Institut für Chemie

Dissertation

2´-Nukleolipide: Synthese, molekulare Erkennung und ihr Verhalten in Membranen

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
im Fach Chemie

eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dipl.-Chem.  Oliver   Kaczmarek ,
geb. Heyder , 
geboren am 05.05.1979 in Berlin

Dekan: Herr Prof. Dr. rer. nat. habil. Lutz-Helmut Schön

Gutachter:
1. Prof. Dr. Jürgen Liebscher
2. PD Dr. rer. nat. habil. Rainer Mahrwald

eingereicht: 25. November 2008

Datum der Promotion: 11. Dezember 2008

Zusammenfassung

Ausgangspunkt dieser vorliegenden Arbeit waren bisherige Untersuchungen unseres Arbeitskreises zum Membranverankerungsverhalten (Phospholipidmembranen, LUV) von Nukleosiden und Oligonukleotiden, welche einen lipophilen Anker an der 5-Position der Pyrimidin- oder an der 8-Position der Purinbase tragen. Diese Nukleolipide ankern gut in der Membran, stehen aber nicht mehr für eine Watson-Crick-Basenpaarung an der Phasengrenzfläche zu Verfügung. Demnach wurde durch die Verwendung unterschiedlicher Reaktionen (Veresterung, Thioetherbildung, Carbamoylverknüpfung oder „Clickreaktion“ zu Triazolen) und verschiedener funktioneller Gruppen (Hydroxy, Thiohydroxy, Azid, Amin) an die 2´-Position der Nukleoside eine Reihe von lipophilen Resten (Alkylketten, Cholesterol, Pyren) eingeführt. Diese Konjugate verankerten ebenfalls gut in den Membranen und es zeigten sich erste Hinweise, dass durch die Einführung eines Spacers zwischen dem Nukleosid und dem lipophilen Anker, eine Basenpaarung an der Phasengrenzfläche möglich ist. Weiterhin zeigte es sich, dass Nukleolipide mit nur einem lipophilen Rest nicht stabil in Membranen verankern, vor allem, wenn dieser nicht verzweigt ist. Bei der Anwendung von Oligonukleotiden zum Ankern in Membranen ist es unbedeutend, an welcher Stelle der lipophile Rest am Nukleotid vorkommt, denn zum einen geht das entsprechende Nukleolipid selbst keine Basenpaarung ein und zum anderen erfolgt keine Basenpaarung über dieses hinweg.

Für biotechnologische Anwendungen konnte mit Hilfe dieser synthetisierten lipophilen Oligonukleotide gezeigt werden, dass zwei vesikelmembranverankerte Oligonukleotide, welche komplementäre Enden tragen, eine Doppelhelix miteinander bilden und so diese beiden Vesikel auf einen definierten Abstand halten können.

Da Nukleolipide einen amphiphilen Charakter aufweisen, sollte unter dem AFM untersucht werden, ob diese supramolekulare Strukturen zeigen. Dies wurde in der Tat auch beobachtet. Ebenso konnten mittels der LB-Technik LB-Schichten aus Nukleolipiden dargestellt werden.

Eigene Schlagworte: Oligonukleotid, Nukleolipide, Membranverankerung, Rasterkraftmikroskopie, Langmuir-Blodgett

Abstract

The starting point of this work was found in our previous studies about anchoring behaviour of lipidated nucleosides and oligonucleotides in biocompatible phospholipid membranes (LUV). That nucleosides and oligonucleotides bear a lipophilic anchor at the 5-position of pyrimidine or at the 8-position of purinbases. This nucleolipides anchor well in such membranes, but were not longer available for a Watson-Crick base pairing at the interface to water. Therefore lipophilic groups (alkyl chain, cholesterol, Pyren etc.) were now connected to the 2'-position of nucleosides by several reactions (esterification, thioether binding, carbamoyl binding or "click reaction") and various functional groups (hydroxy, thiohydroxy, azide, amine) to the 2´-position of nucleosides. These nucleolipides also well anchored in the model membranes, and gave first evidence that by introducing a spacer between the nucleoside and the lipophilic anchor a base pairing at the interface to water is possible. However, only one anchor is not sufficient for a stable anchoring in the phospholipid membranes, especially if they are not branched. It was found out that it is insignifacant for the application of oligonucleotides in membrane anchoring, at which position of nucleotide the lipid is attached, because on the one hand, the corresponding nucleolipid can not form a pair with a corresponding nucleobase and secondly, there is no base pairing in the nucleotides situated between two lipidated positions.

For biotechnology applications it might be interesting that two different vesicles each of it furnushed with a complementary lipidated oligonucleotide could be kept together in a defined distance by forming double strand DNA.

Since nucleolipide possess amphiphilic character, there abillity to form supramolecular structures was investigated by atomic force microscope (AFM). In addition formation of LB-layers could be achieved by LB-technology.

