Sequentielle Genotypisierung von Pseudomonas aeruginosa-Isolaten und Übereinstimmung von bakteriologischen Proben aus dem oberen und unteren Respirationstrakt von Patienten mit Cystischer FibroseAndreas Jung1 Einleitung1.1 Stand der Forschung1.1.1 Cystische Fibrose: Historisches11.1.2 Pathophysiologie der Atemwege21.1.3 Pulmonale Infektion mit P. aeruginosa 1.1.4 Mikrobiologische Probengewinnung1.1.5 Typisierung von P. aeruginosa 31.2 Aufgabenstellung42 Material und Methoden2.1 Patientenkollektiv, Ein- und Ausschlusskriterien42.2 Probenentnahme2.2.1 Untersuchungszeitpunkte, Art der Proben52.2.2 Bronchiallavage2.2.3 Mikrobiologische Anzucht und Identifizierung62.3 Genotypisierung (Genetisches Fingerprinting)2.3.1 Phenol-Chlorophorm-Extraktion der genomischen DNA2.3.2 Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)-Analyse72.3.3 DNA-Makrorestriktion und Pulsfeld-Gelelektrophorese82.4 Auswertung der Ergebnisse und Biometrie93 Ergebnisse3.1 Mikrobiologische Kulturen und Lungenfunktionsdaten910113.2 Vorhersagewerte der Atemwegsproben123.3 Vergleich der Typisierungsmethoden13605#6573.4Pseudomonas-Stämme und Subtypen1415605#6671617605#6794 Diskussion174.1 Diagnostische Wertigkeit von mikrobiologischen Kulturen18194.2 Methoden der Genotypisierung204.3 Intraindividuelle und longitudinale Variabilität der Pseudomonas-Genotypen21225 Zusammenfassung2223AbkürzungsverzeichnisLiteraturverzeichnisDanksagungLebenslaufPublikationenEidesstattliche ErklärungdeInhaltsverzeichnisHilfeAus der Klinik für Pädiatrie m. S. Pneumologie / Immunologie
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin BerlinDissertationSequentielle Genotypisierung von <em>Pseudomonas aeruginosa</em>-Isolaten und Übereinstimmung von bakteriologischen Proben aus dem oberen und unteren Respirationstrakt von Patienten mit Cystischer FibroseZur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlinvon
Andreas Jung aus München Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul Prof. Dr. med. Karl P. Paul Prof. Dr. med. Antje Schuster Prof. Dr. med. Gesine Hansen Datum der Promotion: 21. Oktober 2005

Gewidmet meinen Eltern, in Dankbarkeit und Anerkennung.

 Abstract

Die Frage nach adäquaten mikrobiologischen und molekulargenetischen Methoden, um die Kolonisation des Respirationstrakts von Mukoviszidose-Patienten mit Pseudomonas aeruginosa nachzuweisen und zu charakterisieren, wird kontrovers diskutiert.

Von 38 klinisch stabilen Patienten mit cystischer Fibrose (CF) wurden sequentiell im Abstand von 18 Monaten Proben aus Rachenabstrich, Sputum und Bronchiallavage (BAL) entnommen und bezüglich Pseudomonas-Nachweis untersucht. Die Pseudomonas-Stämme wurden mittels Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)-Analyse und Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) von DNA-Makrorestriktionsfragmenten typisiert und bezüglich der Frage nach genetisch divergierenden Isolaten innerhalb des selben Individuums sowie nach möglichen longitudinalen genetischen Veränderungen evaluiert.

Sensitivität, negative und positive prädiktive Werte und Spezifität, um eine P. aeruginosa-Besiedlung zu erkennen, waren 36%, 74%, 83% und 96% im Falle der Kulturen aus dem Oropharynx von nicht-expektorierenden Patienten und 92%, 94%, 100% und 100% für Sputumkulturen von expektorierenden Probanden. RAPD-Analyse und PFGE waren in der Lage, zwischen unterschiedlichen Pseudomonas-Stämmen zu diskriminieren, wobei nur die DNA-Makrorestriktion zwischen Subtypen unterscheiden konnte. Die Genotypen der Pseudomonas-Isolate aus Rachenabstrich und Sputum divergierten in 55% und 40% zu den Isolaten der BAL. Longitudinale Variationen des Genotyps wurden in 62% der Fälle beobachtet, die Hälfte davon war nur mittels bronchoskopisch gewonnener Proben erkennbar.

