Diese H1000-Zellen exprimierten P-Glykoprotein und erwiesen sich im Gegensatz zu den Kontrolltransfektanten als resistent gegen Doxorubicin und Epirubicin (Bargou et al., 1997). Diese Ergebnisse belegen, daß der Transkriptionsfaktor YB-1 ein wichtiger Regulator der Transkription von mdr1 ist.

In einer Veröffentlichung wurde gezeigt, daß die Zugabe von Serum zu ruhenden NIH 3T3-Zellen zu einer Erhöhung der Promotoraktivität von mdr1 führt. Die maximale Promotoraktivität wurde 10 Stunden nach der Serumzugabe, kurz vor dem Übergang der NIH 3T3-Zellen von der G1- in die S-Phase des Zellzyklus, beobachtet. Es konnte gezeigt werden, daß die c-Raf-Kinase - eine mitogenaktivierte Seronin/Threonin-Kinase - von entscheidender Bedeutung für diese Aktivierung ist. Es stellte sich heraus, daß die Promotorregion zwischen den Nukleotiden -69 und -41, relativ zum Transkriptionsstartort, für die Stimulation von mdr1 durch die c-Raf-Kinase notwendig ist (Cornwell + Smith, 1993). Wie oben dargestellt, ist YB-1 während des Übergangs der Zellen von der G1- in die S-Phase des Zellzyklus im Zellkern lokalisiert, also zu einem Zeitpunkt, zu dem der Promotor von mdr1 in serumstimulierten NIH 3T3-Zellen die höchste Aktivität besitzt. Außerdem enthält der für die Aktivierung notwendige Promotorbereich ein Y-Box-Motiv. Daraus kann geschlußfolgert werden, daß YB-1 für diese zellzyklusabhängige Stimulation von mdr1 verantwortlich ist. Weiterhin ergibt sich daraus die Vermutung, daß die Translokation von YB-1 in den Zellkern durch einen Signalweg gesteuert wird, der abhängig von der c-Raf-Kinase ist und damit in direktem Zusammenhang mit der Regulation der Zellzyklusprogression steht.


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5.3 Deregulation von YB-1 in primären Mammakarzinomen: Ein molekularer Mechanismus der intrinsischen Multidrug-Resistenz

In der vorliegenden Arbeit konnte eine Deregulation der Expression von YB-1 in primären sporadischen Mammakarzinomen beobachtet werden. Während in dem normalen Brustgewebe kein YB-1 nachzuweisen war, konnte in allen untersuchten Mammakarzinomen die Expression von YB-1 festgestellt werden. Dabei wiesen die Mammakarzinome Unterschiede in der Höhe der Expression und in der intrazellulären Verteilung von YB-1 auf. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression und Lokalisation von YB-1 in primären Mammakarzinomen mit der Expression von P-Glykoprotein verglichen. Bei etwa 30% der von uns untersuchten primären Mammakarzinome konnte YB-1 in den Zellkernen nachgewiesen werden. Diese nukleäre Lokalisation von YB-1 war in allen Fällen von einer starken Expression von P-Glykoprotein begleitet. Im Gegensatz dazu konnte bei den Mammakarzinomen, die durch eine ausschließlich zytoplasmatische Lokalisation von YB-1 gekennzeichnet waren, kein P-Glykoprotein nachgewiesen werden. Diese Beobachtung bestätigt die in den Zellkulturen gefundene Abhängigkeit der Expression von P-Glykoprotein von der nukleären Lokalisation von YB-1. Daraus kann demnach geschlußfolgert werden, daß YB-1 ein wichtiger Regulator der Expression von mdr1 in Mammakarzinomen ist.

