D Endophytisches Pilzwachstum in den Spargelstangen

Vorliegende Untersuchungen sollen zur Klärung der Frage beitragen, ob die Kurzzeitlagerung von nicht geschältem und geschältem Spargel in Folienverpackungen, die für geschälten Spargel aus hygienischen Gründen zwingend erforderlich sind (HACCP-Konzept), bei Lagertemperaturen von 10°C und 20°C Einfluss auf das Pilzwachstum und die Bildung von Mykotoxinen haben.

Zum Nachweis endophytischer Pilzarten im Gewebe von frisch geernteten und gelagerten Spargelstangen wurden zu verschiedenen Terminen (Tab. 75), jeweils zu Beginn bzw. zum Ende der Erntesaison, Spargelstangen dem Versuchsfeld entnommen

Tab. 75: Probennahme-Termine zum Nachweis endophytische Pilzarten im Gewebe von nicht gelagerten und gelagerten Spargelstangen in den Versuchsjahren 2002 und 2003

Die entnommenen Spargelstangen wurden unter hoher relativer Luftfeuchte zur Aufbereitung zum Labor transportiert. Die Zeitdauer von Erntebeginn bis zur Aufbereitung im Labor betrug ca. 3 Stunden. Die Spargelstangen wurden im Labor gewaschen, danach mit NaOCl-Lösung (2 %) eine Minute oberflächendesinfiziert und mehrmals mit sterilem Aqua dest. gespült. Die Erntemenge wurde teils geschält, teils nicht geschält zu je 500 g (n = 3) jeweils in die Folien P-Plus 2 und Folie PP verpackt. Die gleiche Menge, d.h. dreimal 500 g, wurden mitCoating behandelt und bei Temperaturen von 10°C und 20°C für zwei und drei Tage eingelagert.

Am Ende der Stechsaison 2002 erfolgte eine erneute Probennahme und Aufbereitung wie zu Beginn 2002, jedoch wurden keine Lagervarianten dabei berücksichtigt.

Die Probennahme zu Beginn der Stechsaison 2003 erfolgte 2002 im gleichen Versuchsareal (Feld II, Klaistow). Die Aufbereitung wurde wie zu Beginn der Erntesaison [Seite 104↓]2002 durchgeführt, jedoch erfolgte die Einlagerung in einer biologisch abbaubaren Folienverpackung, Folie BAW 3, bei 20°C mit einer Lagerdauer von 3 Tagen.

Am Ende der Stechsaison 2003 erfolgte die Probennahme wie zu Beginn derselben, die Aufbereitung wie zu Beginn der Stechsaison 2002, jedoch ohne Lagervariante.

Die nicht gelagerten, unverpackten Spargelstangen und die nach zwei, drei oder vier Tagen Lagerdauer aus den Folienverkaufsverpackungen entnommenen Stangen wurden wie folgt aufbereitet: Aus der Spargelspitze wurden bei 7cm und bei 14 cm unter der Laminarbox jeweils drei ca. 2 mm³ große Gewebeproben entnommen (Abb. 22), auf SNA (Nirenberg, 1976) ausgelegt und im Brutschrank bei 20°C, 10 h Dunkelheit im Wechsel mit 14 h UV-Licht, 7 Tage inkubiert.

	Abb. 22: Entnahme der Gewebeproben aus der Epidermis (1), des Perizykels (2) und des Gefäßzylinders (3)

Die aus den Gewebestücken ausgewachsenen Pilzarten wurden auf morphologischer Basis mikroskopisch bonitiert und nach Domsch & Gams (1970), Domsch, Gams & Anderson (1980), Gerlach & Nirenberg (1982), Hawksworth et al. (1995) charakterisiert und taxonomisch nach Kirk et al. (2001) determiniert (Tab. 76).

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Tab. 76: Taxonomie der in den Jahren 2002 und 2003 festgestellten Pilzgattungen und Pilzarten nach Kirk et al. (2001)

Um zu testen, ob es einen Zusammenhang zwischen den nachgewiesenen Pilzarten und einer möglichen Mykotoxinkontamination gibt, wurden unabhängig von den vorausbeschriebenen Untersuchungen am Ende der Spargelstechsaison 2003 insgesamt zehn zufällig entnommene Spargelstangen der Länge nach halbiert und zuerst die Entnahme der Gewebeproben für die endophytische Pilzbesiedlung nur an einer Hälfte der frisch geernteten Spargelstangen vorgenommen. Die aus den Gewebestücken ausgewachsenen Pilzarten wurden unter dem Lichtmikroskop betrachtet und auf morphologischer Basis nach Domsch & Gams (1970), Domsch, Gams & Anderson (1980), Gerlach & Nirenberg (1982), Hawksworth et al. (1995) charakterisiert und taxonomisch nach Kirk et al. (2001) determiniert (Tab. 76).

