1. EINLEITUNG

1.1.  Einleitung und Aufgabenstellung

Politische Grundsatzentscheidungen zum Schutz der Artenvielfalt

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Pyrus pyraster (L.) BURGSD., die Wildbirne, und Sorbus torminalis (L.) CRANTZ, die Elsbeere, zählen zu den bedrohten Waldbaumarten. Sie gehören zu den in Deutschland heimischen Wildobst-Baumarten, die Teil des natürlichen Wald-Ökosystems sind. Ihre Erhaltung und Förderung leistet einen Beitrag zur Artenvielfalt in diesem Ökosystem.

Die bekannteste Konvention zum Schutz und zur Förderung der Artenvielfalt wurde 1992 auf der Konferenz der Vereinten Nationen in Rio de Janeiro, Brasilien, verfasst (ANONYM, 1993). Auch auf gesamt-europäischer und EU-Ebene stand seither auf mehreren Ministerkonferenzen, so u.a. in Straßburg (1990), Helsinki (1993), Lissabon (1998) und Wien (2003), die Erhaltung der Biodiversität im Mittelpunkt. Das Abkommen von Helsinki mit den Richtlinien für die Konservierung der biologischen Diversität in den Wäldern Europas wurde von 37 Staaten, das Abkommen von Wien von 40 Staaten unterzeichnet.

In Deutschland waren Konzepte zur Erhaltung von Waldgenressourcen bereits vorher entwickelt worden, ausgelöst durch die seit ca. 1980 offen zutage getretenen immissionsbedingten Waldschäden. Auf Grund eines Bundesratsbeschlusses von 1985 wurde die Bund-Länder-Arbeitsgruppe „Erhaltung forstlicher Genressourcen“ gegründet, die das von ihr entwickelte, seit 1989 bestehende Programm für die Erhaltung forstlicher Genressourcen koordiniert (BUND-LÄNDER-ARBEITSGRUPPE, 1989). Das Programm wurde durch das Strategie-Papier des Bundesministeriums für Ernährung, Landwirtschaft und Forsten im Januar 2000 (BMELF, 2000) bestätigt. Eine Konzept-Neufassung erfolgte ebenfalls in 2000.

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Die Konzepte zur Erhaltung forstlicher Genressourcen fordern eine nachhaltige Forstwirtschaft. Dazu gehört die Förderung von Mischwaldbeständen mit einem hohen Anteil an Laubbäumen. Im Rahmen der naturnahen Waldbewirtschaftung sind auch seltene Baumarten einschließlich der Wildobst-Arten zu berücksichtigen. Durch diese Änderungen in der Forstpolitik und die gleichzeitig stark gestiegenen Preise für das Holz der Wildobstbäume ist das Interesse an ihnen und die Nachfrage nach Pflanzgut gestiegen.

Vorkommen und Verbreitung, Gründe für die Gefährdung

Zu den nativen Wildobst-Baumarten in Deutschland zählen die Vertreter in den Gattungen Malus, Prunus, Pyrus und Sorbus, wie z.B. Malus sylvestris, Prunus avium, Pyrus pyraster, Sorbus aucuparia, S. aria, S. torminalis und S. domestica. Ebenfalls zu Wildobst gezählt werden auch die eingeführten Gattungen Castanea und Juglans. Mit Ausnahme von Sorbus aucuparia, die als Pionier-Baumart gilt, kommen alle genannten Arten auf nährstoffreichen und basenreichen Böden mit guter Wasserversorgung im warmen, gemäßigten Klima vor. Ihr physiologischer Optimalbereich, in dem sie bei forstlicher Pflege höchste Wuchsleistungen erzielen würden, wird jedoch von Buchen besetzt. Auf Grund der natürlichen Konkurrenz sind sie auf trockene oder wiederholt überschwemmte Standorte ausgewichen, auch als Marginalstandorte bezeichnet.

Menschliche Aktivitäten, wie z. B. die Rodung von ca. zwei Drittel der Waldfläche Europas, intensive Nutzung der verbliebenen Wälder und die überproportionale Förderung der ökonomisch wichtigsten Arten seit dem Mittelalter, führten zu einer Umwandlung der Laubmischwälder in Nadelwälder und trugen zur Verringerung der Populationsgrößen von Wildobstarten bei. Da sie auf dem Holzmarkt keine bedeutende Rolle spielten, blieb dieser Verdrängungsprozess lange unbemerkt. Die natürlichen Vorkommen sind heute auf kleine Gruppen von nur wenigen Individuen oder einzeln stehende Bäume beschränkt (Tabellen 1 und 2). Die Wildbirne gehört zu den sehr seltenen Arten in Norddeutschland. Sie wird in den Roten Listen der Farn- und Blütenpflanzen Niedersachsens, Bremens und Schleswig-Holsteins als gefährdet eingestuft (KLEINSCHMIT, 1998). Eine weitere Bedrohung der Wildformen von Malus und Pyrus liegt darin, dass sie leicht mit Kultursorten hybridisieren. Die Unterscheidung zwischen rezenten Wildformen, Hybriden und ausgewilderten Kulturformen stellt ein Problem dar (WAGNER, 1998). Möglichkeiten der Charakterisierung und Identifizierung von Wildformen finden sich bei WAGNER (1995) und BÜTTNER (1998).

Verwendung, ökonomische und ökologische Bedeutung

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Das Holz der Wildobstbäume ist von hoher Qualität und Attraktivität. So wird z.B. Wildbirnen-Holz für Möbelfurniere und Musikinstrumente, speziell Flöten, verwendet. Es lässt sich vorzüglich drechseln, schnitzen, polieren, lackieren, nageln und schrauben (KLEINSCHMIT, 1998).

