3 MATERIAL UND METHODEN

↓28

Für diese Studie wurden insgesamt 334 Patienten der gastroenterologischen Abteilung des Virchow-Klinikums der Charité der Humboldt-Universität zu Berlin untersucht, die entweder stationär oder ambulant betreut wurden und bei denen aufgrund von gastroenterologischen Beschwerden oder einer Allgemeinerkrankung eine Endoskopie des Gastrointestinaltraktes durchgeführt wurde. Hierbei wurden Gewebeproben der Schleimhaut entnommen

Bei 12 Patienten erfolgte die Endoskopie nicht im Virchow-Klinikum. Von den 322 im Virchow-Klinikum endoskopierten Patienten wurden acht Patienten zur Verlaufskontrolle nochmals endoskopiert, so dass hier insgesamt 330 Endoskopien durchgeführt wurden.

Wenn die Endoskopie einen auffälligen Befund ergab (wie Verdacht auf Gastritis, Ulkus, Karzinom oder andere Schleimhautveränderungen), wurde eine anamnestische Befunderhebung durchgeführt, um über die Aufnahme in die Studie zu entscheiden. Die Befunderhebungen wurden durch Histologie, CLO-Test, H. pylori-Anzucht und klinische Diagnostik (Ulkus, Gastritis, Lymphom, Karzinom) gestützt.

↓29

Nach Endoskopie, Befunderhebung und Bestimmung des Krankheitsbildes wurden 79 Patienten (27 Frauen und 52 Männer) im Alter von 17 bis 77 Jahren (Durchschnittsalter der Frauen 56 Jahre und der Männer 55 Jahre) zur weiteren Untersuchung ausgewählt und in Gruppen je nach Krankheitsbild eingeteilt. Von jedem Patienten wurden, je nach Verfügbarkeit, dessen klinische Parameter und diagnostische Untersuchungs-ergebnisse (Histologie, Bakterienkultur, CLO und ELISA) dokumentiert. Patienten, die Immunsuppressiva eingenommen hatten, wurden in die Studie nicht eingeschlossen.

Zur Analyse der Helicobacter-Proteinmustererkennung durch Serumantikörper wurden an 55 der 79 Patientenseren Immunoblots durchgeführt. Sämtliche Patientendaten sind mit Serumkürzeln, H. pylori-Antikörper-Testergebnissen (ELISA), Ergebnissen der Urease-Schnelltests (CLO) und der Bakterienanzucht aus der Biopsie, H. pylori-Anamnese undZustand nach Eradikation im Anhang in Tabelle 16 zusammengestellt.

Zusätzlich wurden 10 Immunoblots mit gepoolten Seren durchgeführt.

↓30

Die 79 Patienten, die in die Studie aufgenommen wurden, erhielten eine zusätzliche Aufklärung, und gaben eine zweite Einverständniserklärung ab.

3.1  Gastroskopische Helicobacter pylori - Diagnostik

Die Biopsieentnahmen für Histologie, CLO-Test sowie Kultur wurden in der Endoskopie-Abteilung der Medizinischen Fakultät der Humboldt-Universität, Campus Virchow (Direktor: Prof. Dr. Wiedenmann) durchgeführt. Die Endoskopie wurde bei einem Teil der Patienten auf Wunsch unter Lokalanästhesie des Rachenrings oder unter Sedierung mit 5 mg Midazolam i.v. vorgenommen. Die von unterschiedlichen Ärzten vorgenommene Gastroskopie erfolgte in der Regel in Linksseitenlage des Patienten mit dirigierbaren Gastroskopen der Firma Olympus und der dazugehörigen Biopsiezange. Zur Desinfektion wurde Lysetol FF 2% verwendet.

3.1.1  Nachweis der Ureaseaktivität von Helicobacter pylori
(CLO - Schnelltest)

Grundlagen: Die H. p.-Urease ist ein oberflächlich assoziiertes, relativ großes Enzym, das aus zwei strukturellen Untereinheiten (Ure A, ca. 28 kDa, und Ure B, ca. 66 kDa) besteht. Sie katalysiert die Spaltung von Harnstoff in Ammoniumionen und Hydrogencarbonat, danach Bildung von Ammoniak und Kohlendioxid. Das bewirkt eine lokale Neutralisierung des sauren pH und erlaubt es dem Bakterium, kurzfristig im sauren Magenlumen zu überleben, bevor es in die Bikarbonat-gepufferte Schleimhautschicht der Magenmukosa eindringt (CLAYTON et al.,1990).

