4 Diskussion

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Die vorliegende Studie wurde durchgeführt, um P. aeruginosa-Isolate aus den oberen und unteren Atemwegen sequentiell molekulargenetisch zu typisieren. Hierzu wurden zwei unterschiedliche Typisierungsmethoden angewendet und verglichen. Zusätzlich wurde die diagnostische Wertigkeit von Rachenabstrich- und Sputumkulturen bezüglich des Nachweises einer Pseudomonas-Infektion der tiefen Atemwege evaluiert.

4.1 Diagnostische Wertigkeit von mikrobiologischen Kulturen

In den vorliegenden Untersuchungen besaßen Rachenabstrichkulturen eine geringe Sensitivität und einen geringen negativen Vorhersagewert für das Erkennen einer Kolonisation der tiefen Atemwege von CF-Patienten mit P. aeruginosa. Dagegen lag nur in einem von 18 Fällen eine falsch negative Sputumkultur in bezug auf die Bronchoskopie vor, bei gleichzeitig hoher Sensitivität. Allerdings konnten Sputumproben lediglich in 28 Fällen (40,6%) entnommen werden, da viele Patienten kein Sputum produzieren konnten. Diese Ergebnisse sind auf Grund der niedrigen Fallzahlen nicht statistisch signifikant, jedoch lässt sich eine eindeutige Tendenz erkennen.

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Einige wenige frühere Studien haben Proben aus BAL, Sputum und Rachenabstrich von CF-Kindern (29, 31, 32) und Erwachsenen (28, 30) mit unterschiedlichen Ergebnissen verglichen. Armstrong et al. (29) evaluierte prospektiv über einen Zeitraum von 30 Monaten Rachenabstriche und Sputumproben von 75 Kindern im Alter von 1 bis 25 Monaten mit CF und milder Lungenerkrankung. Hierbei zeigte sich, dass der fehlende Nachweis von P. aeruginosa im Rachenabstrich bei symptomatischen Kindern eine Infektion der tiefen Atemwege nicht ausschließt. Diese Daten wurden durch Ramsey et al. (31) anhand Untersuchungen bei 43 jungen CF-Patienten (mittleres Alter 8,2 Jahre) in gutem respiratorischem Zustand bestätigt. In einer multizentrischen Studie, welche Patientendaten der beiden zuvor genannten Studien mit einschloss, analysierte Rosenfeld et al. (32) Proben von 141 CF-Patienten in einem Alter bis fünf Jahren ohne vorhergehende pulmonale Exazerbationen. In dieser Alterklasse waren Rachenabstrichkulturen für den Pseudomonas-Nachweis hilfreich, da Spezifität und negativer Vorhersagewert der Rachenabstriche hoch waren. Niedrige Sensitivität und positiver prädiktiver Wert zeigten jedoch, dass ein positiver Rachenabstrich nicht zuverlässigerweise eine Kolonisation der tiefen Atemwege repräsentierte.

Von einer guten Überseinstimmung zwischen den Ergebnissen des Rachenabstrichs und der BAL berichtete Konstan et al. (28). In dieser Studie wurden 18 klinisch stabile CF-Patienten über 11 Jahren mit moderater Lungenbeteiligung bronchoskopiert. Allerdings war die Erkrankung weiter fortgeschritten als bei den Patienten unserer Studie und der Kollektive von Armstrong, Ramsey und Rosenfeld, und die Prävalenz der Pseudomonas-Besiedlung lag deutlich höher (88,9% im Vergleich zu 47,4% in unserer Studie).