Nach der Gewebeprobenentnahme (Abb. 23) wurde die andere Hälfte der beprobten Spargelstangen sofort in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und einzeln in der Vakuum-Gefriertrockenanlage (ALPHA 1-4 Firma Martin Christ) getrocknet und zu Pulver vermahlen. Das gefriergetrocknete Probenmaterial wurde im Labor mittels HPLC IAS Clean up, Vorsäulenderivatisierung mit OPA und HPLC mit FLD (AGES GmbH, CC Cluster Chemie, Linz, 2004) auf das Mykotoxin Fumonisin B₁ untersucht.

	Abb. 23: Schema der Probenahme zum Nachweis endophytischer Pilzarten und des Mykotoxins Fumonisin B1

Es wurden die gleichen statistischen Methoden, wie in Kapitel C 2.9 verwendet.

In der Erntesaison der Jahre 2002 und 2003 wurden insgesamt 696 Gewebeproben von nicht gelagerten und ungeschält bzw. geschält bei 10°C und 20°C in Folie PP, Folie P-Plus 2, Folie BAW 3 und Coating-Behandlung für zwei und drei Tage gelagerten Spargelstangen untersucht.

Es konnten vierzehn Pilzarten im Jahre 2002 und zwölf im Jahre 2003 nachgewiesen werden (Tab.77).

Tab. 77: Anteil der Pilzarten (%) in Spargelgewebeproben, geordnet nach der Häufigkeit ihres Auftretens, in den Versuchsjahren 2002 (n = 336) und 2003 (n = 360)

Das Pilzwachstum in Gewebeproben der Spargelstangen war im Jahre 2003 (n = 360) höher als im Jahr 2002 (n = 336).

Das nachgewiesene endophytische Pilzspektrum in den untersuchten Gewebeproben der Spargelstangen differierte zwischen den Jahren 2002 und 2003, so ließen sich Crysosporium spp., Cephalosporium-artige Pilze, Aspergillus spp., Rhizopus spp. und Eurotium spp. nur im Jahre 2003 nachweisen (Tab. 78).

Innerhalb der jeweiligen Ernteperiode konnte an nicht gelagerten Spargelstangen nachgewiesen werden, dass sich der Anteil der Proben, die mit den in Tab. 83 genannten Pilzarten kontaminiert waren, signifikant erhöhte. Eine Ausnahme machte die Pilzart Idriella spp., sie ließ sich am Ende der Saison 2002 nicht mehr nachweisen.

Tab. 78: Anteil der Pilzarten (%) zu Beginn und Ende der Stechsaison 2002 und 2003 aus Gewebeproben von nicht gelagerten Spargelstangen (Kontrolle, n = 60)

Die auf SNA ausgelegten Gewebeproben aus nicht gelagerten Spargelstangen wiesen folgende Pilzarten auf, geordnet nach aufgetretener Häufigkeit: Idriella spp., Cladosporium spp., Fusarium spp., Verticillium spp. und Penicillium spp.

Die zum gleichen Zeitpunkt ausgelegten Gewebeproben des bei 10°C in den Folien PP, P-Plus 2 und mit Coating behandelt gelagerten Spargels zeigten Pilzauswuchs, der den Gattungen Idriella spp., Mucor spp., Cladosporium spp. und Fusarium spp. zugeordnet werden konnte. Nach drei Lagertagen war der prozentuale Anteil von Idriella spp. in der Folienverpackung P-Plus 2 und bei der mit Coating behandelten Variante um 3,3 % angestiegen, in der Folienverpackung PP um 21,7 % gesunken. In der Folie P-Plus 2 stieg nach drei Lagertagen der prozentuale Anteil von Cladosporium spp. um 13,4%.Die nach zwei Lagertagen in der Folie P-Plus 2 nachgewiesene Pilzart Mucor spp. konnte nach drei Lagertagen nicht mehr nachgewiesen werden (Tab.79).