Keywords: Oligonucleotide, Nucleolipide, membrane anchoring, atomic force microscopy, langmuir-blodgett

 Widmung

We absolutely must leave room for doubt or there is no progress and no learning. There is no learning without having to pose a question. And a question requires doubt. People search for certainty. But there is no certainty – Richard Feynman

meinen Eltern

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung und Aufgabenstellung
  • 1.1 Einleitung
  • 1.2 Interaktion von Substanzen mit biologischen Membranen
  • 1.3 Derzeitiger Stand der Forschung auf dem Gebiet der Nukleolipide
    • 1.3.1  Synthese und Anwendung von Nukleolipiden
    • 1.3.2 Verhalten von Nukleolipiden an Phasengrenzflächen
    • 1.3.3 Supramolekulare Verhalten von Nukleolipiden
  • 1.4 Aufgabenstellung – Warum 2´-Nukleolipide
• 2 Allgemeiner Teil
  • 2.1 Synthese von Ethern und Estern
  • 2.2 2´-Carbamoylnukleoside
  • 2.3 Synthese von Uridin-2´-Thioethern und Uridin-2´-Disulfiden
  • 2.4 „Click-Reaktionen“ an 2´-Azido-2´-desoxyuridin
  • 2.5 Reaktionen an 2´-Amino-2´-desoxyuridin
  • 2.6 Kreuzkupplungen an 2´-Iod-2´-desoxyuridin
  • 2.7 Sonogashirareaktion an 5-Iod-2´-desoxyuridin
  • 2.8 Synthese der Oligonukleotide
  • 2.9 NMR-Spektroskopische Untersuchungen
    • 2.9.1  Untersuchungen an Nukleosiden
    • 2.9.2 Untersuchungen an Oligonukleotiden
  • 2.10 Untersuchungen an LB-Filmen
  • 2.11 Biophysikalische Untersuchungen
  • 2.12 AFM – Untersuchungen
• 3 Zusammenfassung
• 4 Experimenteller Teil
  • 4.1 Allgemeine experimentelle Bedingungen
  • 4.2 Versuchsvorschriften
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Anhang
• Danksagung
• Eidestattliche Erklärung

Tabellen

• Tabelle 1: Versuche zur Synthese von 22
• Tabelle 2: Versuche zur Synthese von 40
• Tabelle 3: Einführung von Octadecylaminocarbamatgruppen in Adenosin, Guanosin, Cytidin
• Tabelle 4: Alkylierung von 2´-Desoxy-2-thiouridinen
• Tabelle 5: Versuche zur reduktiven Spaltung des Disulfides 99 mit DTT
• Tabelle 6: Synthesewege zur Darstellung der N2’-(4-(n-alkyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-2’-desoxyuridine
• Tabelle 7: 5´-DMTr-geschützte lipophile Oligonukleoside 130
• Tabelle 8: Atomic coordinates ( x 10⁴) and equivalent isotropic displacement parameters A² x 10³) for OK-268. U(eq) is defined as one third of the trace of the orthogonalized Uij tensor
• Tabelle 9: Bond lengths [A] and angles [deg] for OK-268
• Tabelle 10: Anisotropic displacement parameters (A²x10³) for OK-268. The anisotropic displacement factor exponent takes the form: -2 pi² [h² a•² U11 + 2 h k a• b• U12]
• Tabelle 11: Hydrogencoordinates (x 10⁴) and isotropic displacement parameters (A²x10³) for OK-268
• Tabelle 12: Torsion angles [deg] for OK-268
• Tabelle 13: Atomic coordinates ( x 10⁴) and equivalent isotropic displacement parameters A²x 10³ for OK-321. U(eq) is defined as one third of the trace of the orthogonalized Uij tensor
• Tabelle 14: Bond lengths [A] and angles [deg] for OK-321
• Tabelle 15: Anisotropic displacement parameters (A²x10³ for OK-321. The anisotropic displacement factor exponent takes the form: -2 pi²[h² a•² U11 + 2 h k a• b• U12]
• Tabelle 16: Hydrogen coordinates ( x 10⁴) and isotropic displacement parameters (A²x 10³) for OK-321
• Tabelle 17: Torsion angles [deg] for OK-321

