2 Allgemeiner Teil

↓28

2.1 Synthese von Ethern und Estern

Ausgangspunkt der vorliegenden Dissertation waren bisherige Arbeiten aus unseren Arbeitskreis(Bunge et al., 2007 ;Flasche et al., 2004 ;Kurz et al., 2006;Scheidt et al., 2004 ) und Arbeiten von Pincet et al.(Heuvingh et al., 2004 ;Pincet et al., 2001 ;Pincet et al., 1994 ;Pincet et al., 1996 ). In diesen wurden zwei unterschiedlich mit komplementären lipidierten Nukleosiden tagged-GUVs mit Hilfe der Basenpaarung so dicht herangeführt, dass eine Hemifusion beobachtet werden konnte.

Abbildung 31: Zwei aggregierende Vesikel nach von Pincet et al. Ein Vesikel ist mit einen Adenosinlipid funktionalisiert und mit RhPE auf der Oberfläche und FITC-Dextran im Inneren gelabelt. Das andere Vesikel ist ungelabelt und mit dem Thymidinlipid versetzt (Balkenlänge 10μm). Links: Fluoreszenzbild bei der Laseranregung von Rhodamin (514nm) Rechts: Fluoreszenzbild bei der Laseranregung von Fluorescein (488nm)

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Abbildung 32: Die verwendeten Nukleolipide

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche lipophile Uridine synthetisiert, um einen Vergleich erzielen zu können, wie viele Anker für eine Bindung des Nukleolipides in Membranen benötigt werden. Weiterhin wurde untersucht, ob ein Spacer zwischen dem Zucker und dem lipophilen Rest Unterschiede in der Membranverankerungstiefe des entsprechenden Nukleolipides ersichtlich werden lässt. Wie im Kapitel 1.2.1 erwähnt, wurden viele Pharmawirkstoffe wie 5-Fluoruridin oder andere antivirale Nukleoside mit Fettsäuren umgesetzt, um sie biologisch besser verfügbar zu machen (Prodrugs) und vor dem enzymatischen Abbau zu schützen. Dabei wurden die Veresterungen meist enzymatisch durchgeführt(Bijsterbosch et al., 2002 ;Ramirez et al., 1982: ;Shea et al., 1990). Diese dargestellten Ester lassen sich natürlich nicht in der späteren Oligonukleotidsynthese einführen, da es bei der basischen Abspaltung des Oligonukleotides vom CPG (controlled pore glass), auch zu einer Spaltung des Esters kommen wird. Aus dem Grunde wurden solche Oligonukleotide in der Literatur nachträglich mit Fettsäuren oder Glycerolester umgesetzt, um ihre Bioverfügbarkeit zu erhöhen.

Für die Synthese eines Nukleosides mit einer Estergruppierung an O2´- Position wurde nach einer Vorschrift von Furusawa et al.(Furusawa et al., 1990) die O3´- und die O5´-Position des Uridins mit Ditertbutylsilylditriflat in einer Ausbeute von 88% geschützt und anschließend die O2´-Position mit dem Säurechlorid der Palmitinsäure in Pyridin verestert. Das Zwischenprodukt 3 wurde ohne Aufreinigung im nächsten Schritt mit NH4F entschützt.

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Abbildung 33: Synthese des O2´-Palmitoyluridins: I) 1.5 eq. n-C15H31COOH, DMAP, Pyridin, 16 h bei RT; II) NH4F, MeOH, 16 h bei RT, 48% über 2 Stufen

Man erhält dabei nicht nur das gewünschte 2´-Palmitoyluridin 4, sondern ein Isomerengemisch aus O2´- und O3´-(Palmitoyl)uridin 4 und 5, im Verhältnis von 4:9. Ein ähnliches Umesterungsverhalten ist schon seit längerem bei der Synthese von acylierten Nukleosiden(Neumann et al., 1968;Reese und Trentham, 1965;Reese und Trentham, 1965 ) und auch in der Biologie bekannt. Dort vor allem bei der Biosynthese der second   messenger 3´,5´-cycloAMP oder 3´,5´-cycloGMP aus den entsprechenden Triphosphaten der Nukleoside. Durch eine Wechselwirkung des Nukleosides mit dem Enzym kommt es zu einer Schwächung der HO3´-Bindung, wodurch das Sauerstoffatom am Phosphoratom an O5´- Position intramolekular angegriffen wird. Ein ähnlicher Mechanismus wird auch für die Umesterung an 4 vorgeschlagen (s. Abb. 34). In diesem Fall wird durch die Spaltung der Si-O-Bindung und der Bildung einer viel stärkern Si-F-Bindung ein Alkoxidion generiert, welches intramolekular die Umesterung hervorruft. Trotz des Vorliegens der Isomerenmischung 4 und 5, wurde das System von uns in Membranbildungs- und verankerungsversuchen erfolgreich eingesetzt (s. Abs. 2.9 s. Abs. 2.10).

Abbildung 34: Möglicher Mechanismus für die beobachte 2´3´-Acylwanderung

↓31

Der Nachweis und die Bestimmung des Verhältnis des Isomerengemisches erfolgte mittels 1H–NMR spektroskopischer Untersuchungen und dem Vergleich mit den Edukten und der Literatur (s. Abb. 35)

Abbildung 35: 1H-NMR-Spektrum des Isomerengemisches des O2´,O3´-(Palmitoyl)uridin 4/5

Diese Umlagerung wird aus sterischen Gründen unterbunden, wenn der lipophile Rest mit der O2´-Position des Arabinosanalogons des Uridins verknüpft ist. Man erhält nach einer Mitsunobureaktion von 2 mit der 4-(1,3-bis(oleoyloxy)propan-2-yloxy)-4-oxobutansäure  6 und anschließender Entschützung das stabile 2´-Acyl-arabinosederivat 8 (s. Abb. 36).

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Abbildung 36: Synthese des 2´-Acyl-arabinosederivat 8: I) 1.26 eq. DIAD, 1.2 eq. PPh3, 1.2 eq. 6, THF, 16 h bei RT, 62%; II) NH4F, MeOH, 16 h bei RT, 17%

Die Synthese des verwendeten 1,2,3-Trihydroxypropan-1,3-dioleat 11, welches anschließend mit Bernsteinsäureanhydrid in Pyridin zu 6 umgesetzt worden ist, erfolgte nach einer Vorschrift von Bentley(Bentley und Mccrae, 1970 ).

Abbildung 37: Synthese von 6: I) 3.3 eq. Oleoylchlorid, Pyridin, CH2Cl2, 2 ¼ h bei RT, 81%; II) 1.1 eq. NaBH4, H2O, THF, 1h, 4°C->RT, 92%; III) Bernsteinsäureanhydrid, DMAP, CH2Cl2, 16h bei RT, 90%

↓33

Für die Synthese eines Uridins mit zwei lipophilen Resten an O2´- und an O3´- Position (s.Abb. 38) wurde O5´-(4,4´-Dimethoxytrityl)uridin 12 analog zu der oberen Vorschrift, zum einen in 81% Ausbeute mit Palmitinsäurechlorid in Pyridin verestert und zum anderen in quantitativer Ausbeute mit Bernsteinsäureanhydrid. Das Dipalmitat 13 wurde mit 80%iger Essigsäure in 28% Ausbeute zu dem Produkt 14 entschützt. Das Disuccinat 1 5 wurde zuerst mit Pentadecanol, unter Verwendung von DCC, in 95% Ausbeute umgesetzt und anschließend sauer zu dem gewünschten Produkt 16 entschützt.

Abbildung 38: Synthese der O2´, O3´-Diacylnukleolipide: I) 3.0 eq. nC15H31COCl, DMAP. Pyridin, 2h bei RT, 81%; II) 80% CH3COOH, 20 min bei RT, 26%; III) 3.0 eq. Bernsteinsäureanhydrid, DMAP, Pyridin, 72h bei RT, quant. IV) 0.5 eq. nC15H31OH, DCC, DMAP, Toluol, 72h bei RT, quant.; V) CF3COOH, CH2Cl2, 30 min bei RT, 46%

In Analogie zur Herstellung des Arabinosederivates 7 wurde auch versucht, ein Uridinderivat mit zwei lipophilen Acylresten an O2´- Position zu synthetisieren. Dies erwies sich, womöglich wegen des sterischen Anspruches des lipohilen Restes, als schwieriger. Es wurden daraufhin verschiedene Synthesewege getestet (s. Tab. 1).

↓34

Abbildung 39: Synthese von 22: I) s. Tab. 1; II) Et3N·3HF, THF, 16h bei RT, 80%

Tabelle 1: Versuche zur Synthese von 22

21

Edukt 1

Edukt 2

Reaktionsbedingung

a

DCC (1.0 eq.),

DMAP (1.0 eq.),

DMF,

72h bei RT

21% Produkt

b

DCC (1.2 eq.),

HOBT (1.2 eq.),

DMF,

72h bei RT

kein Produkt

c

DCC (1.2 eq.),

HOBT (1.2 eq.),

DMF,

72h bei RT

kein Produkt

d

DMAP (1.2 eq.),

Pyridin,

72h bei RT

kein Produkt

e

EDC (2.0 eq.),

PyPy (2.0 eq.),

DMF,

72h bei RT

kein Produkt

f

DCC (1.2 eq.),

DMAP (0.4 eq.),

THF,

16 h bei RT

58% Ausbeute

Mit der Wahl des Lösungsmittel THF für die Synthese wurde letztendlich das gewünschte Produkt 2 1f in guter Ausbeute aus dem geschützten Uridin 20 und dem Dioleat 6 erhalten. Nach der Entschützung mit Triethylamintrihydrofluorid in THF wurde das Produkt 22 in 80%iger Ausbeute, ausschließlich als 3´- Isomer isoliert, wie aus den aufgenommenen H,H-COSY-NMR-Spektrum zu entnehmen war.

↓35

Für Untersuchungen einer Fusionsbildung zwischen zwei Vesikeln mit unterschiedlichen Nukleolipiden, ähnlich dem Experimenten von Pincet et al., wurde auch das entsprechende Adenosinanalogon dargestellt (s. Abb. 40). Dabei wurde nach einer Vorschrift von McLaughlin et al.(Mclaughlin et al., 1985 N6-Benzoyladenosin 2 4 synthetisiert, welches anschließend mit TIPDSCl(Markiewicz, 1979 ) regioselektiv an der O3´- und der O5´-Position geschützt worden ist. Die Veresterung des geschützten Adenosins 25 erfolgt nach der oben erprobten Methode in THF, allerdings nur in 22% Ausbeute. Nach Abspaltung der Silylschutzgruppe in 89% Ausbeute wurde versucht die Benzoylschutzgruppe unter milden Bedingungen zu entfernen, ohne dabei den Ester zu spalten. Eine Entschützung mit überhitztem Methanol nach einer Vorschrift von Nowak et al.(Nowak et al., 2005 ) sollte laut Angaben des Autors zu einer selektiven N-Deacylierung führen. Im genannten Beispiel untersuchten sie unter anderem die Reaktion von N6-Benzoyl-2′,3′,5′-tri-O-isopropyladenosin und erhielten das N-deacylierte Produkt nach 12 h in 88% Ausbeute. In unseren Fall kam es zu einer Abspaltung der Benzoylschutzgruppe und auch des Esters. Der Versuch dieser Esterspaltung durch den Einsatz eines stärkeren Nukleophiles (Isobutylamin) zu umgehen, schlug fehl. Es wurden die Edukte zurück erhalten. Interessanterweise verlief eine basische Abspaltung mit 25% Ammoniumhydroxid in Ethanol bei Raumtemperatur zu einem Verlust des Esters, aber zum Erhalt der Benzoylschutzgruppe.

Abbildung 40: Synthese des 1,3-Bis(oleoyloxy)propan-2-yl-(N6-benzyoladenosin)succinat: I) a) 7.5 eq. TMSCl, Pyridin, 3h, bei RT; b) 3 eq. BzCl, 16 bei RT; c) 25% NH4OH 20 min bei 0°C, 79%; II) TiPSCl2, Pyridin, 16h bei RT, 90%; III) 6, DCC, DMAP, THF, 72h bei RT, 22%; IV) Et3N·3HF, THF, 2h bei RT, 89%

Da dieser Weg nicht erfolgversprechend war, wurde die Veresterung mit dem Glyceroldioleat 6, trotz der exozyklischen ungeschützen Aminogruppe, nach der oben erprobten Methode am O3´,O5´-Tetraisopropyldisilyladenosin 28 durchgeführt und das Produkt 2 9 in 60% Ausbeute erhalten (s. Abb. 41). Eine N-Acylierung konnte aufgrund eines Vergleichs der 1H-NMR Spektren von 2 6 und 2 9 ausgeschlossen werden (s. Abb. 42). Man erkennt eine sehr ähnliche Verschiebung des 2´-Proton, was für eine gleiche Derivatisierung an dieser Stelle spricht. Interessanterweise sind die aromatischen Protonen aufgrund des Fehlens der Benzoylschutzgruppe stark verschoben, was dafür spricht, dass der Aromat der Benzoylschutzgruppe in den Anisotropiekegel des Purins ragt und die beobachtete chemische Verschiebung hervorruft. Die Entschützung mit Triethylamintrihydrofluorid ergab 31 in 18% Ausbeute, jedoch ausschließlich als O3´-Isomer. Die vollständige Umlagerung der Produkte 31 und 22 in das 3´-Acylprodukt ist wahrscheinlich auf den größeren Raumbedarf der Acylgruppe 6, im Vergleich zu den Palmitoylprodukten 4 und 5, zurückzuführen, wo beide Produkte beobachtet wurden.

↓36

Abbildung 41: Synthese des 1,3-Bis(oleoyloxy)propan-2(adenosinyl)succinat: I) TiPSCl2, Pyridin, 16h bei RT, 90%; II) 1,3-Bis(oleoyloxy)propan-2-ylsuccinat, DCC, DMAP, THF, 72h bei RT, 60%; III) Et3N·3HF, THF, 4h bei RT, 18%

Abbildung 42: Gegenüberstellung der 1H-NMR-Spektren von 26 (oben) und 29 (unten).

Um den Einfluss der Anzahl von Fettsäureresten in Nukleosiden systematisch untersuchen zu können, wurde ein Vertreter mit drei lipophilen Ankern synthetisiert. Dabei wurde von einem Pentaerythritolderivat ausgegangen. Da große Ähnlichkeiten zu Glycerol oder TRIS bestehen, kann Pentaerythritol aufgrund seiner chemischen Struktur sehr gut als funktionelle Ausgangssubstanz für Lipidsynthesen genutzt werden. Um drei lipophile Reste und einen Spacer einzuführen, war es notwendig, drei der vier Alkoholgruppen zu differenzieren. Dies gelang in Form einer Bromierung zu 33 durch die Behandlung des Pentaerythritol mit konzentriertem HBr in Anwesenheit von Eisessig und anschließendem Umsatz in konzentrierter Schwefelsäure(Davis et al., 1999 ) in 46% Ausbeute. Die Einführung des Spacers erfolgte durch die schon oben genannte Synthese mit Bernsteinsäureanhydrid. Der entstandene Halbester 3 4 wurde anschließend in 47% Ausbeute mit dem geschützten Uridin 20 verestert. Die Umsetzung von 3 5 mit 3.3 eq. Octadecanthiol in Dichlormethan und der anschließenden Entschützung brachte überraschenderweise lediglich das einfachalkylierte Produkt 37 in eine Mischung aus 2´ -und 3´-Produkt im Verhältnis von 1:4.

↓37

Abbildung 43: Synthese des 2´-(4-(3-Octadecyl-2,2-bis(octadecylmethyl)propyl)-4-oxobutanester)-2´-desoxyuridin 33: I) a) AcOH(glacial) : 40%HBr 1:5, 24 h unter Rückfluss b) H2SO4 (konz.), 40% HBr 1:2, 24 h unter Rückfluss, 46%; II) Bernsteinsäureanhydrid, DMAP, Pyridin, 60h bei RT, quant.; III) DCC, DMAP, THF, 64 h bei RT, 48%; IV) 3.3 eq. C18H37SH, 15 eq. DIPEA, CsCO3, CH2Cl2, 12d bei RT, 10%; V) Et3N•3HF, THF, 3h bei RT, 69%

Um die 2´-3´-.Acylwanderung zu umgehen, mussten für weitere Untersuchungen andere funktionelle Gruppen gewählt werden. Manfredini et al.(Manfredini et al., 2001 ) synthetisierten ausgehend von O2,O2´-Anhydrouridin, 2´-O-Acyl- und auch 2´-O-Alkylderivate des Arabinofuranosyl-pyrimidins, um sie als hochselektive Kinaseinhibitoren zu verwende Es konnte nachgewiesen werden, dass die Einführung des Acylrestes, nicht aber des Alkylrestes zu einer Erhöhung der Affinität zu TK-2 führte und eine stärkere inhibierende Wirkung zeigte, als das unmodifizierte Nukleosid.

Mit der Entdeckung der Nukleosid- und Nukleotid-Rezeptoren(Geoffrey, 1978) erkannte man, dass Nukleotide auch außerhalb der Zelle wichtige Aufgaben als Neurotransmitter bzw. Neuromodulatoren erfüllen (s. Abb. 44). Dies legt nahe, auch die von uns synthetisierten Nukleosidester pharmakologisch zu untersuchen. Die Ergebnisse hier zu stehen aber noch aus.

↓38

Abbildung 44: Pharmakologische Wirkungen von Uridin aus der Dissertation von Till Schumacher(Schumacher, 2005 )

Die Veretherung der 2´-O-Position ist schon seit längerem bekannt. Einer der bekanntesten Vertreter sind die 2’-O-methylierten RNAs, welche für die Antisensetechnologie eingesetzt werden, um die RNA gegenüber Nukleasen resistenter zu machen. Bei der Antisense-Technologie(Gleave und Monia, 2005 ;Miller et al., 1977 ;Stephens.Ml et al., 1973;Uhlmann und Peyman, 1990 ) wird ein RNA- oder DNA–Strang, welcher modifiziert sein kann, in die Zelle eingeschleust, um dort mit der komplementären RNA („Sense“) einen stabilen Doppelstrang zu bilden. Dadurch wird der Sensestrang der Transkription entzogen und steht für die Proteinbiosynthese nicht mehr zu Verfügung. Probleme traten dahingehend auf, dass diese RNA-RNA-Duplexe nicht sehr stabil waren, zum einen in thermischer, zum anderen in enzymatischer Hinsicht. Um diese Stabilität zu erhöhen, wurden modifizierte Nukleoside verwendet (s. Abb. 46). Die erste Generation der Antisenseoligonukleotide bestand in dem Austausch des nicht verbrückenden Sauerstoffatoms im Phosphatrückgrat durch ein Schwefelatom, zum Phosphorthionat(Declercq et al., 1969 ). Diese Phosphorthionate waren nun zwar 10 h gegenüber RNA-Nuklease stabil, aber sie hatten auch den Nachteil, dass sie sich unspezifisch an Proteine binden konnten, demzufolge zytotoxisch waren und sehr langsam mit dem Sensestrang hybridisierten. Die zweite Generation der Antisenseoligonukleotide waren die 2´-O-modifizierten Ribonukleoside (s. Abb. 45).

