1 Einleitung und Aufgabenstellung

1.1 Einleitung

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Die lebende Zelle besteht aus einer Unzahl chemischer Substanzen, welche miteinander interagieren und so neue Verbindungen entstehen lassen. Unter diesen befinden sich Nukleinsäuren (DNA, RNA) die unter anderem beim genetischen Code und der Proteinbiosynthese eine wesentliche Rolle spielen. Die molekulare Erkennung ist in vielen fundamentalen biologischen Prozessen, wie Katalyse, Regulation und Signaltransduktion von entscheidender Bedeutung. Diese drei Prozesse werden ebenfalls von der RNA ausgeübt, wodurch sie unter dem Stichpunkt „It’s an RNA World“ eine Schlüsselrolle in der Entstehung des Lebens zugeschrieben bekommen hat(Copley et al., 2007 ;Corradini et al., 2007 ;Gilbert, 1986 ;Joyce, 2002 ). Aus all diesen Gründen besitzen Nukleosidderivate schon seit längerer Zeit eine große Bedeutung in der pharmazeutischen Industrie(Corradini et al., 2007;Corradini et al., 2007 ;Rosemeyer, 2004 ;Rosemeyer, 2005 ), der Biotechnologie(Barnes und Dickson, 2006 ;Hirao et al., 2006 ;Sturino und Klaenhammer, 2006 ) und selbst der Materialwissenschaft(Alberti et al., 2006 ;Beissenhirtz und Willner, 2006 ;Mao et al., 2000 ).

Durch diese vielfältigen Möglichkeiten der molekularen Erkennung der Nukleoside werden diesen Substanzen unterschiedliche Ansätze eingeräumt. So bietet der Einsatz von Nukleinsäurederivaten und/oder Oligonukleotiden einen therapeutischen Ansatz, um zum Beispiel in die Genexpression oder auch in die Genregulation einzugreifen. Zum einen kann man durch den Einbau von unnatürlichen Nukleosiden während der Transkription die Genexpression stoppen. Ein Beispiel hierfür ist Acyclovir, welches als Mittel gegen verschiedene Herpesviren eingesetzt wird (Herpes Simplex Virus Typ I/II (HSV-1/2), Varicella-Zoster-Virus (VZV), Epstein-Barr-Virus (EBV))(Fiddian, 1995 ;Kulikowski, 1994 ;Kussmann-Gerber et al., 1999 ). Seine Wirksamkeit besteht darin, dass es in der Zelle zuerst durch die virale Thymidinkinase, welche 3000-mal aktiver ist, als die zelluläre Thymidinkinase, phosphorylisiert wird. Anschließend fügt es sich als Acyclo-GTP in die virale DNA ein, was während der Translation zum Kettenabbruch führt.

Abbildung 1: Strukturen von Acyclovir (links) und Acyclo-GTP (rechts)

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Zum anderen kann man mittels RNA-Interferenz (siRNA, microRNA)(Corey, 2007 ;Fire et al., 1998 ;Manoharan, 2004 ) direkt in die Proteinbiosynthese eingreifen. Das Prinzip besteht darin, dass die mRNA, welche das entsprechende Gen codiert in ihrer Translation durch die siRNA oder microRNA blockiert wird. Der Unterschied zwischen der siRNA und der microRNA bestehe in ihrer Herkunft. Die microRNA wird auf eigenen pri-miGenen codiert, welche durch bestimmte Enzyme pri-microRNA, in Form von Hairpinstrukturen, transkribieren. Die siRNA stammt aus Transposons oder viralen Quellen. SiRNA und microRNA werden durch das Enzym „Dicer“ aus den entsprechenden dsRNA herausgeschnitten (ca. 21 nucleotidlange Doppelstränge) und anschließend unter ATP-Verbrauch entwunden und in einen sense und einen ant i sense-Strang gespalten. Die „reifen“ RNAs binden darauf an den RISC–Komplex (RNA-induced silencing complex). An den sense–Strang kann sich sodann komplementär die entsprechende mRNA binden (s. Abb. 2). Da sich im RISC-Komplex RNA–Helicase- und Nuklease-Aktivitäten befinden, wird die mRNA entwunden und durch die Nukleasen gespalten. Sie steht demnach nicht mehr der Proteinbiosynthese zu Verfügung. Eine genauere Beschreibung des Mechanismuses gibt Sontheimer in seinem in „Nature“ veröffentlichten Artikel wieder(Sontheimer, 2005 ).

Abbildung 2: SiRNA (microRNA) und mRNA im RISC-Komplex (aus MedGadget, 2005)

Ein Problem bei der Applikation von Wirkstoffen wie Acyclovir oder auch von synthetischen siRNA besteht in der Bioverfügbarkeit der Substanzen in den Zellen.

1.2 Interaktion von Substanzen mit biologischen Membranen

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Während lipophile Botenstoffe die Lipidmembran von Zellen leicht passieren können, ist das für hydrophile Signalstoffe (bis auf kleine, ungeladene Moleküle wie CO2 oder Harnstoff), wie vor allem polyanionische hydrophile Oligonukleotide, deutlich schwieriger. Dies ist meist biochemisch nur durch membrandurchspannende Rezeptoren möglich, welche das entsprechende Signal in das Zellinnere weitergeben können. Die für die Signaltransduktion verantwortlichen Rezeptoren werden in zwei Klassen eingeteilt:

Zu der einen gehören unter anderem die Steroidrezeptoren. Man spricht hier von intrazellulären Rezeptoren, denn der Ligand muss dafür die Zellmembran permeieren.

Die zweite Klasse stellen die Transmembranrezeptoren dar, welche in verschiedene Unterarten unterteilt werden, zu denen unter anderem die Ionenkanäle gehören. Diese transmembranen Proteine binden einen Signalstoff, wodurch eine Öffnung des Kanals für bestimmte Ionen induziert wird. Weiterhin sind Enzym-gekoppelte Rezeptoren transmembrane Proteine bekannt. Diese binden Signalmoleküle, wodurch eine Konformationsänderung eine Autophosphorylierung der einzelnen Rezeptoren bewirkt, so dass das Signal ins Zellinnere weitergeleitet wird. Häufig handelt es sich bei diesen um Tyrosinkinase-gekoppelte Rezeptoren. Die dritte Art der membranen Proteine bilden die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, welche ein Signal über Guaninnukleotidbindende Proteine in die Zelle transportieren. Dabei veranlasst der Rezeptor den Austausch von GDP gegen GTP, wodurch ein Zerfall des G-Proteins erfolgt. Makromoleküle, wie Peptide oder Proteine werden über rezeptorvermittelte Endocytose in die Zelle aufgenommen. Jedoch gibt es für die DNA kaum natürliche Möglichkeiten eines Zelltransfers (eine Ausnahme wäre z.B. die Plasmabrücke bei Bakterien). Da viele Wirkstoffe ihre Information weder durch Signaltransduktion, noch durch biologische Kanäle an das Zellinnere übertragen können, gilt es, an anderen Wegen der Signalübertragung zu forschen.