Bilder

• Abbildung 1: Strukturen von Acyclovir (links) und Acyclo-GTP (rechts)
• Abbildung 2: SiRNA (microRNA) und mRNA im RISC-Komplex (aus MedGadget, 2005)
• Abbildung 3: Struktur von Cytidindiphosphatdiacylglycerol
• Abbildung 4: Lipohile Acyclovirderivate nach Rosemeyer et al.(Rosemeyer et al., 1985 ) (rechts) und Welch et al.(Welch et al., 1985 ) (links)
• Abbildung 5: Mechanismus der DNA-Übertragung in die Zelle durch Lipofection nach(Li und Szoka, 2007 ;Xu und Szoka, 1996 )
• Abbildung 6: Lipophile Anker nach Manoharan et al.(Manoharan et al., 1997 ;Manoharan et al., 1997 ) (links) und Unverzagt et al.(Lorenz et al., 2004 ) (rechts)
• Abbildung 7: Signalverstärkung von DNA–Fragmenten nach Willner et al.(Patolsky et al., 2001 )
• Abbildung 8: Schema des Verknüpfens funktionalisierter Vesikel auf Glass nach Boxer et al.(Chan et al., 2007 ;Yoshina-Ishii und Boxer, 2003 ;Yoshina-Ishii et al., 2006 ;Yoshina-Ishii et al., 2005 )
• Abbildung 9: Schematische Darstellung des DNA-vermittelten Ankern von Liposomen auf einer „solid-supported-membrane“(Jakobsen et al., 2008 ) (A und B). Nachweis der thermischen Reversibilität (C and D)
• Abbildung 10: Verwendetes ODN und deren schematischen Darstellung zur unterschiedlichen Bindung von Vesikeln nach Pfeiffer et al.(Olofsson et al., 2003 ;Pfeiffer und Hook, 2004 ;Pfeiffer und Hook, 2006 )
• Abbildung 11: Schematische Darstellung der Bindung von Vesikel an planaren Membranen durch A) SNARE-Proteine und B) lipophilen DNA-Doppelhelices nach Pfeiffer et al. und Boxer et al.(Chan et al., 2008 )
• Abbildung 12: DNA induzierte Vesikelfusion nach Stengel et al.(Stengel et al., 2008 ;Stengel et al., 2007 )
• Abbildung 13: Schema des dargestellten Lipidmembrans aus Lipidbestandteilen des Lipoproteins LDL und des DC-Cholesterol und der anschließenden elektrostatischen Wechselwirkung mit der siRNA nach Kim et al.(Kim et al., 2008 )
• Abbildung 14: Lipophile Anker von Bijsterbosch et al.(Bijsterbosch et al., 2002 ;Bijsterbosch et al., 2000 ;Rump et al., 1998 )
• Abbildung 15: Struktur des „Antagomirs“ von Stoffel et al.(Krutzfeldt et al., 2005). Die 2´-Hydroxylgruppe der Ribose wurde durch eine Methoxygruppe ersetzt und einige der Phosphordiesterverknüpfung durch das Phosphorthioat
• Abbildung 16: Oberflächendruck-Flächendiagramm des Uridinanaloga in einer Lösung von Monomeren bei 20°C A) kein Base; B) Adenin (0.01 mol/l); C) Thymin (0.01 mol/l)
• Abbildung 17: Oberflächendruck-Flächendiagramm des Adeninanaloga in einer Lösung mit Poly(U) bei 20°C PBS-Buffer Lösung (1.5•10^-3 mol/l, pH 7.4) wurde für die Poly(U)-Phase verwendet A) keine Base; B) Poly (U) (1.5•10^-5mol/l); C) Poly (A), (1.5•10^-5mol mol/l)
• Abbildung 18: Von Luisi et al.(Cruciani et al., 2004 )beobachtete Wechselwirkung zwischen den Proton 2_Ino und 6_Cyt durch (a) die nachgewiesenen Kreuzpeaks im 2D-NOESY-HR-MAS-NMR Spektrum, (b)Schema der klassischen Watson-Crick-Basenpaarung
• Abbildung 19: Einige Beispiele synthetischer Nukleolipide von Barthelemey et al.(Barthelemy et al., 2005 ;Gissot et al., 2008 ;Moreau et al., 2004 ;Moreau et al., 2006 ;Moreau et al., 2006 )
• Abbildung 20: Model, welches die DNA-ähnliche helikale Struktur von DPUPC (I₄) in Wasser zeigt a) zwei Moleküle DPUPC, die die Grundeinheit der helikalen Struktur bilden; b) Blick von oben auf den in c) dargestellten Strang (α ist dabei der hydrophile Phosphocholinrest, β die Uridineinheit und γ der hydrophobe Kern; d) Schemata der multilamellaren Selbstorganisation
• Abbildung 21: (A) Optische Mikroskopie (links oben), TEM (rechts oben) und SEM (rechts oben) – Bilder von linksgängiger Helicesbildung in reinen Wasser, durch Selbstaggregation von C₁₄AMP (Struktur links). (B) Nach 3-4h beobachte Helixbildung aus den feinen Nadeln durch Aime´ et al.(Aime et al., 2007 )
• Abbildung 22: Modell für die Ausbildung von Bandstrukturen von Barthelemey et al.(Campins et al., 2007 ) a) Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Thymin; b) Van-der-Waals–Wechselwirkungen zwischen den lipophilen Ketten; c) Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Adenosin; d) und e) 3D Strukturen der beobachteten Bänder