Abbildung 45: Affinität der der modifizierten Oligonukleotide zum DNA-Duplex 2´-Aminoethoxy modifizierte Thymidine (fettgedruckt, Strang 3) hybridisiert mit den Strang 1 und 2 (180mm KCl, 20 mm Na+, 10 mm Phosphatpuffer (pH 7.0) und 0.1 mm EDTA) Die Schmelztemperaturen für die Tripelhelix des modifizierten Oligonukleotid (■) wurde mit der des nichtmodifizierten Oligonukleotid verglichen (≤) Struktur – Affinitätsbeziehung der verschiedenen 2´- substituierten Oligonukleotide

↓39

Die Darstellung von 2´-Nukleosidethern erfolgt meist durch Deprotonierung der Hydroxylgruppe im basischen (NaH) und anschließender Umsetzung des Alkoxides in einer Williamson´schen Ethersynthese. Bei den ungeschützen Purinbasen gelingt dies sogar mit einer hohen Regioselektivität (<5:1; 2:3 Isomer), da die 2´-OH die höchste Acidität (pKa ~ 12) (Izatt et al., 1965 ;Levene und Bass, 1926) der Hydroxylgruppen aufweist. Aufgrund dieser Tatsache wurden auch viele lipophile 2´-O-alkylierte Adenosinanaloga dargestellt. Manoharan et al.(Manoharan et al., 1991 ;Manoharan et al., 1993 ) setze Adenosin im Basischen mit 6-(Bromohexan)tritylthiol oder 6-(Bromohexan)phthalimid um. Das geschützte 2´-O-Thiohexyladenosin bzw. das 2´-O-Aminohexyladenosin wurde weiter in die Oligonukleotidsynthese verwendet. Nach dem Entschützen wurden die freien Thiolanker oder Aminanker mit verschieden Fluorophoren (Pyren, Phenanthrolin oder Fluorescein) oder Lipiden (Cholsäure, Digoxigenin, Phospholipide) verknüpft.

Eine mäßig regioselektive Synthese von 2´-O-alkylierten Pyrimidinnukleosiden konnte über einen 2´,3´-O-(Dibutylzinn)- Komplex(Wagner et al., 1974 ) durch Umsetzung mit Alkylhalogeniden, im Verhältnis von ~ 1:2 (3´-O : 2´-O) erzielt werden.

In ihren Arbeiten wiesen Zhu et al.(Zhu et al., 2002 ) nach, dass die Alkylierung von N3-Benzoyl-3',5'-O-(di-tert-butylsilandiyl)uridin mit sterisch gehinderten Alkylioden, wie 2-Ethylbutyliodid als Elektrophil eine unerwartete Umlagerung zum N3-alkyl-2'-O-benzoyluridin vollzieht.

↓40

2´-O modifizierte Ribonukleoside werden als sogenannte „Gapmer“ verwendet(Cuenoud et al., 1998 ;Kawasaki et al., 1993 ;Lesnik et al., 1993 ;Monia et al., 1993 ). Diese zeigen eine bedeutend höhere Affinität gegenüber RNA als DNA, waren jedoch als Oligonukleotid nicht in der Lage die Genexpression zu inhibieren. Erst als „Chimäre“ mit 2´-Desoxynukleotide konnte man eine Inhibierung beobachten. Somit dienten diese 2´-O modifizierten Ribonukleoside am 3´- und 5´-Ende dem Schutz des Antisensestranges vor RNase H–Abbau. Eine weitere Erhöhung der thermischen Stabilität von Sense–Antisense-Duplexen und der Zielerkennung brachte die dritte Generation der Antisensenukleotide(Herdewijn, 2000 ;Kurreck, 2003). Zu ihnen zählen unter anderen PNA (peptid nucleic acid), LNA (locked nucleic acid) und HNA (hexitol nucleic acid).

Abbildung 46: Darstellung der drei Generationen der Nukleotidmodifikationen für Anwendungen in der Antisense-Technologie, aus dem IDTutorial- Antisense-Technologies 2005 A) Phosphothionatrückgrat; B) Modifizierung durch Alkylierung der 2´-Position der Ribose; C) verschiedenste Änderungen am Rückgrat

Wir griffen zur Herstellung von 2´- modifizierten Uridinen auf das O2,O2´-Anhydrouridin zurück, dass sich nach einer Vorschrift von Prakash et al.(Prakash et al., 2002) leicht aus dem Uridin mit Diphenylcarbonat synthetisieren lässt(Hampton und Nichol, 1966 ;Ogilvie und Iwacha, 1969: ). Diese Verbindung reagiert bekanntermaßen mit Nukleophilen in der 2´-Position unter Inversion der Konfiguration. Setzt man als Nukleophil Ethylenglycol in Gegenwart einer Lewisbase ein, gelangt man zum Uridinether 39.

↓41

Anschließend sollte die primäre Hydroxylgruppe in eine Fluchtgruppe überführt werden (s. Abb. 47), um sie nachfolgend mit einem guten Nukleophil (Amin, Thiol) umzusetzen. Verschiedene Versuche führten jedoch zu keinem einheitlichen Produkt (s. Tab. 2).

Abbildung 47: Synthese des O2´-(Hydroxethyl)-2´-desoxy-O5´-(TBDPS)uridin 40: I) Ethylenglycol, BH3•THF, 16h bei 160°C, 80%; II) siehe Tabelle 2

Tabelle 2: Versuche zur Synthese von 40

40

Reaktionsbedingungen

Ergebnis

a

1.1 eq. TosCl,

DMAP, Pyridin,

16h bei RT

Edukt zurück erhalten

b

1.1 eq. TosCl,

DMAP, CH2Cl2,

16h bei RT

Edukt zurück erhalten

c

1.1 eq. TosCl,

DMAP, Pyridin,

16h von -20°C -> RT

Edukt zurück erhalten

d

1.1 eq. TosCl,

Et3N, CH2Cl2,

16h von -30°C -> RT

2 Regioisomere als Monotosylprodukte und ein Ditosylprodukt erhalten

e

1.1 eq. TosCl,

Et3N, CH2Cl2,

16h von -78°C -> RT

2 Regioisomere als Monotosylprodukte und ein Ditosylprodukt erhalten

↓42

Aus diesem Grunde, wurde anstelle des Ethylenglycols, DL-Isopropylidenglycerol eingesetzt (s. Abb. 48). Die 2´-Position des Anhydrouridins 38 wurde verethert, die 3´-Position mit TBDMS geschützt und nach der Abspaltung des Acetons aus 43 in den Glycerolrest zwei Stearylreste unter Bildung von 45 eingeführt. Die Einführung von Glycerol in das TBDPS geschützte Anhydrouridin 38 gelang in vergleichbarer Ausbeute. Jedoch ist an diesem Glycerolether 42 mit einer Konkurrenzreaktion an der freien 3´-Position zu rechnen.

Abbildung 48: Synthese des O2´-(1,2-Distearylglycerol)-2´-desoxyuridin 46: I) Ph2CO3, DMF, 4 h bei 110°C, 88%; II) 1.1 eq. TBDPSCl, DMAP, Pyridin, 60 h bei RT; 58%, III) Glycerol, BH3•THF, 16 h bei 160°C, 36%; IV) a) DL-Isopropylidenglycerol, BH3•THF, 16 h bei 160°C; b) 6.0 eq. TBDMSCl, 12 eq. Imidazol, DMF, 24 h bei RT, 28% über 2 Stufen; V) DOWEX 50X8, H+-Form, 48 h bei RT, 17%; VI) C17H35COOH, DCC, DMAP, CH2Cl2, 16 h bei RT, Quant; VII) n-Bu4NF, THF, 4 h bei RT, 73%

Um die nachträgliche Schützung an der 3´- Position zu umgehen, konnte die zweizähnige TIPDS-Schutzgruppe für die gleichzeitige Schützung der 3´- und 5´- Position am O2,O2´-Anhydrouridin in sehr guten Ausbeuten eingesetzt werden. Durch Umkristallisieren des Produktes 47 aus Dichlormethan wurden die erforderlichen Kristalle für die Einkristallstrukturanalyse (s. Abb. 49) erhalten, die die Arabinosekonfiguration beweist

↓43

Abbildung 49: Einkristallstruktur von 47

Jedoch führte die nachfolgende Umsetzung von 47 mit Ethylenglycol zu keinem Produkt. Anscheinend ist die freie Hydroxygruppe an der 3´-Position entscheidend für die lewiskatalysierte Ringöffnung des O2,O2´-Anhydrouridin durch Nukleophile oder aber es ist auf eine sterische Hinderung der 2´-Position zurückzuführen, wie anhand der Einkristallstruktur zu erkennen ist.

Abbildung 50: Syntheseversuch von 48: I) HOCH2CH2OH, BH3•THF, THF, NaHCO3, 14 h bei 160°C

↓44

Kachalova et al.(Kachalova et al., 2000;Zatsepin et al., 2001) synthetisierten ausgehend von geschütztem Uridin über eine mehrstufige Synthese ebenfalls 2´-Glycerol-2´-desoxyuridin. Wobei die entscheidenden Schritte die palladiumkatalysierte Allylierung der 2´-Positon und eine anschließende Bishydroxylierung waren. Martin et al.(Martin, 1996 ) synthetisierte 2´-Glycerol-2´-thymidin über die basenkatalysierte Umsetzung von geschütztem Thymidin mit Epichlorhydrin und anschließender Ringöffnung des Epoxides mit einem Alkohol unter Katalyse mit BF3•OEt2.

2.2 2´-Carbamoylnukleoside

Wachter et al.(Wachter et al., 1986 ) beschrieben 1986 eine einfache Synthese von 5´-Carbamten des Uridins. Die 5´-OH-Gruppe des Uridins wurde mit 1,1´-Carbonyldimidazol (CDI) umgesetzt und das entstandene Imidazolid mit aliphatischen Aminen in das Carbamat überführt. Diese aliphatischen Carbamate sind auch unter den Reaktionsbedingungen der Oligonukleotidsynthese und -abspaltung (55 °C, NH4OH) vom Harz stabil. Aus diesen Gründen, der einfachen Darstellung und auch der hohen Stabilität der Carbamate bei der Oligonukleotidsynthese, wurde diese funktionelle Gruppe in jüngster Zeit oft genutzt, um Biomoleküle (Biotin, Digoxigenin), Fluoreszenzmarker (Dansyl, Pyren) (Asseline und Thuong, 1990 ;Boreskov und Berlin, 1995 ;Civitello et al., 2001 ;Dubey et al., 1997 ;Korshun und Berlin, 1994 ;Kubo et al., 2001 ;Misra et al., 2004 ;Singh et al., 1990 ;Will et al., 1991 ), Peptide(Beyer et al., 2003;Gaur, 1991 ;Holmlin et al., 1999 ;Karpyshev et al., 1991 ;Kobori et al., 2008 ;Mestre et al., 1996 ;Murakami et al., 1993 ;Peyrottes et al., 1998 ;Sproat et al., 1987 ;Sproat et al., 1987 ;Virta et al., 2003 ) und viele andere Moleküle(Korshun et al., 2002 ) in Oligonukleotide einzuführen.

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden Versuche zu Synthese von lipophilen Carbamoylnukleosiden unternommen. Ausgehend von 3´,5´-geschütztem Uridin 20, wurde dieses zuerst in hoher Ausbeute mit CDI und anschließend mit Octadecylamin zum Carbamat 50 umgesetzt(Dubey et al., 2000 ;Seio et al., 1998 ). Dies kann man entweder als Eintopfreaktion durchführen oder auch das Zwischenprodukt 4 9 isolieren und zu einem späteren Zeitpunkt mit dem Amin umsetzen. Die Anwendung von CDI zur Einführung von Carbamatfunktionen beruht auf der guten Fluchtgruppeneigenschaft der Imidazolreste, welche leicht durch Nukleophile ersetzt werden können. Da auch Carbamate unter bestimmten alkalischen Bedingungen zu einen 2´,3´- Carbamoylwanderung neigen(Korshun et al., 2002 ), wurde das empfohlene Desilylierungsreagenz Triethylamintrihydrofluorid verwendet. Dieses ergab nach der Entschützung nur das O2´-Carbamt 51

↓45

Abbildung 51: Synthese des O2´-(Octadecylcarbamoyl)uridin 51: I) CDI, CH2Cl2, 3 h bei RT, 97%; II) C18H37NH2, CH2Cl2, 48 h bei RT, 78%; III) Et3N•3HF, THF, 16 h bei RT, 77%

In der Literatur ist die Bildung solcher Carbamate auch mit sekundären Aminen, wie N-Methylpropargylamin beschrieben(Moorthy und Singhal, 2005), allerdings mit geringeren Reaktionsgeschwindigkeiten. In unseren Fall führte jedoch die Umsetzung des geschützten Imidazolids 52 mit dem aliphatischen sekundären Dioctadecylamin zu keinem Produkt. Gleiches wurde auch mit 2-Aminofluoren beobachtet.

Abbildung 52: Umsetzung von 52 mit einem sekundären Amin und einem arylischen Amin: I) CDI, CH2Cl2, 3 h bei RT, 95%; II) 2-Aminofluoren, CH2Cl2, 14 d bei RT; III) Dioctadecylamin, CH2Cl2, 14 d bei 40°C

↓46

Wir vermuten, dass das Versagen der Reaktion auf sterische Gründe zurückzuführen ist und führten deshalb einen Linker zur Abstandsvergrösserung ein (s. Abb. 53). So gelang die Umsetzung des geschützten Imidazolids 52 mit 1,6-Diaminohexan zu 56 in 60%iger Ausbeute. Doch verwunderlicherweise blieb eine entsprechende Reaktion mit 1,4-Diaminobutan zu 55 aus. Versuche, die terminale Aminogruppe des Aminobutylcarbamates 56 mit 2.2 eq. Octadecylbromid in ein sekundäres Amin zu überführen, lieferte lediglich das monoalkylierte Produkt 5 7. Nach der Entschützung von 57 konnte leider kein Produkt mehr isoliert werden.

Abbildung 53: Synthese eine amphiphilen Carbamoyluridin mit Spacer: I) 1.5 eq. Butan-1,4-diamin, CH2Cl2, 48 h bei RT; II) Hexan-1,6-diamin, CH2Cl2, 48 h bei RT, 60%; III) 2.2 eq. Octadecylbromid, 3.0 eq. K2CO3, DMF, 48 h bei RT, 88%; IV) Et3N•3HF, MeOH, 16 h bei RT

Da diese Reaktionen nicht zum gewünschten Produkt führten, wurde versucht, die Kombination aus primärem Amin, Linker und terminalem Dioctadecylamin direkt mit dem Imidazolid umzusetzen. Zur Darstellung eines derartigen Konstruktes wurde zunächst Dioctadecylamin unter Rückfluss mit frisch destilliertem Acrylnitril zum 3-dioctadecylaminopropionitril 60 umgesetzt, welches anschließend mit LiAlH4 (Davis, 2004 ; Giorgi et al., 2003 ; Gottarelli et al., 2000 ) oder NiCl2•6H2O(Dorn et al., 1984 ) und NaBH4 in das Amin reduziert wurde. Alternative Versuche die Reduktion des Nitriles durch Pd(OH)2/C katalysierte Hydrierung vor zunehmen, schlugen fehl. Wird die Hydrierung in Essigsäure als Lösungsmittel durchgeführt, entsteht bemerkenswerterweise unter C-N-Bindungsknüpfung das Dipropyltriamin 63 mit vier Dodecylresten. Weitere Versuche das Nitril im Basischen mit Wasserstoffperoxid in das Acetamid zu überführen misslangen. Im Gegensatz verlief die Hydrolyse des Nitriles im sauren Medium quantitativ(Jones et al., 1990 ). Eine anschließende Reduktion von 6 2 mit BF3•OEt2 und NaBH4 ( Satoh et al., 1969 ) scheiterte ebenfalls.

↓47

Abbildung 54: Synthese des N,N-Bis-octadecyl-1,3-aminopropylamin 61: I) Acrylnitril, 18 h unter Rückfluss, Quant.; II) LiAlH4, Et2O, 4 h unter Rückfluss, 87% oder NiCl2•6 H2O, NaBH4, CH2Cl2 : MeOH 5:1, 16 h bei RT, 90%; III) TFA, H2SO4 (konz.), 32 h bei 60°C, Quant.; IV) BF3•OEt2, THF, 5 h unter Rückfluss und 16h bei RT; V) Pd(OH)2/C, 1atm H2, CH3COOH, 16h bei RT

Anschließend ließ sich das 3-Dioctadecylaminopropylamin 61 in 74% Ausbeute mit dem Imidazolid 49 umsetzen. Eine nachträgliche Entschützung mit Et3N•3HF führte in 73% Ausbeute zu dem Zielprodukt 6 5.

Abbildung 55: Synthese von O2´-((Dioctadecylamino)ethylcarbamoyl))-2´-desoxyuridin 65: I) N,N-Bis-octadecyl-1,3-aminopropylamin, CH2Cl2, 21 d bei RT, 74%; II) Et3N•3HF, 2 h bei RT, 73%

↓48

Für späterer AFM–Untersuchungen und auch für mögliche Untersuchungen von einzelnen Nukleosiden in Lipidmembranen, konnte mittels der Carbamatroute die Octadecylamingruppe auch in die anderen drei Nukleoside, des Adenosins, des Guanosins und des Cytidins eingeführt werden, so dass komplementäre lipophile Nukleoside zur Verfügung standen (s. Abb. 56). Die einzelnen Nukleoside wurden mit der TIPDSCl–Schutzgruppe an der O3´- und O5´-Position in guten Ausbeuten geschützt und anschließend in einer Eintopfreaktion zuerst mit CDI und das entstandene Carbamat anschließend mit dem Amin umgesetzt. Die geschützten Nukleolipide wurden in 45%-72% Ausbeute erhalten. Nach der Entfernung der Schutzgruppe mit Triethylamintrihydrofluorid wurden die gewünschten Nukleoside in moderaten bis guten Ausbeuten erhalten (s. Tab. 3). Die geringen Ausbeuten bei der Entschützun g des Guanosins lassen auf supramolekulare Wechselwirkung dieses Amphiphiles zurückschließen. Denn es wurde zunächst eine geleeartige Masse isoliert, welche wahrscheinlich durch die Ausbildung von tetrameren Guanosin-Komplexen unter Einlagerung von Lösungsmittel zu erklären ist(Brown et al., 1958). Durch Trocknung dieses Geles im Vakuumtrockenschrank wurde 68 b als ein Feststoff gewonnen.

Tabelle 3: Einführung von Octadecylaminocarbamatgruppen in Adenosin, Guanosin, Cytidin

Nukleobasen (R)

Schritt I

Schritt II/ Schritt III

Schritt IV

Adenin (a)

80%

62%

76%

Guanin (b)

96%

55%

29%

Cytosin (c)

89%

45%

68%

Abbildung 56: Synthese der O2´-(Octadecylcarbamoyl)nukleoside: R = Adenin, Guanin, Cytosin I) TIPDSCl, Pyridin, 24 – 48 h, 0°C - >RT; II) CDI, CH2Cl2, 24 – 72 h bei RT; III) C18H37NH2, CH2Cl2, 48 h bei RT; IV) Et3N•3HF, THF, 16 h bei RT

2.3 Synthese von Uridin-2´-Thioethern und Uridin-2´-Disulfiden

↓49

Das O2,O2´-Anhydrouridin erwies sich als eine gute Ausgangsverbindung zur Einführung weiterer nukleophiler funktioneller Gruppen in die 2´-Position des Uridins. Nach einer Vorschrift von Divakar et al.(Divakar und Reese, 1982 ) wurde es im Basischen mit 4-Methoxyphenylmethanthiol umgesetzt und anschließend das 4-Methoxytoluol im Sauren abgespalten. Dabei ist zu beachten, dass 2´-Thio-2-desoxynukleoside oberhalb von pH 6.5 bei Raumtemperatur eine glykosidische Spaltung eingehen können(Johnson et al., 1995 ). Es gelang weiterhin, die freie Thiolgruppe im Basischen mit verschieden Alkylbromiden in moderaten bis guten Ausbeuten zu alkylieren (s. Tab. 4). Da die meisten der verwendeten Alkylierungsesdukte nicht kommerziell erhältlich sind, wurden sie vorher aus den käuflich verfügbaren Substanzen dargestellt.

