MATERIAL UND METHODEN

Pflanzenmaterial

Das Pflanzenmaterial wurde, sofern nicht anders angegeben, von der Niedersächsischen Forstlichen Versuchsanstalt, Abteilung C Waldgenressourcen (NFV-C) in Escherode, zur Verfügung gestellt.

Pyrus pyraster Winterknospen

Als Explantatspender für Arbeiten mit ruhenden Winterknospen dienten selektierte, qualitativ hochwertige Einzelbäume aus 3 Nachkommenschaftsprüfungen (NKP) an folgenden Standorten:

Niedersächsisches Forstamt Oldendorf, Revierförsterei Dobbelstein, Abteilung 1067, Aktenzeichen 21.218.01. NKP mit 4 Halbgeschwisterfamilien aus Einzelbaumabsaaten von Plusbäumen aus Fürstenberg. 1987 ausgesät und 1989 gepflanzt. Es wurden 15 Bäume aus 4 Halbgeschwisterfamilien mit den Bezeichnungen 1067–1 bis 1067–15 verwendet.
Niedersächsisches Fortsamt Grohnde, Revierförsterei Ottenstein Süd, Abteilung 320, Aktenzeichen 21.218.06. NKP mit 10 Halbgeschwisterfamilien aus Einzelbaumabsaaten von Plusbäumen aus Fürstenberg, Trittau, Nonnenholz und der Schweiz. 1987 ausgesät und im Frühjahr 1989 gepflanzt. Es wurden 12 Bäume aus sieben Familien mit den Bezeichnungen 320-1 bis 320-12 verwendet.
Niedersächsisches Forstamt Bovenden, Revierförsterei Lenglern, Abteilung 95, Aktenzeichen 21.218.08. NKP mit 6 Halbgeschwisterfamilien aus Einzelbaumabsaaten von Plusbäumen aus Arenberg, Göttingen und Lappwald. 1989 ausgesät und 1992 gepflanzt. Es wurden 14 Bäume aus 5 Familien mit den Bezeichnungen 95-1 bis 95-14 verwendet.

Für die vorliegende Arbeit wurden die jeweils besten Einzelbäume aus den besten Familien ermittelt, wobei die ausschlaggebenden Kriterien die Wuchsleistung und die Stamm- und Kronenform waren. Es wurden einjährige Triebe mit ruhenden Winterknospen geerntet, sofort gebündelt, in gasdurchlässige Plastiktüten verpackt und bis zur Verwendung im Kühlraum bei +5°C eingelagert. Die beernteten Bäume wurden mit Farbbändern markiert, so dass bei Wiederholungen sichergestellt war, dass vom selben Baum geerntet wurde.

Ein weiterer Standort mit Bäumen, die als Explantatspender verwendet wurden, war das Wildbirnenklonarchiv mit dem Standort Niedersächsisches Forstamt Escherode, Revierförsterei Pfaffenstrauch, Abt. 70, Aktenzeichen 11.203.06. Es war als Randbepflanzung der Bergahorn-Pfropflingssamenplantage „Bergland über 400 m“ 1993 gepflanzt worden. Bei den Wildbirnen-Pfropflingen handelte es sich um Material von Originalbäumen aus norddeutschen Reliktvorkommen.

Eine Aufstellung der verwendeten Klonnummern und deren Zuordnung zeigt Tabelle 4.

Grüne Knospen von Pfropflingen

Für die Versuche zur Etablierung von grünen Knospen (im Gegensatz zu ruhenden Winterknospen) wurden Pfropflinge aus dem Freiland in Kalenderwoche (KW) 13 zum Antreiben in ein Folien-Gewächshaus gestellt. Die frischen Austriebe wurden nach 2 Wochen (in KW 15) und 14 Wochen (in KW 27) geerntet. Es wurden sowohl Sprossspitzen als auch ca. ½ cm lange Nodienstücke mit Achselknospen verwendet. Bei den Pfropflingen handelte es sich um Material von Originalbäumen aus norddeutschen Reliktvorkommen, aufgestellt in Containern (Tabelle 4).

NFA = Niedersächsisches Forstamt

SAFA = Sachsen-Anhaltinisches Forstamt

MVFA = Mecklenburg-Vorpommersches Forstamt

Wildbirnenklonarchiv, Standort Niedersächsisches Forstamt Escherode, Revierförsterei Pfaffenstrauch, Abt. 70, Aktenzeichen 11.203.06. Als Randbepflanzung der Bergahorn-Pfropflingssamenplantage „Bergland über 400 m“ 1993 gepflanzt.

Klonnummer

Herkunft, Alter des Mutterbaums

Anzahl Pfropflinge

Bov 0-1

NFA Bovenden, Alter unbekannt

1

Gött 80-20

NFA Göttingen, 61 Jahre

1

Gött 80-21

NFA Göttingen, 61 Jahre

1

Gött 80-22

NFA Göttingen, 81 Jahre

1

HanM 408-4

NFA Münden, 50 Jahre

1

HanM 409-9

NFA Münden, 90 Jahre

2

HanM 421-12

NFA Münden, 20 Jahre

2

HanM 422-13

NFA Münden, 80 Jahre

1

HanM 422-14

NFA Münden, 50 Jahre

1

HanM 427-21

NFA Münden, Alter unbekannt

1

HanM 431-16

NFA Münden, Alter unbekannt

1

Hard 176-1

NFA Winnefeld, 80 Jahre

2

Rein 0-2

NFA Reinhausen, 70 Jahre

2

Rein 0-4

NFA Reinhausen, 20 Jahre

1

Rein 0-5

NFA Reinhausen, 25 Jahre

3

STO 59-1

NFA Stadtoldendorf, 120 Jahre

1

STO 59-2

NFA Stadtoldendorf, 70 Jahre

5

Bäume im Container, gepfropft zwischen 1995 und 1998

Klonnummer

Herkunft, Alter des Mutterbaums

Anzahl Pfropflinge

AlfEi 4-6

NFA Grünenplan, 80 Jahre

1

AlfEi 10-21

NFA Grünenplan, 60 Jahre

1

Nord 7-18

NFA Nordsteimke, 30 Jahre

1

Steck 0-12

SAFA Lindau, 130 Jahre

1

Luc 0-3

MVFA Großen Luckow, 100 Jahre

1

Luc 0-5

MVFA Großen Luckow, 200 Jahre

1

Tab. 4 Pyrus pyraster-Pfropflinge von Originalbäumen aus norddeutschen Relikt-vorkommen

In vitro Kulturen

Es wurden bestehende in vitro Kulturen der NFV-C genutzt, um rasch mit den Versuchen beginnen zu können. Es handelte sich zum Teil um Klone mit sehr guter in vitro Eignung, wie z.B. dem Klon 59-2 (Abbildung 28 im Anhang) Außerdem wurden zwei Klone von externen Stellen zur Verfügung gestellt. Ihre Charakterisierung steht in Tabelle 5.