↓31

Der CLO (Campylobacter like Organisms)-Test ist ein kommerziell erhältlicher Test, dessen Grundprinzip auf der starken Ureasebildung des Helicobacter pylori basiert. Ein wesentlicher Bestandteil des CLO-Testes ist ein Agar, der neben Harnstoff und einem pH-abhängigen Farbindikator (Phenolrot) ein Bakteriostatikum enthält, das die Vermehrung anderer, ureasebildender Bakterien effektiv unterdrückt. In dieses Testmedium wird das zu untersuchende, endoskopisch gewonnene Biopsiepartikel aus der Magenmukosa eingebracht.

Mit diesem Nachweisverfahren wird eine in der zu testenden Probe enthaltene Ureaseaktivität qualitativ erfaßt. Das Prinzip des Tests ist die Spaltung der in dem Testmedium vorhandenen Urease (KOLTS et al.,1993). Der mit der Abspaltung von Ammoniak verbundene Anstieg des pH-Wertes bewirkt einen Farbumschlag des Indikators (Phenolrot) von gelb nach rosa.

Material:

Gewebeproben

Testmedium der Firma Procter und Gamble Pharmaceuticals

↓32

Durchführung des Tests: Bereits während der Gastroskopie wurden die aus dem praepylorischen Antrum und aus dem Corpus entnommenen Gewebeproben in das Testmedium gegeben. Das nur kurz geöffnete Reaktionsgefäß wurde nach Einführung der Gewebeproben sofort wieder veschlossen und bei Raumtemperatur trocken gelagert. Eine rosa oder rote Verfärbung des Testmediums zeigt eine positive Reaktion und damit die Anwesenheit von Helicobacter pylori an. In den meisten Fällen einer Helicobacter pylori-Infektion ist der Farbumschlag innerhalb von 30 Minuten zu erkennen. Bei Vorliegen einer nur geringfügigen Besiedlung trat ein verzögerter Farbumschlag ein. Farbumschläge, die nach Ablauf von 24 Stunden eintraten, galten als negative Reaktion.

3.1.2 Histologischer Nachweis von Helicobacter pylori

Für den histologischen Nachweis wurden Biopsien aus Bereichen eng umschriebener Rötungen, Erosionen, Ulzera oder anderer morphologischer Veränderungen entnommen. Die Klassifikation erfolgte nach dem Sydney-System.

Für den direkten Nachweis einer zum Zeitpunkt der Untersuchung bestehenden
H. pylori-Infektion wurden pro Patient insgesamt zwei Magenbiopsien aus Magenkorpus und -antrum, gegebenfalls aus dem Ulkusrand, mikrobiologisch und histologisch auf
H. pylori untersucht. Auch bei Verdacht auf Ösophagusveränderungen wurden von entsprechenden Stellen Biopsien entnommen. Bei einigen Patienten ist auch die Duodenalschleimhaut untersucht worden. Eine histologische Begutachtung der Magenschleimhautbiopsien liegt für die meisten Patienten vor.

↓33

Die Biopsien wurden in 10%igem Formalin konserviert und zur histologischen H .pylori-Routine-und Gastritisdiagnostik versandt.

3.1.3 Nachweis von Helicobacter pylori auf Kultur

Als "Goldstandard" hat der kulturelle Nachweis aus den Biopsien zu gelten, der bei einem lege artis gesicherten positiven Befund keinem Zweifel unterliegt. Negative Befunde können jedoch neben richtig negativen auch falsch negative oder biologisch richtig, klinisch aber falsch negative Ergebnisse beinhalten (BÖRSCH, 1988), so dass zumindest wissenschaftlich ein negatives Kulturergebnis durch eine vom Prinzip her nicht fokale Nachweismethode, und zwar den Harnstoff-Atemtest, als "negativer Goldstandard" überprüft werden sollten (BÖRSCH et al., 1989).

Der Transport der Biopsien für die mikrobiologischee Anzucht betrug weniger als zwei Stunden und erfolgte in Thioglykolat-Bouillon, die in Kunststoff-Bouillon, in Kunststoff-Schraubröhrchen vom Labor der Mikrobiologischen Abteilung, Campus Virchow zur Verfügung gestellt wurde (Direktor: Prof. Dr. Dr. U. Göbel). Dort erfolgte auch die Anzucht. Die Wachstumszeit der Agarkulturen betrug 5 Tage bei 37°C unter mikroaeroben Bedingungen.

