Aus dem
Institut für Mikrobiologie und Hygiene
(Leiter: Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. U.-B. Göbel)
Universitätsklinikum Charitè
Fachbereich Humanmedizin
Humboldt - Universität zu Berlin

DISSERTATION

Antigenerkennung
während unterschiedlicher
Stadien der
Helicobacter pylori - Infektion

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité –
Universitätsmedizin Berlin

von
Galip Karaali

aus Antakya

Gutachter:
1. Prof. Dr. Dr. U. B. Göbel
2. Prof. Dr. med. P. Malfertheiner
3. Prof. Dr. S. Suerbaum

Datum der Promotion: 24.06.2005

Teile dieser Arbeit wurde unter folgendem Titel veröffentlicht :

Haas, G., Karaali, G., Ebermayer, K., Metzger, W.G., Lamer, S., Zimny-Arndt, U., Diescher, S., Goebel, U.B., Vogt, K., Roznowski, A.B., Wiedemann, B.J., Meyer, T.F., Aebischer, T., Jungblut, P.R. (2002) : Immunoproteomics of Helicobacter pylori infection and relation to gastric disease. Proteomics 2 :313-324.

Teile dieser Arbeit wurde beim Europäischen Patentamt unter folgendem Titel angemeldet :

Method for identifying Helicobacter antigens (Patent Nr.01931657.9-2405-EP0104728 )

Inhaltsverzeichnis

• 1 EINLEITUNG
  • 1.1  Klinische und pathologische Bedeutung von Helicobacter pylori nach den Vorgaben der Literatur
  • 1.2 Epidemiologie der Helicobacter pylori - Infektion
  • 1.3  Morphologie und Pathogenität
    • 1.3.1  Morphologie von Helicobacter pylori
    • 1.3.2 Virulenz und Pathogenität von Helicobacter pylori
  • 1.4 Klinik der Helicobacter pylori - Infektion
  • 1.5 Diagnostik der Helicobacter pylori - Infektion
  • 1.6  Helicobacter pylori - induzierte Entzündung und Immunreaktion
  • 1.7  Helicobacter pylori - assoziierte Erkrankungen
    • 1.7.1  Gastritistypen
    • 1.7.2 Helicobacter pylori und Gastritis
    • 1.7.3  Helicobacter pylori und Ulkuserkrankungen
    • 1.7.4  Helicobacter pylori und Magenkarzinom
    • 1.7.5  Helicobacter pylori und gastrointestinale Lymphome
    • 1.7.6  Helicobacter pylori und funktionelle Dyspepsie
    • 1.7.7 Bedeutung von Helicobacter pylori bei Dermatosen
  • 1.8 Therapiemöglichkeiten bei Helicobacter pylori - Infektion
• 2 AUFGABENSTELLUNG UND ZIELSETZUNG
• 3 MATERIAL UND METHODEN
  • 3.1  Gastroskopische Helicobacter pylori - Diagnostik
    • 3.1.1  Nachweis der Ureaseaktivität von Helicobacter pylori (CLO - Schnelltest)
    • 3.1.2 Histologischer Nachweis von Helicobacter pylori