NFA = Niedersächsisches Forstamt

Rfö. = Revierförsterei

StFoA = Stadtforstamt

HLFWW = Hessische Landesanstalt für Waldeinrichtung und Waldnutzung

Klonnummer

Etablierung in vitro

Herkunft, Alter des Mutterbaums

zur Verfügung gestellt von

Rein 0-5

(Kurzform: 5)

1996

NFA Reinhausen, Rfö. Groß Schneen, 25 Jahre

NFV-C

Hard 176-1

(Kurzform: 176-1)

1996

NFA Hardegsen, Rfö. Leisenrode,

80 Jahre

NFV-C

HanM 439-28

(Kurzform: 439-28)

1991

StFoA Münden, Rfö. Hedemünden,

80 Jahre

NFV-C

Sto 59-2

(Kurzform: 59-2)

1991

NFA Stadtoldendorf, Rfö. Heidbrink, 70 Jahre

NFV-C

PER 54

(nicht bekannt; vor 1998)

Istituto Sperimentale per la Frutticoltura, Ciampino, Italien,

18 Jahre

Prof. Dr. Carmine Damiano, Ciampino

B 414

(nicht bekannt; vor 1998)

Hessisches Forstamt Reichensachsen, Rfö Sontra Fort Jakobsgraben

(Alter nicht bekannt)

Dr. Karl Gebhardt, HLFWW

Tab. 5 In vitro Kulturen von Pyrus pyraster

Sorbus torminalis Winterknospen

Als Explantatspender für Arbeiten mit ruhenden Winterknospen dienten selektierte, qualitativ hochwertige Einzelbäume aus einer Nachkommenschaftsprüfung (NKP). Diese bestand aus 69 Halbgeschwisterfamilien aus Einzelbaumabsaaten von Plusbäumen der 9 Herkünfte Göttingen, Lutter, Sailershausen, Schweinfurt, Würzburg, Bar-le-Luc / Frankreich, Luxemburg, Österreich und Tschechoslowakei. Diese waren 1976 ausgesät und im Herbst 1979 auf drei verschiedenen Standorten ausgepflanzt worden. Einer dieser Standorte war Freiburg und stand auf Grund der weiten Entfernung nicht zur Verfügung. Die beiden anderen Standorte waren:

NFA Lutter, Rfö. Haarwald, Abt. 77, Aktenzeichen 22.214.01. Für die vorliegende Arbeit wurden aus zehn Halbgeschwisterfamilien 20 Einzelbäume selektiert. Sie erhielten die Klonnummern 1077–1 bis 1077-20.
2. NFA Grohnde, Rfö. Wilmeröderberg, Abt. 126, Aktenzeichen 22.214.02. Es wurden 3 Einzelbäume selektiert. Sie erhielten die Klonnummern 126-1 bis 126-3.

In vitro Kulturen

Es wurden bestehende in vitro Kulturen der NFV-C genutzt, um, wie bei Pyrus pyraster, rasch mit den Versuchen beginnen zu können. Diese sind in der folgenden Tabelle 6 charakterisiert.

Abkürzung: NFA = Niedersächsisches Forstamt

Klonnummer

Etablierung in vitro

Herkunft, Alter des Mutterbaums

85, 98, 121, 163

1992

Saatgut zweier frei abgeblühter Plusbäume aus Thüringen, Revier Oberndorf, Oberförsterei Arnstadt, Abt. 4504 b ², Naturschutzgebiet „Der Hain“.

18/2

1992

Stockausschlag von einem der oben genannten Bäume.

76, 146, 283

243

1995

1996

vierjährige Sämlinge aus der Lohnanzucht des NFA Liebenburg bei Firma Rathe

Tab. 6 In vitro Kulturen von Sorbus torminalis

Prunus avium

Winterknospen

Als Explantatspender wurden drei Bäume aus drei Familien aus der Einzelbaumnachkommenschaftsprüfung Gatersleben ausgewählt, die als Pfropflinge von 1991 im Kamp der NFV-C, Fläche 16, standen. Die Bäume sind wie folgt beschrieben:

Baum Nr. 247-4

Familie Heteborn 16. Ursprungsort des Auslesebaumes ist Revier Heteborn, Forstamt Ballenstedt.

Baum Nr. 247-24

Familie Heteborn 3. Ursprungsort des Auslesebaumes wie 247-4.

Baum Nr. 247-28

Familie Altenweddigen IX/48. Herkunftsort des Zuchtbaumes: Altenweddigen bei Magdeburg, Sämlingsplantage holländischer Herkunft eines Saatzuchtbetriebes.

Reisererntetermin und Reiserlagerung

In zwei aufeinander folgenden Wintern (zwei Serien) wurde der Einfluss von Reisererntetermin und Reiserlagerung untersucht. Modellhaft wurde in Serie 1 Prunus avium mitbearbeitet.

Die Reiser wurden in monatlichen Abständen (jeweils zur Monatsmitte) von jeweils denselben Bäumen geerntet. In Serie 1 (Winter 1999/2000) erfolgte dies von Dezember bis März. Auf Grund der Ergebnisse der 1. Serie wurde in der 2. Serie (Winter 2000/2001) von November bis März geerntet.

Um Variationen, die auf die Position der Zweige am Baum zurückzuführen sein könnten, zu vermeiden, hätten die Reiser alle aus demselben Bereich der Krone geschnitten werden müssen. Die Baumkronen waren allerdings dafür zu klein. Stattdessen wurden an jedem Termin Reiser aus verschiedenen Bereichen der Krone entnommen und anschließend gemischt auf die verschiedenen Behandlungsvarianten verteilt.

Alle Reiser jedes Erntetermins wurden für die in vitro Kultur präpariert, vorher jedoch 4 Behandlungsvarianten unterzogen, von denen jede mit 20 Knospen durchgeführt wurde: Ein Viertel wurde sofort präpariert. Ein Viertel wurde sofort der Kryokonservierung zugeführt. Zwei Viertel wurden für zwei Monate bei +5°C gelagert. Nach der Lagerung wurde das eine Viertel direkt präpariert und das letzte Viertel kryokonserviert. Es waren daher in diesem Versuchsschema folgende 8 Variable von Einfluss:

Baumart
Genotyp
Erntejahr
Erntemonat
ohne Lagerung ohne Kryokonservierung
ohne Lagerung mit Kryokonservierung
mit Lagerung ohne Kryokonservierung
mit Lagerung mit Kryokonservierung.

Es wurden folgendes Material verwendet:

Pyrus pyraster: Drei Bäume mit den Bezeichnungen 95-1, 95-12 und 95-14 (Standort Bovenden, siehe oben, Punkt 2.1.1.).

Sorbus torminalis: Drei Bäume mit den Bezeichnungen 126-1, 126-2 und 126-3 (Standort Grohnde, siehe oben, Punkt 2.1.2.).

Prunus avium: Drei Bäume mit der Bezeichnung 247-4, 247-24 und 247-28 (Standort NFV-C, siehe oben, Punkt 2.1.3.).

Kulturgefäße

Als Kulturgefäße wurden den Explantatgrößen entsprechend entweder Glaspetrischalen (100 x 20 mm) oder 250 ml – Weckgläser (Rillengläser der Fa. Weck) mit Zellstoffringen (Paramoll, Durchmesser 260/200 mm, 2 mm stark, Fa. Mauck) zwischen Glasunterteil und Glasdeckel verwendet. Alle Gefäße wurden nach der Reinigung an der Luft getrocknet und dann in Aluminium-Büchsen verpackt im Trockensterilisator bei 200°C für 6 Stunden sterilisiert. Bis zur Verwendung blieben sie zum Schutz vor Verunreinigung in den Aluminium-Büchsen.

In der Vermehrungsphase fanden neben den og. Weckgläsern auch 380 ml - Honiggläser der Firma Meli, Belgien, Verwendung. Wegen ihres Kunststoffdeckels (opak) wurden sie im Autoklav sterilisiert.

Pro Kulturgefäß wurden ca. 40 ml Medium (Petrischalen), ca. 80 ml (Weckgläser), bzw. ca. 50 ml (Honiggläser) ausgegossen. Nach Einsetzen der Explantate wurden Petrischalen und Rillengläser nicht, wie häufig üblich, mit Parafilm abgedichtet. Die Deckel wurden mit zwei kurzen Klebestreifen (Tesafilm) fixiert, so dass der Gasaustausch so wenig wie möglich behindert wurde. Die Schraubdeckel der Honiggläser wurden nicht zusätzlich fixiert.

