Institut für Chemie

Dissertation

2´-Nukleolipide: Synthese, molekulare Erkennung und ihr Verhalten in Membranen

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
im Fach Chemie

eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dipl.-Chem.  Oliver   Kaczmarek ,
geb. Heyder , 
geboren am 05.05.1979 in Berlin

Dekan: Herr Prof. Dr. rer. nat. habil. Lutz-Helmut Schön

Gutachter:
1. Prof. Dr. Jürgen Liebscher
2. PD Dr. rer. nat. habil. Rainer Mahrwald

eingereicht: 25. November 2008

Datum der Promotion: 11. Dezember 2008

Zusammenfassung

Ausgangspunkt dieser vorliegenden Arbeit waren bisherige Untersuchungen unseres Arbeitskreises zum Membranverankerungsverhalten (Phospholipidmembranen, LUV) von Nukleosiden und Oligonukleotiden, welche einen lipophilen Anker an der 5-Position der Pyrimidin- oder an der 8-Position der Purinbase tragen. Diese Nukleolipide ankern gut in der Membran, stehen aber nicht mehr für eine Watson-Crick-Basenpaarung an der Phasengrenzfläche zu Verfügung. Demnach wurde durch die Verwendung unterschiedlicher Reaktionen (Veresterung, Thioetherbildung, Carbamoylverknüpfung oder „Clickreaktion“ zu Triazolen) und verschiedener funktioneller Gruppen (Hydroxy, Thiohydroxy, Azid, Amin) an die 2´-Position der Nukleoside eine Reihe von lipophilen Resten (Alkylketten, Cholesterol, Pyren) eingeführt. Diese Konjugate verankerten ebenfalls gut in den Membranen und es zeigten sich erste Hinweise, dass durch die Einführung eines Spacers zwischen dem Nukleosid und dem lipophilen Anker, eine Basenpaarung an der Phasengrenzfläche möglich ist. Weiterhin zeigte es sich, dass Nukleolipide mit nur einem lipophilen Rest nicht stabil in Membranen verankern, vor allem, wenn dieser nicht verzweigt ist. Bei der Anwendung von Oligonukleotiden zum Ankern in Membranen ist es unbedeutend, an welcher Stelle der lipophile Rest am Nukleotid vorkommt, denn zum einen geht das entsprechende Nukleolipid selbst keine Basenpaarung ein und zum anderen erfolgt keine Basenpaarung über dieses hinweg.

Für biotechnologische Anwendungen konnte mit Hilfe dieser synthetisierten lipophilen Oligonukleotide gezeigt werden, dass zwei vesikelmembranverankerte Oligonukleotide, welche komplementäre Enden tragen, eine Doppelhelix miteinander bilden und so diese beiden Vesikel auf einen definierten Abstand halten können.

Da Nukleolipide einen amphiphilen Charakter aufweisen, sollte unter dem AFM untersucht werden, ob diese supramolekulare Strukturen zeigen. Dies wurde in der Tat auch beobachtet. Ebenso konnten mittels der LB-Technik LB-Schichten aus Nukleolipiden dargestellt werden.

Eigene Schlagworte: Oligonukleotid, Nukleolipide, Membranverankerung, Rasterkraftmikroskopie, Langmuir-Blodgett

Abstract

The starting point of this work was found in our previous studies about anchoring behaviour of lipidated nucleosides and oligonucleotides in biocompatible phospholipid membranes (LUV). That nucleosides and oligonucleotides bear a lipophilic anchor at the 5-position of pyrimidine or at the 8-position of purinbases. This nucleolipides anchor well in such membranes, but were not longer available for a Watson-Crick base pairing at the interface to water. Therefore lipophilic groups (alkyl chain, cholesterol, Pyren etc.) were now connected to the 2'-position of nucleosides by several reactions (esterification, thioether binding, carbamoyl binding or "click reaction") and various functional groups (hydroxy, thiohydroxy, azide, amine) to the 2´-position of nucleosides. These nucleolipides also well anchored in the model membranes, and gave first evidence that by introducing a spacer between the nucleoside and the lipophilic anchor a base pairing at the interface to water is possible. However, only one anchor is not sufficient for a stable anchoring in the phospholipid membranes, especially if they are not branched. It was found out that it is insignifacant for the application of oligonucleotides in membrane anchoring, at which position of nucleotide the lipid is attached, because on the one hand, the corresponding nucleolipid can not form a pair with a corresponding nucleobase and secondly, there is no base pairing in the nucleotides situated between two lipidated positions.

For biotechnology applications it might be interesting that two different vesicles each of it furnushed with a complementary lipidated oligonucleotide could be kept together in a defined distance by forming double strand DNA.

Since nucleolipide possess amphiphilic character, there abillity to form supramolecular structures was investigated by atomic force microscope (AFM). In addition formation of LB-layers could be achieved by LB-technology.

Keywords: Oligonucleotide, Nucleolipide, membrane anchoring, atomic force microscopy, langmuir-blodgett

 Widmung

We absolutely must leave room for doubt or there is no progress and no learning. There is no learning without having to pose a question. And a question requires doubt. People search for certainty. But there is no certainty – Richard Feynman

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29.07.2009