1 Einleitung

1.1 Stand der Forschung

1.1.1 Cystische Fibrose: Historisches

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„Woe to that child which when kissed on the forehead tastes salty. 
He is bewitched and soon must die.”

Diese aus dem europäischen Raum stammende Überlieferung belegt, dass bereits seit dem frühen 17. Jahrhundert ein typisches Symptom der Mukoviszidose, nämlich der hohe Salzgehalt des Schweißes, bekannt und gefürchtet war (1, 2). Dennoch sollte es bis zum Jahr 1936 dauern, dass der Schweizer Physiologe Fanconi erstmals eine klinische Beschreibung des „Coeliakiesyndroms bei angeborener zystischer Pankreasfibromatose und Bronchiektasen“ dem medizinischen Kollegium präsentierte (3). Zwei Jahre später veröffentlichte die amerikanische Pathologin Anderson ihre Untersuchungen an verstorbenen Kindern, welche unter Destruktion des Pankreas und Infektionen mit Zerstörung des Lungengewebes litten, und gab der „zystischen Pankreasfibrose“ ihren noch heute gebräuchlichen Namen (4). Der in Deutschland und einigen anderen europäischen Ländern daneben verwendete Name „Mukoviszidose“ geht auf die Ausführungen von Farber 1945 zurück, der eine generalisierte Eindickung der Sekrete bei dem neu beschriebenen Krankheitsbild konstatierte (5). Das pathophysiologische Korrelat zu dieser Beobachtung lieferte 1953 Di Sant´ Agnese, als er den hohen Natriumchloridgehalt des Schweißes bei Patienten mit cystischer Fibrose (CF) beschrieb (6) und damit den Grundstein für den Goldstandard der CF-Diagnostik, den Schweißtest nach Gibson und Cooke (7), legte. Die Entdeckung des Cystic-Fibrosis-Transmembrane-Conductance-Regulator (CFTR)-Gens auf Chromosom 7 (8), welches für einen Chloridionenkanal codiert (9), schuf schließlich 1989 die Grundlage für die heutige molekularbiologische Diagnostik der Mutationsanalyse, wobei mittlerweile über 1000 Mutationen des CFTR-Gens bekannt sind (10). Dass der interindividuell sehr heterogene pulmonale Verlauf der Erkrankung jedoch nicht nur vom CFTR-Genotyp, sondern wahrscheinlich auch von so genannten „modifier genes“ abhängt, ist eine der wesentlichsten Erkenntnisse der aktuellen molekulargenetischen Forschung (11).

1.1.2 Pathophysiologie der Atemwege

Progressive Infektion und chronische, durch Neutrophile vermittelte Inflammation der tieferen Atemwege mit fortschreitender Destruktion des Lungengewebes und konsekutiver respiratorischer Insuffizienz stellen auch heute noch die Hauptursache für die reduzierte Lebensqualität und Lebenserwartung der Mukoviszidose-Patienten dar (12).

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Die Mukoviszidose ist eine generalisierte Störung des sekretorischen Epithels aller exokrinen Drüsen. Die Mutationen im CFTR-Gen lösen den Basisdefekt des gestörten Salz- und Wassertransports aus. Fehlendes oder defektes CFTR-Protein vermindert die Chloridpermeabilität der Apikalmembran der exokrinen Epithelzelle. Am Bronchialepithel stellt die inadäquate NaCl-Sekretion und die damit verbundene erhöhte Viskosität, relative Wasserarmut und eingeschränkte mukoziliäre Clearance der Sekrete einen wesentlichen Pathomechanismus dar. Zellulärer und bakterieller Debris, insbesondere hochmolekulare DNA, sowie proteolytische enzymatische Prozesse, Antikörperproduktion und Sauerstoff-Radikalbildung sind weitere wichtige Komponenten der komplexen pathologischen Vorgänge in den Atemwegen (13). Die bakterielle Flora des Respirationstrakt von CF-Patienten ist charakteristisch und schließt neben Staphylococcus aureus, Hämophilus influenzae und Problemkeimen wie Burkholderia cepacia oder Stenotrophomonas maltophilia typischerweise einen zunächst nicht mukösen, später ein mucoides Exopolysaccharid (Alginat) produzierenden Phänotyp der Spezies Pseudomonas aeruginosa ein (14). Trotz einer Vielzahl experimentell gewonnener Erkenntnisse sind die genauen Ursachen, warum die Atemwege von CF-Patienten gerade für diese Bakterien so empfänglich sind, weiterhin nicht restlos geklärt, ebenso wie die Frage, ob die bereits in einer frühen Krankheitsphase nachweisbaren entzündlichen Veränderungen in erster Linie Folge von Infektionen sind oder durch das mutierte CFTR-Protein selbst hervorgerufen werden (13).

