Kryokonservierung und in vitro Kultur von
Pyrus pyraster (L.) BURGSD. und Sorbus torminalis (L.) CRANTZ

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum horticulturarum (Dr. rer. hort.)

eingereicht an der Landwirtschaftlich-Gärtnerischen Fakultät

der Humboldt-Universität zu Berlin

von Dipl.-Ing. agr. Marianne Kadolsky

geboren am 20.12.1954 in Berlin

2005

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

Prof. Dr. Hans-Jürgen Prömel

in Vertretung

Dekan der Landwirtschaftlich-Gärtnerischen Fakultät
Prof. Dr. Dr. h. c. Uwe Jens Nagel

Gutachter:
1. Prof. Dr. Frank Pohlheim
2. PD Dr. Kurt Zoglauer
3. Dr. Andreas Meier-Dinkel

Tag der mündlichen Prüfung: 21. Juli 2006

Zusammenfassung

Die Erhaltung und Nutzung seltener, hochwertiger Baumarten ist in vielen Fällen nur mit Hilfe vegetativer Vermehrungsverfahren möglich. Zur langfristigen und sicheren ex situ Erhaltung ist die Kryokonservierung von vegetativem Pflanzenmaterial in flüssigem Stickstoff bei -196°C geeignet. Ziele der vorliegenden Arbeit waren, für die beiden in ihrem Bestand gefährdeten Baumarten Pyrus pyraster und Sorbus torminalis die in vitro Kultur zu optimieren, um eine kommerzielle Nutzung zu fördern, sowie Kryokonservierungsmethoden auf ihre Anwendbarkeit hin zu evaluieren. Mit Sorbus torminalis wurde Kryokonservierung erstmalig durchgeführt.

Von beiden Baumarten wurden in vitro Kulturen von ausgewählten Individuen etabliert. Als Explantatquellen dienten ruhende Winterknospen von ca. 10-jährigen Bäumen aus Nachkommenschaftsprüfungen oder von Pfropflingen alter Bäume (bis 200 Jahre) von Originalstandorten. Für die Optimierung der in vitro Kultur wurden neben Nährmedien-Screenings folgende Faktoren untersucht: der Einfluss des Kulturgefäßes (Honiggläser an Stelle der üblichen Weckgläser), die Schneidetechnik in der Vermehrungsphase (mono-nodiale Sprosssegmente versus Einzelsprosse), Temperaturabsenkung während der Bewurzelungsphase, Länge des Mikrostecklings für die Bewurzelung, der Pikiertermin.

Ein umfangreicher Versuch zum Einfluss des Reisererntetermins und der Reiserlagerung zeigte, dass der physiologische Zustand der Ausgangspflanzen ein entscheidender Faktor ist. Bei beiden Baumarten wurden je 3 Genotypen aus Nachkommenschaftsprüfungen dafür verwendet. Die Reiser mit den als Explantatquelle dienenden Winterknospen wurden an zwei aufeinanderfolgenden Jahren im November, Dezember, Januar, Februar und März jeweils zur Monatsmitte geerntet und sofort in die in vitro Kultur überführt. Außerdem wurden von jedem Erntetermin Reiser für 2 Monate bei +5°C gelagert und anschließend in die in vitro Kultur überführt. Bei Pyrus pyraster zeigte sich, dass alle Kennzahlen der in vitro Kultur durch den Erntetermin beeinflusst wurden: Etablierungsraten, Etablierungsdauer, Vermehrungs-koeffizienten und Akklimatisierungsraten. Diese Kulturkennzahlen wurden in einer Berechnung, bei der alle Erntetermine für den Zeitpunkt Null angenommen wurden, zueinander in Beziehung gesetzt. Daraus ergab sich die für die fiktive Produktion von 1000 Pflanzen benötigte Zeit und Anzahl Transfers. Die beste Variante mit der kürzesten Produktionszeit und wenigsten Transfers war der Erntetermin Anfang bis Mitte März in Kombination mit 2-monatiger Lagerung der Reiser.

Die in vitro Kultur von Sorbus torminalis wurde ebenfalls stark vom Reisererntetermin und der Reiserlagerung beeinflusst. Aber die Ergebnisse zwischen den Jahren differierten stark und waren nicht vergleichbar.

Versuche zur Kryokonservierung wurden mit in vitro Material und mit Winterknospen durchgeführt. Reiser mit Winterknospen wurden schrittweise auf -30°C heruntergekühlt und dann in Flüssigstickstoff überführt. Sie zeigten nach dem Auftauen bei Raumtemperatur Vitalitätsraten bis zu 100%, geprüft mit dem Triphenyl-Tetrazoliumchlorid-(TTC-)Test. Dieser Schnelltest zur Ermittlung der Vitalität nach dem Gefrieren stand in keiner Beziehung zum Sprossregenerationsvermögen der Explantate. Bei Sorbus torminalis war der TTC-Test nicht anwendbar, da vitales Gewebe nicht mit dem Farbstoff reagierte.