• Abbildung 23: Schematische Darstellung der Extraktion von ssDNA mit Hilfe einer reversen Micelle nach Goto et al.(Maruyama et al., 2007) a) verwendeter lipophiler Anker; b) Extraktions-Schritt
• Abbildung 24: Struktur des Dioctanoylphosphatidyladenosin (oben links) ,des ODN (polyU) und deren vorgeschlagenes Model der erhaltenden Superstruktur nach Berti et al.(Banchelli et al., 2007 )
• Abbildung 25: SEM–Bild des Hydrogels bei 0.2 wt-% des Nukleolipides in Wasser von Kim et al.(Park et al., 2003)
• Abbildung 26: a) Photografie eins Organogeles und b) SEM-Bild des DPUPC- (rechts) Organogeles nach Barthelemey et al.(Moreau et al., 2004)
• Abbildung 27: Möglichkeiten der Derivatisierung von Nukleosiden und deren Auswirkungen auf die Oligonukleotidsynthese und die Watson-Crick-Basenpaarung
• Abbildung 28: Tiefenposition der Nukleolipide in POPC mittels Kreuzrelaxationsmessungen bestimmt(Kurz et al., 2006 )
• Abbildung 29: DNA mit mittigen lipophilen Anker für den Einsatz in Multi-Enzym-Komplexen oder Molec u lar   Beacon aus der Dissertation von Andreas Bunge(Bunge, 2008)
• Abbildung 30: Verwendeter DNA–Anker von Kim et al.(Kim et al., 2004 ) zur Ausbildung von Hairpinstrukturen
• Abbildung 31: Zwei aggregierende Vesikel nach von Pincet et al. Ein Vesikel ist mit einen Adenosinlipid funktionalisiert und mit RhPE auf der Oberfläche und FITC-Dextran im Inneren gelabelt. Das andere Vesikel ist ungelabelt und mit dem Thymidinlipid versetzt (Balkenlänge 10μm). Links: Fluoreszenzbild bei der Laseranregung von Rhodamin (514nm) Rechts: Fluoreszenzbild bei der Laseranregung von Fluorescein (488nm)
• Abbildung 32: Die verwendeten Nukleolipide
• Abbildung 33: Synthese des O2´-Palmitoyluridins: I) 1.5 eq. n-C₁₅H₃₁COOH, DMAP, Pyridin, 16 h bei RT; II) NH₄F, MeOH, 16 h bei RT, 48% über 2 Stufen
• Abbildung 34: Möglicher Mechanismus für die beobachte 2´3´-Acylwanderung
• Abbildung 35: ¹H-NMR-Spektrum des Isomerengemisches des O2´,O3´-(Palmitoyl)uridin 4/5
• Abbildung 36: Synthese des 2´-Acyl-arabinosederivat 8: I) 1.26 eq. DIAD, 1.2 eq. PPh₃, 1.2 eq. 6, THF, 16 h bei RT, 62%; II) NH₄F, MeOH, 16 h bei RT, 17%
• Abbildung 37: Synthese von 6: I) 3.3 eq. Oleoylchlorid, Pyridin, CH₂Cl₂, 2 ¼ h bei RT, 81%; II) 1.1 eq. NaBH₄, H₂O, THF, 1h, 4°C->RT, 92%; III) Bernsteinsäureanhydrid, DMAP, CH₂Cl₂, 16h bei RT, 90%
• Abbildung 38: Synthese der O2´, O3´-Diacylnukleolipide: I) 3.0 eq. nC₁₅H₃₁COCl, DMAP. Pyridin, 2h bei RT, 81%; II) 80% CH₃COOH, 20 min bei RT, 26%; III) 3.0 eq. Bernsteinsäureanhydrid, DMAP, Pyridin, 72h bei RT, quant. IV) 0.5 eq. nC₁₅H₃₁OH, DCC, DMAP, Toluol, 72h bei RT, quant.; V) CF₃COOH, CH₂Cl₂, 30 min bei RT, 46%
• Abbildung 39: Synthese von 22: I) s. Tab. 1; II) Et₃N·3HF, THF, 16h bei RT, 80%
• Abbildung 40: Synthese des 1,3-Bis(oleoyloxy)propan-2-yl-(N6-benzyoladenosin)succinat: I) a) 7.5 eq. TMSCl, Pyridin, 3h, bei RT; b) 3 eq. BzCl, 16 bei RT; c) 25% NH₄OH 20 min bei 0°C, 79%; II) TiPSCl₂, Pyridin, 16h bei RT, 90%; III) 6, DCC, DMAP, THF, 72h bei RT, 22%; IV) Et₃N·3HF, THF, 2h bei RT, 89%
• Abbildung 41: Synthese des 1,3-Bis(oleoyloxy)propan-2(adenosinyl)succinat: I) TiPSCl₂, Pyridin, 16h bei RT, 90%; II) 1,3-Bis(oleoyloxy)propan-2-ylsuccinat, DCC, DMAP, THF, 72h bei RT, 60%; III) Et₃N·3HF, THF, 4h bei RT, 18%
• Abbildung 42: Gegenüberstellung der ¹H-NMR-Spektren von 26 (oben) und 29 (unten).
• Abbildung 43: Synthese des 2´-(4-(3-Octadecyl-2,2-bis(octadecylmethyl)propyl)-4-oxobutanester)-2´-desoxyuridin 33: I) a) AcOH(glacial) : 40%HBr 1:5, 24 h unter Rückfluss b) H₂SO₄ (konz.), 40% HBr 1:2, 24 h unter Rückfluss, 46%; II) Bernsteinsäureanhydrid, DMAP, Pyridin, 60h bei RT, quant.; III) DCC, DMAP, THF, 64 h bei RT, 48%; IV) 3.3 eq. C₁₈H₃₇SH, 15 eq. DIPEA, CsCO₃, CH₂Cl₂, 12d bei RT, 10%; V) Et₃N•3HF, THF, 3h bei RT, 69%
• Abbildung 44: Pharmakologische Wirkungen von Uridin aus der Dissertation von Till Schumacher(Schumacher, 2005 )