1.1.3 Pulmonale Infektion mit P. aeruginosa

Das obligat aerobe, gramnegative Stäbchenbakterium P. aeruginosa kommt ubiquitär in der Erde und im Wasser vor. Es ist durch eine polare Begeißelung beweglich und bildet die Pigmente Pyocyanin und Fluorescein. Humanpathogene Bedeutung erhält es als opportunistischer Infektionserreger bei abwehrgeschwächten Patienten. Bei CF-Patienten gelingt es dem Bakterium durch Ausbildung und kontinuierliche Anpassung multipler Virulenzfaktoren, die Abwehrmechanismen des Wirtes zu überwinden und sich, trotz wiederholter aggressiver Antibiotikatherapie, dauerhaft in den Atemwegen zu etablieren (22). Wichtige Komponenten sind hierbei Biofilmbildung (15, 24), genetische Hypermutabilität (16), multiple Antibiotikaresistenz, phänotypische Anpassungsvorgänge wie Alginat- und Pilusbildung oder Motilitätsverlust (14), und die Sekretion von Exoprodukten, unter anderem Elastase, alkalische Protease und Exotoxin A (17). Untersuchungen des bakteriellen Genotyps haben gezeigt, dass genetisch unterschiedliche P. aeruginosa-Stämme einen gemeinsamen Phänotyp entwickeln können, was als Ausdruck dieser Anpassungsvorgänge angesehen wird (23). Aber auch verschiedene Wirtsfaktoren, unter anderem die salzabhängige Inaktivierung antimikrobiell wirkender Peptide des Atemwegssekrets, der Defensine (18), oder die durch die CFTR-Mutation bedingte Ausbildung von Pseudomonas-Rezeptoren, beispielsweise auf epithelständigen Gangliosiden (19), erleichtern den Erregern ihre Persistenz. Als chronische Infektion wird hierbei der Nachweis von P. aeruginosa über mindestens 6 Monate auf der Basis von Sputumkulturen, welche in mindestens einmonatigen Abständen entnommen wurden, zusammen mit klinischen Zeichen einer Infektion oder eines histologisch erkennbaren Gewebsschadens definiert (20). Häufig findet man deutlich erhöhte Pseudomonas-Antikörpertiter im Serum (22).

1.1.4 Mikrobiologische Probengewinnung

Bereits in einer sehr frühen Krankheitsphase sind sowohl entzündliche Veränderungen als auch bakterielle Infektionen der Atemwege bei CF-Patienten nachweisbar (21, 25, 26). Während die Prävalenz der S. aureus-Infektion mit dem Lebensalter abnimmt, gewinnt die Besiedlung mit P. aeruginosa zunehmend an Bedeutung (22). Die pulmonale Pseudomonas-Infektion führt zu einer vermehrten Entzündung im Bereich der Atemwege und hat bereits im Kleinkindesalter einen negativen Effekt auf den Verlauf der Lungenfunktion (27). Hohe Spiegel an Zytokinen, neutrophilen Granulozyten und leukozytären Proteasen als Ausdruck der körpereigenen Immunabwehr sind hierbei maßgeblich an der fortschreitenden Zerstörung des Lungengewebes beteiligt (14). Ein besonderer klinischer Focus liegt deshalb in der frühzeitigen Erkennung und aggressiven antibiotischen Behandlung der pulmonalen Kolonisation mit P. aeruginosa, um eine chronische Infektion, und damit Inflammation der Atemwege möglichst lange zu verzögern (22). Zur mikrobiologischen Diagnostik werden hierzu Proben aus dem Oropharynx oder Sputumproben gewonnen. In einem frühen Stadium der Lungenerkrankung sind viele Patienten allerdings nicht in der Lage, Sputum zu expektorieren, während sputumproduzierende Patienten mit fortgeschrittener Infektion häufig nur unzureichend auf die in-vitro sensibel getesteten Antibiotika ansprechen. Mehrere Studien, welche die Erregergewinnung bei CF-Patienten mittels Bronchiallavage (BAL) mit Proben aus dem Rachenabstrich verglichen, lieferten Hinweise auf eine Überlegenheit der Bronchoskopie bezüglich der Sensitivität und der Spezifität des Erregernachweises aus den tieferen Atemwegen (28, 29, 30, 31, 32). Die BAL gilt daher in bezug auf die mikrobiologische Probengewinnung derzeit als Goldstandard. Auf der anderen Seite wird BAL-Sekret nur von einem oder ein paar wenigen Orten des Bronchialsystems gewonnen, so dass über die bakterielle Flora der anderen Lungenabschnitte keine Aussage gemacht werden kann (14). Die Sputumgewinnung hat hier den theoretischen Vorteil, möglicherweise mehrere unterschiedliche Kompartimente des tiefen Atemtraktes zu repräsentieren. Insgesamt gesehen ist die Datenlage, insbesondere in bezug auf die Wertigkeit von Sputumproben jedoch widersprüchlich, da die Ergebnisse vom Alter der Patienten und dem Schweregrad der Erkrankung abhängen. Darüber hinaus verwenden die meisten epidemiologischen Studien für Ihre Untersuchung Rachenabstrich- oder Sputumproben, ohne dass die Repräsentativität dieser Materialien für die bakteriologische Flora der tiefen Atemwege bisher belegt ist.