    • 3.1.3 Nachweis von Helicobacter pylori auf Kultur
  • 3.2 Serumdiagnostik nach ELISA
    • 3.2.1  Serumproben
    • 3.2.2 Material und Geräte
    • 3.2.3 Ablaufschema der serologischen Identifikationen
  • 3.3 Zweidimensionale Gelelektrophorese und Western - Blotting
    • 3.3.1  Zweidimensionale Gelelektrophorese
      • 3.3.1.1  Herstellung der bei der 2D - Elektrophorese verwendeten Lösungen  (JUNGBLUT et al.,1997)
      • 3.3.1.2 Durchführung der 2D – Elektrophorese (JUNGBLUT et al., 1997; KLOSE, J., 1975 )
    • 3.3.2 Blotten („Westernblot“)
      • 3.3.2.1  Durchführung(ECKERSKORN et al., 1988)
  • 3.4 Färbeverfahren
    • 3.4.1  Gelfärbeverfahren
      • 3.4.1.1  Coommassie Brilliant Blue - Färbung
      • 3.4.1.2 Silberfärbung(HEUKESHOVEN et al., 1985)
  • 3.5  Auswertung von zweidimensionalen Gelen und Blots
• 4 STATISTISCHE METHODEN
• 5 ERGEBNISSE
  • 5.1  Diagnostik und Prävalenzen einer Helicobacter pylori-Infektion
    • 5.1.1  CLO-Test und Helicobacter pylori-Anzucht
    • 5.1.2 Histologische Untersuchungsergebnisse
    • 5.1.3 Ergebnisse der ELISA-Tests
    • 5.1.4 Auswahlkriterien zur Definition des Helicobacter pylori - Status
    • 5.1.5 Gruppeneinteilung für die Analyse der Immunoblots
  • 5.2 Analyse von zweidimensionalen Gelen und Blots
  • 5.3 Qualitative Auswertung der Immunoblots
  • 5.4 Quantitativer Vergleich der Immunoblots von Helicobacter pylori - positiven Patienten mit Helicobacter pylori - negativen Patienten
    • 5.4.1  Häufig erkannte Antigene in beiden Gruppen
    • 5.4.2 Durch Helicobacter pylori-negativen Seren selten erkannte Proteine
    • 5.4.3 Antigene mit höherer Frequenzstärke in Helicobacter pylori-negativen Seren
  • 5.5 Qualitativer und quantitativer Vergleich der Immunoblots bei den Krankheitsgruppen Gastritis, Ulkus und Karzinom
    • 5.5.1  Antigene mit größerer Frequenzstärke in Karzinomseren
    • 5.5.2 Statistisch auffälligste Antigene bezüglich der Frequenzstärke
  • 5.6 Untersuchungen von Serumpools
• 6 DISKUSSION
  • 6.1  Bedeutung der Serodiagnostik
  • 6.2 Bedeutung der zweidimensionalen Gelelektrophorese
  • 6.3  Helicobacter pylori-spezifische Antigene
  • 6.4  Helicobacter pylori-Antigene und Bezug zur Krankheit
  • 6.5 Serien - Spots
  • 6.6 Analyse der Serumpools
• 7 ZUSAMMENFASSUNG
• 8 LITERATURVERZEICHNIS
• 9 ANHANG
• 10 DANKSAGUNG
• 11 LEBENSLAUF
• 12 SELBSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG

