In der vorliegenden Arbeit wurden für NMR-spektroskopische und auch biophysikalische Untersuchungen während der Membraninkorporierung von Nukleolipiden und lipohilen Oligonukleotide, die nötigen Substanzen synthetisiert.

Um einen Eindruck zu gewinnen, welche Ankeranzahl für eine erfolgreiche Insertierung in Membranen sinnvoll ist und ob ein Spacer wichtig ist, damit der Anker nicht zu weit in die Membran hereinragt, wurden an Uridin ein oder mehrere Fettacylreste eingeführt, ohne dass diese Produkte später in eine Oligonukleotidsynthese einfließen sollten (s. Abb. 137). Hierzu wurde die O3´- und die O5´-Position des Uridins mit der zweizähnigen Silylschutzgruppe TIPDSCl geschützt und anschließend die O2´-Position mit Palmitinsäure verestert. Nach der Entfernung der Silylschutzgruppe mit Fluorid wurde jedoch infolge einer 2´,3´-Acylwanderung ein Isomerengemisch 4/5 in 43% (über 3 Stufen) Ausbeute erhalten. Für die Anbringung zweier lipophiler Gruppen wurde das Uridin an der O5´-Position mit DMTrCl geschützt und die freien Hydroxylgruppen mit Palmitinsäurechlorid verestert. Nach dem Entfernen der Schutzgruppe wurde der erwartete 2´,3´-Dieester 1 4 in 20% Ausbeute (über 3 Stufen) erhalten. Das Disuccinat 17 ließ sich analog durch Diacylierung mit Bernsteinsäureanhydrid und nachfolgender Veresterung mit Pentadecanol und abschließender Entschützung in 43% Ausbeute (über 4 Stufen) herstellen. Der Versuch, ausgehend vom 3´,5´-geschützten Uridin durch Reaktion mit 4-(1,3Bis(oleoyloxy)propan-2-yloxy)-4-oxobutansäure das 2´-Acylierungsprodukt 21 zugänglich zu machen, lieferte bei der Entschützung ausschließlich das umgelagerte 3´-Acylprodukt 22. Eine derartige Umlagerung konnte unterbunden werden, wenn der lipophile Rest in die O2´-Position mittels einer Mitsunobureaktion eingeführt wird. Allerdings entsteht dabei das Arabinosederivat 8.

Abbildung 137: Lipidierte Uridine 4/5, 8, 14, 17 und 22 mit einem oder mehreren Lipidresten an der O2´-Position

Anhand der Aufnahme von axialsymmetrischen ³¹P-Pulverspektren ist durch die Inkorporierung der dargestellten Nukleolipide in die Membran keine Störung der Kopfgruppe zu erkennen. Die POPC–Membran bleibt in der lamellaren flüssig-kristallinen Phase. Messungen von ²H–NMR-Spektren konnten weiterhin zeigen, dass sie weder die Packungseigenschaften der Membran noch deren Elastizität signifikant verändern. Mittels ¹H-NOESY-NMR-Spektroskopie unter MAS wurden durch das Auftragen der relativen Kreuzrelaxationsraten zwischen den eindeutig zuordenbaren Protonen des Nukleolipides (CH5, CH6 und CH1´) und des Phospholipides (Cholingruppe, Glycerolgruppe, Doppelbindung im Oleoylrest) ermittelt, wie weit die Nukleolipide in die Membran ragen. Die Ergebnisse zeigen, dass Nukleolipide mit mehr als einen Alkylanker sehr tief in die Membran verankert sind und demzufolge nur für die Watson-Crick-Basenpaarung zur Verfügung stehen, wenn sie einen Spacer zwischen dem lipophilen Rest und der Ribose aufweisen.