Zusammengefasst besitzen Sputumproben bezüglich des Pseudomonas-Nachweises dieselbe Wertigkeit wie Kulturen aus der BAL, während Rachenabstriche in einer frühen Krankheitsphase für die Charakterisierung der bakteriellen Flora des unteren Respirationstrakts wenig geeignet sind. Die Methode der DNA-Makrorestriktion kann als zuverlässige Technik für epidemiologische Untersuchungen empfohlen werden. Unterschiedliche Genotypen innerhalb desselben Individuums und longitudinale genetische Alterationen sind häufig, jedoch unter Umständen nur bronchoskopisch nachweisbar.

 Cystische Fibrose Bronchiallavage Pseudomonas aeruginosa Pulsfeld-Gelelektrophorese Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus Random Amplified Polymorphic DNA-Analyse Polymerasekettenreaktion Abstract

There is controversy about adequate specimen to detect and characterise colonisation of cystic fibrosis (CF) airways by Pseudomonas aeruginosa.

Oropharyngeal, sputum and bronchoalveolar lavage (BAL) samples were evaluated sequentially from 38 stable CF patients for the detection of P. aeruginosa. Pseudomonas strains were typed by random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) of DNA macrorestriction fragments. The occurrence of genetically different isolates within the same host and longitudinal variations in the genotype during repeated examinations was assessed.

Sensitivity, negative and positive predictive values and specificity to detect P. aeruginosa were 36%, 74%, 83% and 96% for oropharyngeal cultures in non-expectorating patients and 92%, 94%, 100% and 100% for sputum cultures from expectorating patients, respectively. RAPD analysis and PFGE were suitable to characterize P. aeruginosa CF isolates, although only DNA macrorestriction was able to distinguish between identical and closely related strains. Genotypes of Pseudomonas isolates recovered from oropharyngeal swabs and sputum differed to the strains recovered by bronchoscopy in 55% and 40%, respectively. In 62% longitudinal variations in the genotype occurred. Half of these alterations were only detectable from bronchoscopically obtained samples.

In conclusion, sputum samples have the same value as specimens from BAL to detect P. aeruginosa colonisation, whereas cultures from the oropharynx are not suitable for characterising the bacterial conditions in the CF lungs in an early disease state. DNA macrorestriction is recommended as an excellent tool for epidemiological investigations. Different genotypes within the same host and longitudinal genetic alterations are common and may be detectable in the BAL fluid exclusively.

 Cystic fibrosis, bronchoalveolar lavage Pseudomonas aeruginosa pulsed-field gel electrophoresis restriction fragment length polymorphism random amplified polymorphic DNA analysis polymerase chain reaction Inhaltsverzeichnis

  • 1 Einleitung

    • 1.1 Stand der Forschung

      • 1.1.1 Cystische Fibrose: Historisches

      • 1.1.2 Pathophysiologie der Atemwege

      • 1.1.3 Pulmonale Infektion mit P. aeruginosa

      • 1.1.4 Mikrobiologische Probengewinnung

      • 1.1.5 Typisierung von P. aeruginosa

    • 1.2 Aufgabenstellung

  • 2 Material und Methoden

    • 2.1 Patientenkollektiv, Ein- und Ausschlusskriterien

    • 2.2 Probenentnahme

      • 2.2.1 Untersuchungszeitpunkte, Art der Proben

      • 2.2.2 Bronchiallavage

      • 2.2.3 Mikrobiologische Anzucht und Identifizierung

    • 2.3 Genotypisierung (Genetisches Fingerprinting)

