2 Material und Methoden

2.1 Patientenkollektiv, Ein- und Ausschlusskriterien

↓4

38 Patienten der Kinderklinik der Charité – Universitätsmedizin Berlin, Campus Virchow-Klinikum, und des Dr.-von-Haunerschen Kinderspitals der Ludwig-Maximilians-Universität München wurden zwischen Juni 1996 und Juli 1999 untersucht. Alle Patienten nahmen and der multizentrischen BEAT (Bronchoalveolar lavage for Evaluation of Anti-inflammatory Treatment)-Studie teil, die das Ziel hatte, prospektiv den natürlichen Verlauf der bronchialen Inflammation bei klinisch stabilen CF-Patienten mit normaler Lungenfunktion zu evaluieren und den Einfluss von Dornase alpha zu untersuchen (63, 64). Patienten über 4 Jahren mit einer FEV1 von mindesten 80% des Solls wurden in die Studie eingeschlossen, während die Behandlung mit anti-inflammatorischen Substanzen wie Ibuprofen oder systemischen und inhalativen Kortikosteroiden, sowie der Nachweis einer allergischen bronchopulmonalen Aspergillose und ein Shwachman-Score von unter 55 Punkten Ausschlusskriterien darstellten. Die Probanden mussten außerdem in den letzten 6 Wochen vor der ersten BAL frei von respiratorischen Infekten und pulmonalen Exazerbationen gewesen sein und durften in diesem Zeitraum keine intravenös applizierten Antibiotika oder systemisch verabreichten Quinolone erhalten haben. Lungenfunktionsuntersuchungen wurden während des Beobachtungszeitraums in dreimonatlichen Abständen durchgeführt. Bei nachgewiesener Pseudomonas-Infektion wurde den Patienten inhalativ Tobramycin, falls sensibel, oder Colistin über ein Jahr verabreicht (n=4). Pulmonale Exazerbationen wurden mit Intravenösen Cephalosporinen und Aminoglykosiden behandelt (n=6).

Die Studie wurde von den Ethik-Kommissionen der beteiligten Zentren positiv beurteilt. Ein schriftliches Einverständnis der Eltern und/oder der Patienten lag vor.

2.2 Probenentnahme

2.2.1 Untersuchungszeitpunkte, Art der Proben

↓5

Mikrobiologische Proben wurden zu zwei Untersuchungszeitpunkten im Abstand von 18 Monaten (t1 und t2) aus Rachenabstrich, Sputum und BAL gewonnen. Patienten, die kein Sputum produzieren konnten, erhielten lediglich einen Rachenabstrich und eine BAL. Die Rachenabstriche wurden von einer erfahrenen Ambulanzschwester in einem standardisierten Verfahren aus dem tiefen Oropharynx einschließlich Zungengrund, Tonsillen und Rachenwand entnommen.

2.2.2 Bronchiallavage

Bronchoskopie und BAL wurden nach dem Protokoll der BEAT-Studie durchgeführt (63). Um das Verfahren zu standardisieren, wurden die Bronchoskopien in jedem Zentrum von dem selben Untersucher durchgeführt. Verwendet wurde ein flexibles Bronchoskop mit einem Außendurchmesser von 3,5 mm bei Patienten unter einem Alter von 10 Jahren und 4,9 mm bei Patienten ab 10 Jahren. Topische Anästhesie wurde vor dem Eingriff mittels Inhalation von 2 - 4 ml einer 4%igen Lidocain-Lösung erzielt. 1 - 4 ml einer 1%igen Lidocain-Lösung wurden beim Einführen des Bronchoskops in die Atemwege instilliert. Die Sedierung erfolgte mit einer Kombination von Midazolam (0,2 - 0,3 mg/kg Körpergewicht) und Propofol (initiale Dosis 2 mg/kg Körpergewicht, Wiederholungsdosen je 10 mg). Das Bronchoskop wurde bei allen Patienten in die Lingula oder eines ihrer Segmente vorgeschoben. Die BAL wurde mit 3 ml/kg Körpergewicht angewärmter physiologischer Kochsalzlösung durchgeführt. Bei Kindern unter 20 kg Körpergewicht wurden 3 x 1 ml/kg physiologischer Kochsalzlösung instilliert und sofort vorsichtig manuell abgesaugt. Bei Kindern ab 20 kg Körpergewicht wurde die BAL mit 20 ml-Aliquoten bis zu einem Gesamtvolumen von 3 ml/kg Körpergewicht durchgeführt.