Abbildung 138: Schematische Tiefendarstellung der Nukleolipide 14, 22 und 4/5 in einer POPC- Membran

Es stellte es sich heraus, dass das Nukleolipid 4/5 oberflächenaktiv ist und stabile Langmuir-Filme ausbilden können, obgleich Aggregation auftreten kann. Ebenfalls konnte ein Transfer auf Quartz in Form von LB-Filmen nachgewiesen werden. Das 2´-diacylierte Nukleolipid 22 ließ sich stabil in die Membran einbauen, was mittels Absorptionsmessungen nach einer Ultrazentrifugation von Saccharose-gefüllten LUVs bestimmt werden konnte. Konfokale Fluoreszenzmikroskopie-Untersuchungen an GUVs, LUVs oder MLVs aus POPC und NBD-PE zeigten jedoch, dass das in Membranen verankerte lipidierte Uridin 22 keine Bindung mit in Lösung befindlichem RhA20mer eingeht. Weiterhin konnte bisher keine Wechselwirkung zwischen Vesikeln nachgewiesen werden, welche zum einen 22 und POPC/NBD-PE enthielten und zum anderen ein komplementäres Nukleolipid und POPC/Rh-PE. Der Grund dafür könnte in einer zu tiefen Verankerung des komplementären lipidierten Adenosins 1 32 in der Membran liegen, da es den lipophilen Anker an der C8-Position des Adenins trägt und im Gegensatz zu 22 kaum eine Watson-Crick-Basenpaarung ausbilden kann. Um dies zu klären, wurde statt mit 1 32, das POPC-LUV mit dem zu 22 analogen Adenosinderivat 31 inkubiert. Jenes wurde durch Veresterung eines O3´,O5´–geschützten Adenosins mit 6 und anschließende Entschützung in 10% Ausbeute (über 3 Stufen) erhalten. Die Ergebnisse zu diesen biophysikalischen Messungen stehen jedoch noch aus.

Um der 2´,3´-.Acylwanderung zu umgehen, wurden andere funktionelle Gruppen für die Verknüpfung des Lipidankers verwendet. So konnte das über eine 2´-Glycerolether verknüpfte Derivat 46 über 6 Stufen in Anlehnung an eine Verfahrensweise von Prakash et al.(Prakash et al., 2002 ), ausgehend von O2,O2´-Anhydro-O5´-TBDPS-uridin 38 erhalten werden.

Ähnlich der Synthese von nichtlipophilen des O2´-Carbamoyluridinen(Korshun et al., 2002 ) wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit alle vier Nukleolipide 51/68 mit einem Octadecylaminrest dargestellt. Dadurch eröffnet sich generell, auch für zukünftige Arbeiten, ein einfache Methode, um alle vier Nukleoside (Uridin (Thymidin), Adenosin, Guanosin, Cytidin) in ihre Nukleolipidanaloga zu überführen. Nach der Einführung der Schutzgruppe, der anschließenden Umsetzung des Nukleosides in einer Eintopfreaktion mit CDI und Octadecylamin wurden die entsprechenden Produkte nach der Entschützung in Ausbeuten zwischen 15 und 54 % (über 4 Stufen) erhalten. Dabei konnte keine Wanderung des Carbamatrestes von der O2´- auf die O3´- Position mittels NMR–Spektrum beobachtet werden.

Abbildung 139: Synthese der O2´-Octadecylcarbamoylnukleoside

Zur Erforschung eines möglichen supramolekularen Verhaltens der lipidierten Nukleolipide wurden AFM-Untersuchungen auf Glasoberflächen durchgeführt. Es zeigte sich, dass diese Carbamte 68 keine besonderen Strukturen ausbilden. Dafür könnte die geringe Löslichkeit solcher Carbamte in dem verwendeten Lösungsmittelgemisch verantwortlich sein oder die Tatsache, dass diese Substanzen nur einen Anker tragen, im Gegensatz zu den literaturbekannten AFM–Messungen von Nukleolipiden, in denen zwei Lipidanker vorhanden sind. In der Tat ließ sich durch AFM-Untersuchungen an den zweifach lipidierten Vertretern 22 und 31 die Ausbildung von vesikelähnlichen Strukturen nachweisen. An einem anderen zweikettigen amphiphilen Nukleolipid 46 zeigte sich die Ausbildung von Lipidschichten.

Der Nachteil der Synthese von Carbamten liegt darin, dass keine sekundären Amine direkt eingesetzt werden können. Um dennoch Dialkylaminogruppen einzuführen wurden deshalb auf Amine zurückgegriffen, die einen primären Aminoethyllinker besitzen. So gelang die Umsetzung des O3´,O5´-geschützten Uridins 20 mit dem N,N-Bis-octadecyl-1,3-aminopropylamin 61 und anschließender Entschützung zu dem lipidierten Uridin 65 in 52% Ausbeute (über 3 Stufen).