Elsbeeren-Holz ist hart, fest und elastisch und wird ebenfalls für Furniere im Möbelbau und für Musikinstrumente, sowie Maschinenteile, Schrauben, Kämme, Pressen und ähnliches verwendet (NAMVAR und SPETHMANN, 1985). Diese Hölzer werden seit einigen Jahren verstärkt nachgefragt und erzielen zunehmend höhere Preise. 1970 wurde Birnbaumholz noch mit weniger als 100 DM/Fm (Deutsche Mark pro Festmeter) gehandelt. Heute liegen die Preise bei dem Vierfachen und darüber – Spitzenstämme erzielen über 7000 DM/Fm (KAUSCH, 1998). Die Durchschnittserlöse im Staatswald des Landes Baden-Württemberg betrugen in den Jahren 1961 bis 1970 für die Güte- und Stärkeklasse A/4 aller Sorbus-Arten 150,- DM (Buche: 100,- DM). Bei den Submissionen in Erfurt, Northeim, Fritzlar, Alsfeld und Schrozberg im Winter 1997/1998 lagen die Durchschnittspreise für Elsbeeren zwischen 2788,- DM und 4739,- DM (Buche: 433,- DM). Dabei wurden für Spitzenstämme mehrmals mehr als 20.000 DM bezahlt (KAUSCH, 1998). Im Jahr 2000 wurden auf der Submission in Northeim Spitzenpreise zwischen 14.400 und 16.200 DM für Elsbeeren erzielt und damit gezeigt, dass das hohe Preisniveau stabil blieb (MERTEN, 2000).

Abgesehen von ihrem ökonomischen Wert stellen Wildobstbäume ein Habitat für Insekten und Vögel dar. Sie bieten diesen und einigen Säugetieren, wie z.B. Siebenschläfer, Marder, Dachs und Igel, auch Nahrung (ROLOFF, 1998). Sie bereichern durch Form und Aussehen die Landschaft und die Waldränder und sind züchterische Ressourcen für Eigenschaften wie z.B. Resistenzen gegen Krankheiten. Obwohl sie bisher kaum genetisch untersucht wurden, ist auf Grund ihres weiten natürlichen Verbreitungsgebiets mit den unterschiedlichsten ökologischen Bedingungen, sowie ihrer hohen phänotypischen Variabilität zu vermuten, dass auch ihre genetische Variabilität sehr breit ist.

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Konservierungsmaßnahmen und Versorgung mit Pflanzgut

Einen Überblick über die Ziele und Aktivitäten im Rahmen des Programms für die Erhaltung forstlicher Genressourcen geben BEHM et al. (1997). Für Pyrus pyraster und Sorbus torminalis werden folgende Ziele verfolgt: 1) Konservierung in situ, wo immer es möglich ist, durch Ausweisung von Generhaltungsbeständen und einer auf das Erhaltungsziel ausgerichteten Bewirtschaftung. 2) Erhaltung ex situ durch Evakuierung und Wiederherstellung von effektiven Reproduktionspopulationen mit einer großen Anzahl unterschiedlicher Genotypen, und 3) Förderung durch Produktion und Nutzung.

Tab. 1 Art und Umfang von in situ- und ex situ-Beständen von Pyrus pyraster in Deutschland bis Ende 1997 (ANONYM, 1998)

in situ-Bestände oder Einzelbäume:

6 Bestände auf 2,8 ha, 967 Bäume

ex situ-Bestände oder Einzelbäume:

1 Bestand auf 0,1 ha, 400 Bäume

Samenplantagen:

16 Plantagen auf 12,9 ha mit 400 Klonen aus 40 Familien

Klonarchive:

2 Archive mit 57 Klonen

Herkunftsversuche:

1 Versuch auf 0,1 ha

Nachkommenschaftsprüfungen:

41 Prüfungen auf 7,0 ha

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Tab. 2 Art und Umfang von in situ- und ex situ-Beständen von Sorbus torminalis in Deutschland bis Ende 1997 (ANONYM, 1998)

in situ-Bestände oder Einzelbäume:

15 Bestände auf 3,5 ha, 1661 Bäume

ex situ-Bestände oder Einzelbäume:

13 Bestände auf 6,2 ha, 4707 Bäume

Samenplantagen:

8 Plantagen auf 9,6 ha mit 282 Klonen aus 100

Familien

Klonarchive:

2 Archive mit 41 Klonen

Herkunftsversuche:

1 Versuch auf 3,6 ha

Nachkommenschaftsprüfungen:

1 Prüfung auf 0,2 ha.

In Deutschland fallen Wildobstbaumarten und damit auch Pyrus pyraster und Sorbus torminalis nicht unter das Gesetz über forstliches Saat- und Pflanzgut (AID, 1990) (Ausnahme: Prunus). Daher kam und kommt immer wieder Material von unbekannter oder fraglicher Herkunft in den Handel, was unter ökologischen Aspekten unerwünscht ist. Um stattdessen die Verwendung von Pflanzgut hoher Qualität zu fördern, muss es in ausreichenden Mengen bereitgestellt werden, wofür das Vorhandensein geeigneter Produktionsstätten Voraussetzung ist.

