4.  DISKUSSION

↓154

In den vorgelegten Untersuchungen wurde die Kryokonservierung von Pyrus pyraster optimiert. Die Kryokonservierung von Sorbus torminalis wurde erstmalig erfolgreich durchgeführt und beschrieben. Die für die Kryokonservierung notwendige in vitro Kultur wurde für beide Baumarten optimiert. Der physiologische Zustand der Ausgangspflanzen erwies sich als wichtigerer Faktor als Kulturmaßnahmen im Labor. Die Anwendung verschiedener Methoden der Kryokonservierung bei der Verwendung von in vitro Material war erst nach erheblicher Versuchsarbeit erfolgreich. Die Verwendung von Winterknospen als Ausgangsmaterial war in technischer und organisatorischer Hinsicht von großem Vorteil und für Wildbirne und Elsbeere geeignet, jedoch nicht für Vogelkirsche. Weder negative noch positive Auswirkungen der Kryokonservierung auf Wachstum und Vermehrung der Pflanzen konnten festgestellt werden. Die Zusammenhänge zwischen in vitro Kultivierbarkeit und Dormanz einerseits, sowie Kryotoleranz und Dormanz andererseits werden diskutiert.

4.1.  In vitro Kultur

Bei der Optimierung der in vitro Kultur zeigte der Reisererntetermin einen überragenden Einfluss. Dies ist im Zusammenhang mit der Dormanz der als Ausgangsmaterial dienenden Winterknospen zu sehen. Dormanz ist eine temporäre, endogen regulierte und durch die Umwelt beeinflusste Unterbrechung des Wachstums (LARCHER, 1995). Die jährlich eintretende Winter-Dormanz der holzigen Pflanzen ist eine Anpassung an die widrigen Wachstumsbedingungen des Winters. Nach KRAMER and KOZLOWSKI (1979) durchlaufen die Knospen laubabwerfender Bäume verschiedene Phasen der Ruhe:

↓155

Damit es in vitro zum Wachstum kommt, muss die Dormanz gebrochen werden. Dies gelingt bei Knospen, die sich im Stadium der Vorruhe befinden, bereits dadurch, dass sie vom Reis entfernt und einzeln auf Nährmedium aufgesetzt werden. Damit sind sie den hormonellen Einflüssen durch die Position am Baum, bzw. Zweig, entzogen. Im Stadium der Nachruhe wird die Dormanz dadurch gebrochen, dass in der in vitro Kultur mit 24°C bei 16-stündiger Belichtung günstige Außenbedingungen für das Wachstum geschaffen werden. Im Stadium der Hauptruhe ist es offenbar je nach Baumart verschieden, durch welche Maßnahmen die Dormanz überwunden werden kann. Für Prunus avium zum Beispiel ist anzunehmen, dass die den Austrieb verhindernden Faktoren vom umliegenden Gewebe ausgehen und daher das Entfernen der Knospenschuppen und Isolieren des Apex vom restlichen Gewebe in Verbindung mit den günstigen Außenbedingungen dazu führt, dass der Austrieb erfolgen kann. Die vorgelegten Ergebnisse zur in vitro Etablierung von Prunus avium unabhängig vom Erntetermin der Reiser unterstützen diese Annahme. Für Pyrus pyraster und Sorbus torminalis kann diese Annahme jedoch nicht zutreffen, da die Etablierung und anschließende Vermehrung sehr stark vom Reisererntetermin und der Reiserlagerung beeinflusst wurde.

Auf diesen Punkt wird in den publizierten Arbeiten über Pyrus und Sorbus nur wenig eingegangen. Viele Autoren bevorzugen als Ausgangsmaterial die an frischen Austrieben gebildeten „grünen Knospen“ von im Gewächshaus gezogenen Pfropflingen anstelle von Winterknospen. Der Grund liegt nicht im besseren Wachstum, sondern in den niedrigeren Kontaminationsraten (BHOJWANI et al., 1984; LIBERALI und DAMIANO, 1997). Dies war bei den hiesigen Untersuchungen ebenfalls der Fall (5% Kontamination bei grünen Knospen, bis zu 30% bei Winterknospen). Dennoch ist die Verwendung von Winterknospen notwendig, weil bei der Arbeit mit Waldbäumen auf Grund der vielen verschiedenen Genotypen die Herstellung von Propflingen als Ausgangsmaterial für die in vitro Kultur zu aufwendig ist. Auch sind Kontaminationsraten von bis zu 30% akzeptabel, da normalerweise ausreichend Pflanzenmaterial vorhanden ist.

Bei Verwendung grüner Knospen wurde in der vorliegenden Arbeit ebenfalls ein Einfluss des Erntetermins festgestellt. Hierzu finden sich weder für Pyrus noch für Sorbus Angaben in der Literatur. Bei anderen Pflanzenarten wurde auf den Erntetermin eingegangen. Z.B. hat RIECHERS (1993) dies für Ericaceae untersucht (4 Erntetermine), WALDENMAIER (1991) für Syringa (7 Erntetermine) und JESCH und MUSCHE (1991) für Prunus-Arten (5 Erntetermine). In allen drei genannten Untersuchungen wird ein Einfluss des Termins zumindest auf die Kontaminationsrate festgestellt, z.T. auch auf den Etablierungserfolg.

↓156

In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Etablierungsdauer durch den Erntetermin stark beeinflusst wird. In der Literatur zur in vitro Kultur von Baumarten wird dieser Zusammenhang selten untersucht. In den sehr intensiven, aber nicht auf die in vitro Kultur bezogenen Studien von GRUPPE et al. (1975) an Prunus avium wurden erhebliche Einflüsse auf die Austriebsbereitschaft geernteter Zweige festgestellt. Diese ist mit der in vitro Etablierungsdauer in gewisser Weise vergleichbar, hat aber nicht den Effekt des Isolierens des Apex vom umliegenden Gewebe. Bemerkenswert war hier das Fehlen jeglichen Austriebs bei Ernte am 1. Oktober. LIBERALI und DAMIANO (1997) hatten September als günstigen Etablierungstermin für Wildbirne genannt. Die Ursache für diese Diskrepanz könnte ein Unterschied zwischen den Arten Prunus und Pyrus sein. Möglich ist auch der Einfluss der unterschiedlichen Klimate in Deutschland und Italien, da sowohl Induktion als auch Terminierung der Ruhephase stark von den klimatischen Faktoren beeinflusst werden.

Für Vitis haben CHENG et al. (1974) eine induktive Temperatur von +5°C, sowie das Kältebedürfnis sortenspezifisch ermittelt. Die Erfüllung des Kältebedürfnisses, ausgedrückt als Produkt der „relativen Temperatur“ und der „Zeit in Stunden unter +5°C“, ist jedoch in der physiologischen Wirkung von der Differenz der gegebenen Temperatur zum Schwellenwert und der Einwirkungsdauer abhängig. Dies könnte auch die Erklärung für die in dieser Arbeit gefundenen Unterschiede zwischen den Versuchsjahren bei Pyrus pyraster sein. Auch bei CHENG et al. (1974) waren solche Unterschiede aufgetreten, deren Ausmaß sortenspezifisch war. Generell fanden die Autoren eine kontinuierlich ansteigende Verkürzung der Austriebsdauer ab dem ersten Frost im November bis März, die mit einer ansteigenden Austriebsrate korreliert war, was in den eigenen Untersuchungen wiederum nicht der Fall war.