Abbildung 140: AFM–Aufnahme von 22

Abbildung 141: AFM–Aufnahme von 46

O2, O2´- Anhydrouridin war aus der Literatur als ein guter Vorläufer für die Einführung verschiedener funktioneller Gruppen, wie Amino, Azido, Mercapto und Iod, in die 2´-Positon, bekannt.

Abbildung 142: Funktionalisierungen der O2´- Position des Uridins ausgehend vom Anhydrouridin 41

Wir stellten aus dem so zugänglichen 2´-Amino-2´-desoxyuridin 112 und Oleoylchlorid das entsprechende 2´-Oleoylaminoderivat her. Eine reduktive Aminierung zum Nonylaminoderivat gelang an 112 mit Nonanal in 90% Ausbeute, jedoch mit 2,3-Bis(octadecoxy)propanal lediglich in 12% Ausbeute.

Das 2´-Iod-Derivat 120 sollte mittels einer Kreuzkupplung in entsprechende 2´-C-α-alk(in)yluridine überführt werden. Entsprechende Versuche zu Kumada- und Suzuki-Kupplungen schlugen jedoch fehl, was auf den per se problematischen aliphatischen Charakter dieses Substrates zurückgeführt werden kann. Es wurden lediglich Eliminierungsprodukte oder unumgesetzte Edukte erhalten.

Am 2´-Azido-2´-desoxyuridin 100 konnten erstmalig Cu-katalysierte Click-Reaktionen mit Dodecin bzw. Cholesterolpropargylether erzielt werden. Die besten Ausbeuten wurden mit 40 mol% Natriumascorbat und 20 mol% CuSO₄•5 H₂O als Katalysatorensystem erreicht. In den so erhaltenen Produkten ist der Lipidrest über einen 1,2,3-Triazollinker an der 2´-Position verknüpft.

Ein weiterer einfacher Zugang zu 2´-lipidierten Uridinen erfolgte über das 2´-Thio-2´-desoxyuridin 69. Durch basische Veretherung gelang es in moderaten bis guten Ausbeuten eine Reihe neuartiger 2´-Thioether darzustellen (s. Abb. 143). Alternativ ließen sich Lipidanker an der 2´-Position von 2´-Thio-2´-desoxyuridin auch über die DIAD- oder PTAD-(4-Phenyl-1,2,4-triazolin-3,5-dion) vermittelte Disulfid-Bildung einführen.

Abbildung 143: Synthese von neuartigen 2´-Thioether-2´-desoxyuridinen

Nun konnten durch die Verwendung unterschiedlichster Synthesestrategien und unterschiedlicher Funktionalisierungen an der O2´-Position eine Reihe neuer lipophiler Nukleoside dargestellt werden, von denen einige in Membranen verankern. Auch wurde gezeigt, dass einige der Nukleolipide supramolekulares Verhalten durch die Bildung von vesikelähnlichen Strukturen oder Lipidschichten in organischem Lösungsmittel aufweisen. Doch wie sieht es nun mit lipophilen Oligonukleotiden dieser Spezies aus? Verankern diese nun auch in Membranen und binden sie gar komplementäre Oligonukleotide? Um dieses Verhalten zu klären wurden einige der vorstehend aufgeführten Nukleoside in die Synthese von Oligonukleotiden einbezogen. Hierzu wurden diese 5´-DMTr-geschützt, in die 3´-Phosphoramidite überführt und anschließend im DNA-Synthesizer weiter umgesetzt.

Abbildung 144: Eingesetzte 2´-lipidierte Nukleotide in den synthetisierten Oligonukleotiden

Es stellte es sich heraus, dass es bei der basischen Abspaltung des Oligonukleotides vom Harz zu einem Strangbruch der Disulfide kam. Die Oligonukleotidsynthese von 70b zu Oligo1 und 70c  zu Oligo2 gelang dagegen ohne Probleme.