Der Einfluss des Reisererntetermins und der Reiserlagerung wurde in Kombination mit Kryokonservierung nach dem gleichen Versuchsplan wie oben beschrieben geprüft. Bei Pyrus pyraster erfolgte bei 5 Varianten Sprossregeneration. Die Reisererntetermine lagen zwischen November und Januar. Die Reiserlagerung wirkte positiv. Alle drei geprüften Klone wurden etabliert. Bei Sorbus torminalis führten 3 Varianten zu Sprossregeneration. Die Reisererntetermine waren Dezember ohne Reiserlagerung, sowie Januar sowohl mit als auch ohne Reiserlagerung. Es wurden 2 der 3 geprüften Klone etabliert. Dies ist die erste Beschreibung einer erfolgreichen Kryokonservierung von Sorbus torminalis.

Die Anwendung der beschriebenen Kryokonservierungsmethode von Winterknospen auf Prununs avium war negativ, obwohl die in vitro Kultur ohne Kryokonservierung zu jedem Erntetermin mit und ohne Reiserlagerung möglich war.

Eine Machbarkeitsstudie zur Kryokonservierung von in vitro Material beinhaltete die Methode der Einkapselung in Alginatkugeln und die Droplet-Technik. Bei Pyrus pyraster führte das Einkapseln von Apices in Alginatkugeln mit anschließender Trocknung auf 61% des Frischgewichts zum Absterben. Die gleiche Behandlung beeinträchtigte die Sprossbildung von Sorbus torminalis – Apices nicht, wenn sie mit 4-wöchiger Vorkultur bei +4°C kombiniert war. Die beste Trocknungsmethode für Alginatkugeln war über Silicagel. Sie wurde stark von der Größe und Form der Alginatkugeln beeinflusst und war daher schlecht reproduzierbar. Auf Grund dieser Ergebnisse wurde die Methode als ungeeignet eingestuft.

Ein Screening von Vorbehandlungsmethoden für die Droplet-Technik ergab für Pyrus pyraster Kombinationen von Vorbehandlungen, die keiner der bisher veröffentlichten Methoden entspricht. Bei folgendem Vorgehen wurden Vitalitätsraten zwischen 7 und 13% nach Kryokonservierung, geprüft mit 3 Klonen und nachgewiesen durch in vitro Sprossregeneration, ermittelt: Apices von Sprosskulturen als Startmaterial, 20 Stunden bei 0°C vorgekühlt, Vorinkubation (optional) für 20 Minuten in MS-Flüssigmedium mit 0,4 M Saccharose und 2,0 M Glycerin, Inkubation in PVS2-Vitrifizierungslösung für 5, bzw. 15 Minuten, Einfrieren in Flüssigstickstoff in einem Tropfen PVS2-Lösung auf einen Aluminiumstreifen. Auf Grund dieser Ergebnisse wurde die Droplet-Technik als praktikable Methode eingestuft.

Die Kennzahlen der in vitro Kulturen von Pyrus pyraster wurden nach Kryokonservierung mit denen ohne Kryokonservierung verglichen. Es wurden weder positive noch negative Einflüsse der Kryokonservierung festgestellt.

Ruhende Winterknospen von Pyrus pyraster und Sorbus torminalis haben sich als geeignetes Ausgangsmaterial für die in vitro Kultur und die Kryokonservierung in Kombination mit in vitro Kultur erwiesen. Der physiologische Status der Winterknospen, die Dormanz, ist je nach Zeitpunkt der Reiserernte verschieden. Ein Problem besteht in der Diskrepanz zwischen der Nutzung der tiefen Dormanz der Knospen und des damit verbundenen natürlichen Frostschutzes für die Kryokonservierung und der Vermeidung von zu tiefer Dormanz bei der Etablierung von in vitro Kulturen, weil sie das Wachstum in vitro stark behindern kann. Für die verschiedenen Anwendungszwecke geeignete Reisererntetermine wurden genannt. Die erreichten Kulturkennzahlen erlauben eine kommerzielle in vitro Vermehrung von Pyrus pyraster. Für die Kryokonservierung mit dem Ziel des Aufbaus einer Kryogenbank wurden für Pyrus pyraster die Möglichkeiten erweitert und für Sorbus torminalis die Grundlagen gelegt.

Abstract

In many cases the conservation and utilization of rare valuable tree species is only possible by methods of vegetative propagation. Cryopreservation in liquid nitrogen at -196°C is a suitable technique for the safe and long-term conservation ex situ of vegetative plant material. The aim of the study presented was to optimize the tissue culture protocol of the two endangered tree species Pyrus pyraster and Sorbus torminalis in order to promote commercial utilization. In a feasibility-study methods of cryopreservation were to be evaluated. For Sorbus torminalis cryopreservation was to be conducted for the first time.