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Eine Alternative, die Verankerung und eventuell darauf basierend den Durchtritt einer Nukleinsäure durch eine Lipidmembran zu erzielen, besteht in der kovalenten Verknüpfung von Nukleinsäuren bzw. Nukleosiden mit Lipidresten. Derartige Konjugate aus Nukleobase, Nukleosid, Nukleotid oder Oligonukleotid und Lipid bezeichnet man als Nukleolipid(Smrt und Hynie, 1980 ). Ein in der Natur weit verbreitetes Nukleolipid ist das Cytidindiphosphatdiacylglycerol (s. Abb. 3), welches bei der Glycerollipidbiosynthese die Diphosphatdiacylglycerolgruppe auf einen Zucker oder ein Protein übertragen kann und sich somit die anionischen Phospholipide, wie das Cardiolipidin, das Phosphatidylglycerin oder das Phosphatidylinisitol bilden.

Abbildung 3: Struktur von Cytidindiphosphatdiacylglycerol

Auch sind seit längerer Zeit weitere monomere Nukleolipide bekannt, welche aus natürlichen Quellen isoliert und charakterisiert worden sind, wie z.B. das antibakterielle Tunicamicyn oder das antifunginale Septacidin(Rosemeyer, 2004). Die meisten der in der Natur vorkommenden Nukleolipide hemmen oder fördern die Bildung von Membranbestandteilen, wahrscheinlich weil sie selbst mit Hilfe des lipohilen Restes an Membranen binden können. Mitte der 80er Jahre kombinierten verschiedene Arbeitsgruppen pharmakologisch aktive Nukleoside wie 5-Fluor-2´-desoxyuridin (Zytostatikum in der Krebstherapie) kovalent mit Lipiden, welche aggregieren können. Diese Konjugate wurden in Liposomen eingebaut und anschließend in Zellen eingeschleust. Man beobachtete, dass das Liposom dabei eine verlangsamte Abgabe des Pharmastoffes hervorruft und ihn vor der enzymatischen Spaltung schützt. Damit stieg die Bioverfügbarkeit einiger Wirkstoffe, z.B. des derivatisierten 5-Fluoruracils, um das 2 bis 8-fache(Schwendener et al., 1985 ). Jedoch gelang dies nicht bei allen Wirkstoffen. Um z.B. die Bioverfügbarkeit, welche bei Acyclovir nur bei 10-20% liegt, zu erhöhen, stellten Rosemeyer et al.(Rosemeyer et al., 1985 ) und auch Welch et al.(Welch et al., 1985 ) Derivate dieses Wirkstoffes dar. In-vitro-Versuche zeigten einen ID5 0 von 1 μM gegenüber HSV-1. In-vivo-Tests wiesen aber keinen therapeutischen Nutzen auf.

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Abbildung 4: Lipohile Acyclovirderivate nach Rosemeyer et al.(Rosemeyer et al., 1985 ) (rechts) und Welch et al.(Welch et al., 1985 ) (links)

Auch die in der HIV-Therapie eingesetzten nukleosidischen Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (NRTI) Zidovudin (3´-Azido-3´-desoxythymidin) oder Cordycepin (3´-Desoxyadenosin) wurden unter anderem von Pfleiderer et al.(Sigmund und Pfleiderer, 1996;Wasner et al., 1996;Wasner et al., 1996 ) an 5´- Position mit einem lipohilen Glycerolphosphatrest verknüpft, um die Zellmembrandurchlässigkeit zu erhöhen und die Toxität zu verringern.

In gleicher Weise war der Transport von siRNA problematisch und konnte u.a. mit Hilfe von Vektoren(Opalinska und Gewirtz, 2002: ;Schakowski et al., 2007: ;Schroff, 2007 ), welche als „Carrier“ einen Membrandurchtritt ermöglichen, erfolgen. Beispiele hierfür sind Phagen, virale Vektoren (retrovirale Transduktion) oder Nanopartikel(Vijayanathan et al., 2002 ). Eine weitere Möglichkeit, um siRNA oder Antisenseoligonukleotide in die Zelle einzuschleusen, erreicht man durch Lipofection(Felgner et al., 1987 ).

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Abbildung 5: Mechanismus der DNA-Übertragung in die Zelle durch Lipofection nach(Li und Szoka, 2007 ;Xu und Szoka, 1996 )

Dabei kondensieren kationische Liposomen, bestehend aus Liposperminen, (Lipofectamine®, Transfectam® oder Lipofectin®) mit der DNA zu einem kationischem Partikel (Stufe 1 in der Abbildung 5). Durch Interaktion der äußeren Lipidschicht, dieses Lipoplexes, mit der Zellmembran wird die DNA, wie in den Stufen 2-4 dargestellt, in die Zelle übertragen.

Eine dritte Möglichkeit DNA oder RNA in die Zelle einzubringen, besteht in der Verwendung kurzer elektrischer Impulse und wird als Elektroporation bzw. Elektrotransfektion bezeichnet(Chu et al., 1987 ;Neumann et al., 1982 ). Diese Technik wurde inzwischen bei einem breiten Spektrum tierischer und pflanzlicher Zellen, sowie an Bakterien erfolgreich angewendet. Bei dieser Methode wird durch das Anlegen eines (oder mehrerer kurz aufeinander folgender) elektrischen Impulses die Permeabilität der Zellmembran kurzfristig so erhöht, dass auch größere DNA-Moleküle in die Zellen eindringen können. Auch mit Hilfe der Mikroinjektion konnte mRNA in kultivierte menschliche Zellen eingebracht werden. Jedoch sind diese Methoden lediglich in vitro oder ex vivo möglich.

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Manoharan et al.(Manoharan et al., 1997 ;Manoharan et al., 1997 ) konnten unter anderem zeigen, das die zelluläre Aufnahme von RNA durch die Verknüpfung mit verschiedenen lipophilen Resten (Cholesterol, Glycerolester, Alkylester) erhöht werden kann. Weiterführende Arbeiten von Soutschek und Manoharan(Soutschek et al., 2004 ) wiesen nach, dass lipophile siRNA (3´-Cholesterol-RNA) in in vivo–Versuchen an Mäusen die Reduktion der Target-mRNA (Gensilencing) hervorrufen, und zwar bedeutend stärker, als unkonjugierte siRNA. Den gleichen Ansatz verfolgten auch Unverzagt et al.(Lorenz et al., 2004 ) welche zur Bekämpfung des Hepatitis C-Virus verschiedene lipophile Anker am 5´-Ende von siRNA einführten und somit eine erhöhte Aufnahme in Leberzellen nachweisen und ebenfalls Gensilencing erzielen konnten.

Abbildung 6: Lipophile Anker nach Manoharan et al.(Manoharan et al., 1997 ;Manoharan et al., 1997 ) (links) und Unverzagt et al.(Lorenz et al., 2004 ) (rechts)

Die Grundidee der meisten Arbeiten auf diesen Gebiet bestand darin, die Nukleoside, Nukleotide oder Oligonukleotide mit einem lipophilen Rest zu versehen, um sie durch Membranen zu schleusen, damit sie besser als Wirkstoffe (NRTI) oder für die Antisense und RNAi-Therapie verfügbar sind.

