Zum Zeitpunkt des Studienbeginns betrug das mittlere Alter der Patienten 14,2 Jahre (5,2 - 34,2 Jahre), die mittlere FEV₁ lag bei 95% des Solls (80% - 120%). Bei 18 der 38 Patienten (Prävalenz 47,4%) wurde zu mindestens einem Zeitpunkt in mindestens einer Kultur P. aeruginosa in den Atemwegen nachgewiesen. In Tabelle 2 sind Anzahl und Verteilung der Atemwegsproben zu beiden Entnahmezeitpunkten dargestellt.

n (%)

t₁

t₂

P+

P–

P+

P–

Rachenabstrich

Sputum

BAL

14 (36,8)

13 (34,2)

18 (47,4)

11 (28,9)

9 (23,7)

20 (52,6)

15 (48,4)

5 (16,1)

16 (51,6)

14 (45,2)

1 (3,2)

15 (48,4)

Gesamtanzahl Patienten 38 (100)

31 (100)

Tabelle 2: Anzahl n der mikrobiologischen Kulturen aus den Atemwegen der Patienten mit und ohne Pseudomonas-Nachweis zu beiden Untersuchungszeitpunkten (P+ und P–). Die Prozentangaben beziehen sich auf die Gesamtanzahl der Patienten.

Sieben Patienten hatten die Studie vor der zweiten Untersuchung (t₂) abgebrochen. Zwei der Pseudomonas-positiven Probanden unterzogen sich nur einer Bronchoskopie. Zum ersten Untersuchungszeitpunkt waren 13 der Patienten Sputumproduzenten, während fünf von Ihnen kein Sputum expektorieren konnten. Die Anzahl der Sputumproduzenten nahm zum zweiten Untersuchungszeitpunkt auf fünf ab, versus 11 nicht-expektorierende Patienten. Zusätzlich zum Rachenabstrich wurde bei neun (t₁) beziehungsweise vier (t₂) Probanden Sputumproben entnommen, da diese Patienten anfänglich nicht in der Lage waren zu expektorieren, dieses aber nach der Durchführung des Rachenabstrichs konnten.

Insgesamt wurden 80 P. aeruginosa-Isolate aus 221 Sekretproben gewonnen. Bei einigen Patienten waren mehrere phänotypisch unterschiedliche Isolate in derselben Kultur nachweisbar. Die Bakterienzahl betrug in den positiven Kulturen zwischen 10² und 10⁹ CFU/ml. Alle Patienten mit mindestens einmaligem Pseudomonas-Nachweis sind in Tabelle 3 dargestellt.

^{A w = weiblich, m = männlich; B}nicht durchgeführt; ^CKultur P. aeruginosa-negativ; ^DKultur P. aeruginosa-positiv, jedoch keine Genotypisierung durchgeführt

Patientendaten

Methode

Pseudomonas-aeruginosa Genotypen

Pat.-Nr.

Alter (Jahre)

w/m^A

Intervall t₁ bis t₂ (Monate)

Untersuchungszeitpunkt t₁

Untersuchungszeitpunkt t₂

Rachen-abstrich

Sputum

BAL

Rachen-abstrich

Sputum

BAL

1

34,2

w

22,5

RFLP

RAPD

n. d. ^B

–^C

–

–

n. d.

I

1

2

17,4

w

23

RFLP

RAPD

n. d.

–

–

–

–

II

2

3

21,3

w

21,5

RFLP

RAPD

–

n. d.

III

3

–

n. d.

IV

4

4

12,3

m

21

RFLP

RAPD

–

–

–

–

n. d.

V

5

5

11,1

m

20,5

RFLP

RAPD

VI

6

VI

6

VI

6

V

5

n. d.

VI

6

6

15,3

m

---

RFLP

RAPD

n. d.

VIIa

7

VIIa, VIIb

7

n. d.

n. d.

n. d.

7

14,9

w

22

RFLP

RAPD

–

VIIIa

8

VIIIa, VIIIb

8

VIIIa

8

n. d.

VIIIa, IX

8, 9

8

11,0

w

19,5

RFLP

RAPD

–

n. d.