Tab. 79: Prozentualer Anteil der Pilzarten im Gewebe von nicht geschält bei 10°C gelagerten Spargelstangen zu Beginn der Stechsaison 2002 in unterschiedlichen Folienverpackungen(nicht gelagerte Stangen n = 60, gelagerte Stangen pro Folienverpackung n = 12).

In der Folie PP konnte nach drei Lagertagen mit 16,7 % die geringste endophytische Pilzbesiedlung beobachtet werde. Die Gewebeproben aus dem in Folie P-Plus 2 gelagerten Spargel wiesen 50 % Pilzbesiedlung und die mit Coating behandelten Spargelstangen 66,6 % auf (Tab.80).

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Tab. 80: Pilzwachstum (%) (Mischinfektion) in nicht geschälten Spargelstangensegmenten bei 10°C Lagertemperatur in Abhängigkeit von Lagerdauer und Folienverpackung zu Beginn der Stechsaison 2002 (n = 6)

Vom Einlagerungstag bis zum dritten Lagertag verringerte sich deutlich das Pilzwachstum der Gewebeproben aus den nicht geschälten Spargelstangen, die in der Folie PP und mit Coating-Behandlunggelagert wurden. In P-Plus 2 erfolgte am zweiten Lagertag ein Anstieg um 10 %, am dritten Lagertag konnte kein Pilzwachstum mehr festgestellt werden.

Das Pilzwachstum aus den Gewebeproben, die aus S1 entnommen wurden, sank bei in Folie PP und mit Coating-Behandlunggelagerten Spargelstangen bis zum zweiten Lagertag und nochmals bis zum dritten Tag, in P-Plus 2 stieg das Pilzwachstum in geschälten Spargelstangen bis zum zweiten Lagertag in S2 an, am dritten Lagertag konnte kein Pilzwachstum mehr festgestellt werden. (Tab. 81).

Tab. 81: Pilzwachstum (%) (Mischinfektion) in geschälten Spargelstangensegmenten bei 10°C Lagertemperatur in Abhängigkeit von Lagerdauer und Folienverpackung zu Beginn der Stechsaison 2002

Die Spargelgewebeproben des geschälten, zwei und drei Tage gelagerten Spargels zeigten Pilzwachstum, das den Pilzarten, geordnet nach der Häufigkeit ihres Vorkommens, Idriella spp. und Cladosporium spp. zugeordnet werden konnte. Die im [Seite 111↓]erntefrischen Produkt nachgewiesenen Gattungen Verticillium spp., Penicillium spp. und Fusarium spp. konnten nach zwei- und dreitägiger Lagerung nicht mehr nachgewiesen werden (Tab.82).

Tab. 82: Pilzarten (%) im Gewebe von geschälten zwei und drei Tage bei 10°C gelagerten Spargelstangen zu Beginn der Erntesaison 2002

Das Pilzwachstum aus den Gewebeproben der geschält bei 20°C gelagerten Spargelstangen verringerte sich gegenüber dem Pilzwachstum aus Gewebeproben der nicht gelagerten Spargelstangen in Folie PP. In Folie P-Plus 2 konnten prozentual keine signifikanten Veränderungen gegenüber den Ergebnissen der erntefrischen Spargelstangen festgestellt werden, jedoch in der Zusammensetzung der Pilzarten. In den mit Coating behandelt Spargelstangen nahm das Pilzwachstum zu.

Das Pilzwachstum war im Stangensegment S1 und S2 nicht signifikant unterschiedlich; eine Ausnahme machten die untersuchten Gewebeproben der Spargelstangen, die mit Coating behandelt wurden: das Pilzwachstum stieg bis zum dritten Lagertag an (Tab.83 und Tab. 84).

Tab. 83: Pilzwachstum (%) (Mischinfektion) in geschälten Spargelstangensegmenten bei 20°C Lagertemperaturin Abhängigkeit von Lagerdauer und Folienverpackung zu Beginn der Stechsaison 2002

Tab. 84: Pilzarten (%) im Gewebe von geschälten zwei und drei Tage bei 20°C gelagerten Spargelstangen zu Beginn der Erntesaison 2002 in Abhängigkeit von der Folienverpackung

Am Ende der Erntesaison 2002 konnten die Pilzarten Fusarium spp.,Cladosporiumspp.,Penicilliumspp.,Verticillium spp.,Botryotinia spp., Mucor spp., Pythium spp., Zygorhynchus spp., Alternaria spp., Aspergillus spp., Mortierella spp., Trichoderma spp. und Aureobasidium spp. in den Gewebeproben von nicht gelagerten Spargelstangen nachgewiesen werden (Tab. 85).