Bei Wildobst können die in situ konservierten Bestände nicht als reproduktive Populationen gelten, da es sich um isoliert stehende Bäume oder sehr kleine Gruppen handelt, bei denen die Gefahr von Inzucht und Hybridisierung mit Kultursorten besteht (SOPPA, 1998). Daher kommt den ex situ angelegten Erhaltungssamenplantagen große Bedeutung im Hinblick auf die Verfügbarmachung von Wildtyp-Saatgut zu: Sie führen das genetische Material aus den zerstreut liegenden Reliktvorkommen zusammen, sind aus identifiziertem Basismaterial aufgebaut und so angelegt, dass der Polleneintrag durch Kultursorten eingeschränkt ist (SOPPA, 1998). Für die langfristige Erhaltung der Wildformen und ihrer genetischen Variabilität und Anpassungsfähigkeit ist die generative Vermehrung unerlässlich.

Aufgabenstellung und Zielsetzung der vorgelegten Arbeit

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Die gesellschaftliche Forderung nach Erhaltung und Schutz der Artenvielfalt hat zu politischem Handeln geführt. Naturwissenschaftliche Untersuchungen und auf deren Ergebnissen basierende Maßnahmen wurden ermöglicht.

Genbanken gehören zu den wichtigsten Institutionen, die Artenvielfalt erhalten oder wieder herstellen. Moderne biotechnologische Methoden, wie in vitro Kultur und Kryokonservierung werden bisher wenig genutzt. Kryokonservierung ist das Einfrieren in flüssigem Stickstoff (bei –196°C). Sie ist vor allem unter wirtschaftlichen Gesichtspunkten eine hervorragende Möglichkeit, das Überleben vieler Genotypen zu ermöglichen. Kryokonservierung ist technisch einfach, kostengünstig und zuverlässig (SCHÄFER-MENUHR et al., 1996).

In Deutschland ist die Kryokonservierung von vegetativ zu erhaltenden Pflanzen eine bislang nur wenig genutzte Form der Langzeit-Erhaltung. In der Forschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) in Braunschweig existiert eine Kryo-Genbank für Kartoffeln, die seit 2003 der größten deutschen Genbank, dem Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) in Gatersleben unterstellt ist. Am IPK werden grundlegende Untersuchungen zur Kryolagerung durchgeführt. Die Arbeiten konzentrieren sich auf Allium, vor allem Allium sativum, den Knoblauch (SENULA und KELLER, 2000; KELLER, 2002).

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Wie in Kap. 1.2.2. beschrieben, gibt es weltweit nur eine Genbank, die Pyrus mittels in vitro Kultur konserviert. In Corvallis, USA, wird in Verbindung mit in vitro Kultur auch die Methode der Kryokonservierung zur Erhaltung vegetativer Muster genutzt. Für Sorbus existiert weder eine in vitro- noch eine Kryo-Genbank.

Das dritte Ziel in dem „Programm zur Erhaltung forstlicher Genressourcen“ für Pyrus pyraster und Sorbus torminalis ist die Förderung durch Produktion und Nutzung. Produktion und Nutzung von Holz kann z.B. durch plantagennmäßigen Anbau von Elite-Mehrklongemischen. Zur Herstellung von Elite-Mehrklongemischen werden Plusbäume selektiert und vegetativ vermehrt, so dass ihre genotypischen Eigenschaften erhalten bleiben.

Die Selektion kann nur am adulten Baum vorgenommen werden. Die vegetative Vermehrung adulter Bäume ist jedoch schwierig (MEIER-DINKEL, 1993). Eine Lösung des Problems wäre, von den in Betracht kommenden Bäumen Material im juvenilen Zustand zu entnehmen und so lange aufzubewahren, bis die Selektion vorgenommen werden kann, um sie dann vegetativ zu vermehren. Die Aufbewahrungszeit müsste mehrere Jahre betragen, z.B. 12 oder mehr. Die Erhaltung des juvenilen Materials wäre nur dann durchführbar, wenn sie technisch einfach, kostengünstig und zuverlässig ist.

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Die Kryokonservierung ist eine Form der Erhaltung, die den genannten Anforderungen genügt und außer für Genbanken auch für züchterische Zwecke geeignet ist. Nach der Kryokonservierung erfolgt die Vermehrung des Materials mit in vitro Methoden, also vegetativ, und entspricht auch damit der oben genannten Zielsetzung.

Folgende Themenbereiche sollten untersucht werden:

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Als Ausgangsmaterial für die Kryokonservierung dienten Winterknospen und in vitro Sprosskulturen. Die erfolgreiche Kryokonservierung von Sorbus torminalis wird erstmalig beschrieben.

Es wurde der Frage nachgegangen, inwieweit die Dormanz der Winterknospen einerseits die Kryokonservierbarkeit begünstigt, andererseits die in vitro Kultivierbarkeit beeinträchtigt. Zu diesem Zweck wurden unterschiedliche Erntezeitpunkte der Reiser sowie der Einfluss der Lagerung der Reiser geprüft.

Als Kriterium für erfolgreiches Einfrieren wurden Vitalitätstests auf ihre Aussagefähigkeit geprüft.

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Voraussetzung für die Kryokonservierung ist ein zuverlässiges in vitro Kultur-Protokoll. Vorhandene in vitro Methoden wurden mit bereits vorhandenen Sprosskulturen optimiert und standardisiert. Dies ermöglichte den Vergleich der in vitro Kulturen ohne und nach Kryokonservierung (sine und post Kryo). Die Methode des Einfrierens von Winterknospen erwies sich bei beiden Baumarten als so vielversprechend, dass sie auf eine dritte Baumart, die Vogelkirsche (Prunus avium), modellhaft angewendet wurde. Prunus avium war darüber hinaus nicht Gegenstand der Untersuchungen.

Die Arbeiten wurden an der Niedersächsischen Forstlichen Versuchsanstalt, Abteilung C Waldgenressourcen (NFV-C) in Staufenberg-Escherode, Landkreis Göttingen, durchgeführt. Nur das dort vorhandene Pflanzenmaterial und die dort vorhandenen technischen Einrichtungen wurden verwendet.