IX

9

–

n. d.

IX

9

9

15,3

m

21

RFLP

RAPD

VIIIc

8

n. d.

VIIIc

8

VIIIc

8

n. d.

VIIIc, VIIId

8

10

12,9

w

19,5

RFLP

RAPD

n. d.

–

–

X

10

n. d.

–

11

15,3

m

---

RFLP

XI

n. d.

XI, XII

n. d.

n. d.

n. d.

12

14,4

w

14,5

RFLP

–

XIII

XIII, XIV

XIII, XV, XVI

XIII, XV, XVI

XIII, XIV, XV, XVI

13

9,1

m

20

RFLP

–

n. d.

XVII

–

n. d.

–

14

6,4

w

19

RFLP

–

XVIII

XVIII

–

n. d.

XVIII

15

8,7

w

16

RFLP

XVIII

XVIII

XVIII

–

XVIII

XVIII

16

16,3

m

19

RFLP

–

–

–

–

XIX

XIX

17

5,2

w

18

RFLP

–

–

–

–

n. d.

XX

18

14,4

w

21,5

RFLP

XXI

XXI

XXI

n. d.

+^D

+

Tabelle 3: Patientendaten und Ergebnisse der Genotypisierung der P. aeruginosa-Isolate. Bei den Patienten Nr. 11 bis 18 wurde keine RAPD-Analyse durchgeführt. RFLP-Typen sind mit lateinischen Zahlen, RAPD-Typen mit arabischen Zahlen bezeichnet. Subtypen (klonale Verwandtschaft) sind durch Kleinbuchstaben dargestellt.

Die regelmäßig durchgeführten Lungenfunktionsuntersuchungen zeigten bei den Patienten mit Pseudomonas-Nachweis über den Untersuchungszeitraum von je 18 Monaten einen mittleren Abfall des FEV₁ von 95% auf 87% des Solls.

Sensitivität, Spezifität und prädiktive Werte der mikrobiologischen Kulturen aus dem oberen Respirationstrakt sind in Tabelle 4 dargestellt. Die BAL wurde als Goldstandard definiert.

^APositiver prädiktiver Wert, ^BNegativer prädiktiver Wert

%

Sensitivität

Spezifität

PPW^A

NPW^B

Rachenabstrich

36

96

83

74

Nicht-Sputumproduzenten

Sputumproduzenten

40

100

100

46

Sputum

92

100

100

94

Sputumproduzenten

Tabelle 4: Sensitivität, Spezifität und prädiktive Werte (gerundete Prozentwerte).

Die Genotypisierung der Pseudomonas-Isolate erfolgte mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese nach DNA-Makrorestriktion des bakteriellen Genoms mit dem Restriktionsenzym Spe I sowie mittels RAPD-Analyse unter Verwendung unterschiedlicher Primer. Sowohl RAPD als auch RFLP waren zu 100% in der Lage, einen Fingerprint für jedes Pseudomonas-Isolat zu erzeugen. Die Diskriminationsfähigkeit der RAPD, zwischen unterschiedlichen Stämmen zu unterscheiden, war für die meisten der getesteten Primer ähnlich hoch (Tabelle 5). Lediglich die 10-mer Primer 208 und 272 erzeugten viele Artefakte, und die Wiederholung der PCR aus demselben DNA-Ansatz führte häufig zu unterschiedlichen Bandenmustern. Darüber hinaus stimmten die Typisierungsmuster, die mittels 10-mer Primer generiert wurden, nur unzureichend mit denen der anderen Primer und der RFLP überein. Die anderen vier Primer zeigten eine gute Reproduzierbarkeit der DNA-Polymorphismen. Gelegentlich wurden leichte Abweichungen in der Stärke der Bandenmuster beobachtet, ebenso wie gelegentlich durch Artefakte bedingte Abweichungen einiger Minor-Banden. Der Primer M13 uni wurde für die weiteren RAPD-Analysen benützt, da er unter allen getesteten Primern die höchste Reproduzierbarkeit besaß und in der Regel eine hohe Anzahl an Amplifikationsprodukten generierte. Insgesamt stellte die RAPD eine schnelle und sichere Methode zur Identifikation unterschiedlicher Stämme dar.