2.2.3 Mikrobiologische Anzucht und Identifizierung

Mikrobiologische Kulturen wurden vor der Filtration aus den ersten 2 ml der BAL-Probe gewonnen und auf Columbia-Agar aufgebracht. Unabhängig von der Bakterienanzahl wurde jeglicher Keimnachweis als pathologisch eingestuft und dokumentiert, was der Vorgehensweise früherer Studien an CF-Patienten entsprach (28). Die Bakterienkulturen wurden mit Hilfe des API 20 NE-Systems (Bio Mérieux, Marcy-Etoile, Frankreich) identifiziert. Einzelkolonien von allen phänotypisch unterscheidbaren Isolaten derselben Kultur wurden für die weiteren Untersuchungen ausgewählt. Die Isolate wurden bei -80°C eingefroren. Für die Genotypisierung wurden die Kolonien auf McConcey Agar über Nacht bei 37°C rekultiviert.

↓6

Die mikrobiologischen Untersuchungen und die Genotypisierung wurden im Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Charité - Universitätsmedizin Berlin und im Max-von-Pettenkofer-Institut für Mikrobiologie und Hygiene der Ludwigs-Maximilians-Universität München durchgeführt.

2.3 Genotypisierung (Genetisches Fingerprinting)

2.3.1 Phenol-Chlorophorm-Extraktion der genomischen DNA

Nach Anzucht der Isolate auf McConcey-Agar wurde je eine P. aeruginosa-Kolonie in 700 μl TE (Tris-EDTA)-Puffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) eingebracht und nach Zugabe von 4 mg/ml Lysozym für 10 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde das Lysat mit 280 μl EDTA 0,5 M (pH 8,0) für 20 min bei 4°C inkubiert. Nach Zugabe von 50 μl SDS 10% (Endkonzentration 0,5%) und 0,2 mg/ml RNAse wurde die Lösung erneut für 30 min bei 55°C inkubiert. Im Anschluss erfolgte die Zugabe von 0,2 mg/ml Proteinase K und eine weitere Inkubation für 2 h bei 55°C. Nach Addition von 1 Volumen gepuffertem Phenol wurde die Lösung bei Raumtemperatur für 10 min leicht geschwenkt und über 15 min mit 10000 rpm zentrifugiert. Die Oberphase wurde abgenommen, mit 1 Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) gemischt und für 13 min mit 130000 rpm zentrifugiert. Zur Oberphase wurde 1 Volumen Isopropanol gegeben und das Gemisch mit 1/10 Volumen Natriumacetat versetzt. Die Suspension wurde über Nacht bei 4°C inkubiert und anschließend für 30 min erneut mit 13000 rpm zentrifugiert. Das Pellet wurde 2 x mit 70%-igem Ethanol bei 4°C gewaschen, dann 5 bis 10 min vakuumgetrocknet und in 200 μl TE-Puffer resuspendiert. Die DNA wurde über Nacht bei 4°C gelöst. Im Anschluss erfolgte die Konzentrationsbestimmung mittels Messung der optischen Dichte (OD) bei 260 nm und 280 nm und die Konzentrationseinstellung auf 10 ng DNA/μl TE-Puffer. Bis zur weiteren Verarbeitung erfolgte die Lagerung der DNA-Proben bei 4°C.

2.3.2 Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)-Analyse

Sechs Primer wurden initial in bezug auf ihre Diskriminationsfähigkeit zwischen unterschiedlichen Pseudomonas-Isolaten und Reproduzierbarkeit in wiederholten Untersuchungen evaluiert. Der Primer M13 core zeigte in anderen Studien eine hohe diskriminative Kapazität für eine Reihe von Bakterienisolaten (46, 59, 60, 65, 66). Die Verwendung des Primers M13 uni für P. aeruginosa und andere Pathogene ist ebenfalls beschrieben (66). Die Primer (GTG)5 und T3B wurden in unserem Labor mehrfach für die Typisierung verschiedener Mikroorganismen verwendet (65, 67, 68, 69). Für die RAPD von P. aeruginosa wurde von einer anderen Arbeitsgruppe der Gebrauch von 10-mer-Primern, wie 208 oder 272, vorgeschlagen (53). Alle Primer wurden über TIB Molbiol, Berlin bezogen. Die Zusammensetzung der Reaktionsansätze und die PCR-Protokolle für alle verwendeten Primer zeigt Tabelle 1.

↓7

Tabelle 1: PCR-Reaktionsgemische und PCR-Protokolle für 50 μl-Ansätze.