Das Ziel dieser Arbeit ist, die Generhaltung, Produktion und Nutzung von Pyrus pyraster und Sorbus torminalis in der Niedersächsischen Forstlichen Versuchsanstalt in Escherode um die bisher nicht angewandte Methode der Kryokonservierung zu erweitern. Sie könnte andere Institutionen in Deutschland und anderen Ländern ermutigen, Kryo-Genbanken für bedrohte heimische Baumarten aufzubauen und so für die Zukunft die Artenvielfalt der Wälder zu sichern.

1.2. Stand der Wissenschaft

1.2.1.  In vitro Kultur

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Pyrus pyraster und Sorbus torminalis gehören zu den Baumarten, denen sich in vitro Kultivateure, sei es in Forschungs- oder kommerziellen Labors, erst relativ spät zuwandten. Noch in dem 1987 erschienen Referenz-Handbuch zur Vermehrung holziger Pflanzen (DIRR und HEUSER, 1987) ist für die 18 erwähnten Arten der Gattung Sorbus diese Vermehrungsmethode nicht genannt. Von den 11 genannten Pyrus-Arten wird nur für P. calleryana, P. communis und P. pyrifolia die Möglichkeit der Gewebekultur aufgeführt.

Pyrus pyraster

Die ersten erfolgreichen in vitro Spross-Vermehrungen von Pyrus-Arten wurden 1979 veröffentlicht (CHENG, 1979; LANE, 1979). Eine ausführliche Beschreibung der Untersuchungen der darauffolgenden fünf Jahre findet sich bei SINGHA (1986), der außer den Sprosskulturen auch die Embryo-, Antheren-, Kallus-, Blüten- und Fruchtgewebekultur abhandelt. CHEVREAU et al. (1992) haben dies für die Zeit bis 1992 fortgesetzt. Diese und die Mehrzahl der seither erschienenen Arbeiten wurde jedoch mit Kultursorten, bzw. Unterlagen oder anderen Pyrus-Wildarten durchgeführt.

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Vier neuere Arbeiten befassen sich mit der hier relevanten Art Pyrus pyraster. An zwei als Pyrus communis pyraster bezeichneten Pflanzen wurden von LIBERALI und DAMIANO (1997) folgende Untersuchungen durchgeführt: Auswirkung des Zeitpunktes der Explantatentnahme, der Salz-Zusammensetzung des Nährmediums in der Vermehrungsphase und der Auxin-Komposition, sowie der Phloroglucinol-Zugabe im Bewurzelungsmedium. Die gleichen Autoren in einer erweiterteten Arbeitsgruppe (DAMIANO et al., 2000) prüften auch die Möglichkeit der Regeneration von Adventivsprossen aus Blattscheiben. In der anschließenden Vermehrungsphase wandten sie ein temporäres Immersions-System (TIS) an, das auf dem Wechsel von kompletter Überschichtung der proliferierenden Sprosskulturen mit Flüssigmedium gefolgt von einer Trockenperiode beruht. Ziel dieser Arbeiten war allerdings weniger die Optimierung der Vermehrung als vielmehr die Entwicklung eines Systems, das für Transformationsexperimente mit anschließender schneller Vermehrung geeignet sein sollte. Die Vermehrungsraten und die Bewurzelung wurden durch das TIS im Vergleich zum festen Medium bei diesen zwei untersuchten Klonen verbessert. Allerdings wurden zur Bewurzelung keine Zahlen angegeben. Die Überführung und Abhärtung ex vitro wurde nicht erwähnt.

GEBHARDT et al. (1996) untersuchten 16 unterschiedliche Medien auf ihre Eignung für die Etablierung und die Vermehrung. Sie verwendeten sowohl verschiedene Salz-Zusammensetzungen als auch Phytohormon-Kombinationen und -Konzentrationen. Von deren Einfluss auf Bewurzelung und Abhärtung nach dem Pikieren wurde berichtet.

In Fortsetzung dieser Arbeiten nannten GEBHARDT und MEIER-DINKEL (1998) Sprossvermehrungskoeffizienten zwischen 2,2 und 3,4 pro Monat auf cytokinin- und gibberellinsäurehaltigen Medien. Die Bewurzelung in einem Torf-Sandgemisch unter Hochdrucknebel lag klonabhängig bei mehr als 60 %.

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Sorbus torminalis

Über die in vitro Vermehrung von Sorbus-Arten liegen nur wenige Veröffentlichungen vor. In dem sehr umfangreichen Werk von BAJAJ (1986 - 2001) und TOWILL and BAJAJ (2002) über Biotechnologie in Landwirtschaft und Forstwirtschaft wird die Gattung Sorbus nicht erwähnt.

Es existieren jedoch Veröffentlichungen über S. domestica, S. aucuparia und S. rotundifolia, sowie eine über Sorbus torminalis. CHALUPA (1983, 1987) vermehrte Sorbus torminalis und Sorbus aucuparia auf Medien mit niedrigem BAP-Gehalt (0,6 bis 1,0 mg/l), wobei die Zugabe von IBA (0,05 bis 0,1 mg/l) förderlich war. Bei den angegebenen Vermehrungskoeffizienten von 3 bis 15 pro Subkultur bleibt unklar, ob diese für beide Baumarten gelten. An anderer Stelle erwähnt er ohne nähere Erläuterung, dass Sorbus aucuparia eine höhere Vermehrung aufwies als Sorbus torminalis. Für die Bewurzelung wurden GD- und WPM-Medien in halber Stärke mit Zusatz von 0,3 mg/l IBA und 0,3 mg/l NAA eingesetzt, die bei den meisten Sprossen zur Bewurzelung führten.