Kulturführung Kulturräume

Der Standard-Kulturraum war für alle Phasen der in vitro Kultur gleich. Beleuchtet wurde mit Philips TLD 36W/84 Leuchtstoffröhren im 16 / 8 h Tag-Nacht-Rhythmus. Die übliche Beleuchtungsstärke lag bei 60 – 80 μEm^-2s^-1. Die Temperatur betrug 24° / 18°C (± 1°C) im Tag-Nacht-Rhythmus. Die nicht geregelte Luftfeuchtigkeit betrug ca. 30 bis 60 % r. F., wobei die höheren Werte überwiegend im Sommer auftraten.

Außer dem Standard-Kulturraum wurden Licht-Thermostat-Schränke der Firma Rubarth eingesetzt. Die Beleuchtung erfolgte mit Osram L 36W/11 Leuchtstoffröhren und einer Beleuchtungsstärke von 9 – 13 µEm^-2s^-1 in Höhe der Sprosskulturen. Die Beleuchtungsdauer und Temperatur wird bei den entsprechenden Versuchen beschrieben.

Für Zwischenlagerung und Langzeitlagerung der in vitro Kulturen ebenso wie für die Lagerung der Reiser vor der in vitro Kultur wurde der Kühlraum benutzt. Dieser war wie der Kulturraum mit Philips TLD 36W/84 Leuchtstoffröhren ausgestattet und wurde im 12 / 12 h Tag-Nacht-Rhythmus mit 0,6 µEm^-2s^-1 beleuchtet. Die Temperatur betrug 5°C (± 1°C) konstant.

Gewächshaus

Pikierte Pflanzen wurden standardmäßig in einem Glas-Gewächshaus, das ausschließlich für diesen Zweck genutzt wurde, unter einem Folientunnel an Substrat gewöhnt. Der Tisch war mit Filzmatten ausgelegt, die immer feucht gehalten wurden und so für eine hohe Luftfeuchtigkeit im Tunnel sorgten. Das Temperaturminimum war auf 18°C eingestellt. Darüber hinaus war die Temperatur von den Wetterbedingungen abhängig. Bei starker Sonneneinstrahlung wurden im Folientunnel trotz Schattierung bis zu 40°C erreicht. Das Bewässern der Pflanzen erfolgte von Hand. Bis zum Topfen wurde nicht gedüngt. Als Pflanzenschutzmaßnahme wurden bei Auftreten von Botrytis die Fungizide Rovral und Ronilan im Wechsel gespritzt.

Handhabung der in vitro Kulturen Oberflächensterilisation

Prinzipiell wurde vor der Präparation der Winterknospen folgendermaßen vorgegangen:

Gründliches Spülen und Bürsten der Reiser unter fließendem Leitungswasser.
Schneiden der Reiser jeweils direkt oberhalb einer Knospe und ca. 1 cm unterhalb einer Knospe.

Die gereinigten Reiserstücke wurden in folgenden Lösungen sterilisiert:

Methode 1:

vergälltes Ethanol (EtOH, 70% v/v)
verdünntes Natriumhypochlorit (NaOCl) mit einigen Tropfen Tween 20 (Laurylsorbitan-polyethylen-glycolether)
steriles Leitungswasser, dreimal je 5 Minuten.

Die Dauer der Einwirkung von EtOH (zwischen 0,5 und 2 Minuten) und NaOCl (zwischen 5 und 20 Minuten) wurde variiert, sowie die Konzentration von NaOCl (zwischen 1% und 10% aktives Chlor). In einigen Versuchen wurde eine Nachbehandlung mit Ascorbinsäurelösung (100 mg/l) für 30 Minuten durchgeführt mit dem Ziel, Verbräunungen mit Hilfe dieses Antioxidationsmittels zu vermindern.

Für Prunus avium wurden standardmäßig folgende Zeiten und Konzentrationen eingesetzt:

1 Minute 70% EtOH, 20 Minuten 5% NaOCl

Für die Austriebe der Pfropflinge von Pyrus pyraster wurde die NaOCl-Lösung 1%ig für 10 Minuten angewendet.

Methode 2 (Modifikation der Methode 1 nach GEBHARDT, persönl. Mitteilung):

Ascorbinsäurelösung 0,1% (unsteril; mit einigen Tropfen Tween 20) für 5 – 10 Minuten
NaOCl (mit einigen Tropfen Tween 20)
steriles Leitungswasser, zweimal für je 5 Minuten
EtOH (70% v/v) mit 0,1% Ascorbinsäure für 2 Minuten

Für Elsbeere wurde NaOCl 10%ig für 15 Minuten verwendet.

Für Wildbirne wurde NaOCl 1,5%ig für 10 Minuten verwendet.

Dies war der Standard für alle Versuche zum Einfluss des Reisererntetermins und der Reiserlagerung.

Präparation der Explantate Ausgangsmaterial: Winterknospen

Nach der Oberflächensterilisation wurden die Knospenschuppen entfernt, die Apices in einer Größe von ca. 2 mm keilförmig aus dem Zweig herausgeschnitten und auf Etablierungsmedien in Petrischalen gesetzt. Diese Präparation erfolgte unter einem Stereomikroskop mit 16facher Vergrößerung. Am Tag nach der Präparation wurden die Apices innerhalb derselben Petrischale umgesetzt, um sie von eventuell aus der Schnittstelle ins Medium diffundierten oxidierten Phenolen, die das weitere Wachstum behindern würden, zu entfernen. Wenn Verbräunungen im Medium sichtbar wurden, wurde eine Woche nach Präparation erneut umgesetzt. Ca. 6 Wochen nach Präparation der Apices waren häufig bereits die Blätter entfaltet und der Spross begann zu wachsen (Abb. 29 im Anhang).

Ausgangsmaterial: Grüne Knospen von Pfropflingen

Die Sprossachsen wurden in ca. ½ cm lange Nodienstücke mit Achselknospen geschnitten. Die Sprossspitzen, deren größere Blätter entfernt wurden, wurden ebenfalls in einer Länge von ca. ½ cm verwendet.

Ausgangsmaterial: in vitro Sprosskulturen

Standardmäßig wurden die Einzelsprosse, die aus multipler Sprossbildung an der Basis entstanden und zu Büscheln heranwuchsen, abgetrennt und als Explantate verwendet.

In einem Versuch wurde geprüft, ob das sonst bei der Vermehrung von Baumarten unübliche Zerschneiden von Einzelsprossen in mononodiale Segmente, die so klein sind, dass sie jeweils nur eine Axillarknospe tragen (Segmentlänge ca. 2 – 3 mm), zu höheren Vermehrungsraten führt. Durch diese Segmentierung wird der Einfluss der apikalen Dominanz aufgehoben und das Austreiben jeder einzelnen Achselknospe ermöglicht.

Für diesen Versuch wurden folgende 6 Elsbeeren-Klone der zur Verfügung gestellten in vitro Sprosskulturen verwendet: 76, 85, 146, 163, 243 und 283.

Nährmedien

Herstellung

Folgende Bestandteile für die in vitro Kulturmedien wurden als Stammlösungen mit entsprechend hoher Konzentration angesetzt und in Aliquots verwendet: Makro- und Mikroelemente, Eisen, organische Zusatzstoffe (Vitamine), Auxine, Cytokinine und Gibberellinsäure. Die Lagerung erfolgte im Kühlschrank bei + 8°C.

Mengenangaben in mg/l.