Es ist bemerkenswert, daß in verschiedenen Tumoren, darunter auch in Mammakarzinomen, eine Deregulation von Proteinen zu beobachten ist, die an der Kontrolle des Zellzyklus beteiligt sind. Von besonderer Bedeutung sind dabei Proteine, die den Übergang der Zellen von der G1- in die S-Phase des Zellzyklus kontrollieren (DelSal et al., 1996; Palmero + Peters, 1996). So konnten verschiedene Veränderungen der Expression von Cyclin E in Mammakarzinomen festgestellt werden (Keyomarsi et al., 1994). Wie oben dargestellt, konnten in den untersuchten HeLa-Zellen Cyclin E und YB-1 häufig gleichzeitig im Zellkern nachgewiesen werden. Es ist daher vorstellbar, daß die Deregulation des Zellzyklus oder einzelner Komponenten der Signaltransduktionswege in den Mammakarzinomen zur Akkumulation von YB-1 in den Zellkernen und damit zur Expression von P-Glykoprotein führt. Eine weitere Folge der Translokation von YB-1 könnte außerdem die Aktivierung proliferationsassoziierter Gene sein.


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Klinische Studien belegen, daß für Patientinnen mit chemotherapeutikaresistenten Mammakarzinomen eine schlechte Ausgangssituation für die weitere medizinische Behandlung besteht (Verelle et al., 1991; Schneider et al., 1994). Auf Grund der dargestellten zentralen Rolle bei der Herausbildung der Resistenz der Karzinome könnte YB-1 ein Zielprotein für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze sein.

5.4 YB-1 als Bestandteil zytoplasmatischer Proteinkomplexe

Y-Box-Proteine konnten sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma nachgewiesen werden. Die funktionelle Bedeutung der nukleären Lokalisation von YB-1 wurde in den vorangegangenen Abschnitten diskutiert. Um Hinweise auf die Funktionen von YB-1 im Zytoplasma zu erhalten, wurde die Assoziation von YB-1 mit zytoplasmatischen Proteinen untersucht. Aus Veröffentlichungen war bekannt, daß im Zytoplasma von Oozyten (X. laevis) und in Retikulozyten (Kaninchen) Y-Box-Proteine einen Hauptbestandteil der mRNP bilden. Im Zytoplasma von Oozyten (X. laevis) konnten neben den mRNP zwei weitere Komplexe identifiziert werden, die Y-Box-Proteine enthalten. Der eine Komplex besitzt einen Sedimentationskoeffizienten von 6S, und stellt einen Heterodimer der Y-Box-Proteine p54 und p56 dar. Der zweite Komplex enthält neben den beiden genannten Y-Box-Proteinen noch zwei weitere Proteine (p60 und p100) und besitzt einen Sedimentationskoeffizienten von 15S. Beide Komplexe sind in der Lage, RNA-Moleküle zu binden. Es wird vermutet, daß diese Komplexe Zwischenprodukte beim Prozeß des Zusammensetzens der mRNP darstellen (Murray et al., 1991; Murray et al., 1992; Evdokimova et al., 1995).

In der vorliegenden Arbeit wurden HeLa-Zellen einer sequentiellen Extraktion unterzogen und die zytoplasmatischen Fraktionen mittels der Saccharosegradientenzentrifugation analysiert. Dabei konnte YB-1 in vier verschiedenen Komplexen nachgewiesen werden. Diese Komplexe unterscheiden sich zum einen durch ihr Sedimentationsverhalten im Saccharosegradienten, zum anderen durch die Bedingungen, unter denen sie sich aus den HeLa-Zellen extrahieren lassen.

Ein Komplex mit einem Sedimentationskoeffizienten von 70S konnte bei einem Salzgehalt von 25 mM Kaliumchlorid aus den HeLa-Zellen extrahiert werden. Der geringe Salzgehalt, bei dem die Extraktion erfolgte, deutet darauf hin, daß dieser Komplex nicht an zelluläre Strukturen gebunden ist. Der Sedimentationskoeffizient


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von 70S stimmt gut mit dem von freien zytoplasmatischen mRNP überein. Die Assoziation von Y-Box- Proteinen mit mRNP wurde sowohl in Oozyten von X. laevis als auch in Retikulozyten von Kaninchen gezeigt. Es ist daher anzunehmen, das dieser Komplex mit den mRNP identisch ist.