1.3 Derzeitiger Stand der Forschung auf dem Gebiet der Nukleolipide

1.3.1  Synthese und Anwendung von Nukleolipiden

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Eine Übersicht über frühere Synthesen von Nukleolipiden, ihre supramolekularen Eigenschaften und auch ihren biomedizinischen Anwendungsmöglichkeiten gab Rosemeyer im Jahre 2005(Rosemeyer, 2005). Doch in jüngster Zeit ist das Interesse auf diesem Gebiet sehr stark gestiegen, so dass es zu vielen weiteren Publikationen kam.

Neben den Einsatz von Nukleolipiden als Therapeutika, können lipophile Oligonukleotide ebenfalls in der Biochiptechnologie zur Analytik biologisch relevanter Substanzen genutzt werden. So brachten unter anderem Willner et al.(Patolsky et al., 2001 ) einen DNA–Strang über einen Thiollinker auf eine Goldoberfläche auf. An diesen konnte sich die nachzuweisende DNA komplementär binden, wobei ein Teil des Analytstranges ungebunden blieb („sticky e nd“). Ein „DNA–tagged-Liposom“, lagerte sich schließlich an diesem „sticky end“ komplementär an. Der Nachweis des Analyten erfolgte schließlich mittels FIS (f aradaic i mpendance s pectroscopy). Durch die Bindung des „DNA–tagged-Liposom“ an den Analyten, kommt es zu einer wirkungsvollen Abdeckung der Elektrodenoberfläche, so dass keine Redoxreaktion zwischen FeIII/FeII ablaufen kann. Der Stromfluss ist somit unterbrochen (s. Abb. 7 A). Mit Hilfe der Microgravimetrie ließ sich eine weitere Erhöhung der Nachweisgrenze erzielen (1•10-13 M). Dabei bindet an dem DNA-Strang an der Goldoberfläche komplementär die nachzuweisende DNA, wobei ein Teil dieser ebenfalls ungebunden blieb („sticky e nd“). An diesem freien Ende bindet ein dritter mit Biotin markierter, komplementärer Strang. An das Biotin kann sich Avidin binden und daran ein biotinmarkiertes Liposom, an welches sich wieder Avidin binden kann usw.. Diese Gewichtszunahme kann mittels Microgravimetrie ermittelt werden (s. Abb. 7 B).

Abbildung 7: Signalverstärkung von DNA–Fragmenten nach Willner et al.(Patolsky et al., 2001 )

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Boxer et al.(Chan et al., 2007 ;Yoshina-Ishii und Boxer, 2003 ;Yoshina-Ishii et al., 2006 ;Yoshina-Ishii et al., 2005 ) immobilisierten lipophile „DNA-tagged-Vesicle“ an einer Glasoberfläche, indem sie diese über eine Doppelhelixbildung zweier komplementärer Oligonukleotide verbanden (s. Abb. 8). Dazu wurde die Glasoberfläche mit einer Phospholipiddoppelschicht versehen, in welchen die Oligonukleotidstränge mit terminalen Lipidanker  verankerten. Diese hybridisierten mit dem komplementären Strang A der „tagged-Vesicle“.

Abbildung 8: Schema des Verknüpfens funktionalisierter Vesikel auf Glass nach Boxer et al.(Chan et al., 2007 ;Yoshina-Ishii und Boxer, 2003 ;Yoshina-Ishii et al., 2006 ;Yoshina-Ishii et al., 2005 )

Da die Phospholipidmembran bei Raumtemperatur einem flüssigen Medium entspricht, können die Anker von lipophilen Oligonukleotiden (s. Abb. 9) zwischen zwei Liposomen wandern. Dieses Verhalten nutzen Vogel et al.(Jakobsen et al., 2008 ) aus, um mittels einer zugesetzten unmodifizierten DNA, Liposomen an einer „solid-supported-membrane“  zu binden. Durch die Bildung der Doppelhelix ist ein „Springen“ des lipophilen Ankers am Oligonukleotid inhibiert worden. Durch Erhöhung der Temperatur oberhalb der Schmelztemperatur des Duplexes, kommt es wieder zum Lösen des Liposomes von der „solid-supported-membrane“.

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Abbildung 9: Schematische Darstellung des DNA-vermittelten Ankern von Liposomen auf einer „solid-supported-membrane“(Jakobsen et al., 2008 ) (A und B). Nachweis der thermischen Reversibilität (C and D)

Einen ähnlichen Ansatz verfolgten auch Pfeiffer et al.(Olofsson et al., 2003 ;Pfeiffer und Hook, 2004 ;Pfeiffer und Hook, 2006 ) zum Nachweis von Membranproteinen über gebundene Lipidvesikel. Dabei versahen sie eine Quartzoberfläche mit einer Lipidmembran, in welche zwei komplementäre lipophile ODNs (s. Abb. 10 oben) verankert sind und eine Goldoberfläche mit Biotin-BSA (bovine serum albumin)/ Neutravidin, in welche sich biotinylierte Oligonukleotide verankern können. Somit konnte durch die Wahl der unterschiedlichen Oberflächen Bereiche mit verschiedenen Oligonukleotiden geschaffen werden. Vesikel, welche bestimmte Peptidbindungsdomänen (wie Biotin) enthalten, werden mit zwei komplementären lipophilen ODNs versehen. Das „sticky End“ der „vesi c leanchored - DNA“ kann entweder mit dem an der Quarz- oder der Goldoberfläche verankerten komplementären ODN eine Doppelhelix ausbilden (s. Abb. 10). Diese Helixbildung kann im Falle der lipidverankerten Oligonukleotide mittels der QCMD (Quartz Crystal Microb a lance Dissipation) ausgelesen werden. Dabei wird die Quartzplatte in Schwingung gebracht, deren Frequenz massenabhängig ist. Bei Änderung der Masse, durch Binden des komplementären Stranges, wird eine Frequenzänderung beobachtet.

Abbildung 10: Verwendetes ODN und deren schematischen Darstellung zur unterschiedlichen Bindung von Vesikeln nach Pfeiffer et al.(Olofsson et al., 2003 ;Pfeiffer und Hook, 2004 ;Pfeiffer und Hook, 2006 )

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Die Insertierung solcher lipophiler Oligonukleotide mit einem Cholesteroltetraethylenglycol-anker in Modellmembranen und die Hybridisierung mit komplementären Oligonukleotiden wurde von Baglioni et al.(Banchelli et al., 2008 ) mittels DLS-Messungen und der Elektrophorese nachgewiesen. Stengel et   al.(Stengel et al., 2008 ;Stengel et al., 2007 ) entwickelten diese Methode weiter, um zwei Vesikel ähnlich der SNARE–Protein-vermittelten Zellfusion miteinander zur Hemifusion und auch zur Fusion zu bringen. SNARE-Proteine (soluble N-Ethylmaleinimid-se nsitive factor attachment prot ein receptors) spielen eine Schlüsselrolle in der Fusion von biologischen Membranen. Sie bestehen aus einem hydrophoben, transmembranen C-Terminus und dem SNARE-Motiv, einer wasserlöslichen N-terminalen Domäne. Um die Fusion zweier Vesikel zu ermöglichen, bilden diese zunächst unstrukturierten SNARE-Motive sehr stabile Komplexe (s. Abb. 11), welche jeweils aus 4 SNARE-Proteinen bestehen. Die Bildung dieses Komplexes geht vom N-Terminus aus und zieht sich wie ein Reißverschluss in Richtung C-Terminus. Dies hat eine Verringerung des Abstands zwischen den beiden sich abstoßenden Membranen zur Folge. Durch die starke Verringerung des Membranabstandes kommt es zu einer resultierenden Hemifusion und anschließenden Fusion der Vesikel. Neben den SNAREs spielen auch Rab-Proteine eine Rolle bei der gerichteten Fusion von Vesikeln und Organellen.