Die DNA-Makrorestriktionsanalyse zeigte in unseren Untersuchungen ebenfalls ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit und Diskriminationsfähigkeit. Die Reproduzierbarkeit beider Typisierungstechniken ist in Tabelle 5 dargestellt. Für die RAPD-Analyse war die Reproduzierbarkeit signifikant niedriger als für die DNA-Makrorestriktion (p = 0,018).

Primer/ Enzym

Beschreibung und Sequenz/

Schnitt bei Sequenz (5´ zu 3´)

Diskriminations-fähigkeit

Reproduzierbarkeit in mittleren %

208

ACGGCCGACC

variabel

53

272

AGCGGGCCAA

variabel

64

T3B

t-DNA intergenic spacer region

AGGTCGCGGGTTCGAATCC

hoch

91

(GTG)₅

GTGGTGGTGGTGGTG

hoch

84

M13 core

Core-Sequenz des M13-Phagen

GAGGGTGGCGGTTCT

hoch

92

M13 uni

Universalsequenz des M13-Phagen

TTATGAAACGACGGCCAGT

hoch

95

Spe I

5`-ACTAGT

hoch

100

Tabelle 5: Charakterisierung, Diskriminationsfähigkeit und Reproduzierbarkeit der RAPD-Primer und des Restriktionsenzyms Spe I.

Bei drei Patienten (Nr. 6, 7 und 9) konnte die DNA-Makrorestriktionsanalyse genetische Alterationen in Form von Verlust oder Hinzugewinn einzelner Banden detektieren (RFLP-Typen VIIa und b bzw. VIIIa, b, c und d; Abbildung 1) und somit als jeweils genetisch verwandt klassifizieren, während die Isolate von der RAPD als genetisch identisch eingestuft wurden.

Abbildung 1: (a) PFGE und (b) RAPD Fingerprints von P. aerugoinosa-Isolaten aus dem Respirationstrakt von Patient Nr. 9. Eine neue Bande (ungefähre Größe 125 kb) war bei einem der beiden Isolate aus der BAL zum Zeitpunkt t₂ durch die RFLP nachweisbar (Bahn 11), während durch die RAPD keine Unterschiede zwischen den Isolaten erkennbar waren (Isolate der Bahnen 1 bis 5: Rachenabstrich zu t_1, Bahnen 6 und 7: BAL zu t₁, Bahnen 8 und 9: Rachenabstrich zu t₂, Bahnen 10 und 11: BAL zu t₂). Bahn R: P. aeruginosa-Referenzstamm, Bahn M: Molekularer Größen-Marker (Größenangabe in Kilobasen).

77 der 80 P. aeruginosa-Isolate wurden mittels Genotypisierung charakterisiert, für drei Isolate lagen aus organisatorischen Gründen keine Typisierungsdaten vor. Die Typisierungsergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Bei acht Patienten wurden die Isolate lediglich mittels DNA-Makrorestriktion, bei allen anderen zusätzlich durch eine RAPD typisiert.

Jeder Pseudomonas-positive Patient war von mindestens einem wirtstypischen Stamm kolonisiert. Die Patienten Nr. 4 und 5 waren zum zweiten Untersuchungszeitpunkt mit einem identischen Isolat infiziert. Ob dies durch eine Patient-zu-Patient-Transmission oder eine gemeinsame Infektionsquelle bedingt ist, konnte nicht geklärt werden. In der zweiten BAL wurde bei Patient Nr. 7 der wirtstypische Stamm von Patient Nr. 8 nachgewiesen, was auf eine Übertragung schließen lässt. Bei Patienten Nr. 7 und 9 wurden darüber hinaus genetisch verwandte Stämme in den Atemwegen nachgewiesen. Dies wäre durch eine früher zurückliegende Infektion an einer gemeinsamen Quelle und unterschiedliche genetische Anpassungsmechanismen im Laufe der Zeit erklärbar. Patienten Nr. 14 und 15 sind Geschwister und beherbergten genetisch identische Isolate in den Atemwegen.