Die lipidierten Oligonukleotide wurden in Lipidmembranen (LUVs und GUVs) eingelagert und mit der NMR–Spektroskopie untersucht (³¹P–Pulverspektren, ²H–NMR–Spektren). Es zeigte sich, dass diese Einlagerung weder die Struktur (lamellar flüssig-kristallin) noch die Ordnung der Membran signifikant stören. Aus den ³¹P–Spektrum des Oligo 2 erkennt man einen großen isotropen Peak, der für eine große Beweglichkeit des Oligonukleotides in der Membran spricht und demzufolge für eine schlechtere Insertierung, als bei der Verwendung von Oligonukleotiden mit einem Tocopherolanker an der 5-Position der Base. Mit Hilfe von DSC–Messungen wurde untersucht, ob in lipidierten Oligonukleotiden auch die Nukleoside, welche lipophile Reste tragen, eine Watson-Crick-Basenpaarung eingehen. Die Schmelztemperaturen der lipophilen Oligonukleotide und ihre komplementären Partner (A25) wurden zum einen in Lösung und zum anderen membranassoziert gemessen. Dabei stellte es sich heraus, dass die lipohilen Oligonukleotide in Lösung mehr Basenpaarungen eingehen, als in der Membran, nämlich statt 17 sind es 19 Basenpaare, was dafür spricht, dass die lipidierten Nukleotide im Falle der Membranfixierung keine Basenpaarung eingehen. Außerdem wird deutlich, dass der Teil der DNA, der sich zwischen den lipidierten Nukleotiden befindet, nicht an der Doppelstrangbildung teilnimmt, wenn diese beiden Nukleotide (s. Abb. 145 für die Oligonukleotide Oligo1b, Oligo 7 und Oligo 8) im Abstand von 7 Einheiten (weniger als eine Helixwindung) liegen.

Abschließend sei festzustellen dass es demnach bei Anwendung von Oligonukleotiden unbedeutend ist, wo der lipophile Rest am Nukleotid vorkommt, denn zum einen geht das entsprechende Nukleolipid selbst keine Basenpaarung ein und zum anderen erfolgt keine Basenpaarung über dieses hinweg.

Abbildung 145: Darstellung der für die molekulare Erkennung komplementärer Nukleinsäuren aktiven Bereiche der membranassoziierten lipophilen Oligonukleotide Oligo1b, Oligo 7 und Oligo 8. Der blaue Balken gibt den Teil der lipophilen Oligonukleotide an, der mit den komplementären Strängen eine Helix ausbilden kann

Abbildung 146: Eingesetzte Nukleotide mit basenständigem Anker in den synthetisierten Oligonukleotiden

Für biotechnologische Anwendungen konnte mit Hilfe dieser synthetisierten lipophilen Oligonukleotide gezeigt werden, dass zwei vesikelmembranverankerte Oligonukleotide, welche komplementäre Enden tragen, eine Doppelhelix miteinander bilden und so diese beiden Vesikel auf einen definierten Abstand halten können. Dazu wurde an einen LBL–Partikel kovalent ein A21mer verknüpft. Dieses konnte mit dem passenden Oligonukleotid Oligo5a (LT18), welches in einen LUV insertiert ist, eine Doppelhelix ausbilden. Der Nachweis erfolgte durch den Einsatz der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie und einer abbildenden Mikroskopie (DIC). Durch abwechselnder Verwendung von LT18–NBD-LUVs und LA17–Rh-LUVs (Oligo9) ließ sich die gezielte DNA-vermittelte Bildung mehrerer unterschiedlicher Vesikelschichten auf dem LBL–Partikel erzielen. Die einzelnen Schichten können getriggert (Mellitin) fusioniert werden, was für verschiedenste „drug-delivery“-Anwendungen von großem Interesse ist.

Abbildung 147: Beladen eines LBL-A21-Partikel mit LUVs, welche die membrangebundenen Oligonukleotide Oligo5 und Oligo9 enthalten

Abschließend lässt sich feststellen, dass es gelungen ist, eine Reihe neuer lipidierter Nukleoside und Oligonukleotide zu entwickeln, die den Lipidrest in den meisten Fällen an der 2´-Position tragen. Mit Hilfe dieser Verbindungen konnten wichtige Zusammenhänge zwischen der Struktur und den Eigenschaften (supramolekulare Eigenschaften, Membranverankerung, Ausbildung von Doppelsträngen) aufgedeckt und neuartige Anwendungen in der Nanobiotechnologie ermöglicht werden. Die Ergebnisse haben sich bisher in 3 Publikationen niedergeschlagen.