Abbildung 11: Schematische Darstellung der Bindung von Vesikel an planaren Membranen durch A) SNARE-Proteine und B) lipophilen DNA-Doppelhelices nach Pfeiffer et al. und Boxer et al.(Chan et al., 2008 )

In den Arbeiten von Stengel et   al. wurden einzelne DNA-Stränge mit einem lipophilen terminalen Cholesterolrest als „Membrananker“ versehen, welche sich spontan in die Membran von Vesikeln einbauen. Zwei Vesikelsorten werden mit unterschiedlichen DNA-Helices versehen, deren beide Stränge unterschiedlich lang sind und zueinander komplementäre freie Enden besitzen (s. Abb. 12). Befinden sich zwei derartige Vesikel in räumlicher Nähe, so erfolgt eine Hybridisierung zwischen den Strängen der Vesikel. Diese beginnt vermutlich, ähnlich der SNARE–Protein-vermittelten Zellfusion, an den äußeren terminalen DNA-Resten und zieht sich in Richtung des lipophilen Cholesterol-Restes fort. Auf Grund dessen werden die Membranen in nahen Kontakt zueinander gezogen und es kommt zu einer Fusion der beiden Vesikel. Somit ist es gelungen, mit DNA-Molekülen den Mechanismus der SNARE–Protein-vermittelten Zellfusion(Sutton et al., 1998) zu modellieren. Die Wahl von zwei Cholesterolgruppen als Lipidanker ist entscheidend für eine vollständige Fusion. Dadurch wird ein Wandern der Doppelhelix zwischen den Vesikeln verhindert(Stengel et al., 2008 ).

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Boxer et al.(Chan et al., 2008 ) nutzen ebenfalls diesen SNARE-analogen-Mechanismus, um ein Vermischen der Inhalte zweier unterschiedlichen Vesikel nach der Fusion hervorzurufen.

Abbildung 12: DNA induzierte Vesikelfusion nach Stengel et al.(Stengel et al., 2008 ;Stengel et al., 2007 )

Eine weitere Möglichkeit siRNA an Vesikel zu binden und in Zellen zu transportieren, wurde kürzlich von Kim et   al.(Kim et al., 2008 ) vorgestellt (s. Abb. 13). Dabei nutzen sie die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen dem negativ geladenen Phosphatrückgrat des Oligonukleotides und einem von Cholesterol abgeleiteten quartären Ammoniumsalz. So bildeten sie aus den Lipidbestandteilen des Lipoproteins LDL und aus DC-Cholesterol(Gao und Huang, 1991 ) ein positiv geladenes Nanopartikel, an das sich die siRNA bindet.

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Abbildung 13: Schema des dargestellten Lipidmembrans aus Lipidbestandteilen des Lipoproteins LDL und des DC-Cholesterol und der anschließenden elektrostatischen Wechselwirkung mit der siRNA nach Kim et al.(Kim et al., 2008 )

Einen ähnlichen Schritt gingen Nielsen et al.(Shiraishi et al., 2006 ), welche PNA mit lipophilen Gruppen, wie Acridin, Pyren, Anthrachinon, Porphyrin usw. endständig versahen und mit Hilfe von kationischen Liposomen in Zellen einschleusen konnten. Auch Schneider et al.(Vernille et al., 2004) funktionalisierten PNA mit lipophilen Resten am Ende, um ihre Membrandurchgängigkeit zu erhöhen und um supramolekulares Verhalten an diesen Amphiphilen zu beobachten. Grinstaff et al.(Prata et al., 2008 ) setzten lipophile Peptide ein, welche in wässriger Umgebung Liposomen mit nur einer Lipiddoppelschicht bilden können, um so im Inneren der Liposomen siRNA in Zellen einzuschleusen. Bijsterbosch et al.(Bijsterbosch et al., 2002 ;Bijsterbosch et al., 2000;Rump et al., 1998 ) bedienten sich LDL als Transporter für eine Reihe von lipophilen onkogen gerichteten Antisense-Oligosträngen, welche in Zellen eingebracht werden sollen. Dazu verknüpften sie verschiedene lipophile Reste (Ölsäure, Cholansäure, Lithocholsäure, Chenodesoxycholsäure) an das 3´-Ende des Oligonukleotides (s. Abb. 14).

Abbildung 14: Lipophile Anker von Bijsterbosch et al.(Bijsterbosch et al., 2002 ;Bijsterbosch et al., 2000 ;Rump et al., 1998 )

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Zusätzlich zu den bereits erwähnten Arbeiten von Unverzagt et al., die 5´-cholersterolmodifizierte siRNA einsetzten, um Gensilencing zu erzielen (s. Abs. 1.1), zeigten Arbeiten von Manoharan et al.(Manoharan, 2004;Manoharan et al., 1992 ) und Wolfrum et a l.(Wolfrum et al., 2007 ), dass Oligonukleotide welche mit solchen Anker, wie Cholesterol oder längerkettigen Fettsäuren an 3´-Position verknüpft sind, siRNA in vivo in verschiedene Zellgruppen transportieren können und dort Gensilencing hervorrufen. Dabei stellte sich heraus, dass die Verwendung von phospholipid- und cholesterolreichen Lipoproteinen, wie LDL oder HDL, in denen der lipohile Rest verankert ist, entscheidend für den Transport der siRNA sind.

Mittels sogenannter „Antagomirs“(Krutzfeldt et al., 2005 ) ließen sich ebenfalls in vivo Gene ausschalten. Diese cholesterolkonjugierte ssRNA (s. Abb. 15) bindet dabei gezielt an die microRNA (miR-122) und greift somit in deren Expression ein. Interessanterweise regelte sie dabei nicht nur einige Gene ab, sondern aktivierte auch einige.