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JAMBOR-BENCZUR et al. (1996) haben den Einfluss verschiedener Phytohormone und Kohlenhydratquellen auf die Vermehrung einer Pflanze von Sorbus rotundifolia untersucht. Als beste Kombination erwiesen sich 0,75 mg/l BAP, 0,1 mg/l IBA, 0,1 mg/l GA3 bei 15 bis 20 g/l Saccharose oder Glucose im Medium. Die Autoren betonen, dass die üblicherweise verwendete Zucker-Konzentration von 30 g/l die Sprossbildung erheblich beeinträchtigt hat.

Eine Vermehrung über den Weg der axillären Sprossbildung bei Sorbus domestica gelang ARILLAGA et al. (1991), die sowohl Explantate aus Sämlingen als auch aus adulten Bäumen verwendeten. Später ergänzten sie ihre Arbeit mit den Untersuchungen zur Sprossregeneration aus Hypokotyl-Explantaten. Die Organogenese nach einer Kallusphase wurde hauptsächlich durch die Auxin-Art beeinflusst, wobei NAA Wurzelbildung auslöste und IAA in Gegenwart von BA die Adventivsprossbildung förderte. Die Effekte wurden durch ein Nitrat : Ammonium – Verhältnis von 2:1 bis 4:1 verstärkt. In der besten Variante wurde bei 44% der Explantate Sprossbildung induziert (ARILLAGA and SEGURA, 1992).

Untersuchungen über die Möglichkeiten, die Bewurzelung und Abhärtung von Sorbus domestica zu beeinflussen, wurden von FRANCK et al. (1998) durchgeführt. Sie prüften verschiedene Auxine, sowie eine zweistufige Bewurzelungsphase. Diese bestand aus einer Woche Kultur auf IBA-haltigem Medium mit 3 mg IBA/l, der eine dreiwöchige Kultur auf hormonfreiem Medium, bzw. in einer Mischung von Vermiculit und Gelrite, folgte. Die Ergebnisse wurden nicht aufgeführt.

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Sämlinge von Sorbus domestica waren das Ausgangsmaterial in den Untersuchungen von MEIER-DINKEL (1998). Die Etablierung wurde, die Verwendung des „richtigen“ Mediums vorausgesetzt, als unproblematisch eingestuft. Die Vermehrungskoeffizienten über mehrere Subkulturen lagen gemittelt für sieben Klone je nach Medium zwischen 2,3 und 4,4. Die Bewurzelung war stärker vom Genotyp abhängig (von 22% bis 68%) als von den verwendeten Medien (von 39% bis 43%).

Damit ist der Kenntnisstand über die in vitro Vermehrung von Sorbus-Arten gering. Es war für das Zustandekommen dieser Arbeit sehr hilfreich, dass im Labor der Niedersächsischen Forstlichen Versuchsanstalt, wo die praktischen Arbeiten durchgeführt wurden, bereits etablierte in vitro Kulturen von Sorbus torminalis und somit auch erste Erfahrungen vorhanden waren.

1.2.2.  Kryokonservierung

Bemerkungen zur Entwicklung der Kryokonservierung

Unter Kryokonservierung wird generell die Aufbewahrung von lebendem Material bei ultratiefen Temperaturen verstanden. Dies geschieht i. d. R. in Flüssigstickstoff (englisch liquid nitrogen = LN) bei –196°C oder in dessen Dampfphase bei ca. –150°C. Im Rahmen dieser Arbeit wird „lebendes Material“ eingeengt auf Pflanzenteile, die zur vegetativen Vermehrung in vitro geeignet sind und durch Kryokonservierung die Fähigkeit zu Wachstum und Vermehrung nicht verloren haben.

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Die Kryokonservierung nutzt die Ergebnisse der Forschungen zur Kryobiologie für praktische Zwecke, stellt also eine Anwendungsform dar. Der Zweig der Kryobiologie, der sich mit Pflanzen beschäftigt, erwuchs aus den Fragen nach der Natur der Frosthärte, Frosttoleranz und Frostschäden an Pflanzen. LEVITT (1956) hat in seinem Buch „The Hardiness of Plants“ die Geschichte dieses Wissenschaftszweiges sehr ausführlich geschildert. Das bereits vorhandene Wissen sollte ebenso wie bereits durchlaufene Irrwege nicht in Vergessenheit geraten. Die folgende kurze Darstellung der Meilensteine in der Geschichte der pflanzlichen Kryobiologie sind diesem Buch entnommen.

Die ersten belegten Gefrierversuche wurden bereits 1741 von DUHAMEL durchgeführt, gefolgt 1775 von HUNTER. GÖPPERT (1830) gehörte zu den ersten, die erkannten, dass ein niedriger Wassergehalt zu den Voraussetzungen für das Überleben von gefrorenen Pflanzenteilen gehört. MÜLLER-THURGAU (1880) untersuchte diverse Pflanzenteile verschiedenster Arten und fand bei Kartoffeln heraus, dass nach Unterkühlung* deutlich niedrigere Temperaturen überlebt werden als beim Gefrieren. WIEGAND (1906) beschrieb das Phänomen der Unterkühlung in der Natur an Knospen von acht Baumarten. Dass die Gefriertoleranz eines Organismus von außen beeinflusst werden kann, wies BARTETZKO (1909) durch die Anwendung verschiedener Konzentrationen von Dextrose beim Einfrieren von Aspergillus niger nach. ÅKERMAN (1927) betonte, dass externer Gefrierschutz nur dann wirksam ist, wenn er a) nicht toxisch und b) in der Lage ist, in das Zellinnere hineinzugelangen. Er spricht in dem Zusammenhang von „plasmolysieren“. Eine weitere entscheidende Erkenntnis war, dass die Geschwindigkeit von Einfrieren und Auftauen die Eiskristallbildung im Gewebe und damit das Auftreten von Gefrierschäden maßgeblich beeinflussen. WINKLER (1913) und HILDRETH (1926) wiesen dies an Apfelreisern nach, SCHWARTZE (1937) an Himbeeren. Das Absterben des Gewebes erfolgt im Verlauf schnellen Gefrierens bevor der Gefrierpunkt erreicht ist. Schnelles Auftauen kann die Gefrierschäden beträchtlich erhöhen, wie HILDRETH (1926) zeigte.