Der Dioctadecylether 71 wurde nach einer Vorschrift von Kates et al.(Kates et al., 1963 ) aus DL-Benzylglycerol und Octadecylbromid im Basischen erhalten. Anschließend wurde die Schutzgruppe durch Hydrierung über Pd/C entfernt und die freie Hydroxylgruppe mit NBS/PPh3 in quantitativer Ausbeute in das entsprechende Bromalkan 71 überführt. Nach der Umsetzung mit dem 2´-Thio-2´-desoxyuridin 69 konnte das Nukleolipid 70a, welches zwei Alkylketten trägt, isoliert werden. Auch die Darstellung der Bromide 73 und 74 erfolgte durch Umsetzung mit NBS/PPh3  aus den kommerziell erhältlichen d 33 -Hexadecanol oder But-3-en-1-ol in quantitativer Ausbeute. Das resultierende 2´-(Hexadec-1-ylmercapto)-2’-desoxyuridin 70b und das 2´-(d33-Hexadec-1-ylmercapto)-2’-desoxyuridin 70c wurden in NMR–spektroskopischen Untersuchungen eingesetzt, um die Beweglichkeit von Alkylketten in Lipidmembranen zu untersuchen (s. Abs. 2.9). In der Natur werden überwiegend zwei Anker verwendet, um Proteine oder Glykoside an Membranen zu binden. Von den Ankern ist gewöhnlich einer verzweigt. Aus diesem Grunde wurde zum einen 2´-Farnesylmercapto-2’-desoxyuridin 70e und auch dessen gesättigtes längeres Analogon 2´-Phytanylmercapto-2’-desoxyuridin 70i synthetisiert. Phytol wurde dabei mit Raney–Nickel in Methanol quantitativ zum Phytanol reduziert(Förting, 2008 ), welches nach der Umsetzung mit NBS/PPh3  das gewünschte Produkt 7 9  in 91% Ausbeute liefert. Das eingesetzte Farnesylbromid ist kommerziell erhältlich. Cholesterol ist als wichtiger Bestandteil von Membranen für dessen Stabilität verantwortlich und beteiligt sich zusammen mit Proteinen auch an der Ein- und Ausschleusung von Signalstoffen. Aus dem Grunde wurde auch ein 2´-Cholesterylacetylmercapto-2’-desoxyuridin 70 h dargestellt und erfolgreich in Membranverankerungsversuchen eingesetzt (s. Abs. 2.9). Die Synthese des verwendeten Cholesterolderivates 78 erfolgte nach einer Vorschrift von Elenkov et al.(Elenkov et al., 1995 ). Für spätere spektroskopische Untersuchungen wurden als Fluoresenzmarker ein Pyrenderivat zu 70f und ein Dansylderivat zu 70g umgesetzt. Die Synthese von 77 ging von Dansylchlorid aus, welches zuerst im Basischen mit 1,6-Hexandiol quantitativ umgesetzt und anschließend die Hydroxylgruppe nach der schon erwähnten Vorschrift in das entsprechende Bromid überführt wurde. Pyrenbuttersäure wurde mit LiAlH4 quantitativ reduziert(Nishihara et al., 2005 ) und anschließend in das Bromid 76 überführt.

Abbildung 57: Allgemeine Synthese von S2´-alkylierten Thiouridinen

↓50

Tabelle 4: Alkylierung von 2´-Desoxy-2-thiouridinen

70

Edukt (R-Br)

Ausbeute

a)

13 %

b)

61 %

c)

75 %

d)

20 %

e)

81 %

f)

83 %

g)

67 %

h)

29 %

i)

42 %

Die Alkylierungen liefen mit stark variierten Ausbeuten, wobei kein Trend zu erkennen ist. Von 2´-Octadecylthiouridin 70b gelang es, eine Einkristallstruktur zu erhalten, anhand derer man sehr gut den Einfluss des amphiphilen Charakters auf das supramolekulare Verhalten solcher Nukleolipide erkennt. Über Van-der-Waals-Wechselwirkungen zwischen den Alkylketten einerseits und Wasserstoffbrückenbindungen zwischen NH3 und O4 und auch zwischen C5´OH und O4 anderseits kommt es zur Bildung von Schichtstrukturen. Wobei die Alkylketten in zwei aufeinanderfolgenden Schichten um 120° zueinander verdreht sind.

Abbildung 58: Einkristallstruktur von 70b

↓51

Ozaki et al.(Ozaki et al., 2000 ) beschrieben auch einen direkten Zugang zu 2´-S-alkylierte Nukleosiden, indem sie O2,O2´-Anhydrouridin im stark Basischen direkt mit 1-Hexanthiol umsetzten. Jedoch ist diese Reaktion nur mit kürzerkettigen Alkylketten möglich. Ebenfalls durch Ozaki et al.(Ozaki et al., 2001 ) wurden Oligonukleotide, welche 2´-Methoxycarbonylmethylthio-2'-desoxyuridin enthalten, synthetisiert und nachträglich mit verschieden Aminen (Heptylamin, Ammoniak, Diaminobutan) in die entsprechenden Carbamate überführt. Durch die Verwendung von 2´S-tritylgeschützen 2´-Thio-2´-desoxyuridin in der Oligonukleotidsynthese konnten auch 2-Alklythiooligonukleotide in einer Postmodifikation erhalten werden. Dabei wird die 2´S-Tritylgruppe im Oligonukleotid mit Silbernitrat abgespalten und das entstanden Thiohydroxidion alkyliert. Seeman et al.(Zhu et al., 2003 ) beschrieben die Synthese von „ladderoligomers“ (s. Abb. 59) in der Umsetzung von 2´-Thio-2-desoxyuridin mit geschützten 3-(Brommethyl)pentan-1,5-diamin und auch dessen Carboxylanalogon. Nach der Einführung dieser S2´-alkylierten Nukleoside in die Oligonukleotidsynthese, wurden die freien Aminogruppen und Carboxylgruppen miteinander verknüpft.

Abbildung 59: Verknüpfung von 2´-Thio-DNA-Monomeren zu „ladderoligomers“ nach Seeman et al.(Zhu et al., 2003 )

Patel et al.(Patel et al., 1980 ;Patel et al., 1980 ) beobachteten bei ihrer Synthese des 2´-Thio-2´-desoxycytidin ausgehend von O2,O2´-Anhydro-1-β-arabinosylcytosin, dass es im basischen Medium am 2´-Thio-3´-phosphatnukleosid 80 zu einer Wanderung des Phosphatrestes in die 2´-Position kommen kann und sich 2´-Thiophosphatnukleoside bilden. Diese Reaktion würde im Oligonukleotid zum Strangbruch könnte (s. Abs. 2.8)(Dantzman und Kiessling, 1996 ).

↓52

Abbildung 60: basische Überführung von 2´-Thio-3´-phosphatcytidin zum 2´-Thiophosphatcytidin

Neben der Umsetzung von 2´-Thio-2´-desoyuridin mit Alkylbromiden zu den Thioethern ist auch die Bildung von Disulfiden denkbar. Es gibt mittlerweile mehrere Möglichkeiten(Witt, 2008 ) um unsymmetrische Disulfide darzustellen. Die klassischen Reaktionen sind der Thiolaustausch am Disulfid, die Umsetzungen von Sulfenylchloriden mit Thiolen oder von Benzylsulfenaten mit Alkylthiosilanen. Hierbei trägt meistens einer der Thiolpartner eine gute Fluchtgruppe. Weitere Beispiele sind die Pyridyldisulfide (welches zum Pyridin-(2(1H)-thion reduziert wird) oder die Benzyldisulfide. Auch Bis-(5,5-dimethyl-2-thiono-1,3,2-dioxa-phosphorinanyl)disulfide (83), welche aus dem Thiol und dem Phosphorthioylsulfenylhalogen dargestellt werden, reagieren unter milden Bedingungen mit Thiolen zu unsymmetrischen Disulfiden(Antoniow und Witt, 2007 ). N-Trifluoracetyl-arenesulfenamide(Bao und Shimizu, 2003) (84) oder benzotriazolierte Thiole(Hunter et al., 2006 ) (85) sind ebenfalls sehr effektive Vorstufen für die Synthese von arylischen und aliphatischen unsymmetrischen Disulfiden.

Abbildung 61: Vorläufer für die Synthese unsymmetrischer Disulfide

↓53

In einer Mitsunobu ähnlichen Reaktion (s. Abb. 62) unterstützen DIAD(Mukaiyam.T und Takahash.K, 1968 ;Wnuk et al., 2004 86  oder das zyklische Analogon PTAD(Harusawa et al., 2004 87 die Bildung solcher unsymmetrischen Disulfide. Diese Variante wurde auch von uns favorisiert und in den folgenden Synthesen verwendet.

Abbildung 62: Mechanismus der Bildung des unsymmetrischen Disulfides am Beispiel des DIADs

Die Synthese des Disulfides 9 0 erfolgte zuerst durch die Umsetzung des 2´-Thio-2´-desoxyuridin 69 mit DIAD 86 und anschließend mit einem sehr großen Überschuss des Octadecylthioles in geringer Ausbeute. Durch Nutzung einer anderen Methode ließ sich das Disulfid 9 0 auch nach einer Vorschrift von Porcher et a l.(Porcher et al., 2005 ) direkt aus dem Octadecylsulfenylchlorid(Seliger und Gortz, 1980 ) und dem S2´-(4-methoxybenzylmercapto)-2’-deoxyuridin 89 in einem Gemisch aus CH2Cl2 : CH3COOH (1:1, v:v) in 37% Ausbeute darstellen (s. Abb. 63). Eine Umsetzung mit PTAD und dem 2´-Thio-2´-desoxyuridin 69 in einem Gemisch aus CH2Cl2 : CH3CN (5:3, v:v) und der anschließenden Umsetzung mit dem 11-Thio-1-(pyrenyl)undecan 9 1 ergab lediglich die symmetrischen Sulfide. Zu dem gleichen Ergebnis kam man auch, wenn man als Lösungsmittel ein Gemisch aus CH2Cl2 : DMF (3:2, v:v) oder nur Acetonitril verwendet. Erst ein Wechsel des Lösungsmittels zum Tetrahydrofuran brachte das gewünschte gemischte Disulfid 92 in guter Ausbeute.

↓54

Abbildung 63: Synthese der unsymmetrischen Disulfide: I)a) 1.0 eq. DIAD, THF, 16 h bei RT; b) 20 eq. C18H37SH, 72 h bei RT, 25% über 2 Stufen; II) 5.0 eq. Octadecylsulfenylchlorid, CH2Cl2:CH3COOH 1:1, 62 h bei RT, 37%; III)a) 1.0 eq. PTAD, THF, 14 h bei 40°C; b) 2.0 eq. Pyen-C11H22SH, 24 h bei RT, 75%

Das als Edukt verwendete 11-Thio-1-(pyrenyl)undecan 9 1 wurde ausgehend von Pyren selbst hergestellt. Die Friedel–Crafts-Acylierung des 11-Bromundecansäurechlorid mit Pyren und AlCl3 verlief quantitativ(Visscher et al., 2006 ). Ebenso die anschließende Überführung der Carbonylgruppe über eine Tosylhydrazinzwischenstufe nach einer Vorschrift von Zelikin et al.(Zelikin et al., 1999 ). Leider konnte nach der Reduktion der Zwischenstufe und einer darauf folgenden Umsetzung des Pyrenylundecylbromid mit Thioharnstoff kein Produkt isoliert werden.

Abbildung 64: Versuche zur Synthese von 11-Thio-1-(pyrenyl)undecan: I)a) 2.4 eq. SOCl2, über Nacht bei RT; b) 0.9 eq. Pyren, 1.1 eq. AlCl3, CH2Cl2, 0°C -> 45 °C, 4 h, Quant. II) 2.0 eq. TosNHNH2, DOWEX 50WX4 (H+), Benzol, 14 h unter Rückfluss, Quant. III)a) 5.0 eq. NaCNBH3, CH3COOH, 2 h bei 80 °C; b) 4.0 eq. NH2C(S)NH2, EtOH

↓55

Eine direkte Synthese des 11-Brom-1-(pyrenyl)undecans 9 7 gelang nach einer Vorschrift von Baba et al.(Babu et al., 2007 ) (s. Abb. 65). In der in der ersten Stufe der Eintopfreaktion InCl3 als Katalysator für die Friedel-Crafts-Acylierung zwischen dem Pyren und der Carbonsäure diente und in der zweite Stufe als Hilfsreagens für die Reduktion des entstandenen Ketons mit Dimethylchlorsilan. Dabei bildete sich das Produkt in 30% Ausbeute. Eine günstigere Variante ist die beschriebene Friedel-Crafts-Acylierung mit AlCl3 und einer anschließenden Reduktion des Ketons 94 mit Et3SiH in CF3COOH nach einer Veröffentlichung von Nakamura et al.(Nakamura und Hara, 2002 ). Das Pyrenyldodecylbromid 9 7 wurde im Nachhinein mit KSAc in das 11-Thioacetyl-1-(pyrenyl)undecan überführt. Eine anschließende basische Verseifung lieferte das Produkt 91 in guter Ausbeute, jedoch als Gemisch des Disulfides und des Thioles im Verhältnis 4:6.

Abbildung 65: Synthese des 11-Thio-1-(pyrenyl)undecan 91: I)a) 1.1eq. HSiMe2Cl, 0.3 eq. InCl3, 1,2-DCE, 8 h bei 80°C b) 3.0 eq. HSiMe2Cl, 16 h bei RT, 30% II) Et3SiH, CF3COOH, CCl4, 10 d bei RT, 57%; III) 2.0 eq. KSAc, THF, 16 h unter Rückfluss, 92%; IV) 7.0 eq. NaOH, 1-BuOH, 3 ½ h unter Rückfluss, 64%

Verschiedene Versuche (s. Tab. 5), das Disufild 99 reduktiv mit Dithiothreitol nach Cleland(Cleland, 1964 ) quantitativ in das Thiol zu überführen, schlugen fehl. Weitere Möglichkeiten, wie TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphin)(Ruegg, 1977 ), Natriumborhydrid, Selenocystein (Selenol)(Singh und Kats, 1995 ) oder andere(Jocelyn, 1987 ) wurden nicht ausprobiert, da die Disulfidbildung zu 2´-((11-Pyrenyl) undecandisulfidyl)-2´-desoxyuridin 92 auch bei dem Einsatz eines Überschusses des Gemisches aus dem Thiol 91 und dem Disulfid 9 9 in guter Ausbeute gelang (s. Abb. 63),

↓56

Tabelle 5: Versuche zur reduktiven Spaltung des Disulfides 99 mit DTT

Reaktionsbedingungen

a

DTT unter Argon in CH2Cl2

b

DTT unter Argon in CH2Cl2/ Et3N

c

DTT unter Argon in DMF

Eine Erklärung für die leichte Bildung des pyrenhaltigen Disulfides liegt wahrscheinlich an der beobachteten Excimerenbildung des 11-Brom-1-(pyrenyl)undecans 9 7 (anhand der aufgenommenen Fluoreszenz-Absorptionsmessungen (s.Abb. 66)). Denn es ist bekannt, das Pyren, aufgrund des aromatischen Ringsystems, ein angeregtes Dimer bildet ( exc ited   di mer = excimer). Bei der Excimerenbildung befinden sich ein Pyrenmolekül im Grundzustand und das andere Molekül im angeregten Zustand. Dadurch kommt es zu einer Veränderung der Emissionswellenlänge von ungefähr 380 für das Monomer auf 470 nm. Aus diesem Grunde werden Pyrene oder ihre Derivate häufig es in der Biologie verwendet wird, um Abstände zwischen Biomolekülen zu bestimmen oder um eine Zellfusion nachzuweisen. Bei letzterer kommt es bei einer Fusion zweier Zellen (Vesikel) zu einer Verringerung der Konzentration des Pyrenlipides in der Membran und durch die daraus resultierende fehlende Excimerenbildung zu einer Veränderung der Emissionswellenlänge.

Abbildung 66: Aufgenommenes Fluoreszenzemissionsspektrum von 97 in Dichlormethan

↓57

Abbildung 67: Excimerenbildung von Pyren in Ethanol. Spektrum ist auf 371.5 nm normalisiert 1) 2 mM Pyren mit Argon begast, um den Sauerstoff zu entfernen, 2) 2 mM Pyren unter Laborbedingungen, 3) 0.5 mM (Argonbegasung), 4) 2 μM (Argonbegasung) aus Invitrogen-Molecular Pr o bes Handbuch

2.4 „Click-Reaktionen“ an 2´-Azido-2´-desoxyuridin

Da sich in das O2,O2´-Anhydrouridin 41 bekanntermaßen leicht Azid einführen lässt(Kirschenheuter et al., 1994 ), wurde ins Auge gefasst, verschiedene lipophile Reste in Form der Alkine unter Bildung von 1,2,3 – Triazole mit dem Nukleosid zu verknüpfen.

Abbildung 68: Darstellung des 2’-Azido-2’-desoxyuridins als die Azidkomponente

↓58

Die Huisgen 1,3-Dipolare Cycloaddition(Huisgen, 1963 ;Huisgen, 1984 ) von organischen Aziden und Alkinen ist eine direkte Methode, um 1,2,3-Triazole herzustellen. Dabei fungiert die Azidkomponente als 1,3 Dipol und das Alkin als Dipolarophil. Aufgrund der hohen Aktivierungsenergie (ca. 24-26 kcal/mol) sind diese Cycloadditionen, sogar bei relativ hohen Temperaturen (80-120 °C), oft sehr langsam (12-24 h) und ergeben Regioisomerengemische von 1,4-substituierten bzw. 1,5-substituierten 1,2,3-Triazolen.

Abbildung 69: Regioisomerenbildung bei Azid-Alkin-Cycloaddition

Die Entdeckung, dass Kupfer(I)-Salze terminale Alkine mit Aziden effektiv und regioselektiv vereinen, ermöglicht eine Synthese von 1,4-disubstituierten 1,2,3-Triazolen unter milden Bedingungen. Sie wird deshalb der so genannten „Click-Chemie“ zugeordnet und findet gegenwärtig in einen kaum zu überschaubaren Maße Anwendung in der organischen und bioorganischen Chemie(Gil et al., 2007 ;Kolb et al., 2001 ;Rostovtsev et al., 2002 ) als Sharpless – Meldal - Clickreaktion.

↓59

Als Click-Reaktion bezeichnet man Reaktionen, welche modular und breit anwendbar sind, zu sehr hohen Ausbeuten führen und nur nicht störende Nebenprodukte liefern, die mit nichtchromatografischen Methoden einfach abgetrennt werden können. Außerdem muss die Reaktion stereospezifisch sein, unter einfachen Bedingungen ablaufen und sollte idealerweise nicht gegen Sauerstoff und Wasser empfindlich sein, sowie nur leicht erhältliche Ausgangsverbindungen und Reagenzien benötigen. Weiterhin sollten nur Lösungsmittel verwendet werden, die einen bequemen Einsatz erlauben, die leicht entfernbar sind und eine einfache Produktisolierung ermöglichen. Die Click-Reaktionen beziehen ihre Charakteristika aus starken thermodynamischen Triebkräften, die normalerweise Energiegewinne von mehr als 20 kcal/mol liefern. Sie verlaufen schnell und bis zum vollständigen Umsatz und haben die Tendenz, selektiv nur ein Produkt zu liefern.