Dies deutet darauf hin, dass bei Vitis das Kältebedürfnis erfüllt war, während es für Pyrus pyraster nicht erfüllt war. SAURE (1985) nennt als Kältebedürfnis für Pyrus bis zu acht Wochen bei 2° bis 7°C, während er für Prunus bis zu 10 Wochen angibt. Auf der anderen Seite haben die hier untersuchten Prunus-Knospen keine gravierende Austriebshemmung oder –verlängerung in Abhängigkeit vom Erntetermin gezeigt. Dies stimmt mit den langjährigen Erfahrungen von MEIER-DINKEL (persönliche Mitteilung) überein. Es ist zu vermuten, dass die in der in vitro Kultur applizierten Hormone das Verhalten je nach Baumart unterschiedlich beeinflussen und Prunus avium besonders leicht manipulierbar ist. Bei Pyrus pyraster könnten die Reaktionen im ersten Versuchswinter 99/00 (Serie 1) darauf schließen lassen, dass im Dezember und Januar die Hauptruhe vorliegt, deren Kältebedürfnis durch Reiserlagerung nicht erfüllt wird und die nicht durch die in der in vitro Kultur applizierten Hormone beeinflussbar ist. Ab Februar kann das Kältebedürfnis durch Lagerung erfüllt werden und ab März sind die Knospen dem Einfluss der Hormone der in vitro Kultur besonders gut zugänglich. Somit müssen sich die Wildbirnen im Februar bereits im Stadium der Nachruhe befunden haben.

↓157

Das gänzlich andere Verhaltensmuster im zweiten Versuchswinter 2000/2001 könnte mit dem Witterungsverlauf zusammen hängen. Die Daten der meteorologischen Station der NFV-C in Escherode (Abbildungen 27 a und b), die vom Wildbirnen-Standort ca. 50 km entfernt liegt, belegen folgendes: Unter der Annahme, dass für Pyrus 5°C die kritische Temperatur ist, bleiben in 1999/2000 die Maximalwerte ab Ende November bis Mitte Februar kontinuierlich darunter (einen Ausreißer gibt es Anfang Dezember). Die Minimalwerte bleiben ab Ende Oktober bis Ende März unter 5°C. Dagegen wechselten in 2000/2001 die Maximal-Temperaturen mehrmals über und unter die 5°C-Marke. Sie war unterschritten zu Ende Dezember, Anfang Januar, Ende Januar, Anfang März und Mitte März. Dazwischen wurde sie z.T. ganz erheblich (8°C im Februar, 10°C im Dezember) mehrmals überschritten. Die Minimaltemperaturen blieben ab Mitte November konstant unter 5°C, mit einer Ausnahme Mitte Dezember. Wenn tatsächlich der Abstand zur „kritischen Temperatur“ die Induktion oder Aufhebung der Knospenruhe bewirkt, dann befanden sich die Wildbirnen in 2000/2001 in einem ständigen Wechsel zwischen Ruhe und Aktivität. Die Etablierungsergebnisse passen zu dieser Annahme.

Es soll nicht unerwähnt bleiben, dass es auch noch andere Faktoren gibt, die die Induktion, Intensität und Dauer der Dormanz beeinflussen. Hierzu zählen nach KRAMER und KOZLOWSKI (1979) die Mineralverfügbarkeit und die Wasserversorgung. POWELL (1970) berichtete, dass die Dormanz der Knospen vom apikalen zum basalen Teil des Zweiges zunahm, also ein Topophysis-Effekt vorliegt. Andererseits zeigt bei Malus domestica immer die terminale Knospe tiefere Dormanz als die axillären Knospen (BAILLY and MAUGET, 1989). Weder der Mineralverfügbarkeit, noch der Wasserversorgung noch den Topophysis-Effekten konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit nachgegangen werden. Letztere wurden insofern beachtet, als versucht wurde, bei jedem Erntetermin gleichmäßig Reiser aus dem oberen und mittleren Kronenbereich zu schneiden und beim Zerkleinern der Reiser die apikalen und basalen Stücke gut gemischt auf die unterschiedlichen Varianten zu verteilen. Dennoch ist nicht auszuschließen, dass diese Zufallsverteilung manchmal nicht ganz gleichmäßig war.

Elsbeere reagierte positiv sowohl mit höheren Etablierungsraten als auch kürzerer Etablierungsdauer auf die Reiserlagerung. Daher fiel besonders auf, dass im Februar weder mit noch ohne Lagerung in vitro Kultur möglich war. Es könnte sein, dass die Hauptruhe erst sehr spät eintritt. Eine weit verbreitete Ansicht ist, dass die Hauptruhe in Dezember/Januar vorliegt und durch exogene Maßnahmen schwer oder gar nicht aufzuheben ist. Aber es ist nicht auszuschließen, dass sie bei Sorbus torminalis erst im Februar erreicht ist und daher 8 Wochen Lagerung bei 5°C zur Stillung des Kältebedürfnisses nicht ausreichen.

↓158

Abb. 27 a und b Temperaturdaten der meteorologischen Station der NFV-C in
Escherode

T (Max.) = Maximale gemessene Temperaturen in Dekadenwerten
T (Min.) = Minimale gemessene Temperaturen in Dekadenwerten
Dekadenwert = Mittelwert von 10 Tagen
Ernte = Reisererntetermin

Für Malus domestica stellten SKIRVIN et al. (1986) fest, dass Ausgangsmaterial, das direkt vom Feld geerntet wurde, nur selten zu „guten“ Sprosskulturen führte mit Ausnahme von Ernten im frühen Frühling. Dies scheinen die eigenen Untersuchungen insofern zu bestätigen, als die Kulturen von Pyrus pyraster und Sorbus torminalis mit den höchsten Etablierungsraten bei Erntetermin März, also frühem Frühling, erzielt wurden. Aber die kürzeste Etablierungsdauer und die höchsten Vermehrungskoeffizienten kamen bei anderen Ernteterminen zustande. Daher bedarf es zunächst der Definition einer „guten Sprosskultur“ bevor Vergleiche möglich sind. Diese Definition geben SKIRVIN et al. (1986) nicht.

Bewertungen in allgemeiner Form („gut“), die nicht definiert werden, wie z. B. in der Veröffentlichung von SKIRVIN et al. (1986), erschweren das Vergleichen und Diskutieren. Die eigenen Ergebnisse machen es der Autorin schwer zu sagen, welche Variante „gut“ ist. Wenn unter „gut“ die höchste Etablierungsrate, kürzeste Etablierungsdauer und höchsten Vermehrungskoeffizienten zu verstehen sind, gibt es keine eindeutige Antwort, da diese drei Eigenschaften in keiner der untersuchten Varianten zusammen auftraten. Wenn als „gut“ die Variante verstanden wird, bei der – im Vergleich zu den anderen vorhandenen Varianten - mit dem geringsten Arbeitsaufwand in kürzester Zeit eine bestimmte Pflanzenstückzahl produzierbar ist, ist eine eindeutige Antwort möglich. Hilfreich ist dabei die Abbildung 10 „Einfluss von Reisererntetermin und Reiserlagerung auf den Verlauf von Etablierung, Etablierungsdauer und Vermehrung bei Winterknospen von Pyrus pyraster in Kap. 3.1.4.4., aus der das Zusammenwirken der drei Komponenten zu erkennen ist. Im Text zur Abbildung wurde an einem Beispiel bereits erläutert, welche der Varianten bei der og. Definition von „gut“ als die beste anzusehen ist. In der Praxis kann sich dies durch äußere Umstände wieder verschieben, wenn z.B. zu dem gewünschten Reisererntetermin nicht die notwendigen Arbeitskräfte zur Verfügung stehen oder keine Kühlkammer für die Reiserlagerung vorhanden ist. In diesem Fall ermöglichen es Untersuchungen wie diese hier, die Konsequenzen einzuschätzen und die Variante zu wählen, die unter den gegebenen Umständen zum bestmöglichen Ergebnis führt.