Zwei der nachgewiesenen Komplexe sind durch einen geringen Sedimentationskoeffizienten gekennzeichnet. Während einer dieser Komplexe schon bei einem Salzgehalt von 25 mM Kaliumchlorid extrahiert wird, kann der andere erst bei einem Salzgehalt von 150 mM Kaliumchlorid aus den HeLa-Zellen gelöst werden. Bei der Erhöhung des Salzgehalts auf 150 mM Kaliumchlorid werden Teile des Zytoskeletts dissoziiert (Vedeler et al., 1991). Es ist daher möglich, daß der bei einem Salzgehalt von 150 mM Kaliumchlorid extrahierbare Komplex mit dem Zytoskelett assoziiert ist. Die Zusammensetzung und die Funktion dieser beiden Komplexe ist zur Zeit noch nicht bekannt.

Die Solubilisierung der Membranen des rauhen endoplasmatischen Retikulums durch Detergenzien führt zu einer Freisetzung von membrangebundenen Polysomen. Im Gegensatz zu anderen Polysomen konnte bei den membrangebundenen Polysomen eine Akkumulation von YB-1 festgestellt werden.

Bisher gibt es nur wenige Hinweise darauf, wie die Verteilung von YB-1 zwischen den verschiedenen Komplexen reguliert wird. Aus Veröffentlichungen ist bekannt, daß Y-Box-Proteine zu den Phosphoproteinen gehören. Eine fehlende Phosphorylierung scheint allerdings keinen Einfluß auf die mit der Transkription zusammenhängenden Funktionen zu haben (Tafuri + Wolffe, 1992). Es konnte ebenfalls gezeigt werden, daß die Bindung von Y-Box-Proteinen an RNA-Moleküle unabhängig von Phosphorylierungen erfolgt (Deschamps et al., 1997). Daher liegt die Vermutung nahe, daß die Phosphorylierungen bei der Assoziation von YB-1 mit anderen Proteinen eine Rolle spielen. Bei der Untersuchung von Hundepankreasmikrosomen wurde festgestellt, daß YB-1 in mikrosomalen Fraktionen in vitro phosphoryliert werden kann, was zur Freisetzung eines Teils des gebundenen YB-1 führt. Durch die Behandlung der mikrosomalen Fraktionen mit alkalischer Phosphatase ist es jedoch gelungen, diesen Prozeß zu verhindern (Jürchott, 1994).

5.5 Identifikation von YB-1-bindenden Proteinen

In der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, verschiedene Proteine nachzuweisen, die


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im Zytoplasma mit YB-1 interagieren. Zunächst wurde die Assoziation von YB-1 mit zytoplasmatischen Proteinen in der Koimmunpräzipitation untersucht. Die durchgeführten Kontrollen belegen, daß ein Protein mit dem scheinbaren Molekulargewicht von 35.000 ein Bindungspartner von YB-1 ist (P35). Die Assoziation von P35 mit YB-1 konnte nicht durch eine Inkubation mit DNase I bzw. RNase A beeinflußt werden. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, daß P35 nicht über DNA- bzw. RNA-Fragmente, sondern über Protein-Protein-Wechselwirkungen mit YB-1 interagiert. In weiteren Untersuchungen konnte beobachtet werden, daß die Assoziation von P35 mit YB-1 vom Verlauf des Zellzyklus abhängig ist. Dabei konnte beim Übergang der HeLa-Zellen von der G1- in die S- Phase des Zellzyklus eine maximale Bindung von P35 an YB-1 festgestellt werden. Desweiteren war in den Multidrug-resistenten MCF7/ADR-Zellen im Vergleich zu den sensitiven MCF7-Zellen die Assoziation von P35 mit YB-1 stark erhöht.