• Abbildung 45: Affinität der der modifizierten Oligonukleotide zum DNA-Duplex 2´-Aminoethoxy modifizierte Thymidine (fettgedruckt, Strang 3) hybridisiert mit den Strang 1 und 2 (180mm KCl, 20 mm Na+, 10 mm Phosphatpuffer (pH 7.0) und 0.1 mm EDTA) Die Schmelztemperaturen für die Tripelhelix des modifizierten Oligonukleotid (■) wurde mit der des nichtmodifizierten Oligonukleotid verglichen (≤) Struktur – Affinitätsbeziehung der verschiedenen 2´- substituierten Oligonukleotide
• Abbildung 46: Darstellung der drei Generationen der Nukleotidmodifikationen für Anwendungen in der Antisense-Technologie, aus dem IDTutorial- Antisense-Technologies 2005 A) Phosphothionatrückgrat; B) Modifizierung durch Alkylierung der 2´-Position der Ribose; C) verschiedenste Änderungen am Rückgrat
• Abbildung 47: Synthese des O2´-(Hydroxethyl)-2´-desoxy-O5´-(TBDPS)uridin 40: I) Ethylenglycol, BH₃•THF, 16h bei 160°C, 80%; II) siehe Tabelle 2
• Abbildung 48: Synthese des O2´-(1,2-Distearylglycerol)-2´-desoxyuridin 46: I) Ph₂CO₃, DMF, 4 h bei 110°C, 88%; II) 1.1 eq. TBDPSCl, DMAP, Pyridin, 60 h bei RT; 58%, III) Glycerol, BH₃•THF, 16 h bei 160°C, 36%; IV) a) DL-Isopropylidenglycerol, BH₃•THF, 16 h bei 160°C; b) 6.0 eq. TBDMSCl, 12 eq. Imidazol, DMF, 24 h bei RT, 28% über 2 Stufen; V) DOWEX 50X8, H⁺-Form, 48 h bei RT, 17%; VI) C₁₇H₃₅COOH, DCC, DMAP, CH₂Cl₂, 16 h bei RT, Quant; VII) n-Bu₄NF, THF, 4 h bei RT, 73%
• Abbildung 49: Einkristallstruktur von 47
• Abbildung 50: Syntheseversuch von 48: I) HOCH₂CH₂OH, BH₃•THF, THF, NaHCO₃, 14 h bei 160°C
• Abbildung 51: Synthese des O2´-(Octadecylcarbamoyl)uridin 51: I) CDI, CH₂Cl₂, 3 h bei RT, 97%; II) C₁₈H₃₇NH₂, CH₂Cl₂, 48 h bei RT, 78%; III) Et₃N•3HF, THF, 16 h bei RT, 77%
• Abbildung 52: Umsetzung von 52 mit einem sekundären Amin und einem arylischen Amin: I) CDI, CH₂Cl₂, 3 h bei RT, 95%; II) 2-Aminofluoren, CH₂Cl₂, 14 d bei RT; III) Dioctadecylamin, CH₂Cl₂, 14 d bei 40°C
• Abbildung 53: Synthese eine amphiphilen Carbamoyluridin mit Spacer: I) 1.5 eq. Butan-1,4-diamin, CH₂Cl₂, 48 h bei RT; II) Hexan-1,6-diamin, CH₂Cl₂, 48 h bei RT, 60%; III) 2.2 eq. Octadecylbromid, 3.0 eq. K₂CO₃, DMF, 48 h bei RT, 88%; IV) Et₃N•3HF, MeOH, 16 h bei RT
• Abbildung 54: Synthese des N,N-Bis-octadecyl-1,3-aminopropylamin 61: I) Acrylnitril, 18 h unter Rückfluss, Quant.; II) LiAlH₄, Et₂O, 4 h unter Rückfluss, 87% oder NiCl₂•6 H₂O, NaBH₄, CH₂Cl₂ : MeOH 5:1, 16 h bei RT, 90%; III) TFA, H₂SO₄ (konz.), 32 h bei 60°C, Quant.; IV) BF₃•OEt₂, THF, 5 h unter Rückfluss und 16h bei RT; V) Pd(OH)₂/C, 1atm H₂, CH₃COOH, 16h bei RT
• Abbildung 55: Synthese von O2´-((Dioctadecylamino)ethylcarbamoyl))-2´-desoxyuridin 65: I) N,N-Bis-octadecyl-1,3-aminopropylamin, CH₂Cl₂, 21 d bei RT, 74%; II) Et₃N•3HF, 2 h bei RT, 73%
• Abbildung 56: Synthese der O2´-(Octadecylcarbamoyl)nukleoside: R = Adenin, Guanin, Cytosin I) TIPDSCl, Pyridin, 24 – 48 h, 0°C - >RT; II) CDI, CH₂Cl₂, 24 – 72 h bei RT; III) C₁₈H₃₇NH₂, CH₂Cl₂, 48 h bei RT; IV) Et₃N•3HF, THF, 16 h bei RT
• Abbildung 57: Allgemeine Synthese von S2´-alkylierten Thiouridinen
• Abbildung 58: Einkristallstruktur von 70b
• Abbildung 59: Verknüpfung von 2´-Thio-DNA-Monomeren zu „ladderoligomers“ nach Seeman et al.(Zhu et al., 2003 )
• Abbildung 60: basische Überführung von 2´-Thio-3´-phosphatcytidin zum 2´-Thiophosphatcytidin
• Abbildung 61: Vorläufer für die Synthese unsymmetrischer Disulfide
• Abbildung 62: Mechanismus der Bildung des unsymmetrischen Disulfides am Beispiel des DIADs
• Abbildung 63: Synthese der unsymmetrischen Disulfide: I)a) 1.0 eq. DIAD, THF, 16 h bei RT; b) 20 eq. C₁₈H₃₇SH, 72 h bei RT, 25% über 2 Stufen; II) 5.0 eq. Octadecylsulfenylchlorid, CH₂Cl₂:CH₃COOH 1:1, 62 h bei RT, 37%; III)a) 1.0 eq. PTAD, THF, 14 h bei 40°C; b) 2.0 eq. Pyen-C₁₁H₂₂SH, 24 h bei RT, 75%
• Abbildung 64: Versuche zur Synthese von 11-Thio-1-(pyrenyl)undecan: I)a) 2.4 eq. SOCl₂, über Nacht bei RT; b) 0.9 eq. Pyren, 1.1 eq. AlCl₃, CH₂Cl₂, 0°C -> 45 °C, 4 h, Quant. II) 2.0 eq. TosNHNH₂, DOWEX 50WX4 (H⁺), Benzol, 14 h unter Rückfluss, Quant. III)a) 5.0 eq. NaCNBH₃, CH₃COOH, 2 h bei 80 °C; b) 4.0 eq. NH₂C(S)NH₂, EtOH