↓159

Es waren insbesondere die Versuche zum Einfluss von Jacquiot-Vitaminen im Etablierungsmedium von Elsbeere und der Vergleich der 3 Vermehrungsmedien für Wildbirne, die gezeigt haben, dass heutzutage die Grundlagen für die in vitro Kultur so gut gelegt sind, dass durch Medienversuche nur noch geringfügige oder keine Verbesserungen eintreten. Man könnte dies mit der Entwicklung der Einheitserde im Gartenbau vergleichen, die heute mit nur geringfügigen Anpassungen für eine Vielzahl von Pflanzenarten einsetzbar ist und die früher übliche Herstellung von Spezialsubstraten weitestgehend überflüssig macht. Auf dem Gebiet der In vitro Kultur liegt seit den grundlegenden Arbeiten von MURASHIGE und SKOOG (1962) ein Basismedium vor, dass wie die Einheitserde für die große Mehrzahl der Pflanzenarten geeignet ist. Durch die Vielzahl der seither publizierten Vermehrungsprotokolle sind die Rahmenwerte für Konzentration und Kombination weiterer Medienbestandteile, wie z.B. Wachstumsregulatoren, bekannt. Verbesserungen von Produktionsleistungen im 1-stelligen Prozentbereich oder darunter sind für kommerzielle Betriebe von Belang, aber bei Anwendungen in Genbanken, im Züchtungsbereich und in der Forschung (sofern dieses nicht gerade das Schwerpunktthema ist) spielen sie keine Rolle. Hier ist die Zuverlässigkeit einer Methode bei der Anwendung auf eine Vielzahl von Genotypen mit großer genetischer Bandbreite das wichtigere Kriterium. Dieser Forderung wurde in der vorliegenden Arbeit so weit wie möglich Rechnung getragen.

Bei den Anwendungsbereichen Genbank und Züchtung kommt erschwerend hinzu, dass i.d.R. die Vermehrung von adulten, manchmal schon seneszenten, Bäumen erforderlich ist. Die für die Züchtungsselektion relevanten Merkmale, wie z.B. die Stammform, sind erst in der adulten Phase der Bäume erkennbar. Die Sicherung einzelner Genotypen bedrohter Arten wie z.B. Pyrus pyraster muss sofort erfolgen, wenn ein Individuum gefunden wird – unabhängig von dessen Alter. Die Pfropfung ist eine mögliche Maßnahme, aber sie sollte durch die in vitro Kultur abgesichert werden. Dies ist besonders dann wichtig, wenn der betreffende Baum zufällig auch noch ein Plusbaum ist, dessen vegetative Vermehrung für Samenplantagen und eventuell auch Wertholzplantagen wünschenswert ist. An den Etablierungsraten in der vorliegenden Arbeit ist zu erkennen, welche Schwierigkeiten hieraus resultieren. Bei Wildbirne gelang im ersten Versuch (vgl. Kap. 3.1.1.1.1.) die Etablierung nur bei 3 von 12 Klonen. Bei Elsbeere waren es 8 von 20 Klonen (vgl. Kap. 3.1.1.2.). Im Vergleich dieser Etablierungen mit bereits im Labor vorhandenen Klonen wurde aufgezeigt, wie sich ein höheres Alter der Spenderbäume erschwerend auswirkt (vgl. Kap. 3.1.2.4.). Dies wird mehrmals in der Literatur bestätigt, wie aus der Zusammenfassung von PIERIK (1987) hervorgeht. An Betula spp. (1991) und Prunus avium (1986) konnte MEIER-DINKEL die Möglichkeit der Rejuvenilisierung durch die in vitro Kultur nachweisen, was im Hinblick auf die Nutzung der in vitro Technik für Genbankzwecke ebenso wie für Wertholzplantagen von Vorteil wäre.

Nach dem Einfluss der Dormanz (Erntetermin, Reiserlagerung) war in den vorliegenden Untersuchungen die Art des Kulturgefäßes ein wichtiger Faktor in der Beeinflussung der Vermehrung. Dies ist ein Bereich der Kulturtechnik, dem in den Publikationen nicht immer die nötige Aufmerksamkeit gewidmet wird, obwohl dieser Einfluss so groß sein kann, dass er bei sensiblen Klonen darüber entscheidet, ob die Pflanzen leben oder sterben. (vgl. Kap. 3.1.2.2. Klon B 414). Dies dürfte, neben anderen, einer der Gründe für die Schwierigkeiten bei der Übertragung von Methoden von Labor zu Labor sein.

↓160

Dennoch ist es nicht möglich festzulegen, welches Gefäß das Beste ist, denn die in vitro Kultur muss in ihrer Gesamtheit gesehen werden und die einzelnen Komponenten müssen zueinander passen. Im Labor der NFV-C werden Weckgläser mit Filzring-Einlage wegen ihres guten Gasaustauschs favorisiert. In dem hier vorgestellten Versuch „Vergleich zwischen Weckgläsern und Honiggläsern“ (vgl. Kap. 3.1.2.2.) war die Kondenswasserbildung in Honiggläsern aufgefallen, die bei Weckgläsern fehlte – ein Hinweis auf die bessere Belüftung in Weckgläsern, die gleichzeitig auch mehr Wasserdampfdiffusion ermöglicht. Die gleiche Eigenschaft kann jedoch in Kulturräumen mit stärkerer Luftbewegung zu einer schnellen Austrocknung der Medien und damit zum Absterben der Kulturen führen.

SHORT et al. (1987) haben die relative Luftfeuchtigkeit (rLF) in Kulturgefäßen mit verschiedenen Verschlüssen gemessen. Sie fanden bei fest verschlossenen Schraubdeckeln 100% und bei lose gelassenen Schraubdeckeln 80% rLF. Einzelne Kulturen haben unterschiedliche rLF-Optima. Wenn diese überschritten werden, besteht die Gefahr der Hyperhydrizität, bei Unterschreiten Wuchsdepression bis Absterben. 75 bis 80% rLF gelten als untere Grenze (GEORGE, 1993). LANE (1982) berichtet von Sprossnekrosen bei rLF unter 95% bei Birnen. In der vorliegenden Arbeit wurden weder Sprossnekrosen in Weckgläsern mit möglicherweise niedrigerer rLF noch Hyperhydrizität in Honiggläsern mit offensichtlich hoher rLF beobachtet. Letztere ist dennoch nicht auszuschließen, da sie oft von außen schwer erkennbar ist.