      • 2.3.1 Phenol-Chlorophorm-Extraktion der genomischen DNA

      • 2.3.2 Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)-Analyse

      • 2.3.3 DNA-Makrorestriktion und Pulsfeld-Gelelektrophorese

    • 2.4 Auswertung der Ergebnisse und Biometrie

  • 3 Ergebnisse

    • 3.1 Mikrobiologische Kulturen und Lungenfunktionsdaten

    • 3.2 Vorhersagewerte der Atemwegsproben

    • 3.3 Vergleich der Typisierungsmethoden

    • 3.4Pseudomonas-Stämme und Subtypen

  • 4 Diskussion

    • 4.1 Diagnostische Wertigkeit von mikrobiologischen Kulturen

    • 4.2 Methoden der Genotypisierung

    • 4.3 Intraindividuelle und longitudinale Variabilität der Pseudomonas-Genotypen

  • 5 Zusammenfassung

  • Abkürzungsverzeichnis

  • Literaturverzeichnis

  • Danksagung

  • Lebenslauf

  • Publikationen

  • Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

  • Tabelle 1: PCR-Reaktionsgemische und PCR-Protokolle für 50 μl-Ansätze.

  • Tabelle 2: Anzahl n der mikrobiologischen Kulturen aus den Atemwegen der Patienten mit und ohne Pseudomonas-Nachweis zu beiden Untersuchungszeitpunkten (P+ und P–). Die Prozentangaben beziehen sich auf die Gesamtanzahl der Patienten.

  • Tabelle 3: Patientendaten und Ergebnisse der Genotypisierung der P. aeruginosa-Isolate. Bei den Patienten Nr. 11 bis 18 wurde keine RAPD-Analyse durchgeführt. RFLP-Typen sind mit lateinischen Zahlen, RAPD-Typen mit arabischen Zahlen bezeichnet. Subtypen (klonale Verwandtschaft) sind durch Kleinbuchstaben dargestellt.

  • Tabelle 4: Sensitivität, Spezifität und prädiktive Werte (gerundete Prozentwerte).

  • Tabelle 5: Charakterisierung, Diskriminationsfähigkeit und Reproduzierbarkeit der RAPD-Primer und des Restriktionsenzyms Spe I.

  • Tabelle 6: Vergleich der Genotypen aus verschiedenen Proben des Respirationstrakts innerhalb desselben Individuums.

  • Tabelle 7: Longitudinale genetische Veränderungen des PFGE-Genotyps, unabhängig vom Ort des Erregernachweises.

Bilder

  • Abbildung 1: (a) PFGE und (b) RAPD Fingerprints von P. aerugoinosa-Isolaten aus dem Respirationstrakt von Patient Nr. 9. Eine neue Bande (ungefähre Größe 125 kb) war bei einem der beiden Isolate aus der BAL zum Zeitpunkt t2 durch die RFLP nachweisbar (Bahn 11), während durch die RAPD keine Unterschiede zwischen den Isolaten erkennbar waren (Isolate der Bahnen 1 bis 5: Rachenabstrich zu t1, Bahnen 6 und 7: BAL zu t1, Bahnen 8 und 9: Rachenabstrich zu t2, Bahnen 10 und 11: BAL zu t2). Bahn R: P. aeruginosa-Referenzstamm, Bahn M: Molekularer Größen-Marker (Größenangabe in Kilobasen).

  • Abbildung 2: (a) PFGE und (b) RAPD Fingerprints von P. aerugoinosa-Isolaten aus dem Respirationstrakt von Patient Nr. 5. Ein neuer Stamm wurde aus dem Rachenabstrich zu t2 isoliert (Bahn 5), während die Isolate von t1 (Bahn 1: Rachenabstrich, Bahn 2: Sputum, Bahnen 3a/b und 4: BAL) und die Isolate aus den tiefen Atemwegen zu t2 (Bahnen 6 und 7: BAL) identisch waren. Bahn M: Molekularer Größen-Marker.

  • Abbildung 3: (a) PFGE und (b) RAPD Fingerprints von P. aerugoinosa-Isolaten aus dem Respirationstrakt von Patient Nr. 3. Ein neuer Stamm war in der BAL zu t2 nachweisbar (Bahn 4), während der ursprüngliche Stamm nicht mehr nachweisbar war (Bahnen 1, 2 und 3: BAL zu t2). Bahn H: Leerprobe, Bahn R: Pseudomonas-Referenzstamm, Bahn M: Molekularer Größen-Marker.