*Definition „Unterkühlung“ (BROCKHAUS, 1996): Abkühlung eines Stoffs unter die Temperatur eines für ihn charakteristischen Umwandlungspunkts, ohne dass eine Änderung des Aggregatzustands oder der vorliegenden Modifikation erfolgt. Ein unterkühlter Stoff befindet sich in einem instabilen Zustand im Gebiet einer anderen Phase. Viele Flüssigkeiten ... lassen sich, wenn sie sehr rein sind und nicht erschüttert werden, durch langsames Abkühlen bis tief unter dem Schmelzpunkt flüssig halten (z.B. Wasser bis unterhalb – 70°C). Plötzliches Erschüttern oder Einbringen von Kristallisationskeimen führt schlagartig zum Erstarren, wobei die dabei freigesetzte Schmelzwärme das Gemisch bis zur Schmelztemperatur erwärmt.

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Ein anderer Forschungskomplex widmete sich den Temperaturen in der Pflanze im Verlauf des Gefrierens. Die Verschiedenheit der Gefrierkurven bei den verschiedenen Pflanzen, das Auftreten der Exotherme und teilweise der doppelten Gefrierpunkte ebenso wie die Unterschiede zwischen lebendem und totem Gewebe waren nicht einfach zu erklären und führten zu verschiedenen Hypothesen. Die heute anerkannte Erklärung der Vorgänge beruht zu einem wesentlichen Teil auf den Studien von LUYET und GALOS (1940). Danach sinkt beim Gefrieren die Temperatur im Pflanzengewebe zunächst relativ schnell und kontinuierlich bis zum variablen niedrigsten Unterkühlungspunkt, welcher unter dem Gefrierpunkt der Pflanze liegt. Diesem folgt ein Temperaturanstieg, die sogenannte Exotherme, auf das erste variable Maximum, das dem Gefrierpunkt des Gewebes entspricht und den Beginn der Eisbildung anzeigt. Bei sehr niedriger Kühlrate bleibt die Temperatur auf einem Plateau und sinkt danach langsam kontinuierlich ab. Ein zweiter Gefrierpunkt tritt bei stark dehydriertem Gewebe nicht mehr auf.

Das intra- und extrazelluläre Wachstum der Eiskristalle wurde bereits in der ersten Hälfte des 19. Jahrhunderts detailliert unter dem Mikroskop studiert und in Zeichnungen dokumentiert (GÖPPERT, 1830). Dabei wurde intrazelluläre Eisbildung in der Natur so gut wie gar nicht beobachtet, sondern nur bei künstlich erzeugtem sehr schnellen Gefrieren, z.B. durch starkes Unterkühlen und anschließendes Auslösen von oder Warten auf Eisbildung. Hier beobachtete MORREN (1838) intrazelluläres Eis bei Apfel. Extrazelluläres Eis verursacht nicht notwendigerweise Schäden, wie SIMINOVITCH und SCARTH (1938) berichteten. Aber intrazelluläres Eis führt so gut wie immer zum Zelltod, wie in verschiedenen Studien zwischen 1838 und 1938 regelmäßig beobachtet wurde, es sei denn, dass unter künstlichen Bedingungen die Gefrierrate so hoch ist, dass sich nur extrem kleine, unter dem Lichtmikroskop nicht erkennbare Eiskristalle bilden.

Diese kurze Zusammenfassung der Erkenntnisse über die physikalisch-chemischen Faktoren, die beim Gefrieren das Überleben der Pflanzen beeinflussen, zeigt bereits die wichtigsten Punkte auf, die für die Kryokonservierung bekannt sein müssen. Denn hier müssen die Bedingungen so gestaltet werden, dass Tiefsttemperatur-Toleranz erzielt wird. Zu den Grundlagen der Kryokonservierung gehören daher die Faktoren:

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Alle Faktoren müssen so kombiniert werden, dass keine schädigende intra- und extrazelluläre Eiskristallbildung auftritt.

Um zu diesem Ziel zu gelangen, sind bisher für die Kryokonservierung von vegetativ vermehrbarem Pflanzenmaterial, wie es am Anfang dieses Kapitels definiert wurde, folgende Methoden entwickelt worden:

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Die aufgeführten Methoden sind sehr ausführlich in folgenden Schriften beschrieben: KARTHA, 1985; BENSON, 1994; REED and CHANG, 1997; ENGELMANN, 1998.