Von den Faktoren, die die Gaszusammensetzung im Kulturgefäß beeinflussen, stimmten bei Weck- und Honiggläsern Gesamtvolumen und das Luftvolumen über dem Medium nahezu überein, während die Art des Verschlusses und die Medienmenge (Weckgläser: 80 ml; Honiggläser: 50 ml) unterschiedlich waren. Hier hätte die geringere Medien- und damit Nährstoffmenge in den Honiggläsern dazu führen können, dass sie das Pflanzenwachstum begrenzt. Im Hinblick auf die Sprossanzahl und –größe war das jedoch nicht der Fall.

↓161

Es ist möglich, dass das Trockengewicht der Pflanzen aus Honiggläsern erniedrigt war. Das würde die schlechteren Akklimatisierungsergebnisse bei den 3 der 4 getesteten Klone erklären (vgl. Tab. 17, Kap. 3.1.3.1.). Der durch den Schraubdeckel behinderte Gasaustausch in den Honiggläsern im Vergleich zu Weckgläsern bewirkt das Absenken von CO2 und die Anreicherung von O2 während des Tages. CO2-Mangel begrenzt das Wachstum von photosynthetisch aktiven Pflanzen. Da die Pflanzen in den Honiggläsern kräftig wuchsen, litten sie offenbar nicht unter CO2-Mangel. Möglich ist, dass sie einen mixotrophen Stoffwechsel hatten, indem sie die Saccharose aus dem Medium als Kohlenstoffquelle nutzten. Dafür spricht auch die Beobachtung, dass die Blattfläche gegenüber den Pflanzen in Weckgläsern stark verkleinert war, was eine geringere Photosyntheseleistung zur Folge haben musste. Auch das könnte zur schlechteren Akklimatisierung nach dem Pikieren beigetragen haben. Eine mögliche Erklärung lautet daher: Im Vergleich zur Kultur in Weckgläsern photosynthetisieren Pflanzen in Honiggläsern weniger, sind weniger autotroph, haben dadurch größere Schwierigkeiten bei der Umstellung auf Erde und sind gleichzeitig anfälliger für Pilzbefall, weil sie ein geringeres Trockengewicht haben - „weicher“ sind.

Bei Sorbus torminalis wurde der Einfluss des Explantattyps (Segmentierung) auf die Vermehrung untersucht (vgl. Kap. 3.1.2.3.). Mononodiale Sprosssegmente führten zu besseren Vermehrungskoeffizienten als Einzelsprosse, ohne dass Nachteile beobachtet wurden. Dies steht im Gegensatz zu den Ergebnissen von WALDENMAIER (1991). Er berichtet, dass mit Hilfe der Axillarsprossmethode, wie er die Teilung der aus Axillarsprossen entstandenen Sprossbüschel nennt, bis zu doppelt so hohe Vermehrungsraten erzielt wurden wie mit der Einzelsprossmethode, die der Segmentierung entspricht. Allerdings bezieht er seine Zahlen aus lediglich drei Subkulturen. Die Autorin hält das nicht für ausreichend, da gerade bei der Segmentierung starke Schwankungen von Transfer zu Transfer auftreten. PIERIK (1987) behauptet, dass dafür wenige oder keine Cytokinine gebraucht werden, was auch nicht den Erfahrungen der Autorin entspricht. Bei Elsbeere waren es gerade die mononodialen Segmente, die für ein gutes Wachstum ein Medium mit höherem Cytokinin-Gehalt benötigten (Medium 87/27 mit 0,5 mg/l BAP) als Einzelsprosse (Medium 2/5 mit 0,3 mg/l BAP).

Wie die exemplarischen Bewurzelungs- und Abhärtungsversuche mit dem Wildbirnen-Klon 320-8 (vgl. Kap. 3.1.3.3.) zeigten, sind die Optimierungsmöglichkeiten dieser Phase der in vitro Kultur nicht ausgeschöpft. Man sollte den physikalischen Bedingungen während der Abhärtung viel mehr Aufmerksamkeit schenken als z.B. den Varianten in der Hormonzusammensetzung der Nährmedien. Dafür spricht auch ein Vergleich der Akklimatisierungserfolge in Abhängigkeit vom Pikiertermin sämtlicher in der NFV-C pikierten Wildbirnen in den Jahren 1999 und 2000 (Daten nicht gezeigt):

↓162

In beiden Jahren wurden zwischen März und September jeweils ca. 2200 Mikrostecklinge pikiert. In 1999 wurde eine Gesamt-Akklimatisierung von 29% und in 2000 von 33% erzielt. Die Schwankungen innerhalb eines Jahres betrugen bis zu 50%. Ab der zweiten Hälfte des Sommers, ungefähr ab Mitte Juli, waren in beiden Jahren die Akklimatisierungserfolge höher als in der ersten Hälfte des Sommers und sanken zum September hin wieder ab, mit einem Peak zwischen Ende Juli und Anfang August.

Dieser Verlauf lässt sich den jeweils vorherrschenden Temperaturbedingungen und / oder Sonnenschein zuordnen. Während des Juli 1999 betrugen die erfolgreichen Akklimatisierungen ca. 45%. Es herrschte eine Durchschnittstemperatur von 18° bis 20°C. Im selben Zeitraum des Jahres 2000 lagen die Akklimatisierungserfolge zwischen 8% und 25%. Die Durchschnittstemperaturen betrugen 13° – 15°C.

Im Juni waren die Temperaturen der beiden Jahre annähernd gleich (+- 17°C), aber die Lichtmenge im darauf folgenden Monat war sehr unterschiedlich. Der Juli des Jahres 2000 war ein ausgesprochen dunkler Monat. Die Strahlungsmenge lag ab dem 24.6.00 fast immer unter 2,5 KWh/d/qm. Der Juli-Durchschnitt betrug 1,6, während er im Vorjahr 3,4 betragen hatte. Am Beispiel des Klons 320-8, der, vom gleichen Bewurzelungsmedium kommend, sowohl Anfang Mai als auch Ende Juni 2000 pikiert wurde, ist zu sehen, dass nicht nur hohe Temperaturen, sondern auch hohe Lichtmengen für einen guten Abhärtungserfolg notwendig sind – mehr noch: Der Pikiertermin beeinflusste das Abhärtungsergebnis in weit stärkerem Maße als Nährmedium oder Genotyp. Aus den vorliegenden Daten lassen sich keine Schwellenwerte und daher auch keine konkreten Empfehlungen ableiten. Aber es wäre im Hinblick auf eine kommerzielle Nutzung, die nur bei hohen Akklimatisierungserfolgen wirtschaftlich ist, interessant, diese zu erarbeiten. Bei den Publikationen fehlen sie in aller Regel.