P35 und weitere YB-1-assoziierte Proteine wurden über eine Affinitätschromatographie gereinigt. An Hand mehrerer sequenzierter Peptide konnte ein Protein mit dem scheinbaren Molekulargewicht von 35.000 im Eluat dieser Affinitätssäule identifiziert werden. Dabei handelt es sich um ein Protein, das ursprünglich zusammen mit dem alternativen Splicing factor SF2 gereinigt wurde. Es wurde daher als P32-Untereinheit von SF2 bezeichnet (Honore et al., 1993). Weitere Veröffentlichungen belegen jedoch, daß P32/SF2 auch in Verbindung mit verschiedenen anderen Proteinen zu finden ist. So konnte die Assoziation von YL2, dem P32/SF2-homologen Protein in Mäusen, mit Rev, einem viralen Transaktivatorprotein des HIV Typ 1, nachgewiesen werden. Rev ist in der Lage, an bestimmte RNA-Strukturen zu binden, und unterstützt den Transport der Transkripte vom Zellkern ins Zytoplasma. Es konnte nachgewiesen werden, daß YL2 die Akivität von Rev verstärken kann (Luo et al., 1994). Genaue Studien zur Expression, Lokalisation und Funktion von P32/SF2 wurden jedoch noch nicht veröffentlicht. Es konnte jedoch festgestellt werden, daß P32/ SF2 in der Lage ist, an Hyaluronsäure zu binden (Deb + Datta, 1996). Es ist bekannt, daß die intrazelluläre Hyaluronsäure die Zellproliferation beeinflussen kann (Chen et al., 1998). Somit könnte P32/SF2 ein Bindeglied zwischen Proteinen, die am RNA-Metabolismus beteiligt sind, und der Zellzyklusprogression darstellen. Ein Hinweis darauf könnte auch die verstärkte Assoziation dieses Proteins mit YB-1 beim Übergang der Zellen von der G1- in die S-Phase des Zellzyklus sein.


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Neben P32/SF2 wurden noch folgende Proteine im Eluat der Affinitätssäule identifiziert: hnRNP A1, hnRNP A2/B1, hnRNP K und ein noch nicht genauer charakterisiertes RRM-RNA-bindendes Protein. Diese Proteine konnten jedoch durch die Koimmunpräzipitation nicht nachgewiesen werden. Dafür kommen verschiedene Ursachen in Betracht. Für die Koimmunpräzipitation wurden die Proteine durch eine Reaktion mit einem aktivierten Biotinester markiert. Die Stärke der Markierung ist dabei abhängig von dem Vorhandensein freier Aminogruppen an den Proteinmolekülen. Proteine, die nur über wenige oder gar keine freien Aminogruppen verfügen, können infolge dessen mit dieser Methode nicht nachgewiesen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, daß es durch die Verdünnung des Zytoplasma bei der Koimmunpräzipitation zur Dissoziation dieser Proteinkomplexe kommt. Es sind daher weitere Untersuchungen notwendig, um herauszufinden, wie diese Proteine mit YB-1 assoziiert sind und welche Bedeutung die Interaktion von YB-1 mit diesen Proteinen hat.

Alle identifizierten Proteine stehen in Zusammenhang mit dem RNA-Metabolismus. Es konnte nachgewiesen werden, das hnRNP A1, hnRNP A2/B1 und hnRNP K sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma vorkommen können (Kamma et al., 1995; Hoek et al., 1998). Über die Funktionen, die diese Proteine im Zytoplasma erfüllen, ist bis jetzt wenig bekannt. Das hnRNP K, ein multifunktionelles Protein, wurde sowohl als Transkriptionsfaktor als auch als RNA-bindendes Protein beschrieben (Michelotti et al., 1996; Bomsztyk et al., 1997). Auf Grund der Bindung an das Protoonkogen p95vav wird vermutet, daß hnRNP K ein Bindeglied bei der Umsetzung von extrazellulären Signalen auf die Ebene der Genexpression ist (Hobert et al., 1994). Das hnRNP A1 bindet im Zellkern an Intronsequenzen der prä-mRNA und ist in der Lage, das Splicing zu modulieren. Im Zytoplasma ist hnRNP A1 mit mRNA assoziiert und vermutlich an der Translationskontrolle der mRNA beteiligt (Svitkin et al., 1996; Hamilton et al., 1997). Für das hnRNP A2 wird eine Funktion beim zielgerichteten Transport von mRNA im Zytoplasma diskutiert. So konnte nachgewiesen werden, daß hnRNP A2 an eine Sequenz von 21 Nukleotiden im 3'-nichttranslatierten Bereich der mRNA von Myelin bindet. Diese Region ist dafür verantwortlich, daß die mRNA von Myelin selektiv zu den distalen Enden der Oligodendrozyten transportiert wird (Hoek et al., 1998).