In neun bzw. zehn Fällen war ein Vergleich der Genotypen zwischen Rachenabstrich und BAL bzw. Sputum und BAL möglich. Die Genotypen der Pseudomonas-Isolate, welche mittels Bronchoskopie gewonnen wurden, unterschieden sich von denen des oberen Respirationstrakts in bis zu 56% der Fälle (Tabelle 6). Bei einigen Patienten waren die unterschiedlichen Isolate wie unten beschrieben miteinander verwandt, während die BAL bei den Patienten Nr. 7, 11 und 12 zusätzliche, mit dem wirtstypischen Isolat genetisch nicht verwandte Stämme detektierte.

Bei Patient Nr. 5 wurde ein neuer Stamm im Rachenabstrich zum zweiten Untersuchungszeitpunkt kultiviert, während der erstkolonisierende Stamm über den gesamten Untersuchungszeitpunkt in der Lunge persistierte. Die Genotypisierung dieser Isolate deutete eher auf eine Co-Infektion als auf eine Mutation des alten Stammes, da sich das Bandenmuster in mehr als 6 Banden unterschied (Abbildung 2).

Bronchoskopie

Anzahl der Untersuchungen mit

identischen Isolaten

unterschiedlichen Isolaten

Rachenabstrich

4/9

5/9

Sputum

6/10

4/10

Tabelle 6: Vergleich der Genotypen aus verschiedenen Proben des Respirationstrakts innerhalb desselben Individuums.

Abbildung 2: (a) PFGE und (b) RAPD Fingerprints von P. aerugoinosa-Isolaten aus dem Respirationstrakt von Patient Nr. 5. Ein neuer Stamm wurde aus dem Rachenabstrich zu t₂ isoliert (Bahn 5), während die Isolate von t₁ (Bahn 1: Rachenabstrich, Bahn 2: Sputum, Bahnen 3a/b und 4: BAL) und die Isolate aus den tiefen Atemwegen zu t₂ (Bahnen 6 und 7: BAL) identisch waren. Bahn M: Molekularer Größen-Marker.

Verlust oder Hinzugewinn von einzelnen Restriktionsbanden in der RFLP wurde bei einigen Stämmen in der BAL bei den Patienten Nr. 6, 7 und 9 beobachtet, was auf eine nahe Verwandtschaft zu den initial kolonisierenden Isolaten hindeutet (Abbildung 1). Bei acht Patienten konnten longitudinale genetische Veränderungen nachgewiesen werden (Tabelle 7). Mittels DNA-Makrorestriktion konnte ein Hinzugewinn von neuen Stämmen in vier Untersuchungen gezeigt werden.

Anzahl der Patienten mit

Stammpersistenz

Stammverlust

Stammaustausch

ohne Änderung

und zusätzlichem Stamm

verwandt

unverwandt

3/8

1/8

3/8

0/8

1/8

Tabelle 7: Longitudinale genetische Veränderungen des PFGE-Genotyps, unabhängig vom Ort des Erregernachweises.

Ein Austausch des kolonisierenden Stammes war bei Proband Nr. 3 evident, der seinen wirtstypischen Pseudomonas-Stamm zum zweiten Untersuchungszeitpunkt verloren hatte, jedoch mit einem neunen, genetisch unverwandten Stamm infiziert war (Abbildung 3). In vier Fällen waren diese longitudinalen Alterationen des Genotyps ausschließlich mit bronchoskopisch gewonnenen Proben nachweisbar (Patienten Nr. 3, 7, 9 und 12).

Abbildung 3: (a) PFGE und (b) RAPD Fingerprints von P. aerugoinosa-Isolaten aus dem Respirationstrakt von Patient Nr. 3. Ein neuer Stamm war in der BAL zu t₂ nachweisbar (Bahn 4), während der ursprüngliche Stamm nicht mehr nachweisbar war (Bahnen 1, 2 und 3: BAL zu t₂). Bahn H: Leerprobe, Bahn R: Pseudomonas-Referenzstamm, Bahn M: Molekularer Größen-Marker.