Abbildung 15: Struktur des „Antagomirs“ von Stoffel et al.(Krutzfeldt et al., 2005). Die 2´-Hydroxylgruppe der Ribose wurde durch eine Methoxygruppe ersetzt und einige der Phosphordiesterverknüpfung durch das Phosphorthioat

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Die Arbeitsgruppe um Silver et al.(Ahn et al., 2004 ) synthetisierten eine DNA, welche am 5´-Ende Fluorescein markiert war und am 3´-Ende einen Cholesterolrest trug. Dieses 25mer wurde verwendet um nachzuweisen, ob die Bindung des Cholesterols oder eher das Polyanionphosphatrückgrat des Oligonukleotides ausschlaggebend ist für die Inhibierung des HIV-1. Letztendlich zeigte sich, dass beide Faktoren eine wichtige Rolle in der Inhibierung spielen. Das Oligonukleotid bindet an die Zelle, wegen des lipohilen Restes und das Polyanionphosphatrückgrat verhindert eine Fusion der Zelle mit dem HIV-1 aufgrund elektrostatischer Wechselwirkung. Die Zugabe von DEAE (Diethylaminoethyl)-Dextran verringerte den inhibitorischen Effekt des ODN, denn bekanntermaßen erhöht DEAE-Dextran die Transfektionseffizienz von viraler DNA in Zellen(Mccutcha.Jh und Pagano, 1968 ). Arbeiten von Sugawara et al.(Shohda und Sugawara, 2006 ;Shohda et al., 2003 ) nutzen ein Cholesteryl-PEG-Phosphoramidit und zeigten, dass dieses in die Membran von GUVs inkorporiert und komplementäre DNA bindet. Mittels TritonX-100 konnte eine Fusion der GUVs hervorgerufen werden(Maru et al., 2008 ).

Viele Gruppen(Alam et al., 2008 ;Krieg et al., 1993 ;Lorenz et al., 2004 ;Manoharan, 2002 ;Wolfrum et al., 2007 ) konnten zeigen, das cholesterolgelabelte Oligonukleotide an Zellen binden können und auch die Infektion von HIV-1 in Zellen inhibieren können(Farooqui et al., 1991 ). Mittlerweile hat sich die Arbeit von 3´- oder 5´-cholesteroylmodifzierten ODN für Antisense oder siRNA therapeutische Zwecke soweit etabliert, dass man die für die Festphasensynthese benötigten Cholesteryl-TEG-Phosphoramidite und auch andere lipophile Phosphoramidite, käuflich erwerben kann (MedProbe, Glen   Research, Euroegenetec). Nicht desto trotz ist es notwendig an weiteren lipophilen Ankern zu forschen, welche unter Umständen eine stabilere Membranverankerung hervorrufen.

Einen anderen Weg zur Darstellung von lipophiler ODN als Arzneistoff ging die Gruppe um Scuito et al.(Chillemi et al., 2006 ), welche postsynthetisch ein Oligonukleotid enzymatisch mit einer Fettsäure verknüpften. Das Glycerol an der 5´-Position wurde dabei durch die Phosphoramiditsynthese eingeführt.

1.3.2 Verhalten von Nukleolipiden an Phasengrenzflächen

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In der Literatur wurde schon mehrfach beschrieben und auch nachgewiesen, dass bestimmte amphiphile Oligonukleotide und auch Nukleolipide in Membranen binden können(Lorenz et al., 2004;Rosemeyer, 2005 ;Scheidt et al., 2004). Oft blieb jedoch die Frage offen, ob das gebundene Oligonukleotid oder Nukleolipid mit komplementären Nukleinsäuren oder Oligonukleotiden Doppelstränge bilden kann.

In wässriger Umgebung sind die Nukleobasen von Wassermolekülen umgeben, was eine spezifische Base–Basen–Erkennung erschwert. Aus diesem Grunde werden solche Untersuchungen in nichtwässriger Umgebung durchgeführt oder in sogenannten „hydrophoben Käfigen“. Wohingegen bei der Duplexbildung der DNA die Anwesenheit von Wasser entscheidend ist. Der Grund hierfür liegt darin, dass die Wassermoleküle die elektrostatischen Wechselwirkungen des Phosphatrückgrates mit ihrem hohen Dipolmoment abschirmen. Die Basenpaarung selbst findet im Inneren der DNA statt, wo sich kaum Wassermoleküle befinden. Ahlers et al.(Ahlers et al., 1990 ) studierten an einer Reihe von Nukleolipiden die Orientierung und Erkennung an einer Luft–Wasser–Oberfläche an Langmuirfilmen. Alle untersuchten Nukleolipide bildeten stabile Monolayer. Dabei übte die Kopfgruppe (Nukleobase, Nukleosid) keinen Einfluss auf die Packung aus. Weiterhin wurde an lipophilen Uridinderivaten untersucht, ob die Nukleolipidmonolayer auch für eine Base–Basen–Erkennung von einzelnen Nukleosiden (s. Abb. 16) bzw. von Nukleotidsträngen (s. Abb. 17) in der Lage sind. Bei Messungen mit komplementärem Adenin konnten sie eine Wechselwirkung feststellen, aufgrund der Tatsache, dass sich die Packungsdichte des Monolayers verringerte. Auch nahm die Fläche pro Nukleolipid im Film stärker ab, als bei der Zugabe des nicht komplementären Thymidins. Bei Messungen mit poly(U) (s. Abb. 17) zeigte sich eine Wechselwirkung zwischen dem Nukleolipid und dem zugegebenen Oligonukleotidstrang, da sich bei Erhöhung des Oberflächendruckes, die Packungsdichte weniger stark verringert, als ohne Zugabe des komplementären Partners. Jedoch konnten die Autoren nicht erklären, ob die Wechselwirkungen über Wasserstoffbrückenbindungen oder über - Stacking hervorgerufen werden.

Abbildung 16: Oberflächendruck-Flächendiagramm des Uridinanaloga in einer Lösung von Monomeren bei 20°C A) kein Base; B) Adenin (0.01 mol/l); C) Thymin (0.01 mol/l)

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Abbildung 17: Oberflächendruck-Flächendiagramm des Adeninanaloga in einer Lösung mit Poly(U) bei 20°C PBS-Buffer Lösung (1.5•10-3 mol/l, pH 7.4) wurde für die Poly(U)-Phase verwendet A) keine Base; B) Poly (U) (1.5•10-5mol/l); C) Poly (A), (1.5•10-5mol mol/l)

In Arbeiten von Miao et al.(Huang et al., 2000 ;Miao et al., 2003 ) bzw. Kunitake et al.(Ariga und Kunitake, 1998 ;Kawahara et al., 1992 ) konnten Wechselwirkungen zwischen Nukleolipiden und ihren komplementären Basen an der Luft-Wasser–Oberfläche über Wasserstoffbrückenbindungen nachgewiesen werden. Daraufhin untersuchten Luisi et al.(Cruciani et al., 2004 ) anhand von MLVs, welche POP-Cyctidin und POP-Inosin beinhalteten, mittels HRMAS-NMR, ob sich innerhalb der Lipidmembran schon eine Watson-Crick-Basenpaarung ausbilden kann. Es stellte sich heraus, dass dem nicht so war (s. Abb. 18). Die Autoren wiesen aber auch darauf hin, das Liposomen nicht einem chemischem Gleichgewicht entsprechen, sondern eher als kinetische Fallen angesehen werden sollten, in deren Strukturen stabilisiert, separiert und so vor einer Änderung in einer energetisch ähnlichen konformellen Struktur geschützt werden.