↓163

In Lehrbüchern wird zum Thema „Abhärtung“ nur auf wenige Faktoren eingegangen, vor allem auf die Luftfeuchtigkeit und die Substrate. Zu Temperatur und Belichtung steht entweder nichts oder nur im Nebensatz „spielt auch eine Rolle“ (GEORGE, 1993, KYTE and KLEYN, 1999; PIERIK, 1987). KYTE und KLEYN (1999) regen an, den Akklimatisierungsraum bezüglich Licht und Temperatur genauso regelbar auszustatten wie den Kulturraum. Dennoch gibt es in den zahlreichen Rezepten ihres Buches zwar exakte Angaben zu Licht und Temperaturen der einzelnen Pflanzenarten während der in vitro Kultur, aber keine über die ex vitro Phase. CHALUPA (1987, S. 227) führt wenigstens die Temperatur an, die für eine ex vitro Bewurzelung geeignet ist. Angaben über eine geeignete Lichtstärke fehlen. Für die Akklimatisierung nach der in vitro Bewurzelung nennt er weder Temperatur noch Lichtstärke. Es ist offenbar so, dass bis in die 90er Jahre hinein dieser Aspekt vernachlässigt wurde. DRIVER and SUTTLE (1987) widmen zwar dem Thema „Abhärtung und Anzucht“ ein ganzes Kapitel, aber konkrete Angaben fehlen. Als Temperaturen für optimales Wachstum nennen sie 15°C Minimum basale Wärme und maximale Lufttemperatur 38°C. Dazu empfehlen sie „adäquate“ Tageslänge und Lichtintensität. Genauere Angaben fehlen.

Als Indiz für eine recht späte Bearbeitung dieses Themas dient der Vergleich zwischen der Posterschau auf dem IAPTC-Kongress 1990 in Amsterdam und dem Symposium über Qualitätssicherung 1999 in Cork, Irland: In Amsterdam waren 241 Poster dem Thema „Vegetative Vermehrung“ gewidmet, davon 12 zu Bewurzelung und Abhärtung. Als eigenes Thema gab es Bewurzelung und Akklimatisierung nicht. Von den Autoren dieser 12 Poster machte keiner Angaben zu Licht und Temperatur. In Cork stand ein ganzes Symposium (von 7) unter der Überschrift „Vorbereitung der Mikropflanzen für die Abhärtung“ mit 12 ausführlichen Beiträgen. Von diesen waren 5 mit Angaben über Licht und Temperatur während der Versuchsphase versehen. Dies zeigt, dass der Akklimatisierungsphase heute mehr Aufmerksamkeit entgegengebracht wird und es ins Bewusstsein gedrungen ist, dass Hormone oder relative Luftfeuchtigkeit nur 2 Faktoren unter vielen sind.

DEBERGH et al. (2000) berichten über publizierte Studien zur Hyperhydrizität: Sie ist mit bloßem Auge oft nicht sichtbar und behindert Bewurzelung und Abhärtung (siehe eigene Ergebnisse / Kommentar zu Honiggläsern oben). Die Autoren geben an, dass mikrovermehrte Pflanzen in den ersten Tagen nach dem Pikieren sehr Licht-sensibel sind: Photohemmung und Photostörung können schon bei Lichtintensitäten auftreten, die von „normalen“ Pflanzen gut vertragen werden. Die eigenen Ergebnisse zeigten ein besonders schlechtes Anwachsen in Zeiten mit niedrigen Lichtintensitäten (s.o.), aber das ist möglicherweise von der Pflanzenart abhängig und / oder eine Funktion von Temperatur und Licht. Ein in diesem Zusammenhang auch selten untersuchter Aspekt sind die Ergebnisse von MOREIRA DA SILVA et al. (1997) zur Lichtqualität: In Abhängigkeit vom Verhältnis kurzwelligen Lichts zu langwelligen Lichts stieg die Akklimatisierung von Azorina vidalii von 19% auf bis zu 91% an.

↓164

Obwohl MAENE bereits 1985 nachgewiesen hat, dass ein in vitro entwickeltes Wurzelsystem unter ex vitro Bedingungen nicht immer seine Funktionen erfüllen kann, wird den Bewurzelungserfolgen in vitro immer noch eine große Bedeutung beigemessen. Da dies so üblich ist, wurden in der vorliegenden Arbeit einige Daten zur in vitro Bewurzelung angegeben. Aber beim Vergleich der Prozentzahlen von Bewurzelung und Akklimatisierung fiel der Autorin immer wieder auf, dass die Anzahl akklimatisierter Pflanzen höher war als die Anzahl bewurzelter Pflanzen. Es findet also teilweise in beträchtlichem Umfang ex vitro Bewurzelung statt, obwohl gezielte Versuche hierzu (Daten nicht gezeigt) völlig fehlschlugen. Man könnte daher annehmen, dass die sogenannte Bewurzelungsphase auf dem sogenannten Bewurzelungsmedium möglicherweise nur eine Wurzelinduktionphase ist, die die anschließende ex vitro Bewurzelung begünstigt.

Die Verwendung von Graphit im Medium hatte sich sowohl bei Pyrus pyraster als auch bei Sorbus torminalis negativ auf die Akklimatisierung ausgewirkt. Dies entsprach nicht den Erwartungen, denn 1. soll Graphit chemisch inert und somit im schlechtesten Fall ohne Einfluss sein, und 2. wird allgemein angenommen, dass durch die Dunkelfärbung des Mediums und die Reduzierung des Lichteinfalls im basalen Teil des Mikrostecklings in der Dunkelheit ablaufende Prozesse wie z. B. die Wurzelbildung gefördert werden (GEORGE, 1993). Auf der anderen Seite hat NÉMETH (1979) bei Prunus mit 2000 lx Belichtung höhere Bewurzelungswerte erhalten als mit 800 lx Lichtintensität und SRISKANDARAJAH et al. (1982) erzielten hohe Bewurzelungswerte bei Apfel unter Dauerlicht. Blattscheiben von Prunus mahaleb bewurzelten nur im Licht (HEDTRICH, 1977). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Wurzelinduktion ein Prozess ist, der nicht notwendigerweise im Dunkeln abläuft. Möglicherweise war das bei dem hier geprüften Material auch der Fall.

4.2. Kryokonservierung

Es gehörte zur Aufgabenstellung, Kryokonservierungsmethoden zu evaluieren, die auf das vorliegende Material unter den gegebenen Umständen und im Hinblick auf den Aufbau einer Kryo-Genbank für Konservierungs- und Züchtungszwecke anwendbar sind. Dabei konnte für Pyrus pyraster auf verschiedene bereits publizierte Methoden zurückgegriffen werden, während für Sorbus torminalis erstmalig Kryokonservierungsversuche durchgeführt wurden. Die unter dieser Fragestellung durchgeführten Versuche ergaben, dass sowohl in vitro Material als auch Winterknospen als einzufrierendes Material in Frage kommen und je nach Rahmenbedingungen dem einen oder dem anderen der Vorzug zu geben ist.

↓165

Es zeigte sich, dass bei Verwendung von in vitro Material von Pyrus pyraster eine bisher in der Literatur nicht beschriebene Kombination von Vitrifizierung und Droplet-Technik anwendbar ist, die die Vorzüge einer relativ kurzen Vorbehandlung mit geringem technischen und Arbeits-Aufwand verbindet. Es wurde bei der Entwicklung der Methode sehr auf die Praktikabilität geachtet, um die spätere Anwendbarkeit in der Praxis zu gewährleisten. Das computergesteuerte langsame Einfrieren, wie es von mehreren Autoren beschrieben wurde (SUZUKI et al., 1987; REED, 1990; DEREUDDRE et al., 1990; REED et al., 1998; CHANG and REED, 2001), wurde für diese Arbeit nicht in Erwägung gezogen. Diese Geräte sind teuer, die Einarbeitungszeit bis zur zuverlässigen Benutzung ist lang, und die Ergebnisse sind nur mit Schwierigkeiten reproduzierbar (JÖRGENSEN, persönl. Mitteilung).