• Abbildung 65: Synthese des 11-Thio-1-(pyrenyl)undecan 91: I)a) 1.1eq. HSiMe₂Cl, 0.3 eq. InCl₃, 1,2-DCE, 8 h bei 80°C b) 3.0 eq. HSiMe₂Cl, 16 h bei RT, 30% II) Et₃SiH, CF₃COOH, CCl₄, 10 d bei RT, 57%; III) 2.0 eq. KSAc, THF, 16 h unter Rückfluss, 92%; IV) 7.0 eq. NaOH, 1-BuOH, 3 ½ h unter Rückfluss, 64%
• Abbildung 66: Aufgenommenes Fluoreszenzemissionsspektrum von 97 in Dichlormethan
• Abbildung 67: Excimerenbildung von Pyren in Ethanol. Spektrum ist auf 371.5 nm normalisiert 1) 2 mM Pyren mit Argon begast, um den Sauerstoff zu entfernen, 2) 2 mM Pyren unter Laborbedingungen, 3) 0.5 mM (Argonbegasung), 4) 2 μM (Argonbegasung) aus Invitrogen-Molecular Pr o bes Handbuch
• Abbildung 68: Darstellung des 2’-Azido-2’-desoxyuridins als die Azidkomponente
• Abbildung 69: Regioisomerenbildung bei Azid-Alkin-Cycloaddition
• Abbildung 70: TBTA (Tris[1-benzyl-1H-(1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amin) 105
• Abbildung 71: vorgeschlagene Katalysezyklen für die CuAAC(Rostovtsev et al., 2002 )
• Abbildung 72: Darstellung von „Triazol-cross-linked-ODN“ nach Nakane et al.(Nakane et al., 2008 )
• Abbildung 73: AFM–Bilder der 1:1 Mischung des Adenosinquarterthiophen und des Thymidinquarterthiophen
• Abbildung 74: Synthese von galactose-modifizierten Oligonukleotiden durch die Click-Reaktion
• Abbildung 75: Darstellung der synthetisierten N2’-(4-(n-alkyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-2’-desoxyuridine
• Abbildung 76: Synthese von 2´-Amidouridinen: I) DMTrCl, DMAP, Pyridin, über Nacht bei RT, 90%; II)a) Cl₃CCN, NaH, 18 h bei 90°C, 68%; b) 6 N NaOH, EtOH, 16 h unter Rückfluss, 57%; III) 2.0 eq. TBDMSCl, 8.3 eq. DBU, CH₂Cl₂, 16h bei RT, Quant. IV) n-C₁₅H₃₁COOCl, DCC, HOBT, DMF, 16 h bei RT; V) n-C₁₅H₃₁COOH, EDC, DMAP, CH₂Cl₂, 16 h bei RT; VI) n-C₁₇H₃₃COOH, Et₃N, CH₂Cl₂, 4 h bei RT, 41%
• Abbildung 77: Synthese von 2´- Aminouridinen: I) Dess-Martin-Reagenz, CH₂Cl₂, 4 ½ h, 0°C ->RT, Quant. II) 0.3 eq. NaCNBH₃, MeOH: CycH (2:1, v:v), über Nacht 0°C ->RT, 12%; III) Nonanal, 0.3 eq. NaCNBH₃, MeOH, über Nacht 0°C ->RT, 90%
• Abbildung 78: Postulierter Radikalmechanismus der Synthese von 2´-C-Vinyl-2´-desoxy- und 2´-C-hydroxyethyl-2´-desoxyuridin nach Sukeda et al.(Sukeda et al., 2000 )
• Abbildung 79: Allgemeiner Mechanismus der metallkatalysierten Kreuzkupplung
• Abbildung 80: Kreuzkupplungen an 2´-Iod-2´-desoxyuridin: I) 5 mol% FeCl₃, TMEDA, 3-MeOC₆H₄MgBr in THF (0.25 M), THF, -78°C -> 0°C, 1 h; II) 5 mol% NiCl₂, TMEDA, AllylMgBr in THF (0.25 M), THF, -78°C -> 0°C, 1 h; III) 20 mol% PdCl₂, 20 mol% (dppf)₂, AllylMgBr in THF (0.25 M), THF, -78°C -> 0°C, 1 h; IV) PhB(OH)₂, PPh₃, K₂CO₃, TBAB, Pd(OAc)₂, DMF, 48 h bei 70°C
• Abbildung 81: Reaktionsmechanismus der Sonogashirareaktion
• Abbildung 82: Synthese der 5-Alkinyl-2´-desoxyuridine: I) Propargylbromid (80 wt% in Toluol), TBAB, THF, 50% KOH, 0°C ->RT, 16 h, 20%; II) Propargylbromid (80 wt% in Toluol), TBAB, THF, 50% KOH, 0°C ->RT, 16 h, 85%; III) 5 mol% Pd(PPh₃)₄, 10 mol% CuI, 2.0 eq. Et₃N, DMF, 16 h bei RT, 53%; IV) 5 mol% Pd(PPh₃)₄, 10 mol% CuI, 2.0 eq. Et₃N, DMF, 16 h bei RT, 61%
• Abbildung 83: Synthesezyklus beim Phosphoramiditverfahren
• Abbildung 84: Allgemeine Synthese von 130: I) 2.2 eq. DMTrCl, DMAP, Pyridin, 1 ½ h – 48 h bei RT
• Abbildung 85: Allgemeine Synthese von 131: I) 1.1 eq. CyTIPP, 1.1 eq. 0.45 M Tetrazollösung oder 1.1. eq. 4,5-Dicyanoimidazol, CH₂Cl₂, 2 h – 3 h bei RT
• Oligo1
• Oligo2
• Oligo3
• Oligo4
• Oligo5
• Oligo6
• Abbildung 86: Mögliche Mechanismen zur beobachteten Spaltung von 2´-Thio-2–desoxynukleotiden im Basischen(Johnson et al., 1995 )
• Abbildung 87: ³¹P-NMR Spektren der verschiedenen Phospholipidphasen
• Abbildung 88: Struktur von POPC aus Wikipedia.org
• Abbildung 89: ³¹P–NMR–Spektren von POPC Membranen in Anwesenheit von 25 mol% 4/5 (A), 14 (B), 70b (D), 22 (E) und reinen POPC (F) als Referenz