Kryokonservierung von Pyrus

Zur Kryokonservierung verschiedener Pyrus-Arten liegen 16 Veröffentlichungen vor, beginnend 1978. Sie kommen aus Japan, Frankreich und den USA, wo es große Sammlungen von Pyrus-Arten in Genbanken gibt. Andere Länder mit nennenswerten Sammlungen sind z.B. Belgien (820 Sorten in Gembloux), Dänemark (190 Sorten in Taastrup), Italien (365 Sorten in Florenz, 201 Sorten in Forli, 300 Sorten in Rom) und Großbritannien (484 Sorten in Brogdale). 1989 wurden in einer weltweiten Erhebung des International Board of Plant Genetic Resources (IBPGR) Pyrus-Sammlungen in 32 Ländern an 67 Orten festgestellt (BETTENCOURT and KONOPKA, 1989). Die größte Sammlung von Pyrus-Wildarten befindet sich in dem Land, in dem Pyrus natürlicherweise nicht vorkommt: bei der National Germplasm Collection der USA in Corvallis, Oregon. Bei der IBPGR - Umfrage war Corvallis die einzige Genbank, die angab, Pyrus in Form von in vitro Kulturen zu konservieren. Die bis heute einzige Kryo-Genbank für Pyrus befindet sich ebenfalls in Corvallis und beinhaltet über 100 Akzessionen (REED, 2001).

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Die erste Veröffentlichung über eine erfolgreiche Kryokonservierung von Pyrus erfolgte 1978 von SAKAI und NISHIYAMA und basierte auf langjährigen Forschungen SAKAIs zur Tieftemperatur-Toleranz frostharter Baumarten (SAKAI, 1960). Sie hatten die ruhenden Knospen von Winterreisern auf –40°C vorgefroren und dann direkt in Flüssigstickstoff getaucht. Die mikroskopische Evaluierung ergab bei allen vier geprüften Sorten starke Schäden des Xylems und mittlere oder keine Schäden der Cortex. Die Sprosse überlebten je nach Sorte zu 0% bis 100% der 9 bis 15 Stück je Variante, wobei nicht angegeben wurde, in welcher Form die Prüfung auf Überleben stattfand. Die in demselben Artikel beschriebenen Untersuchungen an der Apfelsorte ‘McIntosh Red’ wurden mittels Pfropfung auf Sämlingsunterlagen geprüft. Da der Begriff „in vitro Kultur“ oder ähnliches in diesem Artikel nicht erwähnt wird, ist davon auszugehen, dass hier keine in vitro Methoden angewendet wurden.

Die einzige andere Untersuchung, in der über Versuche mit Pfropfungen berichtet wird, wobei es sich um Mikropfropfungen in vitro handelte, war die von SUZUKI et al. (1997). Hier wurde, wie bei SAKAI und NISHIYAMA (1978) ausgehend von ruhenden Winterknospen, eine gezielte Dehydrierung der Knospen auf 41% Wassergehalt vorgenommen und dann in 5°C-Schritten, ein Schritt pro Tag, bis –30°C vorgekühlt. Das Auftauen erfolgte langsam bei 0°C in Luft. Die Anwachsraten waren sortenabhängig und betrugen bei den 12 getesteten Birnensorten bis zu 100%. Auch OKA et al. (1991) haben das schrittweise Vorgefrieren von ruhenden Winterknospen untersucht und dabei die Geschwindigkeit des Vorgefrierens ebenso wie die des Auftauens studiert. Die angegebenen Überlebensraten waren am höchsten bei folgender Behandlung: Vorkühlen in Gefrierkammern bei 0, -5, -10, -20, -30°C für einen Tag bei jeder Temperaturstufe, Eintauchen in LN, langsames Auftauen in Luft bei 0°C. Als Überlebensraten gaben OKA et al. Werte zwischen 60% und 80% an. Anders als SAKAI und NISHIYAMA (1978) und SUZUKI et al. (1997) prüften sie auch die Fähigkeit zur Sprossregeneration in vitro. Im Gegensatz zu den hohen Überlebensraten waren die Sprossregenerationsraten gering: Sie lagen zwischen 3% und 8%. OKA et al. wiesen in diesem Zusammenhang auf die ebenfalls niedrige Sprossbildungsrate ihrer ungefrorenen Kontrollen hin (ohne Zahlenangabe) und betonten die Notwendigkeit, zunächst eine funktionierende in vitro Methode zu erarbeiten. Es waren vor allem diese Arbeiten von OKA et al. und SUZUKI et al. (1997), an die die hier vorgelegten eigenen Untersuchungen mit ruhenden Winterknospen anknüpften. Weitere Publikationen über die Nutzung des natürlichen Frostschutzes ruhender Winterknospen bei Pyrus pyraster für die Kryokonservierung und anschließende in vitro Kultur sind nicht bekannt.

In der Tabelle 3 werden die jeweils ersten Publikationen der unterschiedlichen Kryokonservierungsmethoden bei Pyrus aufgeführt. Daraus ist zu entnehmen, dass ruhende Knospen bereits 1985 von MORIGUCHI et al. verwendet wurden. Allerdings wurden vor dem Einfrieren die Apices präpariert und mit Gefrierschutzmitteln behandelt. Dies war ebenso der Fall bei MI und SANADA (1994).

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Die erste Anwendung der aus der Entwicklungsarbeit für synthetische Samen übernommenen Einkapselung von Apices in Alginatkugeln für die Kryokonservierung wurde von DEREUDDRE et al. (1990) an der Birnensorte ‘Beurre Hardy’ erprobt. Sie wurde variiert und weiterentwickelt (SCOTTEZ et al., 1991; NIINO and SAKAI, 1992; NIINO, 1993; DEREUDDRE et al., 1994). In allen Anwendungen wurden in vitro Sprosskulturen nach einer Abhärtungsphase eingekapselt und dann einer mehrstufigen Dehydrierung unterzogen. Diese bestand aus osmotischer Dehydrierung mit Saccharose, z.T. in mehreren Schritten, und anschließendem physikalischen Wasserentzug im Luftstrom oder über Silica-Gel. Danach wurden die Alginatkugeln sehr schnell gefroren durch direktes Eintauchen in LN und langsam aufgetaut in Luft bei Raumtemperatur. Die in vitro Sprossbildungsraten variierten je nach Birnensorte und Methode zwischen 40% und 80%.