MS nach MURASHIGE und SKOOG (1962); WPM nach LLOYD und McCOWN (1981); Jacquiot nach JACQUIOT (1959).

Substanz

Chemische Formel

MS

MS 1/3

WPM

Jacquiot

Nährsalze

Ammoniumnitrat

NH₄NO₃

1650

550

400

1650

Borsäure

H₃BO₃

6,2

2,1

6,2

6,2

Calciumchlorid

CaCl₂. 2H₂O

440

147

96

440

Calciumnitrat

Ca(NO₃)2 . 4H₂O

556

Kaliumjodid

KJ

0,83

0,28

0,83

Kaliumnitrat

KNO₃

1900

633

1900

Kaliumphosphat

KH₂PO₄

170

56,7

170

170

Kaliumsulphat

K₂SO₄

990

Kobaltchlorid

CoCl₂ . 6 H₂O

0,025

0,008

0,025

Kupfersulfat

CuSO₄ . 5 H₂O

0,025

0,008

0,025

0,025

Magnesiumsulfat

MgSO₄ . 7 H₂O

370

123,3

370

370

Mangansulfat

MnSO₄ . 4 H₂O

16,9

5,83

22,3

16,9

Natriummolybdat

Na₂MoO₄ . 2 H₂O

0,25

0,08

0,025

0,25

Zinksulfat

ZnSO₄ . 7 H₂O

8,6

2,87

8,6

8,6

Eisensulfat

FeSO₄ . 7 H₂O

27,8

9,27

27,8

27,8

Natrium-EDTA

Na₂-EDTA

37,3

12,4

37,3

37,3

Vitamine und

N-Quellen

L-Glutamin

750

750

750

L-Glycin

2,0

2,0

2,0

2,0

myo-Inositol

100

100

100

50

Nikotinsäure

0,5

0,5

0,5

1,0

Pyridoxin-HCl

0,5

0,5

0,5

Thiamin-HCl

0,4

0,4

1,0

1,0

Calcium-Panthothenat

0,5

Biotin

0,1

Folsäure

0,01

p-Amino-benzoesäure

1,0

Riboflavin

0,1

Saccharose

30000

30000

30000

30000

Agar

(Oxoidagar No.1)

7000

7000

7000

7000

Tab. 7 Zusammensetzung der Basalmedien: Nährsalze, Vitamine und Stickstoff-
Quellen.

Der pH-Wert des Nährmediums wurde standardmäßig vor Zugabe des Agars mit Natronlauge (NaOH), bzw. Salzsäure (HCl) der Konzentrationen 1, 0,1 , oder 0,01 N auf 5,7 eingestellt. Als Agar wurde, sofern nichts anderes angegeben ist, der Oxoidagar No. 1 mit 7 g / l verwendet. Für einige Bewurzelungsmedien wurde Agar der Firma Roth oder CERO-Agar eingesetzt. Die vorbereiteten Medien wurden in 1000 ml Rundkolben bei 121°C und 110 kPa für 15 Minuten im Autoklaven (Marke Varioclav Typ 400) sterilisiert und nach dem Abkühlen auf ca. 60°C in der sterilen Werkbank in sterile Gefäße gegossen. Wenn Gibberellinsäure filtersterilisiert zugesetzt wurde, erfolgte dies unmittelbar vor dem Ausgießen in die sterilen Gefäße. Alle Stammlösungen und Nährmedien wurden mit Reinstwasser aus einer NANOpure-Anlage (Fa. Barnstead) hergestellt.

Zusammensetzung der Basalmedien

Die Basalmedien sind in Tabelle 7 zusammengefasst.

Etablierungs- und Vermehrungsmedien für Pyrus pyraster

Es wurden die Medien in die Versuche einbezogen, die sich bei anderen Autoren bereits bewährt hatten (MEIER-DINKEL, 1986; GEBHARDT et al., 1996; GEBHARDT und MEIER-DINKEL, 1998). Es handelte sich um MS-Medien mit den Bezeichnungen 2/8 und 87/29 mit jeweils hohem, bzw. niedrigem BAP-Gehalt, sowie das Medium 87/37, das MS-Salze in erniedrigter Konzentration enthielt, einen mittleren BAP-Gehalt, sowie niedrige Gehalte an IBA und GA₃aufwies. Dieses Medium wurde außerdem in einer Variante mit Zusatz von 100 mg/l Ascorbinsäure verwendet (Bezeichnung: 87/37 A) (Tabelle 8).

Für die Vermehrungsphase wurde in der Literatur das Medium 87/39 als geeignet ausgewiesen (GEBHARDT et al., 1996; GEBHARDT und MEIER-DINKEL, 1998). Zusätzlich wurden die in Tabelle 8 angegebenen Varianten verwendet.

* Zusatz von 100 mg/l Ascorbinsäure
Bezeichnung

Basalmedium

BAP

IBA

GA ₃

Verwendung

2/8

MS

1,0

Etablierung

87/29

MS

0,2

Etablierung

87/37

MS 2/3

0,5

0,1

0,1

Etablierung

87/37 A*

MS 2/3

0,5

0,1

0,1

Etablierung

87/6

MS

1,0

0,1

0,1

Vermehrung

87/27

MS

0,5

0,1

0,1

Vermehrung

87/39

MS

0,5

0,3

Vermehrung

8/52

WPM

0,5

0,3

Vermehrung

Tab. 8 Zusammensetzung der Nährmedien für Pyrus pyraster: Basalmedien,
Wachstumsregulatoren und Verwendungszweck
Mengenangaben in mg/l

Etablierungs- und Vermehrungsmedien für Sorbus torminalis

Die Medien mit den Bezeichnungen 2/12 und 87/39 wurden von der NFV-C zur Verfügung gestellt. Sie wurden mit dem Medium mit der Bezeichnung 2/11 verglichen, das sich bei einer anderen Sorbus-Art, dem Speierling (Sorbus domestica L.) als geeignet erwiesen hatte (MEIER-DINKEL, 1998). Auf Grund einer persönlichen Mitteilung von Frau Dr. I. BALLA, Budapest, (1999) wurde das Medium 2/11 dahingehend variiert, dass an Stelle der MS-Vitamine die Vitamine nach JACQUIOT (1959) verwendet wurden (Medium-Bezeichnung: 2/22). Alle Medien enthielten MS-Salze in voller Konzentration. In welchen Komponenten sich die Medien unterschieden, veranschaulicht Tabelle 9.

Bezeichnung

Basalmedium

BAP

IBA

GA ₃

Verwendung

2/12

MS

0,1

0,05

Etablierung

87/39

MS

0,5

0,3

Etablierung

2/11

MS

0,5

0,05

Etablierung

2/22

Jacquiot

0,5

0,05

Etablierung

2/5

MS

0,3

0,05

Vermehrung

87/29

MS

0,2

Vermehrung

Tab. 9 Zusammensetzung der Nährmedien für Sorbus torminalis: Basalmedien,
Wachstumsregulatoren und Verwendungszweck
Mengenangaben in mg/l

Bewurzelungsmedien

Für die Versuche zur Bewurzelung wurden für Pyrus pyraster und Sorbus torminalis die Medien getestet, die in Tabelle 10 dargestellt sind. Es wurden nur solche Mikrostecklinge für die Bewurzelung verwendet, die eine Mindestlänge von ca. 1 cm und keinerlei Deformationen, Hyperhydrizität oder sonstige Beeinträchtigung der Vitalität aufwiesen. Die unteren Blätter wurden entfernt.

In allen Bewurzelungsmedien wurden die MS-Makro-Elemente auf 1/3 reduziert. Die Mikro-elemente wurden in voller Konzentration zugefügt. Ausnahmen hiervon sind die mit * gekennzeichneten Medien 87/03 und 88/09: Sie enthalten MS-Makro- und Mikroelemente in 1/3 Konzentration (Basalmedium MS 1/3).