Eine Methode, die von der Geräte-Ausstattung her nicht aufwendig ist, ist die Methode der Einkapselung in Alginatkugeln. Es wurde die für Pyrus pyraster beschriebene Methode des Einkapselns in Alginatkugeln und der anschließenden Trocknung (DEREUDDRE et al., 1990) nachvollzogen. Dabei stellte sich heraus, dass das hier verwendete Material von Pyrus pyraster den ersten Schritt, die Kältebehandlung zwecks Abhärtung, nicht gut vertrug, das Wachstum durch Einkapseln weiter verschlechtert wurde und nach dem Trocknen viele Apices abgestorben waren. Damit war das Nacharbeiten der Original-Methode schon vor der Kryokonservierung nicht gelungen, und es wäre notwendig gewesen, die einzelnen Schritte anzupassen. Dies ist nicht durchgeführt worden, weil sich gezeigt hatte, dass die Methode im Ganzen sehr umständlich und störanfällig ist. So ist es z.B. sowohl für das Trocknen als auch für das Gefrieren äußerst wichtig, dass Apices und Alginat-Kugeln immer die gleiche Größe haben, denn nur dann ist die Geschwindigkeit des Trocknens und Gefrierens gleich (siehe auch Kapitel 3.2.1.1.1. Trocknungsmethoden), was für die Reproduzierbarkeit von großer Bedeutung ist. Es erfordert einige Übung, bis die in Handarbeit hergestellten Alginat-Kugeln uniform gelingen. Noch schwieriger ist es, sie so herzustellen, dass ihre Größe und Form unabhängig von der ausführenden Person ist. Dies ist ein schwerwiegender Nachteil der Methode. Daher wurde sie auch bei Elsbeeren nicht weiter verfolgt, obwohl diese weniger empfindlich auf die Einkapselungsprozeduren reagierten als Wildbirnen.

Die in dieser Arbeit für Pyrus pyraster entwickelte Vitrifizierungs-Droplet-Methode ist vielversprechend, weil sie bei 3 Klonen und in mehreren Varianten erfolgreich war. Sie ist technisch nicht zu schwierig und vom Zeitaufwand her vertretbar, daher weitaus „benutzerfreundlicher“ als die publizierten Methoden. Es ist jedoch notwendig, sie in jeder Hinsicht auf eine breitere Basis zu stellen. Sowohl Dauer als auch Konzentrationen der Vorbehandlungen benötigen noch eine Feinabstimmung. Die Anwendung auf eine größere Anzahl Klone ist noch zu prüfen.

↓166

Für die Kryokonservierung von in vitro Material von Elsbeere sind mit dieser Arbeit Grundlagen gelegt. Sie lassen erwarten, dass Kryokonservierung möglich ist. Möglicherweise ist die Vitrifizierungs-Droplet-Methode in gleicher Weise anwendbar wie für Wildbirne. Erste Versuche nach demselben Versuchsplan wie für Wildbirne (Tabelle 32) zeigten, dass Elsbeeren in mehreren der geprüften Varianten ohne Kryokonservierung Wachstum zeigten (Abbildung 42 im Anhang; Daten nicht gezeigt).

Die Kryokonservierung von Winterknospen gelang bei Pyrus pyraster und Sorbus torminalis. Es zeigte sich eine Abhängigkeit vom Erntetermin. Die Anwendung des TTC-Tests als Schnelltest für die Ermittlung der Vitalität nach dem Gefrieren ließ keine Rückschlüsse auf das Vermögen zur Sprossregeneration zu. Die Anwendung der für Wildbirne und Elsbeere ermittelten Kryokonservierungsmethode war bei Prunus avium nicht erfolgreich.

Die in den Vorversuchen ermittelten und mit dem TTC-Test evaluierten Einflüsse der Gefriergeschwindigkeit und Auftaugeschwindigkeit hatten die besten Ergebnisse bei schrittweisem Vorgefrieren bis –30°C und langsamem Auftauen ergeben. Dies entsprach vollkommen den Erwartungen. WINKLER (1913) hatte bereits an Zweigen verschiedener Bäume festgestellt, dass die Temperatur, bei der das Gewebe abstirbt, bei langsamem Gefrieren sehr viel niedriger liegt (er gibt „unter –30°C“ an) als bei schnellem Gefrieren (-22°C). Umgekehrt ist bei gegebener Gefriertemperatur der Schaden nach langsamem Gefrieren geringer als nach schnellem Gefrieren (HILDRETH, 1926). Auch der Einfluss der Auftaugeschwindigkeit auf das Ausmaß der Schädigung ist schon früh beschrieben worden (HOFFMANN, 1857). Diese Beobachtungen sind seither an einer Vielzahl von Bäumen bestätigt worden. In neuerer Zeit wurden u.a. die Gattungen Morus, Populus, Salix, Pyrus, Malus, Betula untersucht (SAKAI, 1960; SAKAI and NISHIYAMA, 1978; TYLER and STUSHNOFF, 1988; NIINO et al., 1995).

↓167

Die Anwendung der Methode auf eine größere Anzahl Genotypen hatte sich bei Prüfung mit dem TTC-Test als geeignet erwiesen, dennoch war die Regeneration von Pflanzen in vitro nur in wenigen Fällen erfolgt. Diese Diskrepanz war unerwartet hoch, da der TTC-Test trotz aller Einschränkungen, denen jede Testmethode unterliegt, vielfach angewendet wird (ENGELMANN, persönl. Mitteilung; BENSON, 1999). In einem Vergleich von 5 Methoden zur Ermittlung der Vitalität wurden der mikroskopische TTC-Test und die Messung der Elektrolyt-Verluste als geeignet für das Screening bei der Entwicklung neuer Methoden befunden (VERLEYSEN et al., 2004).

Die Ursachen für die beobachteten Diskrepanzen könnten darin liegen, dass die Zellen zwar nicht tot waren und daher das TTC reduzieren konnten, aber doch geschädigt waren, so dass sie nicht regenerieren konnten. Die das TTC reduzierenden Dehydrogenasen sind im Cytoplasma lokalisiert. Es ist bekannt, dass diese Enzyme auch in teil-geschädigten Zellen noch längere Zeit aktiv bleiben können. Daher empfehlen LARCHER und EGGARTER (1960) einen Zeitraum von mindestens 24 Stunden zwischen Auftauen und Vitalitätsbestimmung. Dies wurde hier eingehalten. Eine falsche Beurteilung als Fehlerquelle kann bei der hier angewandten topographischen Beurteilung weitgehend ausgeschlossen werden, da sich die gefärbten Bereiche sehr eindeutig von den ungefärbten abhoben. Die im Vorversuch ermittelten Werte hatten in deutlichem Bezug zur Behandlung gestanden und waren auch wiederholbar gewesen (Ergebnisse von 3 Materialgruppen). Es hatte keinen Anlass gegeben, an der Aussagekraft des Tests zu zweifeln. Daher kann nur vermutet werden, dass entweder die Reduktasen geschädigter Zellen länger als von LARCHER und EGGARTER angegeben aktiv sind oder dass das Fehlen der Regeneration auf andere Ursachen als Gefrierschäden zurückzuführen ist.