Tab. 3: Erst-Autoren verschiedener Methoden der Kryokonservierung von Pyrus

Art / Sorte

Ausgangsmaterial

Vorbehandlung

Gefriermethode

Referenz

P. serotina cv. Kosui

Apices von ruhenden vegetativen Knospen

90 min. in DMSO, Glucose oder Sorbitol bei 0°C

Vorkühlen auf

–40° bis –70°C

Moriguchi et al., 1985

P. communis cv. Beurre Hardy

axilläre in vitro Apices nach 8 Wochen Abhärtung bei 0°C

Einkapselung in Alginat und Trocknung

direktes Eintauchen in LN

Dereuddre et al., 1990

P. serotina cv. Senryo

vegetative Knospen

schrittweises Vor-kühlen bis –40°C

Oka et al., 1991

8 Sorten von P. communis

axilläre in vitro Apices nach 3 Wochen Abhärtung bei 5°C

Vitrifizierung mit PVS2-Lösung

direktes Eintauchen in LN

Niino and Sakai, 1992

P. cordata

in vitro Apices nach 2 Wochen Abhärtung bei 3°C

3 Wochen auf ABA oder Saccharose, 2 Tage auf DMSO, 1 Std. in PGD (Erläuterung s. u.)

langsames Vorkühlen mit 0,1°C/min bis

–40°C

Reed, 1990; Chang and Reed, 2001

Die Einkapselungs-Dehydrierungsmethode wurde in der weltweit größten Pyrus-Genbank in Corvallis, Oregon, USA, nicht angewendet. Für die seit 1987 im Aufbau befindliche Kryo-Genbank übernahm REED die Methode des langsamen Einfrierens (Kühlraten zwischen 0,1 und 0,8°C/min bis –40°C) von Sprossspitzen von SUZUKI et al. (1987) und entwickelte sie weiter in Kombination mit vorausgegangener Abhärtung. Sie publizierte sie zeitgleich mit DEREUDDRE et al. im Jahr 1990. Beide inkubierten, wie es MORIGUCHI et al. (1985; siehe Tabelle 3) mit Apices von ruhenden Winterknospen getan hatten, das Material in - allerdings unterschiedlichen - Gefrierschutzlösungen und führten ein schnelles Auftauen im Wasserbad bei 40°C durch. Die Sprossbildungsraten lagen sorten- und methodenabhängig zwischen 0% und 95%.

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REED hat seither viel über den Einfluss der Vorkulturbedingungen auf die Kryo-Toleranz bei Birnen und anderen holzigen Gewächsen veröffentlicht (REED, 1993; REED and YU, 1995; REED and CHANG, 1997; REED et al., 1998; CHANG and REED, 1999; CHANG and REED, 2000; CHANG and REED, 2001). Entscheidende Punkte waren die Abstimmung der Abhärtungstemperaturen und Abhärtungsdauer auf die Pflanzenart, bzw. Sorte, der Einfluss von Abscisinsäure (ABA) während der Abhärtungsphase und die Kombination von Abhärtung, ABA und der osmotischen Konditionierung mit Saccharose. Das Vorgehen nach diesen Vorbehandlungen, die bis zu 16 Wochen dauern können, hat REED folgendermaßen standardisiert:

Zwei Tage Inkubation auf DMSO-haltigem Medium (5%), eine Stunde Inkubation in tropfenweise zugegebener PGD-Lösung (einer Mischung von je 10% (w/w) Polyethylenglycol (MW 8000), Glukose und Dimethylsulfoxid (DMSO) in Flüssigmedium) bei 0°C, langsames Kühlen mit 0,1°C/min bis -40°C in einem progammierbaren Gefriergerät, danach Eintauchen in LN. Auftauen im 45°C-Wasserbad für 1 Minute, danach im 23°C-Wasserbad für 2 Minuten. Spülen der Apices in Flüssigmedium, platzieren auf Vermehrungsmedium.

Bei allen Arbeiten setzt REED eine größere Anzahl Genotypen, häufig auch Arten, ein, so dass die Ergebnisse meistens auf einem breiten genetischen Spektrum beruhen. Insgesamt wurden über 100 Genotypen einem Screening unterzogen, von denen 61% Kryo-Toleranz aufwiesen. Die durchschnittlichen Sprossbildungsraten lagen über 40%.

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Auch die Vitrifizierung wurde erfolgreich für die Kryokonservierung von Pyrus genutzt (siehe Tabelle 3). NIINO und SAKAI (1992) hatten sie kombiniert mit vorausgegangener Abhärtung (3 Wochen bei 5°C) und Vorkultur mit 0,7 M Saccharose für 1 Tag bei 5°C. Die Regenerationsraten der 8 getesteten Birnensorten betrugen bis zu 80%. Diese Methode wurde ebenfalls von REED et al. (1998) eingesetzt. Mit 43% positiv reagierenden Genotypen war die Methode jedoch nicht so vielversprechend wie die oben beschriebene Methode des langsamen Einfrierens. Es liegen jedoch keine Veröffentlichungen über weitere Versuche zum Einfluss der Vorkultur oder andere Modifizierungen der Vitrifizierungsmethode im Zusammenhang mit Pyrus vor.

Kryokonservierung von Sorbus

Zur Kryokonservierung von Sorbus liegen keine Veröffentlichungen vor.


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08.11.2007