Abbildung 18: Von Luisi et al.(Cruciani et al., 2004 )beobachtete Wechselwirkung zwischen den Proton 2Ino und 6Cyt durch (a) die nachgewiesenen Kreuzpeaks im 2D-NOESY-HR-MAS-NMR Spektrum, (b)Schema der klassischen Watson-Crick-Basenpaarung

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Nowick et al.(Nowick et al., 1993 ;Nowick et al., 1993 ) nutzen elektrostatische Wechselwirkungen, um die molekulare Erkennung von A-T Paaren in einer Mizelle zu untersuchen. Dabei synthetisierten sie (10-(1-Thyminyl)decyl)trimethylammoniumbromid und inkorporierten dieses in einer Mizelle bestehend aus SDS (sodium dodecyl sulfate). Mittels NMR–Titration mit Adenin, konnten sie eine Basenpaarung beobachten.

Arbeiten von Berndt et al.(Berndt et al., 1995 ) oder Pincet et al.(Pincet et al., 2001 ) konnten in verschiedenen Versuchsreihen mit lipophilen Derivaten von Nukleosiden die auftretenden Kräfte während den Wechselwirkungen nachweisen und messen. Dabei wurden die Nukleolipide als Langmuir–Blodgett-Schichten auf Glimmer-Oberflächen (Mica) aufgetragen. Die Bestimmung der Anziehungskräfte geschieht durch Messung der Kräfte zwischen den Schichten bei unterschiedlichen Abständen und anschließender Trennung der Basenpaare. Werden beide Oberflächen einander genähert, so entstehen erst ab einem Abstand von D < 60 nm Anziehungskräfte zwischen den Schichten. Diese Kräfte verursachen eine schnelle Abnahme des Abstandes auf D = 8.5 nm zwischen den Nukleobasen. Anschließend ist eine Abflachung der gebogenen Schichten bei einer Distanz von 4.5 nm zu beobachten. Der Abstand verringert sich abschließend nochmals auf 2 nm zwischen den komplementären Nukleobasen. Die Trennung der Basenpaare erfolgt erst bei einer Energie von 110 mN/m.

1.3.3 Supramolekulare Verhalten von Nukleolipiden

Die Assoziation von Molekülen zu übergeordneten Strukturen, wie u.a. Mizellen, Vesikeln, Gelen und Monolayern bezeichnet man als supramolekulares Verhalten. Auch Nukleolipide können, aufgrund ihres amphiphilen Charakters dieses Verhalten aufweisen(Berti, 2006).

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Barthelemey et al.(Barthelemy et al., 2005 ;Gissot et al., 2008 ;Moreau et al., 2004 ;Moreau et al., 2006 ;Moreau et al., 2006 ) und auch andere Gruppen(Berti et al., 1999 ;Yanagawa et al., 1989 ) konnten zeigen, dass Nukleolipide unter bestimmten Bedingungen ähnlich der DNA oder RNA helikale Stränge (s. Abb. 20) ausbilden können.

Abbildung 19: Einige Beispiele synthetischer Nukleolipide von Barthelemey et al.(Barthelemy et al., 2005 ;Gissot et al., 2008 ;Moreau et al., 2004 ;Moreau et al., 2006 ;Moreau et al., 2006 )

Abbildung 20: Model, welches die DNA-ähnliche helikale Struktur von DPUPC (I4) in Wasser zeigt a) zwei Moleküle DPUPC, die die Grundeinheit der helikalen Struktur bilden; b) Blick von oben auf den in c) dargestellten Strang (α ist dabei der hydrophile Phosphocholinrest, β die Uridineinheit und γ der hydrophobe Kern; d) Schemata der multilamellaren Selbstorganisation

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Ebenfalls solch eine Helixbildung beobachteten Aime´ et al.(Aime et al., 2007 ) mittels TEM; SEM und optischer Mikroskopie an Nukleotiden, welche in elektrostatische Wechselwirkungen mit tertiären, lipophilen Aminen getreten sind.

Abbildung 21: (A) Optische Mikroskopie (links oben), TEM (rechts oben) und SEM (rechts oben) – Bilder von linksgängiger Helicesbildung in reinen Wasser, durch Selbstaggregation von C14AMP (Struktur links). (B) Nach 3-4h beobachte Helixbildung aus den feinen Nadeln durch Aime´ et al.(Aime et al., 2007 )

Weiterhin wies die Gruppe um Barthelemey et al.(Campins et al., 2007 ) die Ausbildung von bandähnlichen Strukturen von Nukleolipiden mittels TEM, SEM, FT-IR und auch X-Ray Diffraktion nach (s. Abb. 22). Dabei synthetisierten sie verschiedene 3´-Alkylphosphat-2´-desoxynukleoside, welche in einen wässrigen Medium kollodial dispersiert wurden und die erwähnten supramolekularen Strukturen bildeten. Jüngste Arbeiten von Iwaura et   al.(Iwaura et al., 2007;Iwaura et al., 2003 ) zeigten, dass auch bolaamphiphile Nukleoside zur Ausbildung bandähnlicher Strukturen fähig sind.

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Abbildung 22: Modell für die Ausbildung von Bandstrukturen von Barthelemey et al.(Campins et al., 2007 ) a) Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Thymin; b) Van-der-Waals–Wechselwirkungen zwischen den lipophilen Ketten; c) Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Adenosin; d) und e) 3D Strukturen der beobachteten Bänder

An Nukleolipiden(Moreau et al., 2005 ), wie auch an ODN kann es darüber hinaus zur Ausbildung von Vesikeln kommen. So synthetisierte die Gruppe um Vebert-Nardin et al.(Teixeira et al., 2007 ) ein Nukleocopolymer, welches aus einem Oligonukleotid mit einer endständigen Polybutadieneinheit (MW = 2000 Da) besteht. Diese bildet in wässriger Umgebung Vesikel. Goto et al.(Maruyama et al., 2007) nutzen dieses Verhalten der Bildung von Vesikeln, um target-ssDNA mit Hilfe einer reversen Mizelle aus einer organischen Phase zu extrahieren. Dabei wurde ein lipohiler Anker an das 5´-Ende eines Oligonukleotides geknüpft. Dieses Konstrukt formte mit DLPC in Hexanol oder Butanol reverse Mizellen. Im Inneren jener Mizelle bildete das Oligonukleotid mit der target ssDNA (20mer–52mer), welche einen Fluoreszenzmarker am 5´-Ende enthält, eine Doppelhelix. An der Phasengrenzfläche zum Wasser öffnete sich die Mizelle wieder und die ssDNA wird in die wässrige Phase entlassen, was durch die Fluoreszenz des wässrigen Mediums nachgewiesen werden konnte.