Baughmann et al. (30) untersuchte den Nutzen der Bronchoskopie und der semiquantitativen BAL für die Identifizierung bakterieller Mikroorganismen, in erster Linie P. aeruginosa, bei 11 erwachsenen CF-Patienten mit schwerer obstruktiver Lungenerkrankung. Die Indikation zur Bronchoskopie war ein klinisch unbefriedigender Verlauf trotz resistogrammgerechter antibiotischer Therapie. In 41% der Fälle wurde ein in der BAL nachgewiesenes P. aeruginosa-Isolat nicht in einer simultanen Sputumprobe gefunden. 46% der Bronchoskopien führten zu einer Änderung in der antibiotischen Therapie, entweder weil in der BAL ein neuer Keim entdeckt wurde, oder aufgrund des Antibiogramms.

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Die beschriebenen Daten lassen den Schluss zu, dass Sensitivität und Spezifität von Rachenabstrichkulturen vom Alter der Patienten und dem Status der Lungenmanifestation abhängig ist. Offensichtlich hat bereits in einer frühen Krankheitsphase eine Kolonisation der tiefen Atemwege mit P. aeruginosa stattgefunden, während sich dies noch nicht zwangsläufig im Rachenabstrich widerspiegelt. Erst zu einem späteren Zeitpunkt kolonisiert der Erreger chronisch beide Kompartimente, so dass Rachenabstriche mit Sputumproben konkordant sind und die bakterielle Flora der tiefen Atemwege adäquat repräsentieren.

In der vorliegenden Studie wurden Bronchoskopie und BAL von allen Patienten gut vertragen. Die Bronchoskopie stellt jedoch keine Standardmethode in der routinemäßigen mikrobiologischen Diagnostik dar. Induziertes Sputum wurde in dieser Studie nicht gewonnen. Da mit Hilfe von Sputumproben P. aeruginosa-Kolonisationen der tiefen Atemwege von CF-Patienten mit hoher Sensitivität und mit hohen prädiktiven Werten nachweisbar waren, kann spekuliert werden, dass Kulturen aus induziertem Sputum von Patienten, die spontan nicht expektorieren können, ähnlich zuverlässige Ergebnisse wie die BAL erbringen. Diese These wird unterstützt durch die Ergebnisse einer im Jahr 2000 veröffentlichen Studie mit induziertem Sputum (70), wenngleich die Autoren keinen Vergleich von Kulturen aus induziertem Sputum und BAL führten. Darüber hinaus zeigte eine neuere Arbeit der BEAT-Gruppe, dass induziertes Sputum, verglichen mit Bronchialsekret, auch im Hinblick auf eine Beschreibung der Atemwegsinflammation als repräsentativ für die tiefen Atemwege gelten kann (71).

4.2 Methoden der Genotypisierung

Unter den zahlreichen Typisierungsmethoden, die derzeit zur Differenzierung von Pseudomonas-Isolaten verwendet werden, wurden zwei Techniken ausgewählt und appliziert, die in den letzten Jahren häufig für P. aeruginosa-Isolate von Mukoviszidose-Patienten herangezogen wurden: eine RFLP-Technik mit DNA-Makrorestriktion und anschließender Auftrennung mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) sowie eine PCR-basierte RAPD-Analyse. Eine einheitliche Empfehlung oder ein Konsens zur Genotypisierung existiert zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht. Die PFGE-Methode hat sich jedoch in jüngster Zeit als die am häufigsten benutzte Technik etablieren können, und verschiedene Autoren forderten ein international standardisiertes Protokoll für die PFGE-basierte Genotypisierung von P. aeruginosa (45).

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Die Idee, große DNA-Restriktionsfragmente nach Enzymverdau in einem großporigen Elektrophoresegel unter dem Einfluss zweier gepulster elektrischer Felder laufen zu lassen, geht zurück auf Versuche von Schwartz und Cantor 1984 (72) sowie Carle und Olson 1985 (73). Diese Methode, bei dem die elektrischen Felder in einem bestimmbaren Winkel zueinander angebracht sind, ermöglicht die Auftrennung von Makromolekülen mit einer Größe von über 50 kb. Die unterschiedliche Laufgeschwindigkeit der Banden wird hierbei durch die stetige Neuausrichtung der Fragmente im wechselnden elektrischen Feld erzielt, bei der die größeren Fragmente mit der Zeit zurückbleiben. In der DNA-Typisierung von Bakterien, Pilzen und Parasiten hat sich diese Technik in den letzten Jahren fest etablieren können.