1.1.5 Typisierung von P. aeruginosa

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Wenn zwei oder mehrere phänotypisch identische Pseudomonaden parallel aus verschiedenen Kompartimenten des Respirationstrakts nachgewiesen werden, bedeutet dies nicht, dass es sich hierbei um genetisch identische Isolate handelt oder beide Isolate von dem selben Klon abstammen. Bis vor etwa 10 Jahren versuchte man, die bakteriellen Isolate anhand phänotypsicher Charakteristika zu differenzieren. Die diversen Methoden der Phänotypisierung beruhten in erster Linie auf der Serospezifität der Lipopolysaccharide (Serotypisierung), dem Profil der Bacteriocin-Produktion (Pyocintypisierung), der Profilanalyse der äußeren Membranproteine (outer membrane protein profil analysis) und der Empfindlichkeit auf Phagen oder Antibiotika (33, 34, 35, 36, 37), ließen jedoch keinen Rückschluss auf den Genotyp der Isolate zu. Um die verschiedenen Stämme und Subtypen auf molekulargenetischer Basis voneinander unterscheiden zu können, wurden in den letzten Jahren zahlreiche molekulargenetische Methoden entwickelt. Dazu gehören diverse RFLP- und PCR-basierte Typisierungen der rRNA-Genregionen (Ribotyping), des Plasmids, des Gesamtgenoms, und von spezifischen DNA-Proben wie das Exotoxin A Gen (36, 38, 39, 40, 41). Es zeigte sich schnell, dass in bezug auf die Typisierung von P. aeruginosa die genetischen Typisierungsmethoden gegenüber den herkömmlichen Phänotypisierungen sowohl im Hinblick auf Diskriminierung als auch Reproduzierbarkeit überlegen waren (35, 37, 39, 42, 43, 44).

Allerdings besteht bis heute kein Konsensus über eine optimale Typisierungsstrategie oder –methode (45). Unter den derzeit gängigen Techniken gilt die DNA-Makrorestriktions-Analyse, auch Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) genannt, als eine der sensitivsten, spezifischsten und zuverlässigsten Methoden, um klonale Verwandtschaftsverhältnisse zu determinieren (23, 35, 46, 47, 48, 49, 50). Für die Genotypisierung von P. aeruginosa-Isolaten von CF-Patienten stellt die Aufspaltung der genomischen DNA unter Verwendung der Restriktions-Endonukleasen Spe I, Dra I oder Xba I mit anschließender Auftrennung der Restriktionsfragmente mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) eine der anerkannten Methoden dar (29, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57). In jüngster Zeit wurde unter anderem mit Hilfe dieser Technik mit der Kartierung von Pseudomonas-Stämmen begonnen (58). Eine andere, auf der Polymerase-Kerttenreaktion (PCR) basierende Methode, die Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)-Analyse, wurde ebenfalls für die zuverlässige Typisierung von P. aeruginosa herangezogen (44, 46, 53, 55, 56, 59, 60, 61, 62). Für diese Methode werden in der Literatur teilweise auch die Bezeichnungen Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaktion (AP-PCR), DNA Amplification Fingerprinting (DAF) oder PCR Fingerprinting verwendet.

In den letzten Jahren wurden viele epidemiologische Untersuchungen bei CF-Patienten mit Hilfe molekulargenetischer Typisierungsmethoden durchgeführt. Im Focus standen hier vor allem Fragen nach Infektionsquelle bzw. Transmission von P. aeruginosa (51, 55, 56). Unklar blieb bisher jedoch, ob innerhalb der Atemwege desselben Individuums mehrere Pseudomonas-Stämme koexistieren, und ob Veränderungen auf der Ebene des bakteriellen Genoms für die Alteration des Phänotyps verantwortlich sind.

1.2 Aufgabenstellung

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Das Ziel dieser Arbeit war die Evaluierung von mikrobiologischen Proben aus Rachenabstrich und Sputum im Vergleich zur BAL von Patienten mit cystischer Fibrose und milder Lungenerkrankung in bezug auf Sensitivität, Spezifität und prädiktive Wertigkeit des Nachweises von P. aeruginosa. Hierzu wurden bei 38 an Mukoviszidose erkrankten Kindern und Jugendlichen zu zwei Untersuchungszeitpunkten im Abstand von 18 Monaten mikrobiologische Kulturen aus den Atemwegen entnommen und analysiert. Darüber hinaus wurde die Frage nach dem Auftreten von genetisch unterschiedlichen Isolaten in den Atemwegen desselben Individuums und die Beurteilung der genetischen Variabilität der Pseudomonas-Isolate in sequentiellen Probenentnahmen untersucht. Die Genotypisierung der Pseudomonas-Isolate erfolgte mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese von RFLP-Fragmenten sowie mittels RAPD-Analyse des bakteriellen Genoms. Gleichzeitig wurden Diskriminationsfähigkeit und Reproduzierbarkeit beider Methoden verglichen und eine Empfehlung für die Typisierung von P. aeruginosa-Isolaten aus den Atemwegen von CF-Patienten formuliert.


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17.07.2006