Cu(I)-Spezies können direkt in Form von Cu(I)-Salzen (CuI, CuOTf•C6H6, [Cu(NCH3)4][PF6]) oder aber als Präkatalysator in Form von Cu(II)Salzen in die Reaktion eingebracht werden. Sogar ein leicht korrodierter Kupferdraht kann verwendet werden ( Jawalekar et al., 2008 )>. Diese Cu(I)-Salze benötigen, wenn katalytisch eingesetzt, in den meisten Fällen ein Äquivalent einer stickstoffhaltigen Base (z.B. 2,6-Lutidin, Triethylamin, Diisopropylethylamin, Pyridin oder TBTA ( Chan et al., 2004 )), welche die Oxidationsstufe +1 am Kupfer stabilisieren.

Abbildung 70: TBTA (Tris[1-benzyl-1H-(1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amin) 105

↓60

Cu(II)-Salze hingegen sind meist billiger und reiner als Cu(I)-Salze. Sie werden in situ durch Ascorbinsäure oder Natriumascorbat zur Cu(I)-Spezies reduziert und ermöglichen ebenfalls eine große Bandbreite von 1,4-Triazolprodukten in hohen Ausbeuten und Reinheit bei einer Katalysatormenge von 0.25-20 mol%. Als Beispiel sei hier CuSO4•5H2O genannt. Die in Abbildung 69 dargestellte Reaktion von Phenylpropargylether und Benzylazid verläuft in Anwesenheit von 5 mol% Natriumascorbat und 1 mol% Kupfer(II)-sulfat in einer 2:1 Mischung aus Wasser und tert-Butanol quantitativ zum 1,4-Isomer in wenigen Minuten. Zum Vergleich, ergibt die thermische Reaktion (92 °C, 18 h) dieser beiden Substrate beide Regioisomere im Verhältnis 1.6:1 zu Gunsten des 1,4-Isomers.

Ein mechanistischer Vorschlag für den Katalysezyklus der Kupfer(I)-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) ist in Abbildung 71 gezeigt(Rostovtsev et al., 2002 ). Er beginnt wie erwartet mit der Bildung des Kupfer(I)-acetylens I im Schritt A. Aufwendige Dichtefunktionaltheorie-Berechnungen ergaben, dass die konzertierte [3+2]-Cycloaddition (B-direkt) energetisch sehr ungünstig ist (12-15 kcal/mol) und deuten eher auf eine schrittweise Sequenz über II und III zu IV hin (B1-B2-B3). Hierbei wird das Azid durch die Koordination an dem Kupfer aktiviert (II, Schritt B1). Danach konvertiert II in einen ungewöhnlichen 6-gliedrigen Kupfer-Metallzyklus III. Nach einer Ringkontraktion entsteht die Zwischenstufe IV, welche anschließend in das Produkt zerfällt und den Katalysator freigibt. Die Regioselektivität wird im Schritt B2 festgelegt und durch die Koordination des Azids bzw. des Alkins am Kupfer zum 1,4-substituierten Triazol gelenkt.

Abbildung 71: vorgeschlagene Katalysezyklen für die CuAAC(Rostovtsev et al., 2002 )

↓61

Weitere Möglichkeiten zur Darstellung solcher 1,2,3-Triazole sind unter anderem die von Barluenga et al.(Barluenga et al., 2006 ) dargestellte palladiumkatalysierte Umsetzung von Alkenbromiden mit Aziden. Auch die Reaktion von Enolethern mit Aziden führte unter lösungsmittelfreier Synthese bei hohen Temperaturen zu den 1,2,3-Triazolen(Roque et al., 2005 ). In einer Eintopfreaktion war es Moses et al.(Barral et al., 2007 ) möglich, Amine mit Alkinen in der CuAAC zu den entsprechenden 1,2,3–Triazole umzusetzen. Dabei überführten sie das Amin mit tert-Butylnitrit und Azidotrimethylsilan in das Azid, welches ohne weitere Aufarbeitung mit dem Alkin reagieren kann. Es ist auch möglich, andere Regioisomere selektiv zu synthetisieren. Beispielsweise bildet sich das 1,5-disubstituierte 1,2,3-Triazol mit Alkyl-Magnesium-Grignard-Verbindung(Liu et al., 2005 ) oder mittels eines Ru(II)-Katalysators(Zhang et al., 2005 ). Ein weiterer Vorteil der Rutheniumkatalyse ist es, dass sowohl terminale als auch interne Alkine reagieren. Weiterhin können, je nach Wahl bestimmter Ru-Komplexe, beide Regioisomere (1,4- bzw. 1,5-Isomer) selektiv hergestellt werden. Im Gegensatz hierzu reagieren bei der CuAAC nur die terminalen Alkine.

Aufgrund der leichten Durchführbarkeit, der hohen Stereoselektivität und auch der guten Ausbeuten der CuAAC wird diese Reaktion auch vermehrt in der bioorganischen Chemie verwendet. So nutzten Nakane et al.(Nakane et al., 2008 ) die Cycloaddition, um ein Hairpin-Oligonukleotid oder ein Oligonukleotid-Duplex in ein Dumpbe l l-Oligonukleotid zu überführen (s. Abb. 72). Dabei bauten sie jeweils ein N3-(Propargyl)thymidin und ein N3-(Azidoethyl)thymidin in die Oligonukleotide während der Festphasensynthese ein und ließen anschließend, mit Hilfe von Kupfer(II)sulfat, TBTA und Natriumascorbat, das fertige Oligonukleotid eine 1,3-dipolare Cycloaddition eingehen. Diese Oligonukleotide zeigen eine hohe thermische Stabilität und eine exzellente Stabilität gegenüber Nukleasen. Außerdem können sie als Decoy („Köder“)-ODN eingesetzt werden, d.h. sie fangen in der Zelle spezifische Transkriptionsfaktoren ab und binden diese, so dass sie nicht mehr für die Transkription zu Verfügung stehen(Bielinska et al., 1990 ;Li et al., 2007 ).

Abbildung 72: Darstellung von „Triazol-cross-linked-ODN“ nach Nakane et al.(Nakane et al., 2008 )

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Mittels der Click-Reaktion konnten Jatsch et a l.(Jatsch et al., 2008 ) die positiven Eigenschaften von Polythiophenen (exzellente organische Semikonduktoren) und von Nukleosiden (molekulare Erkennung durch Watson–Crick-Basenpaarung) vereinen.

Abbildung 73: AFM–Bilder der 1:1 Mischung des Adenosinquarterthiophen und des Thymidinquarterthiophen

Carell et al.(Gramlich et al., 2008 ;Gramlich et al., 2008 ) nutzen die Reaktion, um ein Galactoseazid mit einem Oligonukleotid zu verknüpfen. Dabei synthetisierten sie das ODN mittels der PCR-Technologie, in dem sie drei natürliche Nukleotide und ein Nukleotid mit einer terminalen Alkingruppe an der Base (5-Position bei den Pyrimidinen und 7-Position an den Purinen) umsetzten.

↓63

Abbildung 74: Synthese von galactose-modifizierten Oligonukleotiden durch die Click-Reaktion

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde nun erstmals versucht, das 2´-Azido-2´-desoxyuridin 100 mit verschiedenen lipophilen Alkinen zu den entsprechenden 2´-Triazolyl-2´-desoxyuridin 106 umzusetzen (s. Abb. 75). Dazu wurden verschiedene Synthesewege im Rahmen einer studentischen Forschungsarbeit(LIT) untersucht (s. Tab. 6). Zum einen war es die Umsetzung mit einen Kupferdraht nach einer Vorschrift von vanDelft et al.(Jawalekar et al., 2008 ). Diese führte weder für das Dodecins, noch das eingesetzte Propargylcholesterol zu einem Produkt. Die Umsetzung des Dodecin, wie auch des Propargylcholesterol mit 100 lieferte jedoch unter CuI katalysierten Reaktionsbedingungen das Produkt 106a und 106c, wenn auch in schlechten Ausbeuten. Hierbei zeichnete sich ein Trend ab. Im Falle des Dodecin verwendeten wir 40 mol% CuI, im Fall des Propargylcholesterols nur 12.5 mol% CuI, was sich auch in der schlechteren Ausbeute (58% vs. 23%) widerspiegelte. Die Verwendung von 5 eq. CuI(Hanelt und Liebscher, 2008 ) brachte im Falle des Propargylcholesterol eine Ausbeute von 69%. Eine in der Literatur häufig verwendete Katalysemethode beruht auf der in situ Generierung von Cu(I) aus Kupfer(II)sulfat und Ascorbinsäure. Diese führte im Falle des Dodecylderivates 106c bzw. des Cholesterolderivates 106a zu einer ähnlichen Ausbeute, wie die Verwendung von CuI, jedoch bereits bei wesentlich kürzeren Reaktionszeiten.

Abbildung 75: Darstellung der synthetisierten N2’-(4-(n-alkyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-2’-desoxyuridine

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Tabelle 6: Synthesewege zur Darstellung der N2’-(4-(n-alkyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-2’-desoxyuridine

Edukt

Reaktionsbedingungen

Produkt/ Ausbeute

1

Kupferdraht,

AcCN/H2O,

72 h bei 35°C

10 6 c /

-

2

40 mol% CuI,

AcCN/H2O,

72 h bei 35°C

10 6 c/

58 %

3

40 mol% Natriumascorbat,

20 mol% CuSO 4 •5H 2 O, MeOH, 16h bei RT

10 6 c/

52 %

4

Kupferdraht,

AcCN/H2O,

72 h bei 35°C

10 6a/

-

5

12.5 mol% CuI,

AcCN/H2O,

72 h bei 35°C

10 6a/

23 %

6

5 equiv. CuI, AcCN/H2O,

72 h bei 35°C

10 6a/

69%

7

40 mol% Natriumascorbat,

20 mol% CuSO 4 •5H 2 O, MeOH, 16h bei RT

10 6a/

52 %

8

40 mol% CuI,

AcCN/H2O,

72 h bei 35°C

10 6b/

12 %

2.5 Reaktionen an 2´-Amino-2´-desoxyuridin

Eine weitere Möglichkeit, lipophile Reste in die 2´-Position von Nukleosiden einzuführen, sahen wir in der Synthese von 2´-Acylamidouridinen durch Umsetzung von 2´-Amino-2´-desoxyuridin und einem Carbonsäurederivat. Die Synthese des 2´-Amino-2´-desoxyuridin erfolgte über eine intramolekulare Cyclisierung von Trichloracetimidat nach einer Vorschrift von McGee et al.(McGee et al., 1996 ). Anschließend wurde die 3´-Position für eine folgende 2´-Amidierung mit TBDMSCl quantitativ geschützt. Jedoch führte weder die Umsetzung von 11 3 mit Palmitinsäure und DCC/HOBT, noch mit Palmitinsäure und EDC/DMAP zum Produkt 11 5. Die Umsetzung von 11 3 mit Ölsäurechlorid in CH2Cl2 mit der Base Triethylamin, erbrachte schließlich das Produkt 11 4 in 41% Ausbeute. Diese Methode wurde in unserem Arbeitskreis weiterentwickelt, so dass sich herausstellte, dass die Verwendung von NaOAc bessere Ausbeuten ergab(Kaczmarek et al., 2008 ). Einen sehr guten Übersichtsartikel über die Synthese und auch deren Eigenschaften von Acylamidonukleosiden gaben Richert und Grimfeldt(Richert und Grilmefeld, 2007 ).

Abbildung 76: Synthese von 2´-Amidouridinen: I) DMTrCl, DMAP, Pyridin, über Nacht bei RT, 90%; II)a) Cl3CCN, NaH, 18 h bei 90°C, 68%; b) 6 N NaOH, EtOH, 16 h unter Rückfluss, 57%; III) 2.0 eq. TBDMSCl, 8.3 eq. DBU, CH2Cl2, 16h bei RT, Quant. IV) n-C15H31COOCl, DCC, HOBT, DMF, 16 h bei RT; V) n-C15H31COOH, EDC, DMAP, CH2Cl2, 16 h bei RT; VI) n-C17H33COOH, Et3N, CH2Cl2, 4 h bei RT, 41%

↓65

Als eine Alternative zur Einführung von lipophilen Resten in die Aminogruppe von 2´-Amino-2´-desoxyuridin verfolgten wir die reduktive Aminierung. Wengel et al.(Christensen et al., 2003 ;Rosenbohm et al., 2003 ) führten über eine reduktive Aminierung 1-Pyrencarboxaldehyd in das 2´-Amino-2´-desoxyuridin 112 ein, um eine zusätzliche Stabilität der Duplexbildung mittels der Excimerenbildung des Pyrens zu erzielen. Raynar et al.(Bugaut et al., 2004 ) nutzen die 2´-Aminogruppe für eine Postmodifikation des Oligonukleotides durch kombinatorischen Einsatz verschiedener Aldehyde in einer reduktiven Aminierung. In Analogie zu einer Vorschrift von Wengel et al. gelang es 11 6 in 90% Ausbeute darzustellen (s. Abb. 77). Der zwei Octadecylreste tragende Glycerinaldehyd 118 lieferte dagegen nur in 12% Ausbeute das gewünschte Produkt 119. Die geringere Ausbeute von 11 9 gründet sich wahrscheinlich auf das verwendete heterogene Lösungsmittelgemisch.

Abbildung 77: Synthese von 2´- Aminouridinen: I) Dess-Martin-Reagenz, CH2Cl2, 4 ½ h, 0°C ->RT, Quant. II) 0.3 eq. NaCNBH3, MeOH: CycH (2:1, v:v), über Nacht 0°C ->RT, 12%; III) Nonanal, 0.3 eq. NaCNBH3, MeOH, über Nacht 0°C ->RT, 90%

2.6 Kreuzkupplungen an 2´-Iod-2´-desoxyuridin

2´-C-α-Hydroxyalkylsubstituierte Nukleoside werden seit einiger Zeit in den verschiedensten Bereichen der Biomedizin (Antisense- oder siRNA–Technologie) eingesetzt, denn sie bilden stabilere Doppelstränge als unmodifizierte DNA und sind gegenüber der Nukleasedegradation(Ora et al., 2005 ) resistent. Die Synthese solcher 2´-C-α-Hydroxyethylnukleoside (z.B. Uridin) erfolgt meist über eine radikalische Reaktion. Zuerst wird 3´-5´-geschütztes Uridin in den 2´-Phenylthiocarbonsäureester überführt und dieser mit Hilfe von AIBN und Allyltributylzinn in das 2´-C-α-Allyl-2´-desoxyuridin. Anschließend erfolgt die Umwandlung in die α-Hydroxyethylgruppe(Demesmaeker et al., 1993: ;Demesmaeker et al., 1993 ). Sukeda et al.(Sukeda et al., 2000 ) nutzten unter anderem das 2´-Iod-2´-desoxyuridin, welches sich durch säurekatalysierte nukleophile Substitution aus dem O2,O2´-Anhydrouridin 41 mit NaI sehr leicht in guter Ausbeute synthetisieren lässt, zur Darstellung von 2´-C-Vinyl-2´-desoxy- und 2´-C-hydroxyethyl-2´-desoxyuridin durch radikalische 3´-2´-Wanderung an 3´-Vinyluridin. Dabei konnten sie über die Konzentration des Tributylzinnhydrids steuern, welche 2´-Hydroxyethylisomere des Uridins dargestellt werden sollten. 2-Hydroxethyl entsteht über eine 6-endo-trig-Cyclisierung bei hoher Bu3SnH-Konzentration, während sich das 1-Hydroxyethyl über eine 5-exo-trig-Cyclisierung bei geringer Bu3SnH-Konzentration bildet.

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Abbildung 78: Postulierter Radikalmechanismus der Synthese von 2´-C-Vinyl-2´-desoxy- und 2´-C-hydroxyethyl-2´-desoxyuridin nach Sukeda et al.(Sukeda et al., 2000 )

Eine weitere Möglichkeit zur Darstellung von 2´-C-α-Alk(in)yl-2´-desoxynukleoside stellten Yoshimura et al.(Yoshimura et al., 1991 ) vor, indem sie die 2´-Hydroxylgruppe zum 2´-Ketonukleosid oxidierten und an dieses verschiedene Lithiumalkine in sehr guten Ausbeuten addierten.

Das 2´-Iod-2´-desoxyuridin sollte sich auch für C-C-Kupplungen in der 2´-Position eignen. Ausgehend von synthetischen Arbeiten und theoretischen Betrachtungen meiner Diplomarbeit, wollte ich diese Möglichkeit einer Kreuzkupplung zur Darstellung solcher 2´-C-α-alk(in)ylnukleoside untersuchen. Da eine allgemein anwendbare metallkatalysierte Kreuzkupplung von nicht aktivierten Alkylhalogeniden mit Nukleophilen noch nicht entwickelt worden ist, wurden verschiedene bekannte Kreuzkupplungsreaktionen ausprobiert. Die Ursachen für diese Schwierigkeiten einer sp3-sp3-Verknüpfung werden deutlich, wenn man den Mechanismus solcher metallkatalysierten Kreuzkupplungen betrachtet (s. Abb. 79).

↓67

Abbildung 79: Allgemeiner Mechanismus der metallkatalysierten Kreuzkupplung

Der erste Schritt jeder Kreuzkupplungsreaktion beginnt mit der oxidativen Addition des Elektrophils (R-X) an einen koordinativ ungesättigten, niedervalenten Metallkomplex (z.B. Pd(0)). Im Unterschied zu Allyl-, Benzyl-, Alkenyl- und Arylbromiden und -iodiden reagieren Alkylhalogenide (sogar CH3I) mit Pd(0)-Komplexen langsam(Ishiyama et al., 1991 ). Der zweite Schritt ist die Transmetallierung durch das Nukleophil. Wenn sich der Alkyl–Pd(II)-Komplex jedoch einmal gebildet hat, kann die Möglichkeit der Zersetzung durch eine schnelle β-Eliminierung von Wasserstoff bestehen, die mit der gewöhnlich langsameren Transmetallierung in Konkurrenz tritt. Die Bedingungen dafür, dass die β-Eliminierung stattfinden kann, sind unter anderem die Anwesenheit einer freien Koordinationsstelle und die Möglichkeit, dass die Metall-Kohlenstoff-Kohlenstoff-Wasserstoff-Atome koplanar angeordnet sind. Durch die Wahl von m-Trifluormethylstyrol, als Ligand für palladiumkatalysierte Reaktionen kann man die reduktive Eliminierung und Transmetallierung beschleunigen, sodass es zu keiner β-Eliminierung kommt. Auch die Zugabe eines Diens oder einer komplexierenden Base, bei nickelkatalysierten Kreuzkupplungen beschleunigt die Reaktion, durch Bildung eines Diallyl-NiII-Komplexes(Terao et al., 2002 ) oder durch die Komplexierung des Nickels. Die β-Eliminierung lässt sich bei der Suzukireaktion durch Verwendung des Ligandes PCy3, welcher ein guter Donor ist und der Base K3PO4 vermindern. Jedoch gilt dies nur für Alkylbromide(Netherton et al., 2001 ). Für Alkyltosylate, -iodide oder –chloride wurden andere Systeme vorgeschlagen(Fu et al., 2002 ;Kirchhoff et al., 2002 ;Netherton und Fu, 2002 ). Der Grund liegt vermutlich in den unterschiedlichen elektronischen und auch sterischen Eigenschaften der Halogenalkane und der Liganden, um einen koordinativ gesättigten PdII-Komplex, welcher für eine schnelle Transmetallierung und keine β-Eliminierung entscheidend ist, zu bilden. Der letzte Schritt der Kreuzkupplung ist die reduktive Eliminierung zum Produkt, wobei der Katalysator zurückgewonnen wird und einen neuen Zyklus eingehen kann. Jedoch verläuft diese reduktive Eliminierung bei s-Alkyl-π-Allyl-PdII-und Di-π-allyl–PdII-Komplexen langsam(Goliaszewski und Schwartz, 1984 ). Dieser Vorgang lässt sich in vielen Fällen durch Zugabe von Verbindungen beschleunigen, die in der Lage sind, den niedervalenten Zustand des Metalls zu stabilisieren; dies sind typischerweise Liganden mit π#SYMBOL#- Akzeptor -Eigenschaften. Somit könnte die Auswahl eines Additivs mit geeigneten koordinativen Eigenschaften diesen Schritt erleichtern. Trotz dieser Probleme wurde in jüngster Zeit von einigen Alkyl-Alkyl-Kupplungsreaktionen berichtet.