• Abbildung 90: Geglättete ²H-NMR-Ordnungsparameterprofile der Proben POPC-d₃₁ P (#SYMBOL#), 4/5/POPC-d₃₁ (↓), 14/POPC-d₃₁ (≤), 22/POPC-d₃₁ (###), 70b/POPC-d₃₁ (⋅), 70c/POPC (﹁)
• Abbildung 91: Geglättete ²H-NMR-Ordnungsparameterprofile der Proben POPC-d₃₁, OK268(70b)/ POPC-d₃₁, OK-268-d ₃₃ (70c)/ POPC-d₃₁
• Abbildung 92: Geglättete ²H-NMR-Ordnungsparameterprofile der Proben POPC-d₃₁, OK345(70h)/ POPC-d₃₁, OK 388(129)/ POPC-d₃₁ im Vergleich zum Cholesterol unter den angegeben molaren Verhältnissen
• Abbildung 93: Square-Law Plots der Proben OK268(70b)/ POPC-d₃₁, OK268-d₃₃ (70c)/ POPC im Vergleich zu DMPC-d₅₄ und POPC-d₃₁
• Abbildung 94: Darstellung der Protonen, welche im ¹H-NOESY-NMR-Spektrum zugeordnet werden können
• Abbildung 95: Normierte intermolekulare ¹H-NOESY Kreuzrelaxationsraten zwischen den lipophilen Nukleosiden 4/5 (Symbol: Raute), 14 (Symbol: Quadrat) bzw. 22 (Symbol: Kreis ) und den POPC-Molekülen innerhalb der Membran als Funktion der Koordinaten der einzelnen Lipidsegmente entlang der Membrannormalen. Oben: Mittlere Lokalisation der Protonen H6 (A), H5 (B) des Uracils und des H1’ Protons der Ribose (C). Die Messungen wurden bei einem molaren Verhältnis POPC/lipophiles Nukleosid 4/1, einer Temperatur von 303 K und einer Rotationsfrequenz von ωr/2π = 6009 Hz durchgeführt.
• Abbildung 96: Schematische Tiefendarstellung der Nukleolipide 14, 22 und 4/5 in der POPC- Membran
• Abbildung 97: Schematische Darstellung eines Oligonukleotides 5´-U_LUU-UUU-UUU_L-UUU-U-3´, wobei L der Anker an der 5-Position des Uridins ist.
• Abbildung 98: Schematische Darstellung eines Oligonukleotides 5´-U_LUU-UUU-UUU_L-UUU-U-3´, wobei L den Anker an der 2´-Position des Uridins ist
• Abbildung 99: Monomer U_L des untersuchten Oligonukleotides
• Abbildung 100: ³¹P-NMR-Spektrum von POPC Membranen in Gegenwart des lipophilen Oligonukleotid Oligo1b bei einem Wassergehalt von 65 wt% (303 K). Die isotrope Linie wurde grau hinterlegt
• Abbildung 101: Geglättete ²H-NMR-Ordnungsparameterprofile der Proben POPC-d₃₁ (Symbol: Quadrat), Oligo7/POPC-d₃₁ (Symbol: Quadrat), Oligo8/POPC-d₃₁ (4), POPC-d₃₁ + 5 mol% DOTAP (Symbol: Kreis) und Oligo1b/POPC-d₃₁ + 5 mol% DOTAP (Ι) bei einem eingesetzten molaren Verhältnis POPC/Oligonukleotid 100/1 (für Oligo1b 200/1), Wassergehalt von 65 wt%, 303 K
• Abbildung 102: ²H-NMR-Spektren der Proben (A) Oligo2b-d₆₆/POPC, (B) Oligo1b/POPC-d₃₁ + 5 mol% DOTAP und (C) POPC-d₃₁ + 5 mol% DOTAP bei einem Wassergehalt von 65 Gewichtsprozent. Die Spektren wurden bei 303 K aufgenommen. Die roten Linien sollen dem Leser bei der Bestimmung der Position der Plateaupeaks helfen
• Abbildung 103: Darstellung der für die molekulare Erkennung komplementärer Nukleinsäuren aktiven Bereiche der membranassoziierten lipophilen Oligonukleotide. Der blaue Balken gibt den Teil der lipophilen Oligonukleotide an, der mit komplementären Strängen eine Helix ausbilden kann
• Abbildung 104: Druck-Flächen (π- Ų)-Diagramm (isotherm) von 4/5
• Abbildung 105: Druck-Flächen-Diagramm (π- Ų, isotherm) von verschiedenen Mischungen aus 4/5 und DPPC
• Abbildung 106: UV-VIS-Spektrum des Nukleopides 4/5 in Lösung (CHCl₃) und im LB-Film
• Abbildung 107: Schematische Darstellung des erwarteten Bindungsexperimentes von Dr. A. Kurz
• Abbildung 108: FRET-Messungen der Vesikel A + B (links) und einer Vergleichsmessung mit den Vesikel B + C (rechts) von Dr. A. Kurz und Dr. A. Arbuzova
• Abbildung 109: Schema der Kapselpräpäration mittels der LBL-Technologie(Peyratout und Dahne, 2004 )
• Abbildung 110: Bedecken eines LBL-A21-Partikel mit unterschiedlichen LUV-Schichten, welche die membrangebundenen Oligonukleotide Oligo5a und Oligo9 enthalten
• Abbildung 111: Theoretische Möglichkeiten der Duplexbildung der Oligonukleotide Oligo5b und Oligo5d mit einen dritten Oligonukleotidstrang
• Abbildung 112: Theoretische Möglichkeit der Duplexbildung der Oligonukleotide Oligo 4 a und Oligo 4 b
• Abbildung 113: Die drei möglichen Modi in der AFM und ihr Messbereich