Tabellen

• Tab. 1: Mögliche Virulenzfaktoren von H. pylori (nach SUERBAUM, 1996)
• Tab. 2: Kurzzeit-Tripel-Therapie (LABENZ et al., 1996)
• Tab. 3: Anzahlen (n) und relative Häufigkeiten (%) histologisch begründeter Diagnosestellungen
• Tab. 4: ELISA -Titerergebnisse untersuchter Patienten (H. p. = H. pylori)
• Tab. 5: Kriterien für die Definition des Helicobacter pylori-Status.
• Tab. 6: Anzahl der Proteinspots, die durch Seren von H. pylori-positiven und H. pylori-negativen Patienten erkannt wurden
• Tab. 7: In H. pylori-positiven Seren (n=24) und H. pylori-negativen Seren (n=12) erkannte Antigene mit der Signalfrequenz > 10 bei den positiven. (KGT : Kleingeltechnik, GGT: Großgeltechnik, ORF: Open reading frame, Sektoren A-F in GGT entsprechen 1_5_ in der Datenbank und in den Abbildungen)
• Tab. 8: Die nicht mit H. pylori- negativen Seren reagierten Proteinspezies. (KGT : Kleingeltechnik,GGT: Großgeltechnik, ORF: Open reading frame, Sektoren A-F in GGT entsprechen 1_5_ in der Datenbank und in den Abbildungen)
• Tab. 9: Durch die gesamten H. pylori-negativen Seren (n=12) nur einmal erkannten Proteinspots mit Frequenzvergleich zu H. pylori-positiven .(KGT : Kleingeltechnik,GGT: Großgeltechnik, ORF: Open reading frame, Sektoren A-F in GGT entsprechen 1_5_ in der Datenbank und in den Abbildungen)
• Tab. 10: Spots mit größerer Frequenz bei H. pylori-negativen gegenüber H. pylori- positiven Seren   (KGT : Kleingeltechnik,GGT: Großgeltechnik, ORF: Open reading frame, Sektoren A-F in GGT entsprechen 1_5_ in der Datenbank und in den Abbildungen)
• Tab. 11: Vergleich der 32 Proteine mit den höchsten Frequenzen in den einzelnen Krankheitsgruppen Gastritis, Ulkus, Karzinom (KGT : Kleingeltechnik,GGT: Großgeltechnik, ORF: Open reading frame, Sektoren A-F in GGT entsprechen 1_5_ in der Datenbank und in den Abbildungen) [G: Gastritis, U:Ulkus, Ca: Karzinom, Freq.: Frequenz]
• Tab. 12: Relative Häufigkeiten, Frequenzen und arithmetische Mittelwerte der Intensitäten statistisch signifikanter Proteinspots bezogen auf die Krankheitsgruppen (KGT : Kleingeltechnik,GGT: Großgeltechnik, ORF: Open reading frame, Sektoren A-F in GGT entsprechen 1_5_ in der Datenbank und in den Abbildungen) [G: Gastritis, U:Ulkus, Ca: Karzinom, Freq.: Frequenz aMW: arithmetischer Mittelwert der Intensität]
• Tab. 13: H. pylori-Antigene mit größerer Frequenzstärke bei Karzinom-Seren mit Vergleich zu den Gastritis- und Ulkusgruppen  (KGT : Kleingeltechnik,GGT: Großgeltechnik, ORF: Open reading frame, Sektoren A-F in GGT entsprechen 1_5_ in der Datenbank und in den Abbildungen) [ Ca: Karzinom, G: Gastritis, U: Ulcus, Freq.: Frequenz].
• Tab. 14: Statistisch signifikanteste Spots mit Frequenzangaben in verschiedenen Krankheitsgruppen (KGT : Kleingeltechnik,GGT: Großgeltechnik, ORF: Open reading frame, Sektoren A-F in GGT entsprechen 1_5_ in der Datenbank und in den Abbildungen) [ Freq.: Frequenz, H. p.: H. pylori, pos.: positiv, neg.: negativ, G: Gastritis, U: Ulkus, Ca: Karzinom].
• Tab. 15: Die geblotteten Pools und ihre Eigenschaften
• Tab. 16: Gesamtübersicht über die Patientendaten (früh. Hp: vor der Studie H. pylori diagnostiziert, spec: Spezial, era: eradiziert, Histo.: Histologie, Kultur: H. pylori-Anzucht, Patient: hier statt Namen nur Kürzel) (IgG, IgA: H. pylori spezielle ELISA-Werte)
• Tab. 17: Kriterien detektierter Antigene: Spots, die in der Positivgruppe (n=24) überzufällig häufiger aufgetreten sind, als in der Negativgruppe Spots, die in der Positivgruppe (n=24) mit größerer Durchschnittsintensität aufgetreten sind, als in der Negativgruppe Die Verteilung der Seren, die diese Spots erkannt haben, sind in den drei Krankheitsgruppen (G,U,Ca) unterschiedlich Spots, die mit signifikant unterschiedlichen Durchschnittsintensitäten in den drei Krankheitsgruppen (G,U,Ca) erkannt wurden (G: Gastritis, U: Ulcus, Ca: Karzinom, KGT : Kleingeltechnik, GGT: Großgeltechnik, ORF: Open reading frame)