2´-Iod-2´-desoxyuridin ist bisher in keiner Kreuzkupplungsreaktion beschrieben worden. Erste Versuche zur C-C-Knüpfung von 1 20 mittels metallkatalysierten Reaktionen schlugen jedoch fehl. Die eisenkatalysierte Kreuzkupplung mit einer Grignardverbindung nach einer Vorschrift von Nakamura et al.(Nakamura et al., 2004 ) führte zu keinem isolierbaren Produkt. Auch die Verwendung von Nickel als Katalysator lieferte ein komplexeres Stoffgemisch(Terao et al., 2002 ). Knochel konnte zeigen, das Alkyiodide schneller mit Ni-Komplexen reagieren, als mit Palladiumkomplexen. Wahrscheinlich erfolgt dies über einen Radikalmechanismus. Die Kumadakreuzkupplung des 2´-Iod-2´-desoxyuridin mit dem Allylmagnesiumbromid wurde bei 0° in Analogie zu einer Vorschrift von Aebischer et al.(Aebischer et al., 2006 ) durchgeführt, brachte es aber zu keinem Produkt. Eine Suzukikupplung mit Phenylboronsäure(Charette und Giroux, 1996 ) lieferte nach HI-Abspaltung wahrscheinlich ein β-Eliminierungsprodukt des Uridins (Nachweis in der HPLC/MS).

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Abbildung 80: Kreuzkupplungen an 2´-Iod-2´-desoxyuridin: I) 5 mol% FeCl3, TMEDA, 3-MeOC6H4MgBr in THF (0.25 M), THF, -78°C -> 0°C, 1 h; II) 5 mol% NiCl2, TMEDA, AllylMgBr in THF (0.25 M), THF, -78°C -> 0°C, 1 h; III) 20 mol% PdCl2, 20 mol% (dppf)2, AllylMgBr in THF (0.25 M), THF, -78°C -> 0°C, 1 h; IV) PhB(OH)2, PPh3, K2CO3, TBAB, Pd(OAc)2, DMF, 48 h bei 70°C

2.7 Sonogashirareaktion an 5-Iod-2´-desoxyuridin

Untersuchungen zum Ankerungsverhalten in Lipidmembranen zeigten, dass die Position (2´-oder Nukleobase) des Lipidankers im Oligonukleotid keine Rolle spielen (s. Abs. 2.9.2). Aus diesem Grunde wurde für weitere Experimente auch einige Nukleoside über die bekannte Sonogashirareaktion an 5-Iod-2´-desoxyuridin mit einen lipophilen Anker versehen(Agrofoglio et al., 2003: ;Flasche, 2005 ;Flasche et al., 2004 ). Die Sonogashirakupplung ist eine palladiumkatalysierte Kreuzkupplung zwischen sp und sp2–hybridisierten Kohlenstoffatomen in Gegenwart von Cu(I). Im Grunde verläuft der Mechanismus ähnlich wie in Abbildung 79 dargestellt. Jedoch entsteht hier das Metallorganyl (Kupferalkin) in situ durch H-Metallaustausch. Als Besonderheit bei der Sonogashirareaktion von 5–Halouridinen ist die Bildung von Furanopyrimidinen zu erwähnen. Diese tritt verstärkt bei Verwendung größerer molarer Mengen an CuI oder zu hohen Temperaturen auf. Noch ist unklar, nach welchem Mechanismus diese Cyclisierung der Alkine verläuft. Yu et al.(Yu et al., 2000 ) vermuten einen baseninitiierten Mechanismus zur Bildung dieser Furanopyrimidone, wohingegen Robins et al.(Robins und Barr, 1983 ) eine metallkatalysierte Cyclisierung annehmen. Ein weiteres Problem solcher Sonogashirareaktionen ist die auftretende Glaserkupplung der Alkine, insbesondere, wenn die oxidative Addition der Arylhalogenide zu langsam ist. Dies kann vor allem bei Arylbromiden oder elektronenreichen Aryljodiden auftreten.

Abbildung 81: Reaktionsmechanismus der Sonogashirareaktion

↓69

Die Sonogashirareaktion verläuft in Anwesenheit von Aminen, wie Et3N, i-Pr2EtN oder Piperidin und CuI als Cokatalysator (5-20%). Dieser wird beigegeben, um die Alkine unter Bildung von Kupferacetyliden zu aktivieren (s. Abb. 82 Kreis B & B´). Bei der Verwendung von Pd(II)–Katalysatoren kommt es in diesem Schritt (ii & iii) zu einer Reduktion des Katalysators zu Pd(0). Die Pd(0)L2–Spezies reagiert anschließend in einer oxidativen Addition (i) mit der sp2–Halogenverbindung zur Pd(II)–Verbindung. Das aus dem Kreis B generierte Kupferacetylid reagiert nun in einer Transmetallierung (ii) zu einem Palladiumkomplex. Nach der reduktiven Eliminierung (iii) erhält man zum einen das gekuppelte Alkin und zum anderen den Katalysator zurück.

Für die Sonogashirareaktion an Nukleosiden oder Nukleobasen wurden optimale Reaktionsbedingungen unter der Verwendung von Pd(PPh3)4  als Katalysator (0.1 eq.), CuI als Cokatalysator (0.2 eq.), Et3N als Base (1.5–2.0 eq.) und DMF als Lösungsmittel gefunden(Flasche et al., 2004 ). Unter diesen Bedingungen wurden zwei neue Nukleolipide für spätere biophysikalische Untersuchungen dargestellt. Zum einen wurde das 5´-Iod-2´-desoxyuridin 12 4 mit Propargyltocopherol 12 6 in 53% Ausbeute zu dem Produkt 12 7 und zum anderen mit dem Cholesterolpropargylether 10 9 in 61% Ausbeute zu dem Produkt 12 9 umgesetzt. Beide Propargylether wurden aus den jeweiligen Alkoholen durch die Reaktion mit Propargylbromid in einem Gemisch aus THF und 50% KOH unter Phasentransferkatalyse bei 0°C gewonnen. Als Phasentransferkatalysator diente dabei TBAB.

Abbildung 82: Synthese der 5-Alkinyl-2´-desoxyuridine: I) Propargylbromid (80 wt% in Toluol), TBAB, THF, 50% KOH, 0°C ->RT, 16 h, 20%; II) Propargylbromid (80 wt% in Toluol), TBAB, THF, 50% KOH, 0°C ->RT, 16 h, 85%; III) 5 mol% Pd(PPh3)4, 10 mol% CuI, 2.0 eq. Et3N, DMF, 16 h bei RT, 53%; IV) 5 mol% Pd(PPh3)4, 10 mol% CuI, 2.0 eq. Et3N, DMF, 16 h bei RT, 61%

2.8 Synthese der Oligonukleotide

↓70

Das Phosphoramiditverfahren, welches von Caruthers eingeführt wurde, ist heutzutage die Methode der Wahl für die Kupplung von monomeren Nukleotiden an der Festphase. Es werden hierbei monomere Nukleotidbausteine als 3´-Phosphoramidite sukzessiv an einer Festphase miteinander verknüpft. Die Phosphoramidite erlauben, aufgrund ihrer hohen Reaktivität, quantitative Umsätze in sehr kurzer Zeit. Der Aufbau der Sequenz erfolgt vom 3´- zum 5´-Ende, wobei bei Standardsynthesen ein „leader nuc leosid“ über ein 3´-Succinat mit einer geeigneten Festphase (z.B. CPG) verknüpft ist. Die als 3´-Phosphoramidit eingebrachten Nukleoside tragen an der 5´-Hydroxylgruppe eine säurelabile Schutzgruppe und an den exocyclischen Aminofunktionen der Basen basenlabile Schutzgruppen. Der Aufbau eines Oligonukleotides nach dem Phosphoramiditverfahren basiert auf einem sich für jeden monomeren Baustein wiederholenden Prozess (s. Abb. 83). Dieser Synthesezyklus besteht aus vier grundsätzlichen Schritten:

1. Coupling: Das Phosphoramidit wird durch die Zugabe einer schwachen Säure, wie 4,5-Dicyanoimidazol (DCI) oder 1-H-Tetrazol, aktiviert und an die 5´-Hydroxygruppe des immobilisierten Nukleosides gekoppelt.

2. Capping: Die nicht umgesetzten OH-Gruppen werden mit Essigsäureanhydrid acetyliert und somit für weitere Umsetzungen blockiert. Hierdurch lassen sich unerwünschte Nebenprodukte reduzieren

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3. Oxidation: Die Oxidation erfolgt mit wässriger Jodlösung und führt zum Phosphorsäuretriester.

4. Detritylation: Die säurelabile Tritylschutzgruppe (MMT, DMT) wird mit einer Dichloressigsäurelösung entfernt.

Nach vollendeter Sequenz werden das Oligonukleotid und die Schutzgruppen der Nukleobasen durch Behandlung mit wässrigem Ammoniak bei 55°C abgespalten

↓72

Abbildung 83: Synthesezyklus beim Phosphoramiditverfahren

Somit mussten auch die eingesetzten Nukleolipide in ein 5´-DMTr-geschützten-3´-phosphoramidit überführt werden.

Die Einführung der Dimethoxytritylschutzgruppe erfolgte nach dem Standardverfahren, durch Umsetzung des amphiphilen Nukleosides unter Argon in Pyridin und 1.1 eq. DMTrCl. Da in allen Fällen nach einer Stunde mittels DC kein vollständiger Umsatz festgestellt worden ist, wurden der Reaktionsmischung weitere 1.1 eq. DMTrCl hinzugefügt. Die Lösung wurde mit Methanol gequencht und das Produkt säulenchromatographisch aufgereinigt.

↓73

Abbildung 84: Allgemeine Synthese von 130: I) 2.2 eq. DMTrCl, DMAP, Pyridin, 1 ½ h – 48 h bei RT

Tabelle 7: 5´-DMTr-geschützte lipophile Oligonukleoside 130

Nr. 130.

Nukleoside

Ausbeute

a

90 %

b

90 %

c

Quant.

d

44 %

e

44 %

f

45 %

Die erhaltenden 5´-DMTr-geschützten Nukleolipide wurden anschließend in die entsprechenden Phosphoramidite überführt. Dabei wurde das 2-Cyanoethyl-N,N,N′,N′-tetraisopropylphosphordiamidit (CyTIPP) als Phosphorylierungsreagens im leichten Überschuss eingesetzt(Bannwarth, 1988 ;Bannwarth und Trzeciak, 1987 ). Als Base kam zum einen eine 0.45 M Tetrazollösung (in Acetonitril) zum Einsatz. Da diese trotz sorgfältigem Umgang sehr schnell Wasser zieht, wurde später zum 4,5–Dicyanoimidazol als Base übergegangen. Nach 2-3 h wurde das Produkt nach säulenchromatographischer Aufarbeitung in den meisten Fällen in guten Ausbeuten erhalten.

↓74

Abbildung 85: Allgemeine Synthese von 131: I) 1.1 eq. CyTIPP, 1.1 eq. 0.45 M Tetrazollösung oder 1.1. eq. 4,5-Dicyanoimidazol, CH2Cl2, 2 h – 3 h bei RT

Nr. 131

Nukleoside

Reaktionsbedingungen

Ausbeute

a

1.1 eq. CyTIPP, 1.1.eq. 0.45 M Tetrazollösung (in Acetonitril),

CH2Cl2, 2 h bei RT

70 %

b

1.1 eq. CyTIPP, 1.1.eq. 4,5-Dicyanoimidazol,

CH2Cl2, 2 h bei RT

78 %

c

1.1 eq. CyTIPP, 1.1.eq. 4,5-Dicyanoimidazol,

CH2Cl2, 3 h bei RT

30 %

d

1.1 eq. CyTIPP, 1.1.eq. 4,5-Dicyanoimidazol,

CH2Cl2, 3 h bei RT

78 %

e

1.1 eq. CyTIPP, 1.1.eq. 4,5-Dicyanoimidazol,

CH2Cl2, 3 h bei RT

51 %

f

1.1 eq. CyTIPP, 1.1.eq. 4,5-Dicyanoimidazol,

CH2Cl2, 3 h bei RT

25 %

Es wurden eine Reihe von neuen lipophil modifizierten Oligonukleotide erfolgreich bei der Firma BioTeZ Berlin – Buch GmbH im 1000 nmol Maßstab synthetisiert.

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Monomer L

Sequenz, Nummer in der Datenbank

Oligo1

a) 5´-LTT-TTT-LTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T-3´(25mer) D18-1

b) 5´-LTT-TTT-TLT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T-3´(25mer), D 33

Oligo2

a) 5´-LTT-TTT-LTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T-3´(25mer), D18-2

b) 5´-LTT-TTT-TLT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T-3´(25mer), D34

Oligo3

a) 5´-LTT-TTT-LTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T-3´ (25mer), failed

Oligo4

a) 5´-TLT-TTC-TCA-CCT-TCC-ATC-TAT-TCC-GTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-3´ (42mer ), D64

b) 3´-TLT-TTG-AGT-GGA-AGG-TAG-ATA-AGG-CA-5´(26mer), D65 

Oligo5

a) 5´-LTT-TTT-LTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T-3´(25mer), D5 1

b) 5'- TLC-CCC-CLT-TTT-TGT-CGC-TTC-AGC -3'(24mer), D5 3

c) 5´-TLC-CCC-CLT-TGC-TGA-AGC-GAC-AAA-3' (24mer), D54

d) 5'- TTC-CTG-GAA-GCA-GGT-TLC-CCC-CLT-3´(24mer), D55

e) 5´-TLT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-LT-3´ (32mer), D61

Oligo6

a) 5´-TLT-TTC-TCA-CCT-TCC-ATC-TAT-TCC-GTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-3´ (42mer ), failed

Es zeigte sich deutlich, das Monomere, welche eine Disulfidgruppe in 2´-Position enthalten, nicht für die Oligonukleotidsynthese geeignet sind Warum dies ist so ist, konnte nicht eindeutig geklärt werden, da Disulfide auch kommerziell in der Oligonukleotidsynthese eingesetzt werden, um Thiolanker an der 3´. oder 5´-Position zu schützen. Eine mögliche Erklärung wäre eine Spaltung des Disulfides durch einen nukleophilen Angriff des Ammonium-Iones (Abspaltung des Oligonukleotides vom Harz mit wässrigem Ammoniak bei 55°C). Das daraus generierte Sulfid kann nun intramolekular das Phosphat unter Strangbruch angreifen, wie es von Thiophosphaten bekannt ist. Auch ein Angriff des Phosphates auf das Disulfid unter Spaltung jenes wäre denkbar.

Mehrere ältere Arbeiten(Dantzman und Kiessling, 1996 ;Hamm und Piccirilli, 1997 ;Johnson et al., 1995 ;Patel et al., 1980 ;Reese et al., 1994 ) untersuchten die Labilität der glykosidischen Bindung von 2´-Thio-2–desoxynukleosiden und stellten unter anderem fest, dass 2'-Thiouridylyl-(3'->5')-uridin unter sauren, neutralen und basischen Bedingungen bei Anwesenheit von Sauerstoff dimerisieren kann, was eigentlich nicht verwunderlich ist. Beachtenswert ist nur, dass sie anschließend unter basischen Bedingungen (pH 9 bei Raumtemperatur) leicht fragmentieren, zum Uracil oder Uridin 2'-thiophosphat (s. Abb. 86). In Tabelle 10 sind die HPLC-Flächenprozente der jeweiligen detektierten Substanzen zu erkennen. Dabei wurde das Nukleotid 20 h bei dem jeweiligen pH–Wert gerührt und anschließend untersucht. Die Experimente wurden in Abwesenheit von 2-Mercaptoethanol und auch in Anwesenheit jenem (Werte in den Klammern) durchgeführt. Diese basischen Bedingungen sind beim Abspalten des Oligonukleotides vom Harz gegeben, was vielleicht erklärt, warum trotz erfolgreicher Kupplung, kein Produkt isoliert werden konnte.

↓76

pH- Wert

% Substrat (Nukleotid)

%Dimer

%Aglycon

1

8.0

13.7 (17.5)

39.0 (1.1)

34.3 (67.0)

2

9.0

8.9 (13.5)

31.6 (0.5)

42.2 (65.9)

Abbildung 86: Mögliche Mechanismen zur beobachteten Spaltung von 2´-Thio-2–desoxynukleotiden im Basischen(Johnson et al., 1995 )

2.9 NMR-Spektroskopische Untersuchungen

2.9.1  Untersuchungen an Nukleosiden

Die Festkörper-NMR-Spektroskopie erwies sich in den letzten Jahren als sehr nützliches Werkzeug, um das Bindungsverhalten und die Struktur von Biomolekülen, wie z.B. Proteinen oder Nukleinsäuren zu untersuchen(Baglioni et al., 1997 ;Bonaccio et al., 1997 ;Cruciani et al., 2004 ;Reuther et al., 2006 ;Reuther et al., 2006 ;Scheidt et al., 2004 ;Zandomeneghi et al., 2001 ).

↓77

Die NMR-spektroskopischen Untersuchungen und auch die DSC–Messungen der dargestellten Nukleolipide und Oligonukleotide, welche in die Membran inkorporiert sind, wurden von Dr. Andreas Bunge und PD Dr. habil. Daniel Huster von der Universität Leipzig (vorher Martin Luther Universität Halle-Wittenberg) gemessen(Bunge, 2008 ). Die Ergebnisse werden im Folgenden gezeigt.

Die Phospholipidmembran besitzt eine bewegliche Mosaikstruktur, aufgebaut aus Lipidmolekülen, und kann eine große Anzahl verschiedener Moleküle akkumulieren oder binden. Dies kann jedoch zu einer geringfügigen Störung der Membran in der Kopfgruppe führen. Diese strukturellen und dynamisch charakteristischen Veränderungen in der Phospholipidmembran wurden mittels der 31P- und 2H–NMR-Spektroskopie untersucht(Seelig, 1978 ;Seelig und Seelig, 1980 ;Seelig und Waespesarcevic, 1978 ).

Abbildung 87: 31P-NMR Spektren der verschiedenen Phospholipidphasen

↓78

Als Modellmembrane wurden POPC-MLVs verwendet (s. Abb. 88), welche mit jeweils 25% des jeweiligen Nukleolipides inkubiert worden sind. Die Messungen erfolgten bei 30°C und einem Wassergehalt zwischen den Membranen von 40 wt%.

Abbildung 88: Struktur von POPC aus Wikipedia.org

Es zeigte sich anhand der Aufnahme von axialsymmetrischen 31P-Pulverspektren, dass es durch die Inkorporierung der Nukleolipide in der Membran zu keiner Störung der Kopfgruppe kommt und die POPC–Membran im lamellaren flüssig-kristallinen Zustand verbleibt. Eine Quantifizierung der Ergebnisse ließ sich aus der Breite des Peaks im 31P–Spektrum und der daraus erhaltenden Anisotropie der chemischen Verschiebung bestimmen (s. Tab. 11).

