Identification and Characterization of the Ion Channel TRPM8 in Prostate Cancer

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)

im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

Simone Kaiser

geboren am 10.10.1973 in Berlin

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. Thomas Börner
2. Prof. Dr. Matthias Dürst
3. PD Dr. Wolfgang Kemmner

Eingereicht am:30.12.2003

Tag der mündlichen Prüfung:10.06.2004

Zusammenfassung

Das Prostatakarzinom ist die häufigste Krebserkrankung des Mannes. Bei den zu Tode führenden Tumoren wird es im Jahre 2003 nach dem Bron­chialkarzinom an 2. Stelle stehen. Diese Inzidenz zeigt, dass dringend neue diagnosti­sche Marker und therapeutische Zielgene zur Be­handlung von Pros­tatakrebs benötigt werden.

Ziel dieser Dissertation war es, mit Hilfe der DNA-Chiptechnologie neue tumorrelevante Gene für eine Small-Molecule- und Antikörper-Basierte Therapie des Prostatakarzi­noms zu identifizieren. Auf einen proprietären Tumor-Chip der Firma metaGen Pharmaceuticals GmbH wurde mikrodissektiertes Normal- und korrespondieren­des Tumorgewebe von 52 Prostatatumorpatienten hybri­disiert. Mit Hilfe bioinfor­matischer Analysen der Chipergebnisse konnte das Gen TRPM8 identifiziert werden, das in Prostatatumoren in mehr als 56% der Patienten überexpri­miert ist.

Northern-Blot, Dot-Blot und Chipexperimente zeigten, dass TRPM8 un­ge­wöhnlich gewebespezifisch exprimiert wird. In mehr als 400 getesteten Tumor­patienten und in 23 Normalgeweben wurde TRPM8 ausschließlich in der Prostata und neuroendokrinen Tumoren nachgewiesen.

TRPM8 gehört zur Familie der Transient Receptor Potential Channel Proteins. Es konnte hier erstmals in Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer- Experi­menten (FRET) gezeigt werden, dass TRPM8 Multi-Homomere bildet. Dies wurde bisher nur für Kanäle anderer TRP-Subfamilien (TRPV und TRPC) gezeigt.

Weiterhin konnten erstmals mehrere Spleißvarianten von TRPM8 identifiziert werden. Quantitative RT-PCR Expe­rimente zeigten, dass diese noch stärker in Prostatatumoren überexprimiert sind als TRPM8 selbst. Des Weiteren wurde ein neues Gen auf dem DNA-Gegenstrang von TRPM8 entdeckt, das mit Exon 11 von TRPM8 100% komple­mentär ist und an der Regulation von TRPM8 beteiligt sein könnte.

Der Promotor von TRPM8 wurde durch eine in silico Analyse identifi­ziert und in vitro bestätigt. Obwohl eine starke androgenabhängige Ex­pression von TRPM8 in LNCaP Zellen gezeigt werden konnte, wurden keine Bindungs­stellen für androgenabhänginge Elemente gefunden. Allerdings lie­ßen sich drei Bin­dungsstellen des androgenregulierten Homeoboxgens NKX3.1 identifizieren.

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass TRPM8 und seine Isoformen aufgrund ihrer Gewebspezifität ausge­zeichnete Angriffspunkte für eine zielgerichtete Prostatakrebstherapie sind.

Eigene Schlagworte: TRPM8, Prostata, Krebs, Chip, Ionenkanal

Abstract

Prostate cancer is the most commonly diagnosed malignancy in men in the Western World. In 2003 malignancies of the prostate will be the second most common fatal cancer in men after lung cancer as estimated by the American Cancer Society. Despite the tremendous efforts made in the past to improve the treatment of prostate cancer patients, there is still an urgent need for new markers and therapeutic targets for medication.

The aim of this thesis was the identification of new genes relevant in prostate cancer, which could be used in a small-molecule or antibody based therapy of prostate cancers. Microdissected matched prostate cancer and normal tissues of 52 prostate cancer patients were hybridized to a proprietary high density Cancer-Chip based on Affymetrix GeneChip technology. Using a bioinfor­matic analysis, it was possible to identify TRPM8, which was highly overex­pressed in 56% of prostate cancer patients. Northern blot, dot blot and gene chip experiments revealed that TRPM8 expression is extremely tissue specific. Of 400 patients and 23 tissues tested, TRPM8 expression could only be de­tected in the prostate and neuroendocrine tumors.

Functionally, the protein belongs to the transient receptor potential channel family of non-voltage gated proteins. It could be shown for the fist time that TRPM8 subunits form homomers using FRET technology.

Molecular characterization of TRPM8 transcription revealed multiple splice forms of TRPM8. Further, it was possible to identify a new mRNA present on the opposite strand of TRPM8, which was 100% complementary to exon 11 of TRPM8, thus it could possibly function as a regulatory RNA of TRP channel. All of these isoforms were found to be even higher overexpressed in prostate tumors than TRPM8 itself.

The promoter region of TRPM8 was identified using in silico methods and confirmed in promoter reporter assays. Although a high androgen dependent transcriptional activation of TRPM8 could be found by RT-PCR in LNCaP cells, no androgen responsive elements was identifiable within the promoter region. On the other hand three binding sites for the androgen dependent homeobox gene NKX3.1 and several other homeobox genes were discovered.

The results of the thesis show that TRPM8 and its isoforms are, due to their tissue specificity, ideal targets for the development of new therapeutic drugs for the treatment of prostate cancer.

Keywords: TRPM8, prostate, cancer, microarray, Ionchannel


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09.03.2005