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5.6 Die Rolle von YB-1 bei der Translationskontrolle von P-Glykoprotein

Vorangegangene Untersuchungen des Autors belegten eine Assoziation von YB-1 mit translatierenden Ribosomen (Jürchott, 1994). Diese Ergebnisse wurden durch die Analyse von mRNP in Retikulozyten von Kaninchen bestätigt. Dort konnte YB-1 ebenfalls in polysomalgebundenen mRNP nachgewiesen werden (Evdokimova et al., 1995). Eine besondere Spezifität von YB-1 für bestimmte Ribosomen wurde dabei nicht untersucht. In der vorliegenden Arbeit werden Ergebnisse dargestellt, die auf eine bevorzugte Assoziation von YB-1 mit membrangebundenen Ribosomen schließen lassen. Die sequentielle Extraktion von HeLa-Zellen ergab drei zytoplasmatische Fraktionen, die freie, zytoskelettgebundene oder membrangebundene Ribosomen enthielten. Die Assoziation von YB-1 mit den Ribosomen wurde durch die Kosedimentation im Saccharosegradienten untersucht. In dem Pellet, das die freien Polysomen enthielt, konnte praktisch kein YB-1 nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu wurden bei den sedimentierten membrangebundenen Polysomen große Mengen von YB-1 gefunden. Eine geringe Menge von YB-1 war bei den zytoskelettgebundenen Ribosomen zu beobachten. Das Vorkommen von YB-1 in dieser Fraktion könnte auf eine geringfügige Kontamination dieser Fraktionen mit membrangebundenen Ribosomen hinweisen.

Verschiedene Experimente mit Hundepankreasmikrosomen, die vom Autor im Rahmen seiner Diplomarbeit durchgeführt wurden, bestätigen diese Ergebnisse. Bei diesen Versuchen konnte YB-1 in Verbindung mit aktiv translatierenden Ribosomen am rauhen endoplasmatischen Retikulum nachgewiesen werden (Jürchott, 1994).

Die Spezifität für membrangebundene Ribosomen deutet auf eine mögliche Rolle von YB-1 bei der Translation von Polypeptiden hin, die am rauhen endoplasmatischen Retikulum synthetisiert werden. Die Beteiligung von YB-1 an der Transkriptionskontrolle von mdr1 wurde im vorangegangenen Teil dieser Arbeit bereits charakterisiert. Es wurde nun untersucht, ob YB-1 auch die Translation von P-Glykoprotein reguliert. Diese Untersuchungen wurden in einem zellfreien In-vitro-Translationssystem auf der Basis von Retikulozytenlysaten (Kaninchen) durchgeführt. Da die Biosynthese von P-Glykoprotein am rauhen ER stattfindet, wurde den Retikulozytenlysaten rauhe Mikrosomen (Hundepankreas) hinzugefügt. Sowohl in den Retikulozytenlysaten, als auch in den Präparationen der rauhen Mikrosomen konnte YB-1 nachgewiesen werden. Um den Einfluß von YB-1 auf die


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Translation von P-Glykoprotein untersuchen zu können, war es daher notwendig, YB-1 aus diesem In-vitro-Translationssystem zu entfernen. Am Beispiel der mRNA der Luciferase konnte gezeigt werden, daß nach dem Entfernen von YB-1 nicht generell eine Hemmung der Translation zu beobachten ist. Die Ergebnisse der In-vitro-Translation des Präprolactin verdeutlichen, daß auch ohne YB-1 die Synthese und der Transport von Proteinen am rauhen ER stattfinden kann. Desweiteren konnte nach der YB-1-Depletion keine Beeinflussung der Glykosylierung des alpha-Faktors beobachtet werden. Im Gegensatz zu diesen Kontrollexperimenten führte die Depletion von YB-1 zu einer fast vollständigen Hemmung der Translation der mRNA von P-Glykoprotein. Auf Grund dieser Resultate wird geschlußfolgert, daß YB-1 ein positiver Regulator für die Translation von P-Glykoprotein ist. Somit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, daß ein und dasselbe Y-Box-Protein in Säugern sowohl für die transkriptionelle wie auch für die translationelle Kontrolle eines Proteins zuständig ist.