↓79

Abbildung 89: 31P–NMR–Spektren von POPC Membranen in Anwesenheit von 25 mol% 4/5 (A), 14 (B), 70b (D), 22 (E) und reinen POPC (F) als Referenz

Um diese Inkorporierung der lipophilen Nukleoside hinsichtlich der Packungseigenschaften der Membran zu untersuchen, wurden aus den erhaltenden 2H–NMR-Spektren Kettenordnungsparameterprofile als Funktion der Kohlenstoffposition des POPC–d31 extrahiert (s. Abb. 90, 91). Die Nummerierung der Palmitoylkette des POPC-d31 beginnt am Carbonyl-C-atom (C1). Aus diesen geglätteten 2H-NMR-Ordnungsparameterprofile und den 31P–NMR–Spektren konnten die in Tabelle 11 aufgeführten Daten mittels mathematischer Berechnungen ermittelt werden.

Abbildung 90: Geglättete 2H-NMR-Ordnungsparameterprofile der Proben POPC-d31 P (#SYMBOL#), 4/5/POPC-d31 (↓), 14/POPC-d31 (≤), 22/POPC-d31 (###), 70b/POPC-d31 (⋅), 70c/POPC (﹁)

↓80

Abbildung 91: Geglättete 2H-NMR-Ordnungsparameterprofile der Proben POPC-d31, OK268(70b)/ POPC-d31, OK-268-d 33 (70c)/ POPC-d31

Membran-

zusammen-setzung

Δσ/ppm

(Anisotropie der chemischen Verschiebung)

SAV

(durchschnitt. Ordnungsparameter)

⟨L C   ⟩/Å

(durchschnitt. Kettenlänge des POPC)

POPC

45.2

0.153

11.46

POPC/

4/5

43.4

0.162

11.74

POPC/

14

45.5

0.165

11.84

POPC/

22

44.1

0.167

11.88

POPC/

70b

44.7

0.154

11.51

POPC/

70c

k.A.

0.152

11.36

POPC/

128

45.6

0.169

12.04

POPC/

129

46.6

0.179

12.31

Anhand der Tabelle 11 konnten nur geringfügige Veränderungen in den chemischen Verschiebungen, den durchschnittlichen Ordnungsparametern (gibt in einem Phasenübergang die Symmetriebrechung an) und der durchschnittlichen Kettenlänge (gibt den gestörten Teil der POPC-Kette an) des POPCs gegenüber einer reinen POPC-Membran festgestellt werden. Dies spricht wiederum für eine gute Inkorporierung der Nukleolipide in die Membran. Jedoch sei hier noch auf einige Besonderheiten hinzuweisen. Zum einen zeigt sich eine Erhöhung der Ordnungsparameter für die Acylnukleoside 4/5, 1 4 und 22 gegenüber den Alkylnukleosiden 70b und 70c, was wahrscheinlich auf das Fehlen der Carboxylgruppe zurückzuführen ist und es somit, aufgrund der Ähnlichkeit zum POPC, zu einer besseren Einlagerung des Nukleolipides zwischen den Acylketten des POPCs kommt. Dies zeigt sich auch in den daraus resultierenden höheren Werten der durchschnittlichen Kettenlänge. Ebenso gilt dies für die Nukleolipide 128 und 129, deren durchschnittliche Kettenlänge nochmals höher ist, als bei den Nukleolipiden mit dem lipophilen Rest am Zucker, was auf eine bessere Membranbindung und eine höhere Ordnung des POPC-Membranes hinweist.

↓81

Abbildung 92: Geglättete 2H-NMR-Ordnungsparameterprofile der Proben POPC-d31, OK345(70h)/ POPC-d31, OK 388(129)/ POPC-d31 im Vergleich zum Cholesterol unter den angegeben molaren Verhältnissen

Ebenso wurden aus den erhaltenden 2H–NMR-Spektren der cholesterolfunktionalisierten Oligonukleotide Kettenordnungsparameterprofile als Funktion der Kohlenstoffposition des POPC–d31 extrahiert (s. Abb. 92). Aus deren Abbildung wird deutlich, dass die cholesterolgebundenen Nukleoside 129 (OK 388) und 70h (OK 345), die Membran viel weniger ordnen, als Cholesterol. Das heißt, um eine höhere Ordnung in den Lipidmembrandomänen zu erzielen, braucht man viel mehr der Cholesterolnukleolipide, als von Cholesterol selbst(Binder et al., 2003 ;Vanmeer und Simons, 1983 ).

Durch die Verwendung eines deuterierten Alkylankers am Nukleosid ließen sich weiterhin Aussagen über die dynamischen (elastischen) Eigenschaften der Membran in Gegenwart des lipophilen Nukleosides treffen. Dazu wurden 2H-NMR-Spin-Gitter-Relaxationsmessungen durchgeführt. Bei der Aufnahme von 2H-NMR-Spektren werden üblicherweise Phospholipide eingesetzt, bei denen die 1H-Atome nicht nur an einer Position durch Deuterium ersetzt sind, sondern eine oder beide Kohlenwasserstoffketten des Lipids vollständig deuteriert ist. Daher kommt es im 1H-Spektrum, aufgrund der Dynamik der Methylengruppen, zur Überlagerung der einzelnen Pake-Dubletts. Durch die Anordnung der Phospholipide in der Membran sind die Methylengruppen am Kettenanfang nahe des Glycerolrückgrats relativ rigide, verglichen mit den CH2-Gruppen am Kettenende, die eine hohe Beweglichkeit und damit geringe Ordnungsparameter aufweisen. Da die Ordnungsparameter insbesondere im oberen Kettenbereich sehr ähnlich sind, können die einzelnen Dubletts nicht mehr aufgelöst werden. Mittels eines mathematischen Algorithmus(Brown et al., 1994 ;Trouard et al., 1994 ), erhält man aus den ermittelten 2H-NMR-Spin-Gitter-Relaxationsmessungen einen sogenannten Square-Law - Plot (s. Abb. 94), dessen Anstieg im direkten Zusammenhang zu den elastischen Eigenschaften der Membran steht(Brown et al., 2000 ).

↓82

Abbildung 93: Square-Law Plots der Proben OK268(70b)/ POPC-d31, OK268-d33 (70c)/ POPC im Vergleich zu DMPC-d54 und POPC-d31

Aufgrund des sehr ähnlichen Kurvenverlaufes der Mischungen im Vergleich zu reinen Phospholipiden in Abbildung 93, kann man darauf zurückschließen, dass die elastischen Eigenschaften der Membran erhalten bleiben und es zu einer guten Durchmischung der Nukleolipide und der Phospholipide in der Membran kommt. Dies gilt wieder als ein Beweis für eine gute Inkorporierung der verwendeten Nukleolipide.

Nachdem anhand unterschiedlicher Methoden gezeigt wurde, dass die verwendeten Nukleolipide in Phospholipidmembranen verankern und auch die Membran nur geringfügig stören, sollte nun untersucht werden, ob die Nukleobasen für eine Watson–Crick–Basenpaarung mit in Lösung befindlichen komplementären Nukleosiden oder Oligonukleotiden genutzt werden können. Denn wie in Kapitel 1.3 beschrieben, zeigten bisherige Versuche, dass Nukleolipide, welche den lipophilen Rest an der Nukleobase tragen, zu tief in die Membran ragen und somit nicht mehr für eine Basenpaarung zu Verfügung stehen. Um dies zu untersuchen, wurde die bevorzugte Lokalisation der lipophilen Nukleoside innerhalb der Membranmatrix mittels 1H-NOESY-NMR-Spektroskopie unter MAS bestimmt (Huster et al., 1999 ). Dabei ist zu beachten, dass die 1H-Spektren durch die Signale des POPC dominiert werden und somit die Methylen- und die Methylgruppen der Lipidanker zwischen ~0.9 bis 2.5 ppm in einem großen Peak untergehen. Auch die meisten Protonen des Zuckers sind von dem Glycerolgerüst des Phospholipid überlagert. Aus diesem Grunde können nur wenige charakteristische Signale der Nukleolipide aufgelöst und eindeutig zugeordnet werden. Dies wären das H1´, das H5 und das H6-Proton (s. Abb. 94). Glücklichweise sind dies genau die Protonen, welche entscheidend sind, um aufklären zu können, wie weit das Nukleolipid in der Membran verankert ist. Bei den entsprechenden NOESY–Messungen macht man sich den Kern-Overhauser-Effekt nutzbar, der beschreibt, dass es zu einem Austausch der Spinmagnetisierung kommt, wenn die Abstände beider Kerne kleiner als 5 Å sind. Dies wird im Spektrum als Kreuzpeaks sichtbar. Da die Nukleolipide nicht starr in der Membran verankert sind, sondern sich darin frei bewegen, konnten keine definierten Abstände gemessen werden. Es konnten lediglich Aussagen darüber getroffen werden, wie wahrscheinlich ein Proton mit einem anderen in Wechselwirkung tritt und ob es zwischen beiden zu einem Austausch ihrer Spinmagnetisierung kommt, was zu einer höheren Kreuzrelaxationsrate führt. Aus diesem Grund wurden für jede Probe mehrere NOESY–Spektren aufgenommen und gemittelt. Aus den Messungen wurden anschließend folgende relativen Kreuzrelaxationsraten bestimmt und grafisch dargestellt (s. Abb. 95).

↓83

Abbildung 94: Darstellung der Protonen, welche im 1H-NOESY-NMR-Spektrum zugeordnet werden können

Abbildung 95: Normierte intermolekulare 1H-NOESY Kreuzrelaxationsraten zwischen den lipophilen Nukleosiden 4/5 (Symbol: Raute), 14 (Symbol: Quadrat) bzw. 22 (Symbol: Kreis ) und den POPC-Molekülen innerhalb der Membran als Funktion der Koordinaten der einzelnen Lipidsegmente entlang der Membrannormalen. Oben: Mittlere Lokalisation der Protonen H6 (A), H5 (B) des Uracils und des H1’ Protons der Ribose (C). Die Messungen wurden bei einem molaren Verhältnis POPC/lipophiles Nukleosid 4/1, einer Temperatur von 303 K und einer Rotationsfrequenz von ωr/2π = 6009 Hz durchgeführt.

Man erkennt aus der Abbildung 95, dass nur bei 4/5 und 22 hohe Kreuzrelaxationsraten zwischen H1´und der Kopfgruppe gemessen werden konnten. Dagegen weist 1 4 hohe Kreuzrelaxationsraten mit den Alkylketten des POPC auf, was für eine tiefe Verankerung in der Membran spricht und es somit nicht mehr zu einer Basenpaarung fähig ist. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass Nukleolipide mit mehr als einen Alkylanker nur dann für die Watson–Crick–Basenpaarung zur Verfügung stehen können, wenn sie einen Spacer zwischen dem Nukleosid und dem lipophilen Rest vorweisen.

↓84

Abbildung 96: Schematische Tiefendarstellung der Nukleolipide 14, 22 und 4/5 in der POPC- Membran

2.9.2 Untersuchungen an Oligonukleotiden

An Nukleosiden konnte belegt werden (s. Abs. 2.9.1), dass es entscheidend ist, dass sich der lipophile Rest am Zucker befindet, damit membranverankerte Nukleolipide für eine Basenpaarung zur Verfügung stehen können. Doch wie ist es mit Oligonukleotiden? Ist es dort auch entscheidend, an welcher Stelle der lipophile Anker hängt? Dazu einige grundlegende Aspekte. Zum einen haben wir von der Natur gelernt, dass viele membrangebundene Proteine zwei lipophile Anker für eine stabile Verankerung tragen. Weiterhin konnte an einigen Beispielen im Kapitel 1 gezeigt werden, dass Oligonukleotide für eine stabile Membranverankerung auch zwei lipophile Ketten tragen sollten. Diese Beobachtungen wurde bei der Wahl der Oligonukleotidsequenzen in den meisten Fällen Rechnung getragen, durch den Einbau zwei lipophiler Nukleotide. Des Weiteren zeigten bisherige Arbeiten aus unseren Arbeitskreis(Bunge et al., 2007 ;Kurz et al., 2006 ), dass Nukleotide, welche den Anker an der Nukleobase tragen, bei der Doppelstrangbildung nicht für eine Watson-Crick-Basenpaarung zur Verfügung stehen. Wahrscheinlich werden diese Nukleobasen zu weit in die Membran hineingezogen (s. Abb. 97). Es konnte nun erwartet werden, dass sich diese Situation ändert, wenn der Lipidanker am Zucker befestigt ist (s. Abb. 98).

Abbildung 97: Schematische Darstellung eines Oligonukleotides 5´-ULUU-UUU-UUUL-UUU-U-3´, wobei L der Anker an der 5-Position des Uridins ist.

↓85

Abbildung 98: Schematische Darstellung eines Oligonukleotides 5´-ULUU-UUU-UUUL-UUU-U-3´, wobei L den Anker an der 2´-Position des Uridins ist

Das 2´-lipidierte Nukleosid 70b wurde in eine analoge Oligonukleotidsequenz 5´-U L TT-TTT-TTU L -TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T-3´ (Oligo1b) eingebaut, wie sie auch bei den vorherigen Untersuchungen mit basenständigen Lipidanker(Flasche, 2005 ) verwendet wurde. Dabei ist L der lipophilen Anker an der 2´-Position des Uridins. Für NMR-Messungen wurde zusätzlich ein Oligonukleotid Oligo2b synthetisiert, das anstelle des Hexadecylthioether die perdeuterierte Kette trägt.

Abbildung 99: Monomer UL des untersuchten Oligonukleotides

↓86

Wie auch bei den Nukleosiden zeigten die 31P–Pulverspektren (s. Abb. 100), dass Oligonukleotide den Phasenzustand der Membran nicht stören, d.h. auch hier erhält man ein Spektrum, was für eine lamellare flüssig-kristallinen Phase der Membran spricht. Da im Gegensatz zu den Nukleolipiden durch das Phosphatrückgrat des Oligonukleotides weitere 31P einen Einfluss auf das Spektrum geben, sieht man einen zusätzlichen isotropen Peak. Dieser schmale Peak spricht für eine hohe Beweglichkeit des Phosphatrückgrates.

Abbildung 100: 31P-NMR-Spektrum von POPC Membranen in Gegenwart des lipophilen Oligonukleotid Oligo1b bei einem Wassergehalt von 65 wt% (303 K). Die isotrope Linie wurde grau hinterlegt

Δσ /ppm

SAV

⟨L C    ⟩ / Å

POPC(-d 31 ) +

5 mol% DOTAP

47,2

0,158

11,61

POPC/Oligo1 b +

5 mol% DOTAP

44,3

0,154

11,50

POPC(-d 31 )

45,2

0,154

11,48

↓87

Abbildung 101: Geglättete 2H-NMR-Ordnungsparameterprofile der Proben POPC-d31 (Symbol: Quadrat), Oligo7/POPC-d31 (Symbol: Quadrat), Oligo8/POPC-d31 (4), POPC-d31 + 5 mol% DOTAP (Symbol: Kreis) und Oligo1b/POPC-d31 + 5 mol% DOTAP (Ι) bei einem eingesetzten molaren Verhältnis POPC/Oligonukleotid 100/1 (für Oligo1b 200/1), Wassergehalt von 65 wt%, 303 K

Zur Bestimmung der Ordnungsparamter des Phospholipidmembran wurden 2H–Spektren aufgenommen (s. Abb. 101). An diesen erkennt man, dass die verankerten Oligonukleotide die Ordnung der Membran kaum stören, was für eine gute Inkorporierung spricht. Dabei sind die Oligonukleotide Oligo 7 und Oligo 8 jene, welche den lipophilen Rest als Tocopherol an der 5-Position der Base tragen(Flasche, 2005 ) und das Oligonukleotid Oligo 1 b dasjenige, mit dem 2´-lipidierten Nukleosid 70b.

Die Darstellung des 2H-Spektren, aus denen die obengenannten Daten gewonnen wurden, zeigen sehr deutlich den großen isotropen Peak bei der Messung des Oligonukleotides Oligo2b mit dem deuterierten lipophilen Rest (s. Abb. 102 A), was wie oben schon erwähnt, für eine gute Beweglichkeit des Oligonukleotides spricht und demzufolge für eine schlechte Insertierung in die Membran. Die Verankerung ist demnach für diesen Fall schlechter, als bei der Verwendung von Oligonukleotiden mit einem Tocopherolanker an der 5-Position der Base, weswegen auch erst eine Zugabe von 5 mol% DOTAP (ein positiv geladenes Lipid) eine erfolgreiche Insertierung ermöglicht (s. Abb. 102 B). Durch 2H-NMR Spin-Gitter-Relaxationsmessungen konnte bei den Oligonukleotiden keine Störung der Membranelastizität festgestellt werden.

↓88

Abbildung 102: 2H-NMR-Spektren der Proben (A) Oligo2b-d66/POPC, (B) Oligo1b/POPC-d31 + 5 mol% DOTAP und (C) POPC-d31 + 5 mol% DOTAP bei einem Wassergehalt von 65 Gewichtsprozent. Die Spektren wurden bei 303 K aufgenommen. Die roten Linien sollen dem Leser bei der Bestimmung der Position der Plateaupeaks helfen

Es konnte gezeigt werden, dass das Oligonukleotid Oligo1 b in Membranen insertiert, wenn auch schlechter als die Oligonukleotide Oligo7 oder Oligo 8 mit nukleobasenständigen Anker. Die Struktur der Phospholipidmembran wird dabei nicht gestört. Doch sind nun die erwartenden Basenpaarungen an den ankertragenden Nukleotiden möglich? Weiterhin ist zu klären, ob 2`-modifzierte Nukleoside die Duplexbildung der DNA stabilisieren oder destabilisieren. Kottysch et al.(Kottysch et al., 2004 ) konnten zeigen, dass die Einführung von 5-modifzierten Uridin in einer DNA die Tm des Duplex über einen großen Bereich beeinflussen (+3.6 °C bei 10mM NaCl eines 12mer). Um diese Fragestellungen zu klären, bediente man sich der DSC–Messung(Duguid et al., 1996 ). Unter anderem fanden Letsinger et al.(Letsinger et al., 1993 ) bei der Bestimmung von Schmelztemperaturen von Oligonukleotiden, dass durch die Anwesenheit von zwei hydrophoben Gruppen (Cholesterol) die hydrophoben Kräfte zwischen dem Cholesterol so stark sind, das ein polyA und ein polyT–Strang eine normalerweise instabile, parallele Orientierung aufweisen.

Für die im Zusammenhang mit der vorliegenden Arbeit durchgeführten DSC–Messungen wurde zuerst eine Kalibrierungskurve durch Messungen der Schmelztemperaturen von 10T/10A-, 15T/15A-, 20T/20A- und 25T/25A-Duplexen ermittelt. Anschließend wurden die Schmelztemperaturen der lipophilen Oligonukleotide und ihre komplementären Partnern (A25) zum einen in Lösung und zum anderen membranassoziert gemessen. Die Messung der Oligonukleotide Oligo8 und Ol i go1 wurden bei höherer Salzkonzentration durchgeführt (150 mM KCl, statt 50 mM KCl, wie bei dem Oligonukleotid Oligo7 und dem unmodifizierten Oligonukleotid). Zum einen stellte es sich heraus, das die lipohilen Oligonukleotide in Lösung mehr Basenpaarungen eingehen, als in der Membran, nämlich statt 17 sind es 19 Basenpaare, was für eine Einbeziehung des lipophilen Nukleosides in Lösung spricht. Dem ist aber nicht so, wenn es membrangebunden ist. Zum anderen erkennt man eine um ~4 BP geringere Affinität gegenüber einem unmodifizierten Oligonukleotid Oligo10 mit der Sequenz 5´-CTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3´. Die beiden Cytidine in der Sequenz sollen eine Fehlpaarungen simulieren. Diese verringerte Basenpaarung bestätigt den störenden Einfluss des lipophilen Ankers bei der Doppelstrangbildung. Somit ist es gleich, wo sich der lipophile Anker am Nukleosid befindet, denn weder verbessert die Position im Nukleosid die Duplexbildung des Oligonukleotides noch findet eine Basenpaarung über das Nukleotid mit dem lipophilen Rest hinweg statt.