Im Jahr 1990 entwickelten zwei unabhängige Arbeitsgruppen eine auf der Polymerasekettenreaktion basierende Methode, bei der durch die Verwendung von Primern mit willkürlich ausgewählten Nukleotidsequenzen eine Amplifizierung von unspezifischen DNA-Segmenten erfolgt (74, 75). Dieses, quasi dem Zufallsprinzip unterliegendes Fingerprinting wird als Random Amplified Polimorphic DNA (RAPD) oder Arbitralily Primed PCR (AP-PCR) bezeichnet. Unzählige Mikroorganismen wurden seitdem mit dieser Methode typisiert. Je nach Auswahl des Primers werden Bandenmuster unterschiedlicher Komplexität erzeugt; aus diesem Grund müssen für jede Spezies optimale Primer ermittelt werden.

Alle Pseudomoas-Isolate konnten mit Hilfe der beiden beschriebenen Typisierungsmethoden zuverlässig charakterisiert werden. Die Techniken zeigten bei den ausgewählten Primern und Enzymen eine hohe Konkordanz bezüglich der generierten Fingerprints. Eine Ausnahme bestand für die beiden 10-mer Primer, die in wiederholten Versuchen viele Artefakte zeigten und sich, entgegen den Beschreibungen anderer Autoren (53), in unseren Untersuchungen nicht zur Genotypisierung eigneten. Die DNA-Makrorestriktion mit dem Restriktionsenzym Spe I war im Gegensatz zur RAPD-Analyse in der Lage, zwischen identischen Isolaten und nah verwandten Subtypen zu differenzieren. Die Reproduzierbarkeit lag ebenfalls etwas höher als die der PCR-basierten Methode, so dass die RFLP mit anschließender PFGE als gute Methode für eine epidemiologisch differenzierte Typisierung von P. aeruginosa empfohlen werden kann. In jüngster Zeit nutzten verschiedene Arbeitsgruppen diese Technik, um die Übertragung und Verbreitung von definierten multiresistenten Pseudomas-Stämmen zu untersuchen und eine entsprechende Isolierung der Patienten auf der Basis genotypischer Kriterien zu fordern (76, 77). Da die PFGE-Methode jedoch zeitaufwendig und teuer ist, schließen wir uns dem Vorschlag anderer Autoren an (41, 42, 59, 62), die Applikation einer schnellen, PCR-basierten Methode, wie der RAPD mit dem Primer M13 uni, für das initiale Screening größerer Zahlen von Pseudomonas-Isolaten heranzuziehen, und die DNA-Makrorestriktionsanalyse konfirmatorisch oder für eine akkurate Antwort auf epidemiologische Fragestellungen zu verwenden.

4.3 Intraindividuelle und longitudinale Variabilität der Pseudomonas-Genotypen

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Die Genotypisierung der P. aeruginosa-Isolate demonstrierte, dass in einer nicht unerheblichen Anzahl der Fälle unterschiedliche Stämme in den verschiedenen Etagen des Respirationstrakts desselben Individuums nachgewiesen werden können. Besonders die Genotypen der Isolate der oberen Atemwege, d. h. aus Rachenabstrich und Sputum, divergieren sehr häufig zu den Stämmen aus der Bronchoskopie. Im Gegensatz zu früheren Studien an CF-Patienten, die sich auf Rachenabstrich- und Sputumproben beschränkten, evaluierte diese Studie erstmals sequentiell die genetischen Beziehungen und Veränderungen von P. aeruginosa anhand Kulturen aus den oberen und unteren Atemwegen einschließlich der BAL. Wenngleich kleinere und größere Abweichungen des Genotyps in allen Kompartimenten des Respirationstrakts nachgewiesen werden konnten, so waren longitudinale Variationen mehrfach nur durch die Bronchoskopie erkennbar. Auf Grund kleiner Fallzahlen und des relativ kurzen Untersuchungszeitraums von 18 Monaten war keine Korrelation zwischen den Alterationen auf genetischer Ebene und dem klinischen Verlauf erkennbar.