Bezeichnung

Wachstumsregulatoren [mg/l]

Graphit [g/l]

Agar

IBA

NAA

87/03 *

1,0

Oxoid No.1

88/09 *

0,5

Oxoid No.1

90/05

1,0

4

CERO Agar

90/06

1,0

Roth Agar

90/07

0,1

Roth Agar

90/08

1,0

CERO Agar

90/09

0,5

0,5

4

CERO Agar

Tab. 10 Bewurzelungsmedien für Pyrus pyraster und Sorbus torminalis

Akklimatisierung und weitere Kultur

Vier Wochen nach dem Aufsetzen auf Bewurzelungsmedium wurde die Bewurzelung bonitiert. Beispiele für das Aussehen der Pflanzen unmittelbar vor dem Pikieren sind auf den Abbildungen 30 und 31 im Anhang zu sehen. Alle vitalen Pflanzen wurden - unabhängig von der Bewurzelung - pikiert. Das für das Pikieren standardmäßig verwendete Substrat wurde aus Pikiererde und Containersubstrat, beide von der Firma Stender, zu gleichen Teilen gemischt und mit 5 % (v/v) Perlite versetzt.

Die Akklimatisierung erfolgte unter einem Folientunnel. Dort verblieben die Pflanzen so lange, bis sich neue Blätter bildeten. Dann wurden die Pflanzen an niedrigere Luftfeuchtigkeit gewöhnt, indem die Folie des Tunnels an einer Seite zunächst für kurze Zeit, dann nach und nach länger, geöffnet und hochgesteckt wurde. Dieser Abhärtungsprozess war nach ca. 5 – 8 Tagen beendet und die Pflanzen verblieben bis zum Topfen ohne Folientunnel im Gewächshaus.

Nach ca. zwei Monaten wurden alle angewachsenen Pflanzen, die keine sichtbaren Mängel aufwiesen, in Containersubstrat getopft (Abbildung 32 im Anhang). Sie verblieben im Gewächshaus, bis sie eine Mindestgröße von 10 cm erreicht hatten. Später wurden sie in größeren Containern im Freiland weiterkultiviert (Abbildung 33 im Anhang).

Bonituren, Berechnungen und Definitionen

Eine visuelle Bonitur, die schriftlich festgehalten wurde, erfolgte am Ende jeder Subkultur, bei akklimatisierten Pflanzen vor dem Topfen. Es wurde die Qualität festgehalten und der Zuwachs bewertet. Der Begriff „etabliert“ wurde ausschließlich auf solche Explantate angewendet, die Wachstum und Vermehrung zeigten. Explantate, wie sie vor allem bei Elsbeere auftraten, die nur die Blätter entfalteten aber dann im Rosettenstadium verharrten, galten nicht als etabliert. Maßgebliche Kriterien zur Bewertung der Pflanzenqualität waren Form, Farbe und Gesamtzustand im Hinblick auf die weitere Verwendung. Im Einzelnen wurde folgende Merkmale bonitiert:

Sprossachse: gerade, grün, nicht übermäßig elongiert oder gestaucht, gekrümmt, deformiert oder abgestorben, keine Anzeichen von Hyperhydrizität
Blätter: entfaltet, grün, nicht gekräuselt, deformiert, gelb oder braun, keine Anzeichen von Hyperhydrizität
Wurzeln: Farbe, Anzahl, Länge, Durchmesser.

Bei allen in vitro Arbeiten wurde die Anzahl eingesetzter, verwendbarer, kontaminierter und abgestorbener Explantate pro Gefäß notiert. Daraus wurden die Etablierungs-, Kontaminations- und Bewurzelungsraten berechnet. Alle Angaben beziehen sich, sofern nicht anders angegeben, auf die Anzahl eingesetzter Explantate. Der Vermehrungskoeffizient ist das Produkt des Anteils Explantate, welche Achselsprosse bilden, und der durchschnittlichen Anzahl neuer Segmente pro Explantat (DUHOUX und DAVIES, 1985; MARTINEZ PULIDO et al., 1990).

Transfer bedeutet Umsetzen der Explantate von einem Kulturgefäß in ein anderes mit frischem Medium. Wenn die Etablierungsphase beendet war, wurden die Explantate dabei in Teile zerschnitten, normalerweise Sprossspitzen und Sprosssegmente. Während der Etablierungsphase zeigten die Explantate oft kein Wachstum oder ein so geringes, dass sie ohne Teilung auf frisches Medium umgesetzt werden mussten. Der erste Transfer mit Teilung kennzeichnete somit das Ende der Etablierungsphase und den Beginn der Vermehrungsphase.

Subkulturen: Die Dauer einer Subkultur betrug in der Regel 4 Wochen. Danach erfolgte der Transfer auf frisches Nährmedium.

Für die Bewertung der Akklimatisierung war die Pflanzenqualität besonders wichtig. Schwach wachsende Pflanzen oder solche mit Deformationen wurden verworfen und gingen daher nicht als „akklimatisiert“ in die Berechnungen ein. Die Akklimatisierung galt als abgeschlossen, wenn die Pflanzen einen Wurzelballen gebildet hatten und getopft wurden.

KRYOKONSERVIERUNG Technische Ausstattung Gefäße für Pflanzenproben

Pflanzenproben wurden in folgenden Kryo-Gefäßen eingefroren:

Kryoboxen der Fa. Greiner, Größe 13 x 13 x 3 cm (Abbildung 34 im Anhang)
Zentrifugenröhrchen, 50 ml
Kryo-Röhrchen mit 2, bzw. 5 ml Volumen

Flüssigstickstoff-Lagercontainer

Die im Folgenden kurz „Lagercontainer“ genannten Gefäße für die Lagerung der Pflanzenproben im Flüssigstickstoff standen in verschiedenen Größen zur Verfügung:

Typen: 4800 RS, 35 HC und 25 LD.

Hersteller: Harsco, Taylor-Whaton Cryogenics, Theodore, Alabama, USA.

Gefrierkammern

Für das stufenweise Einfrieren wurden die Saatgut-Gefrierkammern der NFV-C genutzt. Jeder dieser der Lagerung von forstlichem Saatgut dienenden Räume hatte eine fest eingestellte Temperatur. Die Proben mussten daher nur von einer Kammer zur nächsten gebracht werden, um die nächst niedrigere Temperaturstufe zu erreichen. Es wurden die Kammern mit den Temperaturen –5°, -10°, -20° und –30°C benutzt. Die Temperaturschwankungen lagen bei den drei erstgenannten bei ca. ± 1°C, während bei der letztgenannten ein Ansteigen der Temperatur bis –27°C gelegentlich beobachtet wurde.

Explantatquellen und Erntetermine Explantatquellen und Erntetermine für die Versuche „Einfluss der Geschwindigkeit von Gefrieren und Auftauen“ und „Einfluss von Genotyp und Individuum“ Winterknospen von Pyrus pyraster

Reiser von den am Standort Oldendorf selektierten Explantatspenderbäumen (Bezeichnung 1067-1 bis 1067-15). Ende September 1998 geerntet und verwendet (Beschreibung siehe Kapitel 2.1.1.).
Reiser von 3-jährigen Pfropflingen im Container. Anfang Februar 1999 geerntet und verwendet (Beschreibung siehe Kapitel 2.1.1.).
Reiser von 8-jährigen Pfropflingen des Wildbirnenklonarchivs. Ende Februar 1999 geerntet und verwendet (Beschreibung siehe Kapitel 2.1.1.).