↓89

Oligonukleotid

Schmelztemperatur TM /°C

Anzahl Basenpaarungen n

Oligo 7 (Membran)

39,5

17,5

Oligo8 (Membran)

44,4

15,8

Oligo1b (Membran)

47,2

17,4

Oligo1b (Lösung)

50.0

19,4

Oligo10 (Lösung)

46,1

22,9

Abbildung 103: Darstellung der für die molekulare Erkennung komplementärer Nukleinsäuren aktiven Bereiche der membranassoziierten lipophilen Oligonukleotide. Der blaue Balken gibt den Teil der lipophilen Oligonukleotide an, der mit komplementären Strängen eine Helix ausbilden kann

2.10 Untersuchungen an LB-Filmen

In Kapitel 1.2.2 wurde beschrieben, dass die von Ahlers et al.(Ahlers et al., 1990 ) untersuchten Nukleolipide an der Wasser-Luft-Grenzfläche stabile Monolayer von Langmuirfilmen bilden, wobei die hydrophile Kopfgruppe mit der Subphase und der hydrophobe Teil mit der Atmosphäre in Verbindung stehen. An der im Rahmen der vorliegenden Arbeit synthetisierten Nukleolipide 4/5  wurden von Dr. Osvaldo Novais de Oliveira Jr. am physikalischen Institut der Universität Sao Paulo Langmuir-Blodgett-Untersuchungen auf einen festen Träger durchgeführt. Die experimentellen Details seihen bitte aus seinen Arbeiten zu entnehmen. Die Ergebnisse werden im Folgenden gezeigt.

↓90

Ein wichtiges Hilfsmittel zur Untersuchung der physikalischen Eigenschaften und zur Übertragung einer oder mehrer Schichten auf feste Substrate (z.B. einen Glasobjektträger) ist die Filmwaage(Albrecht et al., 1978 ;Roberts, 1990 ). Dies ist ein mit Teflon behandelter Trog, der die Subphase enthält, meist hochreines Wasser. Das Nukleolipid wird in Chloroform gelöst und dann auf die Oberfläche gespreitet. Durch eine bewegliche Barriere kann die der Monoschicht zur Verfügung stehende Oberfläche variiert werden. Bei der Kompression durchläuft die quasizweidimensionale Monoschicht den dreidimensionalen Systemen analoge Aggregatzustände: gasförmig ungeordnet, flüssig-analog und kondensiert. Demzufolge lassen sich auch für Langmuirfilme Druck-Flächen-Diagramm erstellen. Ein solches Diagramm (π-Å2, isotherm) von 4/5 (OK 211) ist in Abbildung 104 dargestellt. Dabei wurden unterschiedlichen Mengen des Nukleolipides (1-4 μl) auf die Oberfläche gespreitet. Aus dem Diagramm ist zum einen zu entnehmen, das der Kollapsdruck oberhalb 40mN/m liegt und zum anderen, dass die Moleküle bei kleineren Volumen in der flüssig-kondensierten Phase einen Platzbedarf von 70-90 Å2  benötigen. Dieser Platzbedarf steigt jedoch deutlich zu höheren Volumina an. Weiterhin lässt sich ablesen, dass diese Nukleolipide sich ähnlich dem Phospholipid verhalten. Wie auch bei den Phospholipiden bildet das Nukleolipid 4/5 zwischen der L2 (liquid condensed phase) -L1 (liquid fluid phase)-Phase eine horizontale Übergangsphase.

Abbildung 104: Druck-Flächen (π- Å2)-Diagramm (isotherm) von 4/5

Wird nun eine Mischung des Nukleolipides 4/5 und einem Phospholipid (z.B. DPPC) auf der Filmwaage gespreitet, erhält man die in Abbildung 105 dargestellte Isotherme. Es zeigt sich, dass sich die Isothermen zu größeren Flächen verschieben, wenn das Volumen an 4/5 erhöht wird, was für eine gute Inkorporierung in die DPPC-Monolayer spricht.

↓91

Abbildung 105: Druck-Flächen-Diagramm (π- Å2, isotherm) von verschiedenen Mischungen aus 4/5 und DPPC

Die Übertragung von Langmuirfilmen auf Substrate zu LB-Filmen erfolgt mittels der Langmuir-Blodgett-Technik(Blodgett, 1935 ;Langmuir, 1916 ;Langmuir, 1917 ). Durch senkrechtes Eintauchen und Herausziehen des Substrates in die mit Langmuir-Film bedeckte Subphase wird der Film bei konstantem Oberflächendruck, dem sogenannten Transferdruck πT, auf das Substrat übertragen. Um den Transferdruck während der Beschichtung konstant zu halten, müssen die Barrieren die Langmuir-Film-Fläche verringern. Der Nachweis einer erfolgreichen Übertragung des Nukleolipides 4/5 auf das Quartzsubstrat bei einem Transferdruck von 30 mN/m erfolgte anhand UV-Vis-spektroskopischen Messungen des LB-Filmes und des Nukleopides in Lösung (s. Abb. 106).

Abbildung 106: UV-VIS-Spektrum des Nukleopides 4/5 in Lösung (CHCl3) und im LB-Film

↓92

Der Transfer des gemischten DPPC/OK211 Langmuir-Film bei 30mN/m von der Wasserphase auf das Quartz, ließ sich ebenfalls mittels UV-Vis-Spektren nachweisen.

Letztendlich stellte es sich heraus, dass dieses Nukleolipid 4/5 und wahrscheinlich auch noch andere synthetisierte Nukleolipide oberflächenaktiv sind und stabile Langmuir-Filme ausbilden können, obgleich Aggregation auftreten kann. Auch ein Transfer auf Quartz in Form von LB-Filmen konnte nachgewiesen werden. Weitere Ergebnisse zu anderen dargestellten Nukleolipiden stehen noch aus.

2.11 Biophysikalische Untersuchungen

Neben den NMR-spektroskopischen Messungen gibt es weitere Möglichkeiten, die Inkorporierung von biologischen Molekülen, wie Nukleoside oder Oligonukleotide, in Membranen nachzuweisen. Dies sind z.B. die FT-SERS (fourier transform surface-enhanced Raman scattering)(Huang et al., 2000 ), die Mikrokalorimetrie(Pozharski und MacDonald, 2002 ;Pozharski und MacDonald, 2003 ), die ERS (external reflection spectroscopy) (Meister et al., 2006 ), die AFM (atomic force microscopy) (Milhiet et al., 2006 ) und auch die Fluoreszenzspektroskopie.

↓93

Zur Überprüfung des Ankerungsvermögens der lipophilen Oligonukleotide an Modellmembranen wurden verschiedene fluoreszenzspektroskopische Messungen durch Dr. Anke Kurz, Ines Ajili, Ruth-Hendus Altenburger, Dr. Anna Arbuzova und Dipl. Chem. Martin Loew aus der Arbeitsgruppe um Prof. Andreas Herrmann (Humboldt-Universität zu Berlin) durchgeführt. Von diesen werden im Folgenden einige vorgestellt. Darüber hinaus wird auf Zielstellungen eingegangen, die mit Hilfe der in der vorliegenden Arbeit synthetisierten Oligonukleotide verfolgt werden sollten, auch wenn dafür die biophysikalischen Messungen noch ausstehen.

Die Untersuchungen erfolgten an LUVs oder GUVs, die nach Vorschriften von Cullis et al.(Hope et al., 1985 ) und Devaux et al.(Mathivet et al., 1996 ) dargestellt wurden. Mittels Absorptionsmessungen nach einer Ultrazentrifugation von Saccharose-gefülltem LUV(Murray et al., 1998 ) konnte bestimmt werden, wie viel von dem eingesetzten Nukleolipid in die Membran inkorporiert ist. Bei den Untersuchungen zu 22 wurde festgestellt, dass das Nukleolipid sich vollständig und stabil in die Membran eingebaut hat. Vorige NMR–spektroskopische Untersuchungen (s. Abs. 2.9) zeigten, dass die Nukleobase von dem lipidierten Nukleosid 22 (OK 124) weit genug in die wässrige Phase reicht, um für Basenpaarungen zur Verfügung zu stehen. Zur Charakterisierung dieser Aussage wurden Vesikel unterschiedlicher Größe aus POPC hergestellt. Als Puffer wurde 50 mM KCl, 10 mM HEPES bei pH 8,0 eingesetzt. Die GUVs wurden mit dem Nukleolipid 22 und einem fluoreszenzmarkierten 5’-Rh-A20mer bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Bei den anschließenden Messungen konnte jedoch keine Membranbindung von 5’-Rh-A20 an Vesikel mit dem Nukleolipid 22 (10% in POPC-MLVs, LUVs, GUVs) nachgewiesen werden. Auch nach der Zugabe von 5mol% DOTAP wurde mittels Fluoreszenzspektroskopie keine Membranbindung beobachtet. Demnach steht das Nukleolipid 22 einer Membranbindung zu Oligonukleotiden doch nicht zur Verfügung, wie es NMR–spektroskopische Untersuchungen vermuten ließen.

Neben dem Nukleolipid 22 wurden auch andere Nukleolipide erfolgreich in POPC-LUVs eingebaut (s. Tab. 14). Dazu wurde jeweils ein Gemisch von POPC, Monomer und einem fluoreszenzmarkiertes Lipid (Rh-PE 0,1%, NBD-PE 0,5-1%) in CHCl3 hergestellt. Durch Entfernung des Lösungsmittels an einem Rotationsverdampfers (40°C, maximales Vakuum) wurde ein Lipidfilm erzeugt, welcher mit Saccharosepuffer suspendiert (Lipidkonzentration von 2mM) wurde. Die so erhaltenen MLVs wurden 10 Frier-Tau-Zyklen unterworfen, extrudiert (10-mal, 100 nm Filter), mit dem vierfachen Volumen isosomotischen KCl-Puffer versetzt und abzentrifugiert (Ultrazentrifuge, ~140’000g), um ungebundene Monomere, zu kleine oder „undichte“ Vesikel zu entfernen. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet im Ausgangsvolumen KCl-Puffer resuspendiert. Durch die Aufnahme von Absorptionsspektren (260 nm) der resuspendierten LUVs und des Überstands und deren Vergleich, konnten Aussagen über die Bindung der Monomere in Lipidvesikel gemacht werden.

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Monomer

Anteil/mol%

Anteil POPC/mol%

Einbau in LUVs

22

10

90

vollständig

20

80

vollständig

129

20

80

vollständig

27

20

80

vollständig

31

10

90

vollständig

20

80

vollständig

22/31

20/20

60

vollständig

50/50

0

keine Bildung von LUVs

Des Weiteren wurde untersucht, wie sich zwei Vesikelsorten mit den jeweiligen komplementären lipophilen Nukleosiden verhalten, wenn sie zueinander geführt werden. Um dies zu überprüfen, wurden POPC-LUVs A präpariert, welche das Nukleolipid 22 (OK 124) + NBD-PE enthalten und auf der anderen Seite POPC-LUVs B, welche mit dem komplementären Nukleolipid 1 32 (CC 12) und Rh-PE ausgestattet sind (s. Abb. 107). Wenn der Abstand zwischen beiden Vesikel den Försteradius von 6nm unterschreitet(Struck et al., 1981 ), sollte dies ein FRET zwischen dem NBD und dem Rhodamin hervorrufen. Da die typische Bindungslänge von Wasserstoffbrücken nur 0.18 nm beträgt, sollte also bei einer möglichen Basenpaarung ein FRET gemessen werden. Abbildung 108 zeigt jedoch, dass die Fluoreszenzmessungen keine Veränderung ergeben, sprich es zu keinen FRET zwischen den Vesikeln kommt, was gegen eine Basenpaarung zwischen den Nukleolipiden spricht.

Abbildung 107: Schematische Darstellung des erwarteten Bindungsexperimentes von Dr. A. Kurz

↓95

Dies kann unter anderem daran liegen, dass das Nukleolipid 1 29 zu weit in der Membran verankert ist, da es den lipophilen Anker an der C8–Position des Adenins trägt und im Gegensatz zu dem 2´-lipidierten Nukleolipid 22 kaum eine Basenpaarung ausbilden kann(Bunge, 2008). Um dies zu klären ist es angedacht, statt des Nukleolipides 1 29, das POPC-LUV mit dem lipidierten Adeninderivat 31 zu inkubieren, welches wie 22 einen zweikettigen Anker an der 2´/3´-Position über einen Spacer verbunden trägt. Die Ergebnisse zu diesen Messungen stehen noch aus.

Abbildung 108: FRET-Messungen der Vesikel A + B (links) und einer Vergleichsmessung mit den Vesikel B + C (rechts) von Dr. A. Kurz und Dr. A. Arbuzova

Frühere Publikationen aus unserem Arbeitskreis stellten dar, dass lipophile Oligonukleotide mit komplementären Oligonukleotidsträngen Basenpaarungen eingehen (siehe auch Abschnitt 2.9). Es zeigte sich aber auch hier deutlich, das lipophile Oligonukleotide mit unverzweigten Alkylketten schlechter in Membranen binden, als solche mit verzweigten Ketten, wie z.B. α-Tocopherol. Erst durch die Verwendung einer höheren Salzkonzentration (150 mM KCl, statt 50 mM KCl) bei dem Oligonukleotid Oligo8 oder der Zugabe von 5 mol% DOTAP bei dem Oligonukleotid Oligo1b, konnten jene in die Membran inkorporiert werden. Dabei wird durch die höhere Salzkonzentration und/oder der Zugabe des kationischen Lipids die Born-Abstoßung zwischen dem Phosphatrückgrat der DNA und dem Phosphaten des Lipids vermindert, was zu einer attraktiven Einverleibung des lipophilen Oligonukleotides in die Membran führt. Die erfolgreiche Inkorporierung konnte durch Zentrifugationsassays bei der Präparation von Saccharose-gefülltem Luv mit den entsprechenden Oligonukleotiden nachgewiesen werden. Aus diesem Grunde wurden für weitere Messungen Oligonukleotide, welche α-Tocopherol oder auch Cholesterol (s. Abs. 2.8) als lipophilen Anker tragen, verwendet.

↓96

Für spätere biotechnologische Anwendungen konnte mit Hilfe dieser synthetisierten lipophilen Oligonukleotide gezeigt werden, dass zwei vesikelmembranverankerte Oligonukleotide, welche komplementäre Enden tragen, eine Doppelhelix miteinander bilden und so diese beiden Vesikel auf einen definierten Abstand halten können(Loew et al., 2008 ). Dazu wurden LBL–Partikel (Layer-by-Layer) verwendet. LBL-Partikel sind Nanopartikel, welche aus einzelnen Lagen von anionischen (PSS = Poly(styrolsulfonat)) und kationischen Polymeren (PAH = Poly(allylamin)) gebildet werden (s. Abb. 109). Sie zeigten in jüngster Zeit ihre Stärken dadurch, dass sie sehr gut als Nanocontainer für biologische Zwecke genutzt werden(Peyratout und Dahne, 2004 ), da sie eine hohe chemische Stabilität besitzen, monodispers und biologisch abbaubar sind(Moya et al., 2003 ;Zhang et al., 2004 ), sowie über einen großen Volumenbereich (100 nm bis 15 μm) verfügbar sind

Abbildung 109: Schema der Kapselpräpäration mittels der LBL-Technologie(Peyratout und Dahne, 2004 )

Wenn man nun ein Oligonukleotid kovalent an solch ein LBL-Partikel bindet (durch Jing Kang und PD Lars Dähne, Capsulution AG), kann eine Doppelstrangbildung mit einem komplementären lipidierten Oligonukleotid Oligo 5a, welches in einem LUV (enthält POPC und NBD-PE) eingelagert ist, erfolgen. Dadurch wird die LBL-Partikeloberfläche mit diesen LUVs bedeckt (s. Abb. 110a). Der Nachweis erfolgte durch den Einsatz der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie und einer abbildenden Mikroskopie, welches die Differential-Interference-Contrast (DIC) Methode verwendet. Diese Kombination erlaubt es zum einen die LBL-Partikel sichtbar zu machen und zum anderen eine örtliche Fluoreszenz des NBDs. Ein Kontrollexperiment mit einem nichtkomplementären Strang zeigte diese Fluoreszenz nicht (s. Abb. 110b). In vorigen Experimenten konnte gezeigt werden, dass Oligonukleotide auf GUVs oder LUVs homogen verteilt sind. Auf diese LUV-Schicht lässt sich demnach durch Doppelstrangbildung eine weitere Lage von LUVs aufbringen, die einen anderen Fluoreszenzmarker und ein zur ersten Schicht lipidiertes, komplementäres Oligonukleotid Oligo 9 tragen (s. Abb. 110c). Da die zweite Vesikelsorte statt NBD-PE, das Rh-PE, enthält, kann unter Verwendung zwei unterschiedlicher Fluoreszenzkanäle der Nachweis einer zweiten Schichtbildung erfolgen. Wie bei der LBL–Technologie kann man nun durch weitere Zugabe des jeweils komplementären membrangebunden lipophilen Oligonukleotides eine Schicht nach der anderen aufbauen (s. Abb. 110e).

↓97

Für diese Experimente wurde das Oligonukleotid Oligo 5a mit der Sequenz 5´-U L TT-TTT-U L TT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T-3´ (25mer) und das Oligonukleotid Oligo 9 mit der Sequenz 5´-C L CC-CCC-CC L A-AAA-AAA-AAA-AAA-AAA-A-3´ (25mer) verwendet. Dabei ist L ein α-Tocopherolrest, welcher an der 5-Position der Nukleobase verknüpft ist.

Abbildung 110: Bedecken eines LBL-A21-Partikel mit unterschiedlichen LUV-Schichten, welche die membrangebundenen Oligonukleotide Oligo5a und Oligo9 enthalten

Nun war ein weiteres Ziel der Arbeit eine Hemifusion und eine anschließende Fusion von Vesikeln, die lipophile Oligonukleotide tragen, herbeizuführen. Die Arbeitsgruppen um Höök(Stengel et al., 2008 ;Stengel et al., 2007 ) und auch Boxer(Chan et al., 2008 ) adaptierten dazu den aus der Natur bekannten SNARE-Mechanismus, um zwei Vesikel mit einander zur Fusion zu bringen (s. Abs. 1.2.1). Auch wir wollen diese Methode anwenden, um zwei Vesikelsorten zur Fusion zu bringen. Für diese Experimente wurden folgende Oligonukleotide synthetisiert.

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Oligo5b (D53) 5´- TU L CCCCCU L TTTTTGTCGCTTCAGC -3´ (24mer)

Oligo5d (D55) 5´- TTCCTGGAAGCAGGTTU L CCCCCU L T-3´ (24mer)

Dabei ist L ein α-Tocopherolrest, welcher an der 5-Postion des Uridins verknüpft ist.

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Es zeigte sich in ersten Versuchen, dass diese Oligonukleotide bei Raumtemperatur aggregieren, jedoch bei höheren Temperaturen, wie erwartet in Membranen einlagern. Durch die Zugabe eines dritten Oligonukleotidstranges, sollte nun mit diesen Oligonukleotiden eine Vesikelfusion getriggert werden (s. Abb. 111). Ziel war es, zu zeigen, dass im Falle B Aggregation der unterschiedlichen Vesikel, aber keine Fusion auftritt, jedoch im Falle A eine Fusion durch Verwendung eines anderen komplementären Stranges nachgewiesen werden kann. Weiterhin sollte gezeigt werden, dass durch Zugabe des komplementären Stranges aus A im Falle B eine Fusion durch eine Konformationsänderung hervorgerufen werden kann. Die experimentellen Ergebnisse dazu stehen jedoch noch aus.