• Abbildung 114: „Laboratory on a tip“ aus(Muller, 2008 )
• Abbildung 115: AFM-Aufnahme von DOPC auf einer Siliziumoberfläche(Pompeo et al., 2005 ). a) topographische Aufnahme auf 3x3 μm² _; b) Querschnitt zwischen A-A´; c) statistische Auftragung der Vesikelgrößen
• Abbildung 116: AFM-Aufnahmen von rotationsbeschichten POPC-multilamellaren Filmen bei Raumtemperatur und einer Luftfeuchtigkeit von 20-40%(Simonsen und Bagatolli, 2004 ). Alle Aufnahmen bei 10x10 μm² bei unterschiedlichen Lipidkonzentrationen: 5 mg/mL (A), 3 mg/mL (C) and 2 mg/mL (E). Die Filmoberfläche ist terrassenartig aufgebaut mit einer Stufenhöhe von 62 ± 5 Å (siehe Querschnitt oberhalb der topographischen Aufnahmen)
• Abbildung 117: Schematische Darstellung der beobachteten Lipidschichten auf der hydrophilen Oberfläche. Bei geringer Lipidkonzentration wird nur wenig der Oberfläche beladen und man sieht viele Lücken und wenige Doppelschichten. Bei hoher Lipidkonzentration erfolgt eine vollständige Beladung der Oberfläche. Man beobachtet das Ausbilden der Treppenstruktur durch das Ausbilden von multilamellaren Schichten
• Abbildung 118: STM Bilder (a+b) und computergenerierte Modelle (c-f) der untersuchten 3´-Eicosylphosphatnucleoside von Barthelemey und Grinstaff et al.(Bestel et al., 2008 ); links) 3´-Eicosylphosphatthymidin auf HOPG; rechts) 3´-Eicosylphosphatadenosin und 3´-Eicosylphosphatthymidin auf HOPG
• Abbildung 119: Schematische Darstellung der Wasserstoffbrücken und der Orientierung der Nukleobasen während der Übergangsphase vor und nach der molekularen Erkennung von Liang et al.(Miao et al., 2003 )
• Abbildung 120: Struktur der untersuchten 2´-Stearoylcarbamoylnucloside und deren Watson-Crick-Basenpaarungen
• Abbildung 121: AFM- Aufnahme von 51
• Abbildung 122: AFM- Aufnahme von 68a
• Abbildung 123: AFM- Aufnahme von 68b
• Abbildung 124: AFM- Aufnahme von 68c
• Abbildung 125: AFM- Aufnahme von 51 & 68a
• Abbildung 126: AFM- Aufnahme von 68b & 68c
• Abbildung 127: In den AFM-Messungen eingesetzte Nukleolipide 22 und 31
• Abbildung 128: AFM–Aufnahme des Nukleolipides 22 bei 40x 40 μm² und eine Vergrößerung der vesikelähnlichen Struktur bei 1x1 μm²
• Abbildung 129: Querschnitt zwischen A und A´ der AFM-Aufnahme des Nukleolipides 22
• Abbildung 131: Querschnitt zwischen A und A´ der AFM-Aufnahme des Nukleolipides 31
• Abbildung 132: AFM–Aufnahmen des Gemisches der Nukleolipide 22 und 31 bei 40x 40 μm² und eine Vergrößerung der Struktur bei 5x5 μm²
• Abbildung 133: Querschnitt zwischen A und A´ der AFM-Aufnahme des Gemisches der Nukleolipide 22 / 31
• Abbildung 134: Struktur von 46
• Abbildung 135: AFM–Aufnahme des Nukleolipides 46 bei 40x 40 μm² und eine Vergrößerung der markierten Stelle auf 5x5 μm²
• Abbildung 136: Querschnitt zwischen A und A´ der AFM-Aufnahme des Nukleolipides 46
• Abbildung 137: Lipidierte Uridine 4/5, 8, 14, 17 und 22 mit einem oder mehreren Lipidresten an der O2´-Position
• Abbildung 138: Schematische Tiefendarstellung der Nukleolipide 14, 22 und 4/5 in einer POPC- Membran
• Abbildung 139: Synthese der O2´-Octadecylcarbamoylnukleoside
• Abbildung 140: AFM–Aufnahme von 22
• Abbildung 141: AFM–Aufnahme von 46
• Abbildung 142: Funktionalisierungen der O2´- Position des Uridins ausgehend vom Anhydrouridin 41
• Abbildung 143: Synthese von neuartigen 2´-Thioether-2´-desoxyuridinen
• Abbildung 144: Eingesetzte 2´-lipidierte Nukleotide in den synthetisierten Oligonukleotiden
• Abbildung 145: Darstellung der für die molekulare Erkennung komplementärer Nukleinsäuren aktiven Bereiche der membranassoziierten lipophilen Oligonukleotide Oligo1b, Oligo 7 und Oligo 8. Der blaue Balken gibt den Teil der lipophilen Oligonukleotide an, der mit den komplementären Strängen eine Helix ausbilden kann
• Abbildung 146: Eingesetzte Nukleotide mit basenständigem Anker in den synthetisierten Oligonukleotiden
• Abbildung 147: Beladen eines LBL-A21-Partikel mit LUVs, welche die membrangebundenen Oligonukleotide Oligo5 und Oligo9 enthalten