 

T3B

(GTG)5

M13 core

M13 uni

10-mer

Reaktionsgemisch

DNA

10 ng

50 ng

25 ng

25 ng

80 ng

Primer

10 pmol

5 pmol

25 pmol

25 pmol

80 pmol

PolymeraseA

2.5 U

2.5 U

2.5 U

2.5 U

2.0 U

dNTP’s

200 µmol

200 µmol

200 µmol

200 µmol

250 µmol

MgCl2 (1.5 mM)

3 µl

3 µl

3 µl

3 µl

1,5 µl

PufferB

5 µl

5 µl

5 µl

5 µl

5 µl

PCR-Protokolle

Denaturierung

Annealing

Elongation

1 Zyklus:

2´ 95°C

-

-

1 Zyklus:

2´ 95°C

-

-

1 Zyklus:

2´ 95°C

-

-

1 Zyklus:

2´ 95°C

-

-

4 Zyklen:

5´ 94°C

5´ 36°C

5´ 72°C

Denaturierung

Annealing

Elongation

32 Zyklen:

20´´ 95°C

30´´ 52°C

80´´ 72°C

32 Zyklen:

20´´ 95°C

30´´ 50°C

80´´ 72°C

27 Zyklen:

20´´ 95°C

60´´ 50°C

20´´ 72°C

32 Zyklen:

20´´ 95°C

40´´ 56°C

80´´ 72°C

30 Zyklen:

60´´ 94°C

60´´ 36°C

120´´ 72°C

Final Extension

6´ 72°C

6´ 72°C

6´ 72°C

6´ 72°C

6´ 72°C

AAmpliTaq DNA-Polymerase (Perkin-Elmer, Branchburg, New Jersey, USA), B10 mM Tris-Cl (pH 8,0), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,001% Gelatine

Die Reaktionsansätze wurden mit 25 μl Mineralöl beschichtet und mit einem Perkin-Elmer Cetus DNA Thermocycler (Modell Gene-Amp PCR System 9600) amplifiziert. Nach Hervorholen der PCR-Produkte unter dem Mineralöl wurden diese mittels Vakuum-Zentrifuge (Eppendorf Concentrator 5301, Eppendorf, Hamburg) über 23 min auf 25μl eingeengt und anschließend mit je 3 μl Stop-Lösung (für 30 ml: 15 ml Glycerin, 30 mg Bromphenolblau, 6 ml 0,5 M EDTA, 0,3 ml 1 M Tris-Puffer, pH 8,0) versetzt. Im Anschluss wurden die Proben inklusive einem Standardmarker (1 kb-Leiter) und einem laborinternen P. aeruginosa-Referenzstamm auf ein 1%-Agarosegel [2 g Pharmacia-Agarose (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), 20 ml 10 x TBE-Puffer (für 1 l: 108 g Trishydroxymethylaminomethan, 55 g Borsäure, 40 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0), 180 ml aqua bidest] aufgetragen. Die elektrophoretische Auftrennung (Laufpuffer 0,5 x TBE) erfolgte über 5 h bei U = 100 V. Danach wurden die Proben über 10 min mit Ethidiumbromid gefärbt und einer nochmaligen Elektrophorese für 15 min bei 125 V unterzogen. Die Gele wurden mit einer Polaroid-Kamera photographiert und visuell analysiert.

Der Verwandtschaftsgrad der RAPD-Fingerprints wurde nach dem Dice-Koeffizienten berechnet (52). Zwei Isolate sind demnach als verwandt einzustufen, wenn sie mindestens 80% Übereinstimmung in ihren Bandenmustern zeigen. Um Artefakte auszuschließen, wurden alle Proben zweifach amplifiziert.