Winterknospen von Sorbus torminalis

Reiser von selektierten Einzelbäumen des Standortes Lutter / Haarwald mit den Bezeichnungen 1077-7 bis 1077-10 (Beschreibung siehe Kapitel 2.1.2.). Anfang Februar 1999 geerntet, im Kühlraum bei 5°C gelagert und nach 4 ½ Monaten verwendet. Die Lagerung geschah aus organisatorischen Gründen.

Winterknospen für den Versuch „Einfluss von Reisererntetermin und Reiserlagerung“

Es wurde das gleiche Material wie für die unter 2.1.4. beschriebenen Versuche verwendet. Die Versuche für die in vitro Kultur nach Kryokonservierung wurden parallel mit den Versuchen zur in vitro Kultur ohne Kryokonservierung durchgeführt. Daher waren Explantatquellen, Reisererntetermine und Lagerung der Reiser gleich. Das Einfrieren der Knospen erfolgte in den Varianten „ohne Lagerung“ unmittelbar nach der Ernte und in den Varianten „mit Lagerung“ nach zweimonatiger Lagerung der Reiser bei 5°C im Kühlraum.

In vitro Kulturen

Als Explantate aus in vitro Sprosskulturen für die Versuche zur Kryokonservierung wurden Sprossspitzen, ausgetriebene Achselknospen, sowie Apices verwendet. Für die Gewinnung der Apices wurde unter dem Stereomikroskop der Wachstumskegel zusammen mit den ersten zwei bis drei Blattanlagen in einer Größe von ca. 1 mm präpariert und sofort auf, bzw. in die betreffenden Nährmedien verbracht.

Vitalitätstests

Bei den Versuchen zur Etablierung der Methode wurden unter Bezugnahme auf SAKAI (1960), OKA et al. (1991) und SUZUKI et al. (1997) die Einflüsse des schrittweisen Vorkühlens und der Temperatur des Auftauens geprüft. Die Beurteilung erfolgte bei Pyrus pyraster mit dem TTC-Test, bei Sorbus torminalis durch Prüfung der in vitro Sprossregeneration.

TTC-Test

Eine Prüfung der Vitalität erfolgte mittels TTC- (Tetrazoliumchlorid-) Test (TOWILL und MAZUR, 1974). Das hierfür verwendete 2,3,5-Triphenyl-tetrazolium-chlorid wird von dem Enzym Dehydrogenase, das nur in intakten Zellen aktiv ist, zu einer roten Formazanverbindung reduziert. Diese kann, je nach Objekt, photometrisch quantitativ erfasst werden (Absorptionswellenlänge 485 nm), oder, wie im vorliegenden Fall, visuell unter dem Stereomikroskop bonitiert werden. Letzteres hat den Vorteil, dass die räumliche Verteilung innerhalb des Objekts erkennbar ist.

Fehlermöglichkeiten:

Da die Dehydrogenase-Aktivität nicht sofort nach dem Absterben der Zellen erlischt, sondern über einen Zeitraum von einigen Stunden abnimmt bevor sie ganz zum Erliegen kommt, wurde aufgetautes Untersuchungsmaterial erst nach 20 bis 24 Stunden getestet.
Bei grünem Gewebe fällt der Test manchmal negativ aus, auch wenn es sich um vitale Zellen handelt. Dies war hier generell bei Elsbeere der Fall, so dass für diese Baumart keine TTC-Testergebnisse vorgelegt werden können.

Für den Test wird TTC 1%ig (w/v) in 0,05 M Phosphat-Puffer gelöst und mit 0,05 % (v/v) Tween 80 zur Verbesserung der Benetzung versetzt. Die lichtempfindliche Lösung muss dunkel aufbewahrt werden. Die zu untersuchenden Knospen wurden angeritzt, um das Eindringen der Lösung zu gewährleisten. In einem Reagenzglas mit 3 bis 5 ml Lösung wurden je nach Größe 5 bis 10 Knospen für 20 bis 24 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Für die Beurteilung wurden die Knospen einzeln aus der Lösung genommen, der Länge nach aufgeschnitten und sofort unter dem Stereomikroskop bonitiert (Abbildungen 36 a, b, c, d im Anhang). Wichtig war der frische Anschnitt, da an der Luft Oxidationsprozesse einsetzen, die bereits nach wenigen Minuten zu Verbräunungen führen und die Beurteilung erschweren.

Als “vital” wurden die Knospen eingestuft, deren Meristem und angrenzende Leitbündel und Blattprimordien deutlich rot gefärbt waren. Wenn nur Teile dieser Region rot waren oder die rote Farbe nicht deutlich ausgeprägt war, galt die Knospe nicht als vital.

Vitalitätstest in vitro

Apices wurden aus den aufgetauten Knospen für die in vitro Kultur präpariert (Abbildung 35 im Anhang). Sie wurden nach vier Wochen auf Vitalität bonitiert, Bezeichnung: Vitalität T4 (= T4-Wert). Hier galt die Entfaltung grüner Blätter als Zeichen der Vitalität. Diese Apices wurden auch dann in die Wertung aufgenommen, wenn sie bakteriell oder mit Pilzen kontaminiert waren. Der Vitalitätsbeurteilung in vitro kam bei den Elsbeeren besondere Bedeutung zu, da bei ihnen kein TTC-Test möglich war (siehe oben).

Elsbeeren hatten häufig eine lange Etablierungsphase, und es stellte sich erst nach mehreren Monaten heraus, ob eine Etablierung erfolgte. Diese Eigenschaft im Zusammenhang mit der insgesamt seltenen Etablierung nach Kryokonservierung führte zur Aufnahme eines weiteren Parameters, der Informationen über das Verhalten der Explantate während des langen, mehrmonatigen Zeitraums zwischen Präparation und endgültiger Etablierung, bzw. Absterben gibt. Daher wurden Elsbeeren nach 12 Wochen (Vitalität T12 = T12-Wert) ein zweites Mal auf Vitalität bonitiert.

Bonitur der Etablierung

Generell wurde ein Explantat erst dann als etabliert bewertet, wenn es zu einem Spross herangewachsen war, der beim Transfer geteilt werden konnte (siehe Definition in Kapitel 2.5). Nach Kryokonservierung kam es häufig vor, dass sich grüne Blätter entfalteten und über mehrere Monate hinweg grün blieben, aber kein Wachstum erfolgte. In den Abbildungen 37 und 38 im Anhang sind solche Explantate neben Explantaten mit beginnendem Sprosswachstum zu sehen. Nicht wachsende, grüne Explantate wurden im T4- und u. U. auch im T12-Wert als vital erfasst, aber bei der Ermittlung der Etablierungsraten nicht berücksichtigt. Der Prozentsatz etablierter Apices wurde immer auf die Anzahl präparierter Knospen bezogen.

Behandlung von Winterknospen

Ein Fließschema, dass den prinzipiellen Ablauf veranschaulicht, befindet sich im Anhang (Abbildung 43).

Schrittweises Einfrieren

Die Reiser wurden unmittelbar vor Beginn der Gefrierprozedur in Stücke geschnitten, deren Länge dem verwendeten Kryo-Gefäß angepasst war (zwischen ca. 1 und 12 cm), und die mit mindestens einer Knospe bestückt waren (Abbildung 34 im Anhang). Bei Verwendung der Kryoröhrchen wurden die Schraubdeckel der Gefäße nur lose aufgesetzt, um ein schnelles Füllen mit Flüssigstickstoff zu gewährleisten.