Molekulargenetische Typisierungen von P. aeruginosa aus den oberen Etagen der Atemwege deuten darauf hin, dass die meisten CF-Patienten mit einem oder wenigen Stämmen für längere Zeiträume kolonisiert sind (16, 23, 49, 53, 62). Diese Theorie konnten wir anhand bronchoskopisch gewonnener Isolate für die tiefen Atemwege bestätigen. Auch von Co-Infektionen mit einem oder mehreren Stämmen und von Stammersatz wird, wie auch in der vorliegenden Studie gezeigt, in der Literatur berichtet (49, 53, 62). Wir konnten jedoch darüber hinaus nachweisen, dass longitudinale Anpassungsmechanismen des bakteriellen Genoms ein häufiges Phänomen darstellen. Offensichtlich kommt es im Verlauf der Pseudomonas-Besiedlung neben einer Selektion der überlebensfähigeren Stämme auch zu einer Mikroevolution der einzelnen Stämme auf molekularer Ebene. Dies dürfte das genetische Korrelat der seit langem bekannten phänotypischen Anpassungsvorgänge von. P. aeruginosa darstellen, ohne dass dieser direkte Zusammenhang bisher gezeigt werden konnte. Unterstützt werden diese Ergebnisse von einer jüngeren Arbeit der Arbeitsgruppe um Oliver at al. (16), die erstmals nachwiesen, dass der Anteil hypermutabler Pseudomonas-Stämme bei CF-Patienten sehr hoch sein kann.

Die Arbeitsgruppe um Armstrong (29) war vor uns die einzige, die Genotypisierungen von P. aeruginosa-Isolaten aus der BAL von CF-Patienten durchführte. Bei neun aus 75 zufällig ausgewählten simultanen Rachenabstrich- und BAL-Kulturen wurden konkordante Genotypen in acht Fällen beobachtet. Die Autoren untersuchten jedoch nicht den longitudinalen Verlauf der Genomovare.

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Die hier vorgestellten Daten implizieren die Frage, von wie vielen und von welchen Etagen des Respirationstrakts mikrobiologische Kulturen in der Routine gewonnen werden sollten. Sputumproben haben mehrfach ihre Überlegenheit gegenüber Rachenabstrichkulturen gezeigt, selbst wenn diese standardisiert und mit höchstmöglicher Präzision durchgeführt wurden. Bei Patienten, die spontan kein Sputum produzieren können, wird durch die Gewinnung von induziertem Sputum möglicherweise eine größere Zuverlässigkeit des Erregernachweises erreicht als durch Rachenabstriche. Gegenüber der BAL haben Sputumkulturen den theoretischen Vorteil, dass sie das bakterielle Milieu von mehr als einer Region des Bronchialbaumes reflektieren. Diese Fragen müssen in weiteren Untersuchungen geklärt werden. Auch sind weitere longitudinale Studien an CF-Patienten erforderlich, um die klinische Relevanz der beobachteten genetischen Anpassungsvorgänge der Pseudomonas-Isolate zu erfassen. Wir empfehlen, im Falle einer therapieresistenten pulmonalen Exazerbation eine bronchoskopische Erregergewinnung zu versuchen. Zusätzlich zu ihrem Stellenwert in der klinischen Diagnostik ist die Durchführung einer BAL notwendig, um epidemiologische Fragestellungen hinreichend zu beantworten und longitudinale Anpassungsvorgänge des bakteriellen Genoms innerhalb der Atemwege beurteilen zu können.


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17.07.2006