Abbildung 23: Schematische Darstellung der Extraktion von ssDNA mit Hilfe einer reversen Micelle nach Goto et al.(Maruyama et al., 2007) a) verwendeter lipophiler Anker; b) Extraktions-Schritt

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All diese Beobachtungen basieren zum einen auf dem Ausbilden von lipidähnlichen Strukturen durch den lipophilen Rest und/oder von Wasserstoffbrückenbindungen durch die Nukleobase. Viele Arbeiten von Berti et al.(Baglioni und Berti, 2003 ;Banchelli et al., 2007 ;Berti et al., 1997;Berti et al., 2000;Berti et al., 1999 ;Berti, 2006 ;Bombelli et al., 2002;Fortini et al., 2004 ;Milani et al., 2007;Milani et al., 2008) untersuchten dieses Verhalten der molekularen Erkennung zwischen Nukleolipiden untereinander und Nukleolipiden mit Oligonukleotiden. Dabei zeigte sich, dass auch elektrostatische Wechselwirkungen (kationische Amphiphile und anionische DNA) einen gewissen Anteil zur Ausbildung von supramolekularen Strukturen beitragen können, aber nicht unbedingt notwendig sind, wie das nachfolgende Beispiel belegt. Mittels DLS (d y namic lightscattering) und auch SANS (small angle neutron scattering) konnten Berti et al.(Banchelli et al., 2007 ) nachweisen, dass sich um einen PolyU-Strang Mizellen aus lipophilen Adenin anordnen und diesen Strang anschließend zu einer Superstruktur verknäulen lässt (s. Abb. 24).

Abbildung 24: Struktur des Dioctanoylphosphatidyladenosin (oben links) ,des ODN (polyU) und deren vorgeschlagenes Model der erhaltenden Superstruktur nach Berti et al.(Banchelli et al., 2007 )

Ein weiteres supramolekulares Verhalten der Nukleolipide ist seit jüngster Zeit auch in der Bildung von Gelen beobachtet worden(Rosemeyer et al., 2007 ). Dabei gruppierten sich die einzelnen Moleküle zu einem Netzwerk, in welchen Lösungsmittelmoleküle eingeschlossen sind. Handelt es sich bei dem Lösungsmittel um Wasser, so spricht man von Hydrogelen. Ein bekanntes Beispiel für diese Hydrogele sind Substanzen, sogenannte Superabsorber, welche in Windeln eingesetzt werden. Weiterhin werden Hydrogele in der Medizin und Medizintechnik (Kontaktlinsen, gesteuerte Freisetzung von Medikamenten), in der Elektroindustrie (elektrolytische Gele), der Landwirtschaft (gesteuerte Nährstofffreisetzung), sowie der chemischen Industrie (Trennsysteme) und der Sensortechnik (pH-Wert-Messung) eingesetzt. In der Medizin wird zum Beispiel ein Wirkstoff mit einem bereits gequollenem Hydrogel versetzt. Nach oraler Einnahme und dem Kontakt mit der Magensäure reagiert das pH-empfindliche Hydrogel durch Abgabe der Flüssigkeit und gibt somit auch das Medikament in den Magen ab. Wandert es weiter in den Darm, nimmt das Hydrogel dort durch den veränderten pH-Wert Flüssigkeit auf und quillt dadurch auf, wodurch die Abgabe des Wirkstoffes gestoppt wird. Das Hydrogel wird letztendlich vom Körper ausgeschieden.

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Kim et al.(Park et al., 2003 ) konnten zeigen, dass die von ihnen synthetisierten Nukleolipide bei 0.2 wt-% Hydrogele bilden und mittels SEM auch die entstandenen supramolekularen Strukturen nachweisen.

Abbildung 25: SEM–Bild des Hydrogels bei 0.2 wt-% des Nukleolipides in Wasser von Kim et al.(Park et al., 2003)

Die Bildung von Organogelen durch Phosphocholinnukleolipide (DPUPC), wurde auch von Barthelemey et al.(Moreau et al., 2004 ) anhand von SEM und DSC–Messungen nachgewiesen. Die geringste Konzentration des Nukleolipides, um noch eine Organogelbildung zu beobachten, stellte sich bei 6 wt-% in Cyclohexan heraus. Es konnte gezeigt werden, das eine Verlängerung der Alkykette zu keiner Organogelbildung führt, da sich dann das Nukleolipid in Cyclohexan löst. Aufgrund des hydrophilen Charakters bildet dieses Phosphocholinderivat auch ein Hydrogel bei einer Konzentration von 6 wt-%.

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Abbildung 26: a) Photografie eins Organogeles und b) SEM-Bild des DPUPC- (rechts) Organogeles nach Barthelemey et al.(Moreau et al., 2004)

1.4 Aufgabenstellung – Warum 2´-Nukleolipide

Die gegenwärtige intensive Forschung auf dem Gebiet der Synthese von Nukleolipiden, zeigt die Bedeutung dieser Stoffe sowohl in grundlagenorientierter als auch in praktischer Sicht. Bislang ist allerdings nur ein kleiner Teil der strukturellen Vielfalt dieser Stoffklasse erforscht worden. Sowohl für das supramolekulare Verhalten, als auch für das Vermögen mit Lipidmembranen zu wechselwirken ist die Art, Anzahl und die Verknüpfungsposition der Lipidanker an den Nukleosiden bzw. den Oligonukleotiden von großer Bedeutung. Wie jedoch in den vorigen Abschnitten dargelegt, wurden in den bisherigen Arbeiten die Modifikationen meist an der Nukleobase(Kurz et al., 2006 ;Scheidt et al., 2004 ), wie auch an der 3´- oder 5´-Position(Ahn et al., 2004 ;Kaczmarek et al., 2008 ;Pfeiffer und Hook, 2004 ;Pincet et al., 2001 ;Soutschek et al., 2004) vorgenommen. Was vor allem daran liegt, dass diese Modifikationen im ersten Fall auch an der Festphase während oder im letztgenannten Fall nach der Oligonukleotidsynthese möglich ist(Alemdaroglu und Herrmann, 2007 ;Manoharan et al., 1995 ;Tosquellas et al., 1998).

Das Augenmerk dieser Arbeit richtet sich daher aus mehren Gründen auf eine Derivatisierung des Nukleosides an der 2´-Position(Zatsepin et al., 2004;Zatsepin und Oretskaya, 2004;Zatsepin et al., 2004 ). Einen Übersichtsartikel über Synthesen von 2´-Nukleosiden gaben im Jahre 2004 Zatsepin et al.(Zatsepin et al., 2004 ). Jedoch fanden sich darunter nur sehr wenige Beispiele von Nukleolipiden mit 2´-fixierten Lipidanker(Manoharan et al., 1991 ;Manoharan et al., 1997 ;Manoharan et al., 1995 ;Stetsenko et al., 2000 ).

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Abbildung 27: Möglichkeiten der Derivatisierung von Nukleosiden und deren Auswirkungen auf die Oligonukleotidsynthese und die Watson-Crick-Basenpaarung

Ein Grund liegt darin, dass das erhaltene Nukleolipid, wenn es in die Zellmembran eingebracht wird, zur molekulare Erkennung mit anderen Nukleosiden, Nukleotiden oder Oligonukleotiden über die Watson–Crick-Basenpaarung zu Verfügung stehen soll. Nun haben bisherige Versuche in unserem Arbeitskreis hingegen gezeigt(Scheidt et al., 2004 ), dass das Nukleolipid, wenn es an der Nukleobase mit einem lipophilen Rest derivatisiert worden ist, zu tief in der Membran verankert ist und keine Basenpaarung mehr ermöglicht wird (s. Abb. 28).