Bei der Methode des schrittweisen Einfrierens wurden die Gefäße mit den Pflanzenproben nacheinander für jeweils 24 Stunden in die Gefrierkammern mit den Temperaturen -5°, -10°, -20°, -30°C gestellt. Danach wurden sie direkt in den Flüssig-Stickstoff der Lagercontainer verbracht.

Auftauen

Zum Auftauen wurden die Kryo-Gefäße mit den Pflanzenproben aus dem Lagercontainer entnommen und entweder für 24 Stunden in einer Kühlkammer von –5°C oder +2°C (± 2°C) oder bei Raumtemperatur von ca. 22°C aufgestellt („langsames Auftauen“), oder sie wurden für 2 bis 3 Minuten in ein 40°C – Wasserbad gestellt („schnelles Auftauen“). Letzteres wurde mit Winterknospen aber nur im Rahmen der Vorversuche durchgeführt. Danach war „langsames Auftauen“ die Standardauftaumethode. Knospen für die in vitro Kultur wurden unmittelbar danach weiter verarbeitet, während Knospen für den TTC-Vitalitätstest einen Tag bei Raumtemperatur ruhten, bevor der Test durchgeführt wurde.

Nachbehandlungen

Sofern nichts anderes angegeben ist, wurden aufgetaute Winterknospen für die in vitro Kultur wie nicht eingefrorene Winterknospen behandelt: Sie wurden oberflächensterilisiert, unter dem Stereomikroskop präpariert, auf Etablierungsmedium gesetzt und in den Klimaraum gestellt (Abbildung 35 im Anhang).

Mit dem Ziel, die niedrigen Etablierungsraten von Sorbus torminalis zu verbessern, wurden folgende Einflüsse geprüft, wobei als Etablierungsmedium immer das Medium 2/11 benutzt wurde:

Dunkelheit während der ersten zwei Wochen nach Präparation, um möglicherweise ablaufende photooxidative Prozesse zu behindern, die besonders während der ersten Tage nach dem Auftauen an Zellen, die zunächst nur leicht geschädigt sind, größere Schäden verursachen könnten (BENSON, persönl. Mitteilung).
Zusatz von 2 g/l Aktivkohle im Etablierungsmedium, um eventuell von den Pflanzen gebildete Stresssubstanzen, wie z.B. Ethylen, zu adsorbieren und damit ihre wachstumshemmende Wirkung zu mindern.
Verwendung eines Agarosetropfens, der von flüssigem Etablierungsmedium umgeben ist, an Stelle des festen Etablierungsmediums. Diese Methode wird in anderem Zusammenhang als sehr schonend für besonders empfindliches Gewebe empfohlen (siehe 2.6.5.6. Droplet-Methode).
Zusatz von Gibberellinsäure (GA₃) zum Etablierungsmedium in den Konzentrationen 0,1 , 1,0 und 5,0 mg / l, um die Sprossstreckung zu fördern.

Behandlung von in vitro Material Kälteakklimatisierung

Ausgangsmaterial waren Pflanzen aus der Kühllagerung, die für 3 - 6 Monate im Kühlraum bei +5°C gestanden hatten. Von diesen Kulturen wurden Sprosssegmente im Kulturraum bei +24°C auf Vermehrungsmedien angetrieben und die davon präparierten Apices im Klimaschrank einer weiteren Kälteakklimatisierung bei +4°C, bzw. 0°C mit unterschiedlicher Dauer (zwischen 2 Stunden und 5 Tagen) unterzogen. Bei diesem Schritt wurden Medien mit Dehydrierungs- oder Frostschutz-Zusätzen verwendet.

In den Versuchen, in denen mit der Einkapselung in Alginat (siehe Abschnitt 2.6.5.2.) gearbeitet wurde, wurden als Ausgangsmaterial Sprosskulturen in der Vermehrungsphase verwendet. Von diesen wurde 2 Wochen nach dem letzten Umsetzen die Aufteilung auf die beiden Kälteakklimatisierungstemperaturen +10°C und +4°C vorgenommen.

Einkapseln in Alginatkugeln und Trocknen

Ein Fließschema, das den prinzipiellen Ablauf veranschaulicht, befindet sich im Anhang (Abbildung 44).

Das Einkapseln von Apices in Alginatkugeln ist eine gängige Methode geworden, um pflanzliche Zellen auf das Einfrieren vorzubereiten, seit sie von DEREUDDRE et al. (1990) entwickelt wurde. Das Prinzip besteht darin, dass Apices in Alginatkugeln eingebettet werden in denen durch Trocknen die Saccharose-Konzentration erhöht wird. Dadurch werden auch die Pflanzenzellen langsam und schonend osmotisch dehydriert mit der Folge, dass beim Einfrierprozess eine Vitrifizierung stattfindet anstelle von unerwünschter Eiskristallbildung.

Alginatkugeln haben außerdem den Vorteil, dass sie und mit ihnen die Apices einfach zu handhaben sind, vor allem wenn größere Stückzahlen zu bearbeiten sind. Die Apices liegen geschützt in den Kugeln und werden beim Überführen von einer Lösung in die andere nicht mechanisch beschädigt. Der Nachteil besteht darin, dass die Herstellung der Kugeln umständlich und zeitaufwendig ist. Es erfordert auch eine gewisse Übung und große Sorgfalt, die Kugeln in gleichmäßiger Größe und Form herzustellen. Dies ist wichtig, da die Trocknungseigenschaften davon stark beeinflusst werden. Auch für die Wiederholbarkeit von Experimenten ist dieser Punkt unerlässlich.

Herstellung von Alginatkugeln

Für die Herstellung von Alginatkugeln werden zwei Lösungen vorbereitet. Lösung 1 ist ein calciumfreies flüssiges Kulturmedium mit 3% (w/v) Alginat. Lösung 2 ist ein flüssiges Kulturmedium mit 100 mM Calciumchlorid CaCl₂. Die Apices werden präpariert und an geeigneter Stelle gesammelt (in Flüssigmedium oder auf halbfestem Medium). Wenn alle benötigten Apices präpariert sind, werden sie in die Lösung 1 mit Alginat gegeben. Mit einer Eppendorf-Pipette werden ca. 3 ml Alginatlösung mit 2 bis 4 Apices aufgezogen und in einzelnen Tropfen in die calciumhaltige Lösung 2 getropft. Die Tropfen verfestigen sich zu einem Gel, sobald sie mit den Calcium-Ionen in Berührung kommen, und kapseln so die Apices ein. Nach 20 bis 30 Minuten ist das Gel stabilisiert und die Alginatkugeln können entnommen und weiter bearbeitet werden.

Folgende Medien wurden für die Einkapselung verwendet:

Wildbirne: 2/8, 87/29, 87/39 (siehe S. 22)

Elsbeere: 2/11, 87/29, 87/38 (siehe S. 23)

Trocknen von Alginatkugeln

Das Trocknen der Alginatkugeln wurde mit drei Methoden getestet:

Methode Luftstrom: Offene Petrischalen mit je 10 Alginatkugeln wurden in den sterilen Luftstrom der Werkbank gestellt.
Methode Silicagel direkt: 20 ml - Gläser mit Schraubdeckelverschluss wurden mit 8 g Silicagel gefüllt. Pro Glas wurden 10 Alginatkugeln auf Filterpapier gelegt, welches sich direkt auf dem Silicagel befand, so dass die Alginatkugeln nur durch das Filterpapier vom Silicagel getrennt waren.
Methode Exsiccator: Die Größe des Exsiccators betrug 200 mm im Innen-Durchmesser. Er besaß keine Vorrichtung für das Anlegen eines Unterdrucks. Er wurde mit 790 g Silicagel gefüllt. In ca. 5 cm Höhe über dem Silicagel befand sich eine perforierte Keramikscheibe. Darauf wurden offene Petrischalen gestellt, in denen sich die Alginatkugeln zu je 10 Stück pro Petrischale befanden. Der Exsiccator wurde immer nur mit 6 Petrischalen bestückt, damit die für den Feuchtigkeitsaustausch notwendige freie perforierte Fläche der Keramikscheibe immer ungefähr gleich groß war.