2.3.3 DNA-Makrorestriktion und Pulsfeld-Gelelektrophorese

↓8

Die Methode wurde nach einem bereits beschriebenen Protokoll durchgeführt (51), mit einigen wenigen Modifikationen. Nach Anzucht der Isolate auf McConcey-Agar wurde je eine Bakterienkultur in 10 ml TSB (Tryptone soya broth = Caseinpepton-Sojamehl-Pepton-Lösung) resuspendiert und über Nacht bei 37°C bis zu einer optischen Dichte von 0,7 (λ = 590 nm) bebrütet. Die Kulturen wurden mit 100 μl 0,5 M EDTA auf Eis inkubiert und anschließend bei 4°C für 3 min mit 10000 rpm zentrifugiert (Eppendorf Zentrifuge 5415D, Eppendorf, Hamburg). Das Pellet wurde zuerst mit 1 ml SE (sodium chloride/EDTA)-Puffer (75 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) einmal bei 4°C gewaschen und erneut zentrifugiert. Danach wurde das Pellet nochmals gewaschen und in 100 μl SE-Puffer (75 mM NaCl, 0,5 M EDTA, pH 7,4) resuspendiert. Anschließend wurde die Bakteriensuspension auf 55°C erhitzt und mit 100 μl 2% low-melting-point-Agarose (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornien, USA) gemischt, in Blöckchen gegossen und über 20 min bei 4°C zum Erstarren gebracht. Die Agaroseblöckchen wurden in 1 ml SLS (sodium chloride/Na-lauroyl-sarcosine)-Puffer (0,5 M Na2EDTA, Na-Lauroylsarcosin 1%, pH 9,5) und 0,5 mg/ml Proteinase K über 15 h bei 55°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen der Blöckchen in TE-Puffer bei 4°C (Abstand der Waschungen 1,5 - 2 h) wurde zu einem etwa 2 x 5 mm großen Stück Agaroseblöckchen je 78,5 μl aqua bidest, 20 μl 10 x Puffer und 1,5 μl (15 U) Spe I (Boehringer, Mannheim) gegeben und für 15 h bei 37°C inkubiert. Danach wurde das Puffergemisch entfernt und die Reaktion mit TE-Puffer gestoppt. Die Proben wurden, inklusive einem laboreigenen P. aeruginosa-Referenzstamm und einem Standardmarker (DNA size λ-ladder [Boehringer, Mannheim]), auf ein 1%-Agarosegel (2 g Seakem Gold Agarose für PFGE [Bio-Products, Rockland, Maine, USA], 10 ml 10 x TBE-Puffer, 190 ml aqua bidest) aufgetragen und die Slots mit 2% low-melting-point-Agarose aufgefüllt. Im Anschluss erfolgte die Elektrophorese (Chef-DRII System, Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien, USA, Laufpuffer 0,5 x TBE) über 24 Stunden unter den folgenden Bedingungen: U = 200 V, I ~ 0,1 A (6 V/cm), initial time = 1,0 s, final time = 25 s, T = 12°C, included angel = 120°. Das Gel wurde über 15 min in Ethidiumbromid gefärbt, mit einer Polaroid-Kamera photographiert und visuell analysiert.

Alle Pseudomonas-Isolate wurden zweifach typisiert, um Artefakte auszuschließen. Der Verwandtschaftsgrad zwischen den Bandenmustern der unterschiedlichen Isolate wurde nach den von Tenover et al. Vorgeschlagenen Kriterien beurteilt und interpretiert (54). Hiernach werden Isolate als nah verwandt angesehen, wenn sie sich in nicht mehr als drei PFGE-Banden unterscheiden. Fingerprints mit einem Unterschied im Bandenmuster von vier bis sechs Banden werden als möglich verwandt eingestuft, während Stämme mit mehr als sechs Unterschieden im Bandenmuster als genetisch unverwandt gelten.

Für die interne Qualitätskontrolle und die Vergleichbarkeit der Gele wurde bei beiden beschriebenen Typisierungsmethoden auf jedem Gel ein klinischer P. aeruginosa-Referenzstamm aus unserem Labor mitgeführt.

2.4 Auswertung der Ergebnisse und Biometrie

↓9

Sensitivität, Spezifität und prädiktive Werte der mikrobiologischen Proben aus Rachenabstrich (Nicht-Sputumproduzenten) und Sputum (Sputumproduzenten) für den Nachweis einer Pseudomonas-Besiedlung der tiefen Atemwege wurden berechnet, wobei die simultan durchgeführte BAL als Goldstandard definiert wurde. Die Daten beider Untersuchungszeitpunkte wurden für die Analyse gepoolt.

Die Fähigkeit der Primer und Enzyme, zwischen unterschiedlichen Isolaten zu diskriminieren, wurde als das Verhältnis zwischen der Anzahl der Isolate, für die ein Bandenmuster generiert werden konnte, und der Anzahl der getesteten Stämme definiert. Die Reproduzierbarkeit wurde anhand der Isolate drei zufällig ausgewählter Patienten (Nr. 3, 5 und 7) durch dreimalige Repetition beider Typisierungsmethoden untersucht und mit Hilfe des nicht-parametrischen Wilcoxon-Tests für gepaarte Proben analysiert; p ≤ 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.


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17.07.2006