Bilder

• Abbildung 1: Schematische Darstellung der lokalen Immunantwort bei H. pylori-assoziierter Gastritis (modifiziert nach CRABTREE, 1996). 1). Komponenten des Erregers stimulieren das Epithel zur Produktion chemotaktischer Substanzen. Dies führt zur Endothelanheftung von Granulozyten.  2). Stoffwechselprodukte von H. pylori, wie Urease, äußere Membranproteine und/oder Cag A überschreiten die Epithelbarriere und stimulieren das Einwandern von Granulozyten, Makrophagen, T- und B-Lymphozyten. CD4+-T-Zellen unterstützen die Differenzierung von B-Zellen (3) zu Plasmazellen (4), die spezifische Antikörper produzieren. 5). Lymphozyten und Makrophagen produzieren proinflammatorische Zytokine. Diese führen zur Aktivierung von Entzündungszellen und so zu einer Schädigung des Epithels. C5a = Komplementkomponente 5a, Cag A = Zytotoxin-assoziiertes Protein,  IL = Interleukin, LTB4 = Leukotriene B4, OMP = äußere Membranproteine, PAF = Plättchenaktivierender Faktor, TNFα = Tumornekrosefaktor α.
• Abbildung 2: Nachweis eines Proteins auf einem Gel durch Western-Blotting. Die auf einem SDS-Polyacrylamidgel getrennte Proteine werden auf eine polymere Schicht übertragen und mit einem radioaktiven Antikörper gekennzeichnet. Auf dem Autoradiogramm erscheint dann eine Bande, die dem gesuchten Protein entspricht.
• Abbildung 3: Darstellung der analytischen zweidimensionalen Auftrennung von Helicobacter pylori 26695 (in Silberfärbung) in der Datenbank des MPI. Markierte Proteinspots sind identifizierte Antigene (Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie, Berlin).
• Abbildung 4: Analytische Auftrennung der Proteine von H. pylori 26695 (PA4-Gel) in Silberfärbung  (IEF: Isoelektrische Fokussierung = Auftrennung nach Ladung, Mr: Molekulargewicht in Dalton)
• Abbildung 5: Vergleich der Immunoblots eines H. pylori-positiven Ulkus- (links) und eines H. pylori-negativen Gastritispatienten (rechts) in Commasie-Blue -Färbung.
• Abbildung 5A: Eindeutig identifizierte Antigene (Proteinspots) des H. pylori-26695-Stammes, die nach Immunfärbung der 2-DE-Blots durch Seren von Patienten mit nicht H. pylori-assoziierter Gastritis erkannt wurden.  Die einzelnen Proteinspots sind durch ihre Identitätsnummer und durch vorangestellte Ziffern von 1_ bis 6_ entsprechend ihrer Position auf einer der 6 Sektoren der Blots in der 2-DE-Datenbank gekennzeichnet.
• Abbildung 5B: Eindeutig identifizierte Antigene (Proteinspots) des H. pylori-26695-Stammes, die nach Immunfärbung der 2-DE-Blots durch Seren von Patienten mit H. pylori-assoziierter Gastritis erkannt wurden. Die einzelnen Proteinspots sind durch ihre Identitätsnummer und durch vorangestellte Ziffern von 1_ bis 6_ entsprechend ihrer Position auf einer der 6 Sektoren der Blots in der 2-DE-Datenbank gekennzeichnet.
• Abbildung 5C: Eindeutig identifizierte Antigene (Proteinspots) des H. pylori-26695-Stammes, die nach Immunfärbung der 2-DE-Blots durch Seren von Patienten mit Ulcus ventriculi et duodeni erkannt wurden. Die einzelnen Proteinspots sind durch ihre Identitätsnummer und durch vorangestellte Ziffern von 1_ bis 6_ entsprechend ihrer Position auf einer der 6 Sektoren der Blots in der 2-DE-Datenbank gekennzeichnet.
• Abbildung 5D: Eindeutig identifizierte Antigene (Proteinspots) des H. pylori-26695-Stammes, die nach Immunfärbung der 2-DE-Blots durch Seren von Patienten mit Magenkarzinom erkannt wurden. Die einzelnen Proteinspots sind durch ihre Identitätsnummer gekennzeichnet Sie sind in den Identifikationsgelen und Tabellen zur schnelleren Auffindung durch die vorgestellten Buchstaben A – F für die einzelnen 6 Sektoren des Gels gekennzeichnet. In der 2 – DE – Datenbank sind die Gele aus technischen Gründen durch vorangestellte Ziffern von 1_ bis 6_ entsprechend ihrer Position auf einer der 6 Sektoren der Blots in der 2-DE-Datenbank gekennzeichnet. Daher wurde diese Nomenklatur der Sektoren 1_ bis 6_ auf den aus einer Datenbank übernommenen Abbildungen beibehalten, ist aber ganz einfach den Buchstaben A – F zuzuordnen.