Bei den ersten Trocknungsversuchen wurde immer frisch aktiviertes Silicagel verwendet. Lediglich in einem Versuch wurde Silicagel für zwei Trocknungsserien an zwei aufeinanderfolgenden Tagen benutzt. Dadurch flachte die Trocknungskurve erheblich ab, so dass bei allen weiteren Versuchen wieder nur frisch aktiviertes Silicagel eingesetzt wurde.

Bestimmung des Trocknungsgrades

Zur Bestimmung des Trocknungsgrades wurden die Alginatkugeln vor, während und nach der Trocknung auf der Analysenwaage gewogen. Hierfür wurde immer eine Petrischale dem Exsiccator entnommen, komplett mit Alginatkugeln gewogen und dann zurück in den Exsiccator gestellt, der zwischendurch immer wieder geschlossen wurde. Der Trocknungsgrad wurde in % des Frischgewichts angegeben.

Osmotische Dehydrierung

Die osmotische Dehydrierung wird durch den Zusatz osmotisch wirksamer Substanzen zum Nährmedium erreicht. Nach der Standardmethode wurde Saccharose in einer Konzentration von 0,75 M zugesetzt. Die Einwirkdauer betrug zwischen 2 Stunden und 2 Tagen.

Da Elsbeeren sehr empfindlich auf die osmotische Dehydrierung mittels Saccharose reagierten, wurden mit ihnen, basierend auf dem Medium 2/11, zusätzlich folgende Varianten getestet:

Zugabe von Mannitol, Sorbitol oder Saccharose in den Konzentrationen 0,4 M und 1,0 M, Einwirkdauer 1 und 3 Tage.
Schrittweises Dehydrieren durch Zugabe von Mannitol, Sorbitol oder Saccharose in den Konzentrationen 0,1, 0,4, 0,7 und 1,0 M. Einwirkdauer auf jeder Stufe 1 Tag, bevor auf die nächsthöhere Stufe umgesetzt wurde. Auf der Endstufe (1,0 M) Einwirkdauer von 1 und 3 Tagen.

Für die Dauer der Dehydrierung befanden sich die Kulturen im Klimaschrank bei +5°C und 12 Stunden Belichtung. Danach wurde auf das Medium 2/11 umgesetzt und im Klimaraum weiterkultiviert.

Untersuchungen zur Toxizität von DMSO

DMSO (Dimethylsulfoxid) ist ein Frostschutzmittel, dessen Wirkungsweise noch nicht ganz geklärt ist. In der Literatur finden sich viele Hinweise auf seinen Einsatz in Kryokonservierungsprozeduren, aber ebenso auf seine Toxizität.

Es wurde ein Versuch zur Ermittlung der Toxizität, bzw. Verträglichkeit von DMSO durchgeführt: Filterpapier wurde in Petrischalen mit DMSO in den Konzentrationen 0, 5, 10 und 20% getränkt und Apices für 1, 2, 3, 4 und 17 Stunden auf diesem Filterpapier belassen. Danach wurden die Apices in Flüssigmedium (Medium 87/29) gespült und auf einen Agarosetropfen gesetzt, um den herum dasselbe Medium pipettiert wurde (Abbildung 39 im Anhang). Nach 2 Wochen wurden sie auf festes 87/29-Medium umgesetzt. Die Sorbus torminalis – Apices wurden für diesen Versuch in Alginat eingekapselt (Abbildung 40 im Anhang).

Aufgrund der Ergebnisse des Verträglichkeitsversuchs wurde in Folgeversuchen DMSO in einer Konzentration von 5% eingesetzt.

Vitrifizierung

Vorbehandlung

In einigen Versuchen ging der Vitrifizierung eine Vorbehandlung mit einem MS – Flüssig-medium voraus, dem 0,4 M Saccharose und 2 M Glycerin zugesetzt waren. Die Einwirkungszeit betrug 20 Minuten.

Vitrifizierung

Für das Vitrifizieren wurde die PVS2-Lösung nach YAMADA et al. (1991) eingesetzt. Zusammensetzung (pro l fertige Lösung):

107 g Saccharose
300 ml Glycerin
150 g Ethylenglycol
150 ml DMSO
pH 5,8.

gelöst in flüssigem MS-Medium ohne Hormone

Die Einwirkungszeit wurde mit 0, 5, 15 und 20 Minuten geprüft.

Droplet-Methode

Ein Fließschema, dass den prinzipiellen Ablauf veranschaulicht, befindet sich im Anhang (Abbildung 45).

Die Droplet- oder Tröpfchen-Methode wurde von SCHÄFER-MENUHR und MIX-WAGNER (1996) für das Einfrieren von Kartoffeln in der Kryo-Genbank der Forschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) in Braunschweig zur Routinemethode entwickelt. Sie kombiniert die Vitrifizierung mit einer einfach zu handhabenden Einfrier-Technik.

Ein Styroporgefäß mit passendem Einsatz für Kryoröhrchen wurde mitsamt den Kryoröhrchen mit Flüssigstickstoff gefüllt. Hitzesterilisierte Aluminiumfolien-Streifen (Größe: passend für die Kryoröhrchen, ca. 5 x 20 mm) wurden mit der matten Seite nach oben gelegt und mit 4 bis 6 kleinen Tropfen PVS2-Lösung aus der 25 μl-Eppendorfpipette versehen. In jeden dieser Tropfen („droplet“) wurde ein Apex gelegt. Die Aluminiumstreifen wurden dann in den mit Flüssigstickstoff gefüllten Kryoröhrchen platziert, bis zu drei Streifen pro Röhrchen.

Auftauen und Nachbehandlung

Eine Auftaumethode bestand darin, die Kryoröhrchen in Bechergläser zu legen, die mit Flüssigmedium gefüllt in einem 45°C-Wasserbad standen. Nach 1 bis 2 Minuten wurden die Kryoröhrchen herausgenommen und in Bechergläser gegeben, die mit Flüssigmedium von Raumtemperatur gefüllt waren. Bei beiden Temperaturen wurde Flüssigmedium statt Wasser genommen für den Fall, dass die Kryoröhrchen nicht ganz dicht verschlossen waren. Nach 2 – 3 Minuten wurden die Kryoröhrchen geöffnet und die Apices einmal in Spülmedium (hormonfreies MS-Flüssigmedium mit 1,2 M Saccharose) gespült, bevor sie auf halbfestes Etablierungsmedium gesetzt wurden.

Bei der anderen Auftaumethode wurden die Kryoröhrchen geöffnet während sie sich noch im Flüssigstickstoff befanden. Der Aluminiumstreifen mit den gefrorenen Apices („droplets“) wurden mit einer Pinzette entnommen und direkt in Bechergläser, die zur Hälfte mit Spülmedium von Raumtemperatur gefüllt waren, getaucht. Das Spülmedium war ein hormonfreies flüssiges MS-Medium mit 0,4 M Saccharose. Es wurde zweimal im Abstand von 5 Minuten gewechselt. Dann wurden die Apices entweder gleich auf halbfestes Etablierungsmedium (Medium 87/37 für Wildbirne, Medium 87/29 oder 2/11 für Elsbeere) gesetzt oder erst auf einen Agarosetropfen, der von flüssigem Etablierungsmedium umgeben war, und von dort nach 2 Wochen auf festes Etablierungsmedium.