Bei der Arbeit mit Winterknospen liegt die Vermutung nahe, dass die Dormanz der Knospen den Austrieb hemmt.

↓168

Einen Hinweis darauf geben die T12-Werte, die bei Sorbus torminalis erhoben wurden. Es ist sicher zulässig anzunehmen, dass Pflanzengewebe, welches 12 Wochen lang grüne Farbe als Zeichen von Vitalität zeigt, im Wesentlichen intakt ist. Bei solchen Apices könnte das Wachstum auf Grund anderer Ursachen als Gefrierschäden ausbleiben. Ein ähnliches Verhalten ist auch bei Sorbus torminalis ohne Kryokonservierung beobachtet worden, ohne dass die Ursachen geklärt werden konnten. Mögliche Faktoren könnten sein: die Zusammensetzung des Mediums (höhere oder niedrigere Hormonkonzentrationen, andere Hormone, andere Zucker, andere Salze erforderlich), Licht- und / oder Temperatureinflüsse oder Topophysis-Effekte. Letztere könnten dafür verantwortlich sein, dass manchmal extrem wuchs- und vermehrungsfreudige Knospen auftreten, die eine Optimierung der Methode nicht mehr notwendig erscheinen lassen. In dieser Arbeit wurde einigen möglichen Einflüssen nachgegangen, ohne dass eine endgültige Klärung herbeigeführt werden konnte. Die Literatur über Sorbus ist spärlich und behandelt diese Fragestellung nicht. Dass Pflanzen nach Kryokonservierung in „Rosettenform“ bleiben, also keine Sprossstreckung, Vermehrung und Bewurzelung ermöglichen, wird auch von Pyrus berichtet (OKA et al., 1991, SUZUKI et al., 1987).

Das beschriebene Verhalten der Pflanzen nach Kryokonservierung führt zu der Forderung, dass Kryokonservierungsexperimente erst dann als erfolgreich gelten können, wenn vollständige Pflanzen regeneriert wurden. Die Feststellung der Vitalität 4 Wochen nach dem Auftauen ist unzureichend.

Viele Autoren verwenden das ungefrorene Pflanzenmaterial (sine cryo) als Kontrolle für die Kryokonservierung. OKA et al. (1991) sind der Ansicht, dass Kryokonservierungs-experimente erst dann durchgeführt werden sollten, wenn die „normale“ in vitro Kultur optimiert ist. Diese Forderung ebenso wie das verwendete Kontrollmaterial ist aus zwei Gründen anzuzweifeln:

↓169

1. Es würde bedeuten, dass Knospen sine cryo und post cryo die gleichen Kulturansprüche stellen. Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass dies nicht der Fall ist.

2. Bei Verwendung von Winterknospen spielt Dormanz eine Rolle. Im ersten Teil dieser Arbeit wird an ungefrorenen Winterknospen (sine cryo) gezeigt, wie deren Regenerationsbereitschaft in Abhängigkeit vom Erntetermin, also Ausprägung der Dormanz, variiert. Im zweiten Teil der Arbeit wird die Regenerationsfähigkeit nach Kryokonservierung (post cryo) in Abhängigkeit vom Erntetermin demonstriert. Die Etablierungsraten zeigen das Optimum für sine cryo Knospen im März und für post cryo Knospen im Januar (sowohl Pyrus pyraster als auch Sorbus torminalis). Daraus lässt sich schließen, dass für die optimierte sine cryo in vitro Kultur die Dormanz weitgehend oder ganz aufgehoben sein sollte, während sie als natürlicher Gefrierschutz für die Kryokonservierung benötigt wird. Es ist daher nicht sinnvoll, für die zwei verschiedenen Verwendungszwecke das gleiche Ausgangsmaterial zu benutzen. Wenn es nicht gleich ist, kann das eine nicht als Kontrolle für das andere dienen. Zu berücksichtigen ist auch, dass die Dormanz durch das Einwirken der tiefen Kryokonservierungstemperaturen zum Teil aufgehoben wird. Darauf lassen die Januar-Ergebnisse von Pyrus pyraster schließen, die post cryo höher liegen als sine cryo. Dies erschwert die Vergleichbarkeit zusätzlich.

Wenn die Kryokonservierung die Dormanz beeinflusst und die Dormanz die Regenerationsbereitschaft, stellt sich die Frage, wie die Kontrollen für die Kryokonservierung beschaffen sein sollten. Sinnvoll wären Kontrollen, die physiologisch dem aufgetauten Material gleich sind. Um das feststellen zu können, müsste die Dormanz quantitativ erfassbar sein. Dann wäre die Kontrolle diejenige, deren sine cryo Wert dem post cryo Wert der Probanden entspricht. Alternativ wäre es vorstellbar, Marker für die verschiedenen Phasen der Dormanz zu suchen. Die Schwierigkeit besteht darin, dass „Dormanz“ lediglich ein Ausdruck für den Zustand der Wachstumsunterbrechung, der durch eine Vielzahl von Faktoren endogen reguliert und durch die Umwelt beeinflusst wird, ist (LARCHER, 1995). Die Beschreibung der verschiedenen Phasen dieser Wachstumsunterbrechung erfolgt je nach Autor unterschiedlich. Anders als KRAMER and KOZLOWSKI (1979) (siehe oben), orientiert sich CHAMPAGNAT (1989) bei Bäumen und Knollen; aber nicht bei Samen, an den Dormanz-auslösenden Faktoren: 1. Ungünstige Umweltbedingungen wie z. B. niedrige Temperaturen, führen zu „ruhenden“ Knospen („quiescent“). 2. Korrelative Hemmung durch andere Organe oder Teile der Pflanzen, wie z.B. apikale Dominanz, nennt er je nach Abstand zur betroffenen Knospe „long distance correlative inhibitions (LDIs)“ oder „short distance correlative inhibitions (SDIs)“. 3. Wenn Faktoren innerhalb der Knospen bewirken, dass die Knospen in Ruhe bleiben, obwohl alle umweltbedingten und korrelativen Hemmungen beseitigt sind, werden die Knospen „dormant“ genannt. Äußerlich ist den Knospen nicht anzusehen, wodurch ihr Ruhezustand ausgelöst wurde. Zwar sind bei der Bearbeitung einzelner Knospen im Labor unter optimierten Umweltbedingungen die Faktoren 1 und 2 ausgeschaltet, aber es ist unbekannt, ob und wie lange sie nachwirken. Der Versuchsansteller weiß somit nicht exakt, worauf die beobachtete Austriebshemmung beruht. Für die Kryokonservierung wäre dieses Wissen aber von großem Nutzen, da der natürliche Gefrierschutz vermutlich nur durch die Faktoren 1 und 3, Umwelteinflüsse und „echte Dormanz“, aber nicht durch korrelative Hemmungen hergestellt wird.