Abbildung 111: Theoretische Möglichkeiten der Duplexbildung der Oligonukleotide Oligo5b und Oligo5d mit einen dritten Oligonukleotidstrang

Eine weitere Verwendung der lipohilen Oligonukleotide besteht in der Adaptierung des Systems von Höök(Stengel et al., 2008 ;Stengel et al., 2007 ) durch Duplexbildung zweier lipophilen Oligonukleotide mit je einem lipophilen Anker in der gleichen Membran. Dafür wurden die Oligonukleotide Oligo 4a und Oligo 4b synthetisiert. Dabei ist L ein Cholesterolrest, welcher an der 5-Postion des Uridins verknüpft ist.

↓100

Oligo 4 a (D64) 5´-TU L TTTCTCACCTTCCATCTATTCCGTTTTTTTTTTTTTTTTT-3´ (42mer )

Oligo 4 b (D65) 3´-TU L TTTGAGTGGAAGGTAGATAAGGCA-5´ (26mer)

Hierbei werden die beiden komplementären Oligonukleotide Oligo 4 a und Oligo 4 b mit jeweils einem lipophilen Anker in einer Membran verankert. Durch die folgende Duplexbildung könnte es möglicherweise zu einer stabileren Verankerung in der Membran kommen, wie sie bei Cholesterolankern beobachtet worden ist. An das klebrige Ende, kann zum einen ein weiteres komplementäres Oligonukleotid binden, welches einen Fluorophor am Ende trägt, wodurch eine Doppelhelixbildung nachgewiesen werden kann (s. Abb. 111).

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Zum anderen kann auch ein komplementäres Oligonukleotid binden, welches in einer anderen Vesikel verankert ist. Dadurch würden beide Vesikel in eine räumliche Nähe kommen und könnten im günstigen Fall miteinander fusionieren. Eine dritte Anwendung dieses Systems, wäre das sequenzspezifische „Fischen“ von viralen DNA-Strängen aus Zelllysaten mit Hilfe des klebrigen Endes. Dadurch würde sich dieser virale Strang einer Lösung von vielen verschiedenen Oligonukleotidsträngen durch Immobilisierung an der Membran entziehen lassen und man hätte ein System, um verschiedene DNA-Stränge nachzuweisen, je nachdem wie man das „sticky end“  gestaltet. Die Ergebnisse zu den Messungen stehen noch aus.

Abbildung 112: Theoretische Möglichkeit der Duplexbildung der Oligonukleotide Oligo 4 a und Oligo 4 b

2.12 AFM – Untersuchungen

Seit der Entwicklung der Rasterkraftmikroskopie (AFM) aus seinem Vorgänger der Rastertunnelmikroskopie (STM) durch Binning et al.(Binnig et al., 1986 ) ist es heutzutage möglich, biologische Strukturen, wie Proteine, Lipidmembranen, DNA und auch Zellen in ihrer natürlichen Umgebung zu beobachten. Dabei nutzt man den entscheidenden Vorteil des AFM gegenüber der STM aus. Wohingegen es beim STM noch zu einem Tunnelstrom zwischen der Metallspitze des Lesegerätes (Tip) und dem leitenden Probenmaterial kommt, um das Oberflächenprofil der Probe auszulesen, sind es beim AFM abstoßende oder anziehende Kräfte, welche zwischen den Atomen an der Spitze des Tips und den obersten Atomen der zu untersuchenden Probe wirken. Außer diesem wesentlichen Unterschiedes funktionieren beide Methoden nach demselben Prinzip. Der Tip, welcher sich an dem Cantilever befindet, nähert sich einer Probe an. Ab einen bestimmten Abstand (atomare Größenordnung) kommt es zu Wechselwirkungen zwischen dem Tip und der Probe. Durch die Oberflächenstruktur der Probe biegt sich dabei der Cantilever positionsabhängig unterschiedlich weit. Diese Verbiegung bzw. Auslenkung der Spitze kann mit kapazitiven oder typischerweise optischen Sensoren gemessen werden und ist ein Maß für die zwischen der Spitze und der Oberfläche wirkenden Kräfte. Bei der STM gibt es nur den Non-Contact–Mode, da ein Tunnelstrom zwischen dem Tip und der Probe gemessen wird. Man kann dabei die Kraft (also die Stromstärke) konstant halten und somit über Piezoelemente ein elektronisches Höhenprofil der Probe aufnehmen oder man hält die Höhe des Cantilevers konstant und misst die Veränderungen des Tunnelstroms, welcher in Abhängigkeit zum Abstand steht (Tunneleffekt). Im Gegensatz dazu kann man das AFM auch in einem Contact–Mode fahren. Dabei wandert der Tip auf der Probe und man misst die abstoßenden Kräfte zwischen den Oberflächenatomen der Probe und denen des Tips. Im Non-Contact-Mode wird dagegen der Cantilever zum Schwingen gebracht und man misst durch die anziehenden Kräfte zwischen den jeweiligen Atomen des Tips und der Probe die erhöhte Schwingungsamplitude. Der Tip berührt bei dieser Methode die Probe nicht, was eine zerstörungsfreie Messung erlaubt. Als dritten Modi kann man auch den sogenannten intermittierenden Modus verwenden. Hierbei wird der Cantilever in Schwingung gebracht, jedoch berührt er die Probe, wodurch die Wechselwirkungskräfte zwischen der Spitze des Federbalkens und der Probenoberfläche die Resonanzfrequenz des Systems verändern, so dass sich die Schwingungsamplitude und -phase (zwischen Anregung und Schwingung) ändern.

↓102

Abbildung 113: Die drei möglichen Modi in der AFM und ihr Messbereich

Durch diesen vielfältigen Einsatz der Modi des AFMs kann man sich die charakteristischen Strukturen, die Konformationsänderungen und auch das supramolekulare Zusammenlagern der Strukturen in molekularer Auflösung anschauen. Durch Manipulierung des Auslesegerätes („laboratory on a tip“), kann man auch Adhäsionskräfte, die Elastizität, die Hydrophobizität der Strukturen und vieles mehr messen und beobachten(Alessandrini und Facci, 2005 ;Muller, 2008 ).

Abbildung 114: „Laboratory on a tip“ aus(Muller, 2008 )

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Die Gruppe um Castellano et al.(Pompeo et al., 2005 ) untersuchte mittels AFM die Strukturen von Lipidmonoschichten, welche durch Rotationsbeschichtung (spincoating) von Lösungen aus DOTAP und DOPC in Chloroform auf eine Siliziumoberfläche aufgetragen worden sind. Dabei wurde beobachtet, das DOPC unter bestimmten Bedingungen auf dem Trägermaterial vesikelähnliche Strukturen bildet. Erst durch die Zugabe von DOTAP oder durch Ändern der Parameter bei der Rotationsbeschichtung kommt es zur Bildung von Lipidschichten.

Abbildung 115: AFM-Aufnahme von DOPC auf einer Siliziumoberfläche(Pompeo et al., 2005 ). a) topographische Aufnahme auf 3x3 μm2 ; b) Querschnitt zwischen A-A´; c) statistische Auftragung der Vesikelgrößen

Erklärt wird die Ausbildung der vesikelähnlichen Strukturen durch den hydrophoben Effekt. Wenn man sich den Prozess der Ablagerung von Lipiden auf der Oberfläche anschaut, so spielen bei der Bildung von supramolekularen Strukturen (Vesikel, Liposomen, Schichten) zwei Prozesse die Hauptrolle. Zum einen der hydrophobe Effekt und zum anderen die Wechselwirkung zwischen dem Substrat (Wasser, Oberfläche) und der Probe. Durch den hydrophoben Effekt kommt es zur Ausbildung von Vesikeln in wässriger Umgebung, da die lipophilen Teile des Moleküls sich dieser polaren Umgebung entziehen. Während der Rotationsbeschichtung und/oder der Verdunstung des Lösungsmittels sind die Moleküle nur für einen kurzen Moment einer wässrigen Umgebung (Luftfeuchtigkeit) ausgesetzt. Auch die unmittelbar auf der Oberfläche liegenden Moleküle weisen hydrophile Wechselwirkungen mit dem Substrat auf. Beide können demnach supramolekulare Strukturen ausbilden. Lipide, welche sich weit weg von der Substrat- oder der Lipidoberfläche befinden, nehmen deswegen keine geordneten Strukturen ein. Unter den experimentellen Bedingungen kann es dadurch zur Ausbildung von teilweise geordneter Ablagerung der Lipide in überlagernden Ebenen von MLVs kommen. Durch Veränderung der Parameter lässt sich eine langsamere Verdunstung des Lösungsmittels erreichen, was zur Ausbildung von großen geordneten planaren Strukturen führen kann. Eine Quantifizierung der Ergebnisse geben Jurak et al.(Jurak und Chibowski, 2006 ;Jurak und Chibowski, 2007 ) durch die Bestimmung der Energie (surface free energy) zwischen der Oberfläche und der Flüssigkeit, wenn sich die Lipide ablagern.

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Auch die Gruppe von Bagatolli et al.(Simonsen und Bagatolli, 2004 ) untersuchten das Verhalten von Lipiden auf Oberflächen mit AFM. Dazu erzeugten sie, mittels der Rotationsbeschichtung einer Lösung von POPC und DPPC in Hexan und 2-5 mol% Methanol auf Mica, Strukturen, welche sie untersuchten. Auch hier konnte je nach Konzentration des Lipids eine unterschiedliche Ausbildung von Lipiddoppelschichten beobachtet werden.

Abbildung 116: AFM-Aufnahmen von rotationsbeschichten POPC-multilamellaren Filmen bei Raumtemperatur und einer Luftfeuchtigkeit von 20-40%(Simonsen und Bagatolli, 2004 ). Alle Aufnahmen bei 10x10 μm2 bei unterschiedlichen Lipidkonzentrationen: 5 mg/mL (A), 3 mg/mL (C) and 2 mg/mL (E). Die Filmoberfläche ist terrassenartig aufgebaut mit einer Stufenhöhe von 62 ± 5 Å (siehe Querschnitt oberhalb der topographischen Aufnahmen)

Erklärt werden die beobachteten unterschiedlichen Lipiddoppelschichten durch das in Abbildung 117 dargestellte Modell.

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Abbildung 117: Schematische Darstellung der beobachteten Lipidschichten auf der hydrophilen Oberfläche. Bei geringer Lipidkonzentration wird nur wenig der Oberfläche beladen und man sieht viele Lücken und wenige Doppelschichten. Bei hoher Lipidkonzentration erfolgt eine vollständige Beladung der Oberfläche. Man beobachtet das Ausbilden der Treppenstruktur durch das Ausbilden von multilamellaren Schichten

Nun sollte man annehmen, dass lipophile Nukleoside auch dieses Verhalten zeigen, denn sie besitzen wie die untersuchten Phospholipide, eine oder gar zwei lipophile Alkylketten und eine hydrophile Kopfgruppe, in dem Falle das Nukleosid. Einige Publikationen, vor allem aus den Arbeitsgruppen von Barthelemy et a l.(Barthelemy et al., 2005 ;Barthelemy et al., 2005 ;Bestel et al., 2008 ;Moreau et al., 2004 ) und Iwaura et al.(Iwaura et al., 2007 ;Iwaura et al., 2003 ;Iwaura et al., 2002 ) bestätigten diese Annahme (s. Abs. 1.2.3).

Gottarelli et al. (Giorgi et al., 2003 ;Gottarelli et al., 2000 ;Pieraccini et al., 2003 ) untersuchten mittels der AFM und der NMR-Spektroskopie das Verhalten von lipophilen Guanosinderivaten in Lösungen und auf festen Oberflächen. Beide Techniken konnten zeigen, dass sich bei der Selbstorganisation aufgrund des lipophilen Restes und des hydrophoben Kopfes in Abwesenheit eines Metalltemplates bandähnliche Strukturen ausbildeten. Bei Anwesenheit des Metalls bilden sich die bekannten G–Quartetts(Davis, 2004 ). Ebenfalls die Ausbildung solcher Bandstrukturen auf HOPG wurde von Barthelemey und Grinstaff et al.(Bestel et al., 2008 ) mittels STM–Messungen von Nukleolipiden beobachtet (s. Abb. 118). Arbeiten von Hou et al.(Jin et al., 2006 ) konnten anhand von AFM-Untersuchungen zeigen, dass die Position des lipophilen Ankers am Nukleosid oder der Nukleobase und auch die Anzahl der Ketten entscheidend sind, ob sich LB-Filme ausbilden. Desgleichen konnten in Arbeiten von Liang et al.(Huang et al., 1997 ;Huang et al., 2000 ;Huang und Liang, 1997 ;Huang und Liang, 1998 ;Huang und Liang, 1998 ;Li et al., 2000 ;Li et al., 2001 ;Li et al., 2001 ;Miao et al., 2003;Miao et al., 2003 ;Miao et al., 2003;Wu et al., 2004 ;Xu et al., 2006 ) durch die Verwendung unterschiedlicher Nukleolipide mittels FT–Raman, FT–IR, FT–SERS und auch UV–VIS Spektroskopie nachgewiesen werden, dass diese Amphiphile sowohl stabile Schichten an Luft/Wasser-Grenzschichten, als auch auf festen Trägern ausbilden (s. Abb. 119).

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Abbildung 118: STM Bilder (a+b) und computergenerierte Modelle (c-f) der untersuchten 3´-Eicosylphosphatnucleoside von Barthelemey und Grinstaff et al.(Bestel et al., 2008 ); links) 3´-Eicosylphosphatthymidin auf HOPG; rechts) 3´-Eicosylphosphatadenosin und 3´-Eicosylphosphatthymidin auf HOPG

Abbildung 119: Schematische Darstellung der Wasserstoffbrücken und der Orientierung der Nukleobasen während der Übergangsphase vor und nach der molekularen Erkennung von Liang et al.(Miao et al., 2003 )

Ausgehend von diesen Arbeiten und den Beobachtungen während der Membraninkorporierung der von uns synthetisierten Nukleolipide, stellte sich nun die Frage, ob diese Substanzen auch selbst vesikelähnliche Strukturen oder Lipiddoppelschichten ausbilden können.

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Dafür wurden unter anderem die vier über die Carbamatsynthese dargestellten Nukleolipide 51, 68a, 68b und 68c (s. Abs. 2.2) in einem Gemisch aus Dichlormethan und Methanol im Verhältnis 1:1 gelöst. Jeweils 10μl der 0.08 mM–Lösungen wurden auf eine planare Glasoberfläche (Schott Nexterion® Glas B) getropft und das Lösungsmittel in einer Dichlormethan–Atmosphäre verdunstet. Anschließend wurden die Aufnahmen auf einen Nanosurf® Mobile S AFM gemessen (näheres dazu im experimentellen Teil). Dabei betrug die Raumtemperatur ungefähr 20-25 °C und die Luftfeuchtigkeit ungefähr 20-40%.

Abbildung 120: Struktur der untersuchten 2´-Stearoylcarbamoylnucloside und deren Watson-Crick-Basenpaarungen

Die AFM-Messungen (s. Abb. 121 – 124) zeigten, dass diese Carbamte ungeordnete Kristallstrukturen ausbilden, welche nicht auf irgendwelche supramolekularen Eigenschaften zurückzuführen sind. Eine Möglichkeit für dieses Verhalten, kann entweder die geringe Löslichkeit solcher Carbamte in dem verwendeten Lösungsmittelgemisch sein oder auch die Tatsache, dass diese Substanzen nur einen Anker besitzen. Im Gegensatz dazu tragen die Nukleolipide in den literaturbekannten AFM–Messungen in allen Fällen zwei Anker. Dadurch scheint in diesem Fall der lipophile Charakter zu schwach zu sein, um supramolekulare Strukturen über einen hydrophoben Effekt auszubilden. Die AFM-Messung (s. Abb. 125 und Abb. 126) eines 1:1 Gemisches der komplementären Nukleolipide 51 und 68a bzw. 68b und 68c zeigte keine Veränderung gegenüber den Einzelmessungen.

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Abbildung 121: AFM- Aufnahme von 51

Abbildung 122: AFM- Aufnahme von 68a

Abbildung 123: AFM- Aufnahme von 68b

 

↓109

Abbildung 124: AFM- Aufnahme von 68c

Abbildung 125: AFM- Aufnahme von 51 & 68a

 

Abbildung 126: AFM- Aufnahme von 68b & 68c

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Um diese Annahme zu prüfen, wurden die Nukleolipide 22 und 31, welche zwei Anker tragen, untersucht. Die Verbindungen wurden in Dichlormethan gelöst und 10 μl der 4x10-5  M Lösungen auf einen planaren Objektträger getropft. Nach der Verdunstung des Lösungsmittels in einer Dichlormethan–Atmosphäre erfolgte die Messung.

Abbildung 127: In den AFM-Messungen eingesetzte Nukleolipide 22 und 31

An den Aufnahmen (s. Abb. 128 – 131) kann man die Ausbildung von vesikelähnlichen Strukturen, ähnlich denen von Castellano beobachten, erkennen. Dies wird besonders anhand der Darstellung eines Höhenprofiles (blau Linie A – A´) deutlich. Die schlechte Auflösung der Bilder beruht auf Störungen bei den Messungen (Artefaktbildung) und auch auf der Verwendung eines großen Cantilever-Tips von 100μm.

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Abbildung 128: AFM–Aufnahme des Nukleolipides 22 bei 40x 40 μm2 und eine Vergrößerung der vesikelähnlichen Struktur bei 1x1 μm2

Abbildung 129: Querschnitt zwischen A und A´ der AFM-Aufnahme des Nukleolipides 22

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Abbildung 130: AFM–Aufnahme des Nukleolipides 31 bei 40x 40 μm2 und eine Vergrößerung der vesikelähnlichen Struktur bei 5x5 μm2

Abbildung 131: Querschnitt zwischen A und A´ der AFM-Aufnahme des Nukleolipides 31

Bei der Messung eines 1:1 Gemisches von 2 2 und 31 lässt sich anhand der Bestimmung eines Höhenprofils (s. Abb. 133) eine Vesikelattraktion vermuten, jedoch kann das nur ein erster Hinweis sein.

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Abbildung 132: AFM–Aufnahmen des Gemisches der Nukleolipide 22 und 31 bei 40x 40 μm2 und eine Vergrößerung der Struktur bei 5x5 μm2

Abbildung 133: Querschnitt zwischen A und A´ der AFM-Aufnahme des Gemisches der Nukleolipide 22 / 31

Interessant sind die AFM – Bilder des Uridins 46, das ebenfalls zwei lipophile Reste in der 2´-Position trägt. Die Probenpräparation erfolgte der Nukleolipide 22 und 31 entsprechend. Anhand der Aufnahmen erkennt man sehr deutlich die Ausbildung von Lipidschichten (s. Abb. 135), ähnlich den Arbeiten von Bagatolli. Auch diese Lipidschichten haben eine Höhe von ungefähr 5-6 nm, was für eine Lipidmonoschicht sprechen würde.

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Abbildung 134: Struktur von 46

Abbildung 135: AFM–Aufnahme des Nukleolipides 46 bei 40x 40 μm2 und eine Vergrößerung der markierten Stelle auf 5x5 μm2

Abbildung 136: Querschnitt zwischen A und A´ der AFM-Aufnahme des Nukleolipides 46

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Es konnte mittels AFM–Untersuchungen gezeigt werden, dass einige der synthetisierten Nukleolipide sowohl vesikelähnliche Strukturen, wie auch Lipidschichten ausbilden können. Arbeiten von Nicolai Brodersen, konnten weiterhin zeigen, dass Gemische aus komplementären lipophilen Nukleosiden oder lipophilen Nukleobasen in der Lage sind, Lipiddoppelschichten auszubilden, welche sich aus abwechselnden Basenpaarungen ergeben.


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29.07.2009