Außer beim P-Glykoprotein wurden auch bei einer Reihe anderer Membranproteine Y-Box-Motive als regulatorische Elemente bei der Transkription beschrieben. Beispiele dafür sind unter anderem der EGF-Rezeptor (Sakura et al., 1988; Maekawa et al., 1989) und die Gene der Klasse II des Haupthistokompatibilitätskomplexes (Ting et al., 1994; MacDonald et al., 1995; Lloberas et al., 1995). Es besteht daher die Möglichkeit, das auch diese Gene sowohl auf der Ebene der Transkription als auch der Translation von YB-1 reguliert werden. Es ist offensichtlich, daß das Y-Box-Motiv nicht auf Promotoren von Membranproteinen beschränkt ist. Wie schon erwähnt, konnten bei verschiedenen zellproliferationsassoziierten Genen Y-Box-Motive in den Promotoren gefunden werden. Es ist möglich, daß YB-1 bei diesen Genen ausschließlich an der transkriptionellen Regulation beteiligt ist.


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Zusammenfassung

YB-1, ein Y-Box-Protein in Säugerzellen, konnte sowohl im Zytoplasma als auch in den Zellkernen von HeLa-Zellen nachgewiesen werden. Es wurde eine Abhängigkeit der intrazellulären Lokalisation von YB-1 vom Verlauf des Zellzyklus beobachtet. In jeder Phase des Zellzyklus war YB-1 im Zytoplasma zu finden. Eine Kernlokalisation von YB-1 konnte nur in den HeLa-Zellen festgestellt werden, die sich im Übergang von der G1- in die S-Phase oder in der frühen S-Phase des Zellzyklus befanden. Die Abhängigkeit der Lokalisation von YB-1 vom Verlauf des Zellzyklus unterstützt die These, daß YB-1 und andere Y-Box-Proteine an der Regulation der Zellproliferation beteiligt sind.

Es wurden verschiedene Proteine identifiziert, die im Zytoplasma von HeLa-Zellen mit YB-1 assoziiert vorkommen. Alle identifizierten Proteine erfüllen Aufgaben im RNA-Metabolismus, was auf eine Beteiligung dieser Proteinkomplexe an der Regulation der mRNA hinweist. Die Interaktion von P32/SF2 (P35) mit YB-1 erwies sich als abhängig vom Zellzyklus, wobei eine maximale Assoziation dieser beiden Proteine beim Übergang der HeLa-Zellen von der G1- in die S-Phase zu beobachten war. In Multidrug-resistenten MCF7/ADR-Zellen konnte eine deutlich verstärkte Interaktion von P32/SF2 mit YB-1 im Vergleich zu den sensitiven MCF7-Zellen festgestellt werden.

Im Zytoplasma von HeLa-Zellen konnte YB-1 in Verbindung mit membrangebundenen Polysomen nachgewiesen werden. Eine Assoziation von YB-1 mit freien oder zytoskelettgebundenen Polysomen konnte nicht festgestellt werden. Damit wurde erstmalig gezeigt, daß YB-1 eine Spezifität für eine bestimmte Gruppe von Polysomen besitzt. Die Assoziation mit membrangebundenen Polysomen legte die Vermutung nahe, daß YB-1 an der Translationskontrolle von Polypeptiden beteiligt ist, die am rauhen endoplasmatischen Retikulum synthetisiert werden. Es konnte gezeigt werden, daß YB-1 die Translation von P-Glykoprotein, einem integralen Membranprotein, positiv reguliert. Ein Einfluß auf die Translation der untersuchten sekretorischen Proteine (alpha-Faktor und Präprolactin) konnte nicht beobachtet werden. Diese Ergebnisse belegen, daß YB-1 ein spezifischer Regulator der Translation bestimmter Membranproteine ist.

Am Hand von P-Glykoprotein konnte des weiteren demonstriert werden, daß YB-1 sowohl die Transkription als auch die Translation dieses Proteins positiv reguliert. Die


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in den Zellkulturen beobachtete Korrelation von YB-1 mit der Expression von P-Glykoprotein konnte auch in primären Mammakarzinomen nachgewiesen werden. Somit ist YB-1 ein entscheidender Faktor bei der Ausbildung einer intrinsischen multiplen Resistenz von Mammakarzinomen gegen die Behandlung mit Chemotherapeutika. Aus diesem Grunde könnte YB-1 einen Ansatzpunkt für die künftige Diagnose und Therapie von Mammakarzinomen und eventuell auch von anderen Tumoren bieten.


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