Tab. 85: Vergleich der nachgewiesenen Pilzarten (%) für den Beginn und das Ende der Erntesaison 2002 (geordnet nach der Häufigkeit ihres Auftretens) (n = 60)

Zu Beginn der Stechsaison 2003 konnten in Gewebeproben des nicht gelagerten Spargels die Pilzarten Fusarium spp. und Cladosporium spp. festgestellt werden (Tab.86). In Gewebeproben von geschält bei 20°C in Folie BAW 3 drei Tage gelagerten Spargelstangen konnten insgesamt 5 Pilzgattungen nachgewiesen werden: Trichoderma spp., Fusarium spp., Cladosporium spp., Idriella spp. und Cephalosporium-artige Pilze. Die bereits in der erntefrischen Kontrolle nachgewiesenen Pilzart Fusarium spp. stieg bei der Lagerung um 11,6 % an, die Pilzart Cladosporium spp. um 8,3 % (Tab.86).

Tab. 86: Endophytische Pilzbesiedlung (%) in den Spargelstangensegmenten S1 und S2 zu Beginn der Erntesaison 2003 von geschälten, nicht gelagerten und drei Tage bei 20°C in Folie BAW 3 gelagerten Spargelstangen (n = 30)

Am Ende der Erntesaison 2003 konnten in den Gewebeproben der nicht gelagerten, nicht geschälten Spargelstangen die Pilzarten Fusarium spp., Cladosporium spp., Penicillium spp., Crysosporium spp., Idriella spp., Eurotium spp., Mucor spp., Zygorhynchus spp., Rhizopus spp. und Aspergillus spp. nachgewiesen werden (Tab 94). Der prozentuale Anteil von Fusarium spp., Cladosporium spp. und Penicillium spp. war im Stangensegment S1 höher, als in S2. Idriella spp. und Zygorhynchus spp. ließen sich nur im Segment S2 nachweisen, der Anteil von Rhizopus spp. war in beiden Segmenten gleich.

In Gewebeproben von nicht geschältem bei 20°C in Folie BAW 3 drei Tage gelagerten Spargelstangen konnte Fusarium spp., Cladosporium spp., Penicillium spp., Crysosporium spp., Idriella spp. und Eurotium spp. nachgewiesen werden (Tab.87).

Im Segment S1 überwog die Pilzart Cladosporium spp.,

in S2 wurden vermehrt Fusarium spp., Penicillium spp., Idriella spp. und Eurotium spp. nachgewiesen. Qualitativ und quantitativ nahm die endophytische Pilzbesiedlung während der Lagerung ab (Tab. 87).

Tab. 87: Endophytische Pilzbesiedlung (%) von nicht geschälten, nicht gelagerten und drei Tage bei 20°C nicht geschält in Folie BAW 3 gelagerten Spargelstangen am Ende der Stechsaison 2003 (n = 30)

In den Gewebeproben der nicht gelagerten, längs halbierten Spargelstangen (z. B. Probe Nr. 1a, Tab. 94) wurden die Pilzarten Fusarium oxysporum und Fusarium proliferatum nachgewiesen.

In Gewebeproben von drei Tage (20°C Lagertemperatur / Folie BAW 3) gelagerten Hälften derselben gelagerten Spargelstangen (z. B. Probe Nr. 1b, Tab. 94) wurden Fusarium oxysporum, F. proliferatum und Penicillium spp. festgestellt. Neun von zehn untersuchten Proben enthielten Fumonisin B₁ im Messbereich von 0,58 – 1,67 mg / kg (Tab. 88).

In den gelagerten Spargelstangenhälften hatte sich der Gehalt von Fumonisin B₁ gering erhöht.

Tab. 88: Fumonisin B₁ in Gewebeproben von nicht gelagerten und gelagerten Spargelstangen (Folie BAW 3, 20°C Lagertemperatur) am Ende der Stechsaison 2003 (z.B. Probe 1a und 1b siehe Kapitel D 2.3)