↓170

Es bleibt offen, ob die verschiedenen Faktoren verschiedene Stoffwechselvorgänge auslösen, bzw. beeinflussen. Unter der Hypothese, dass dies der Fall ist, kann man nur durch die Ermittlung mehrerer Parameter eine quantitative Charakterisierung der Ruhephase erwarten. Der Versuch dazu wurde mehrmals unternommen. Untersuchungen über die Veränderungen der Stoffwechselwege und -aktivitäten beim Übergang vom Wachstum in die Ruhephase sind zahlreich. Sie betreffen den Zucker- / Stärkehaushalt, die Aminosäuren, Nukleinsäuren und Proteine (hier vor allem die Membran-Proteine), Fettsäuren (das Verhältnis ungesättigter zu gesättigten Fettsäuren), Abszisinsäure und andere Hormone. Da die Dormanz zeitlich mit der Frostresistenz mehr oder weniger zusammenfällt, finden sich Untersuchungen sowohl bei Wachstum-Physiologen als auch bei Kryo-Physiologen. Eine schematische Übersicht über phänologische und resistenzphysiologische Vorgänge geben LYR et al. (1992).

Dennoch mangelt es an Modellen, die diese Vielzahl von Einzelfaktoren so zueinander in Beziehung setzen, dass mit einigen wenigen Merkmalen die einzelnen Stadien der Pflanzen charakterisiert werden können. Einen Versuch hierzu hat CHAMPAGNAT (1989) an Hand des Nucleotid-Metabolismus (ATPase-Aktivität und NTP-Synthese) unternommen. Dies ist aber bei keiner der nachfolgend publizierten Arbeiten aufgegriffen worden.

In dieser Arbeit wurde bei Prunus avium–Winterknospen das Fehlen jeglicher Kryotoleranz festgestellt. In der Literatur zur Kryokonservierung von Prunus avium kommt nur in vitro Material vor. SUZUKI (1993) verwendete Apices, die nach Vorbehandlung langsam kontrolliert eingefroren wurden. Ausgehend von 9 Sorten mit 132 Apices gelang es, 10 Apices zur Sprossbildung zu bringen, aber nur 1 Pflanze bis zur Akklimatisierung. Im Gegensatz zu diesem schlechten Ergebnis publizierten ROEPSTORFF et al. (1997) Folgendes: Die in vitro Sprossspitzen von Prunus jamasakura (1 Sorte), P. lannesiana (2 Sorten) und P. avium (5 Sorten) wurden erst vorbehandelt und nach Vitrifizierung mit PVS2 direkt eingefroren. Die Überlebensraten, nachgewiesen durch Sprossbildung nach vier Wochen, betrugen zwischen 40% und 93%. Alle sind weitergewachsen, konnten nach 4 Monaten bewurzelt und ins Gewächshaus gebracht werden. Es wurden keine Abnormalitäten beobachtet. Interessanterweise wurde die PVS2-Einwirkung (ohne Kryokonservierung) bis 90 Minuten ohne Wachstumsdepression vertragen. Bei längerer Einwirkung sank die Wachstumsrate bis 30% bei 150 Minuten. Auch die Gefrierschutzwirkung von PVS2 begann erst ab 45 Minuten und war optimal bei 90 und 105 Minuten, also der Einwirkungsdauer, bei der PVS2 ohne Kryokonservierung anfängt zu schädigen. Bei den eigenen Arbeiten der Autorin waren die untersuchten Wildbirnen schon nach 10 Minuten PVS2 –Einwirkung geschädigt. HELLIOT und DE BOUCAUD (1997) haben die Prunus-Unterlage Ferlenain nach Kältevorbehandlung und PVS2-Vitrifizierung mit der langsamen Kühlrate von 5°C/min eingefroren. Die PVS2-Einwirkungsdauer von 90 Minuten (länger wurde nicht getestet) war am besten. Die Wachstumsraten wurden nach 1 Monat ermittelt und lagen zwischen 5% und 60%. Es fehlen Angaben über den weiteren Kulturverlauf. Diese drei Publikationen zeigen, dass die Kryokonservierung von Prunus möglich ist. Aber im Vergleich zu Pyrus ist dies sehr wenig, obwohl die Bedeutung von Prunus in Obstbau und Holzindustrie viel größer ist als von Pyrus.

↓171

Es liegen keine Veröffentlichungen über die Kryokonservierung von Prunus-Winterknospen vor, was ein Indiz dafür sein könnte, dass diese als Ausgangsmaterial nicht geeignet sind. Die Ursache könnte in einer geringeren natürlichen Frosthärte als bei Pyrus pyraster und Sorbus torminalis liegen. SAKAI (1973) führt die unterschiedliche Forsthärte verschiedener Baumarten darauf zurück, dass sie in unterschiedlichem Maß (Ausmaß und Geschwindigkeit) extrazelluläres Wasser in dem Temperaturbereich 0° bis –10°C (teilweise bis –20°C) ausfrieren, was Voraussetzung für die Toleranz tieferer Temperaturen ist, die nur überlebt werden, wenn die Knospen ausreichend dehydriert sind.

Es stellt sich die Frage, was „ausreichend“ ist. SUZUKI et al. (1997) haben Winterknospen von Pyrus communis bis 41% dehydriert und zwischen 50% und 93% Anwachsraten erzielt. Bei stärkerer Dehydrierung verschlechterten sich die Anwachsraten. Bei 20% wuchsen noch 5%. NIINO er al. (1995) geben für Morus 39% Wassergehalt an. Die anderen Autoren machen keine Angaben.

Eine andere Möglichkeit, Temperaturen bis ca. –20 / -30°C zu überleben, ist durch Unterkühlungsmechanismen gegeben wie z.B. bei Malus (BURKE et al., 1976). Wenn dies die Winter-Strategie von Prunus wäre, wäre es notwendig, eine andere Vorgefriergeschwindigkeit und / oder –temperatur einzusetzen, um die Unterkühlung zu umgehen und stattdessen das Gefrieren des extrazellulären Wassers zu erreichen und die Knospen ausreichend zu dehydrieren. Wenn aber Prunus natürlicherweise wenig oder kein extrazelluläres Wasser ausfriert, kommt die Möglichkeit in Betracht, dass das Gewebe Dehydrierung gar nicht verträgt. Dann läge keine Kryo-Intoleranz vor, sondern Dehydrierungs-Intoleranz. Das würde erklären, warum die eingesetzte Kryokonservierungsstrategie, die auf Dehydrierung basiert, nicht gelang, aber die in der Literatur beschriebene Kryokonservierung von in vitro Material, basierend auf Vitrifizierung, erfolgreich war.

↓172

Trotz der beschriebenen, noch vorhandenen Probleme ist die Verwendung von Winterknospen für die Kryokonservierung von Bäumen als vorteilhaft anzusehen. Die Methode ist technisch so einfach und billig, wie es für die Praxis einer Genbank gefordert wird. Ein zusätzlicher Vorteil liegt darin, dass keine genetischen Veränderungen durch toxische Gefrierschutz-Additiva ausgelöst werden können. Es wäre wünschenswert, wenn die Methode optimiert würde. Ansätze dafür sind: Prüfen des Dehydrierungs-Zustands und Anpassung von Einfrier-Geschwindigkeit und End-Temperatur des Vorgefrierens. Prüfung des Einflusses der post cryo Behandlung, wie z.B. die Re-Hydrierung der Knospen in einer feuchten Kammer beim Auftauen.

Die Autorin hofft, dass diese Arbeit mehr Mut zur Kryokonservierung macht und dazu beiträgt, dass diese Methode auch in Deutschland verstärkt zur Erhaltung und Nutzung genetischer Ressourcen eingesetzt wird.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
08.11.2007