In vitro cultures were successfully established of both tree species. Explants were taken from dormant winter buds of c. ten-year-old trees from progeny trials or from grafts of old trees (up to 200 years). Optimization of the protocol was achieved by screenings of media and by investigation of the following factors: type of culture vessel (honey jars instead of Weck-jars), cutting technique during the propagation phase (mononodial segments of shoots versus single shoots), temperature reduction during the rooting phase, length of microcutting for rooting, date of pricking.

An extensive experiment on the influence of the harvest date of twigs and their storage revealed that the physiological condition of the donor plants is an overall important factor. Twigs with winter buds which served as explants sources were harvested in two subsequent years in November, December, January, February and March in the middle of the month. They were taken into in vitro culture immediately after harvest and two months later once more after storage at +5°C. It was shown for Pyrus pyraster that all performance figures of in vitro culture were influenced by the harvest date: rates of establishing, duration of establishing, coefficient of multiplication, rate of acclimatization. These culture ratios were correlated in a calculation in which all harvest dates were reset to a date zero from which the period and the number of transfers was calculated that was needed to produce a fictitious quantity of 1000 plants. The best variant with the shortest period and the least number of transfers was the harvest date beginning to middle of March and two months storage of the twigs.

In vitro culture of Sorbus torminalis was also strongly influenced by harvest date and storage of twigs. However, the results between years differed and were not comparable.

Cryopreservation methods were evaluated by using in vitro material and winter buds. Twigs with winter buds were cooled down stepwise to -30°C prior to storage in liquid nitrogen. After rewarming at room temperature vitality was up to 100% as indicated by the triphenyl-tetrazoliumchloride- (TTC-) test. This quick test for the estimation of vitality after freezing showed no relation to the regeneration ability of the plants. In Sorbus torminalis the TTC-test was not applicable since vital controls did not react with the dye.

The influence of the harvest date of twigs and their storage, as described above, was investigated in combination with cryopreservation. In Pyrus pyraster five variants lead to proliferating shoot cultures, the harvest dates being November, December and January with a positive influence of the storage of the twigs. All three genotypes tested were established. In Sorbus torminalis three variants lead to proliferating shoot cultures, the harvest dates being December without storage of the twigs and January both with and without storage. Two of three tested genotypes were established. This is the first description of successful cryopreservation of Sorbus torminalis.

The application of the described cryopreservation method to Prunus avium failed while tissue culture without cryopreservation was successful at each harvest date with and without storage.

A feasibility study in cryopreservation of in vitro material entailed the method of encapsulation in alginate beads and the droplet technique. In Pyrus pyraster, encapsulation of apices in alginate beads followed by drying to 61% fresh weight lead to dying off. Sorbus torminalis shoots kept on proliferating when the treatment was combined with four weeks hardening at +4°C. The best drying methods for alginate beads was over silica gel, but proved to be strongly influenced by the size and shape of the beads and was therefore difficult to reproduce. Due to these results this method was considered unsuitable.

A screening of pre-treatment methods for the droplet technique resulted in a combination of pre-treatments for Pyrus pyraster. Vitality rates of 7 to 13% after cryopreservation were achieved by the following protocol: Apices of shoot cultures as starting material, precooled at 0°C for 20 hours, pre-incubated (optional) in MS liquid medium with 0,4 M sucrose and 2,0 M glycerine, incubated in PVS2-vitrification solution for 5 and 15 minutes, respectively, frozen in a droplet of PVS2-solution placed on a strip of aluminium that is plunged in liquid nitrogen. The method was considered suitable. This combination of treatments for Pyrus pyraster is published for the first time.

The in vitro culture ratios of Pyrus pyraster after cryopreservation were compared with those prior to cryopreservation. Neither positive nor negative influences of cryopreservation were found.

Dormant winter buds of Pyrus pyraster and Sorbus torminalis proved to be a suitable source of starting material for in vitro culture as well as for cryopreservation followed by in vitro culture. The physiological status of the winter buds, the dormancy, varies and depends on the harvest date of twigs. A problem remains in the discrepancy of the dormancy in buds being recognized as the major factor that impedes in vitro culture while at the same time dormant buds show a natural protection against frost damage which is needed for cryopreservation. Suitable harvest dates are given for the different purposes. Culture ratios were achieved that allow commercial in vitro culture as a means of conservation by utilization. For cryopreservation with the object of establishing a cryo-genebank the alternatives for Pyrus pyraster have been enlarged while for Sorbus torminalis a basis is provided.

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08.11.2007