Abbildung 28: Tiefenposition der Nukleolipide in POPC mittels Kreuzrelaxationsmessungen bestimmt(Kurz et al., 2006 )

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Ein weiterer Grund liegt darin, dass das erhaltene Nukleolipid in sein Phosphoramiditanalogon überführt werden soll und dann über die Phosphoramiditsynthese in ein Oligonukleotid eingebaut wird. Viele der bisherigen Arbeiten führten dabei den lipophilen Rest am Ende oder am Anfang des DNA-Stranges ein. Infolgedessen ist es jedoch nicht möglich, die Position des lipophilen Nukleotides in denselben Strang zu varieren. Die Einführung des lipohilen Restes an 2´- Position würde es aber ermöglichen, den lipophilen Anker zwischen zwei relevanten Teilsequenzen eines Oligonukleotides zu bringen, die dann jede einzeln Doppelstränge ausbilden können (s. Abb. 29). Diese zwei verschiedenen DNA-Sequenzen, welche jeweils ein funktionelles Molekül tragen könnten, sind vielfältig einsetzbar. Zum einen könnte man an Ihnen, durch die Bindung von Enzymen an den Enden des DNA-Stranges, sogenannte Multi-Enzym-Komplexe erzeugen, an denen eine mehrstufige katalytische Synthese eines Substrates durch die kurzen Diffusionswege beschleunigt wird. Zum anderen kann man durch das Verknüpfen des einen DNA-Stranges mit einem Reporter-Fluorophor und des anderen mit einem Quencher Molec u lar   Beacons erzeugen. In diesem als stem   loop (=Stamm-Schleife) bezeichneten Zustand zeigt der Reporter durch seinen geringen Abstand zum Quencher keine Fluoreszenz. Durch Anlagerung der membranverankerten Schleifen-Region an eine komplementäre DNA-Sequenz (Analyt-DNA), wird der Abstand zwischen Quencher und Reporter vergrößert. Eine Reporter-Fluoreszenz kann somit beobachtet werden. Arbeiten von Kim et al.(Kim et al., 2004 ) zeigten die Ausbildung von Hairpin-Strukturen durch lipophile Oligonukleotide an Membranen. Dazu wurde aus Lithocholsäure ein Phosphoramidit synthetisiert, welches während der Oligonukleotidsynthese zwischen zwei Nukleotide eingeführt worden ist (s. Abb. 30). Es konnte durch UV-spektroskopische Schmelzpunktmessungen gezeigt werden, dass das ODN vom Typ 5´-d(T12LT12) keine Duplexe bildet, jedoch das ODN vom Typ 5´-d(T12LA12).

Abbildung 29: DNA mit mittigen lipophilen Anker für den Einsatz in Multi-Enzym-Komplexen oder Molec u lar   Beacon aus der Dissertation von Andreas Bunge(Bunge, 2008)

Abbildung 30: Verwendeter DNA–Anker von Kim et al.(Kim et al., 2004 ) zur Ausbildung von Hairpinstrukturen

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Durch eine interne Markierung finden 2’-OH-Derivate von Nukleosiden vor allem Bedeutung in der Aufklärung von Faltungsmechanismen der RNA, da sie gegenüber den 3’- bzw. 5’-Analoga ein größeres Spektrum an denkbaren Derivatisierungspositionen vorweisen. Eine viel versprechende Methode zur Klärung dieser Fragestellung ist die Fluoreszenzspektroskopie, welche in der Aufklärung von Proteinfaltungen und Entfaltungen erfolgreich eingesetzt wird. Hierbei wird ein fluoreszierendes Molekül, z.B. ein Pyrenderivat kovalent an eine durch Substitution eingeführte 2’-NH2-Gruppe eines Nukleotides im RNA-Strang gebunden(Silverman und Cech, 1999 ). Weiterhin werden 2-alkylierte Oligonukleotide im großen Umfang in der Anti-Gene-Biotechnology eingesetzt. Denn es zeigte sich, dass diese kinetisch und thermodynamisch stabilere Duplexe bilden, als die natürlichen Oligonukleotide (s. Abs. 2.1). Eine weitere Verwendung finden 2´-OH-Derivate in der Untersuchung von Protein – Oligonukleotid – Wechselwirkungen. Dabei werden die zu untersuchenden Proteine über Aminolinker mit Oligonukleotide verknüpft, welche an der 2´-Position eine(Turutin et al., 2002 ) oder gar zwei(Gritsenko et al., 2002 ) Aldehydgruppen tragen.

Aus diesen aufgeführten Gründen und den vielfältigen Möglichkeiten des Einsatzes solcher Nukleolipide wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene Synthesestrategien untersucht, um lipophile Reste vorrangig an 2´-Position anzubringen. Dabei wurden in Anlehnung an die Natur, als lipophile Anker vorrangig Fettsäurenderivate, aber auch das Cholesterol und verschiedene Terpene verwendet. Die Verknüpfung erfolgte zum einen über Ester. Diese haben den Vorteil, dass sie biologisch durch Lipasen spaltbar sind. Somit kann das gebundene Nukleosid leicht von der Membran entfernt und auch metabolisiert werden. Ein Nachteil dieser Verknüpfungsart besteht darin, dass diese erhaltenden Monomere nicht in der Oligonukleotidsynthese eingesetzt werden können. Ein ähnliches Verhalten wird auch bei den Disulfiden beobachtet. Der lipophile Anker kann zwar durch Verwendung von solchen Reduktionsmitteln wie Cleland´s Reagenz (DTT) oder Mercaptoethanol gezielt von dem Nukleosid abgespalten werden, aber der Einsatz solcher Disulfide in der Oligonukleotidsynthese ist nur bedingt möglich. Weitere Verknüpfungen sind in der Bildung von Carbamten, Amiden, Ethern oder Thioethern gegeben. Diese Produkte können anschließend in der Oligonukleotidsynthese eingesetzt werden und sind in der biologischen Umgebung relativ stabil.

Einige der dargestellten Monomere wurden demnach in ihre entsprechenden Phosphoramidite überführt und in verschiedenen Positionen in Oligonukleotiden eingebaut.

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AFM–Untersuchungen sollten weiterhin zeigen, inwiefern die in der vorliegenden Arbeit synthetisierten Monomere supramolekulares Verhalten zeigen und Messungen durch unsere Kooperationspartner sollten im Rahmen von geförderten BMBF-Projekten das Verhalten der Nukleolipide und der amphiphilen Oligonukleotide in Membranen zum einen biophysikalisch (Arbeitsgruppe Prof. Dr. A. Herrmann), als auch NMR-spektroskopisch (Arbeitsgruppe PD Dr. D. Huster) untersuchen.


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29.07.2009