3.2 Serumdiagnostik nach ELISA

↓34

Nach gesicherter gastroskopischer Diagnosestellung entsprechend den in Kapiteln 3.1 bis 3.3 dargestellten Verfahren, und nach Zuordnung der einzelnen Patienten zu
H. pylori-assoziierten Erkrankungen (s. Kap. 1.7) folgte die Durchführung der eigentlichen Aufgabenstellung dieser Arbeit.

Da sich Antikörper mit hoher Spezifität an bestimmte Zielstrukturen (Antigene) binden, sind Testverfahren etwickelt worden, die ausschließlich auf dem Nachweis spezifischer Antikörper-Antigen-Komplexe basieren. Um festzustellen, ob ein Antikörper an sein Zielantigen gebunden hat, gibt es verschiedene Möglichkeiten. Eines dieser Verfahren ist der enzymgekoppelte Immunnachweis (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) (GLICK / PASTERNA, 1994), der in der vorliegenden Studie angewandt wurde.

Wegen der bei H. pylori-Infektionen häufiger beobachteten unabhängigen Kinetik der IgG-und IgA-Antikörper ist es sinnvoll, jede erstmalig untersuchte Probe parallel auf beide Antikörperklassen zu testen. Dies empfiehlt sich insbesondere auch für Titerverlaufsuntersuchungen nach erfolgter Antibiotika-Therapie.

↓35

In der Protokollführung der vorliegenden Studie wurden die einzelnen Schritte des ELISA-Testverfahrens wie folgt dokumentiert:

  1. Serumprobe, die ein spezifisches Molekül oder einen bestimmten Erreger enthalten sollen, wurden an einen festen Träger gebunden, meist auf einer Mikrotiterplatte aus Kunststoff mit 96 Vertiefungen.
  2. Ein markerspezifischer Antikörper (der primäre Antikörper) wurde auf das gebundene Material gegeben. Ungebundene primäre Antikörper wurden anschließend durch Waschen entfernt.
  3. Zugabe eines zweiten Antikörpers (sekundärer Antikörper), der an den primären Antikörper spezifisch bindet, aber nicht an das Zielmolekül. Der sekundäre Antikörper ist mit einem Enzym gekoppelt (beispielsweise alkalischer Phosphatase, Peroxidase oder Urease), das die Umwandlung eines farblosen Substrats in ein farbiges Produkt katalysiert. Ungebundene sekundäre Antikörper wurden ebenfalls durch Waschen entfernt.
  4. Zugabe des farblosen Substrats.

3.2.1  Serumproben

Für die Untersuchung geeignet waren nach Standard-Labortechniken (EDTA, Citrat, Heparin) entnommene Serum-und Plasmaproben.

3.2.2 Material und Geräte

↓36

Enzygnost Anti-H. pylori 2 / IgG Testplatte (Mikrotitrationsplatte, BEHRING).

3.2.3 Ablaufschema der serologischen Identifikationen

Die immunologische Bestimmung der Serumproben erforderte jeweils zwei Tage. Alle ELISA-Untersuchungen wurden in Doppelbestimmung durchgeführt.

↓37

1.Tag:

  1. AK wurde in Coating-Puffer verdünnt: 5 µl AK in 5 ml Coating-Puffer, dann erfolgte Coaten der Platte (50 µl / well) mit anschließender Inkubation 1 h bei 37°C im Brutschrank (feuchte Kammer).
  2. Die Platte wurde 4x mit Waschpuffer gewaschen (dann mehrmals ausgeklopft).
  3. Blocken der Platte: 100 µl / well, anschließend 2 h bei 37°C im Brutschrank inkubiert.
  4. 4x Waschen der Platte mit Wasch-Puffer (dann mehrmals ausgeklopft).
  5. Verdünnte Probe (2,5 µl AK in 2,5 ml PBS) wurde auf die Platte aufgetragen (100 µl/well) und inkubiert; über Nacht bei 4°C im Kühlschrank.

↓38

2.Tag:

  1. Die Platte wurde 4x mit Wasch-Puffer gewaschen.
  2. Verdünnung des 2. AK in PBS 1: 3000 und Auftragen auf die Platte
    (100 µl / well).
  3. Inkubation 1 h bei 37°C im Brutschrank (feuchte Kammer).
  4. 4x Waschen der Platte.
  5. Auftragung der verdünnten (1 : 1000) Strept.-Alkalische Phosphatase (100 µl / well) und anschließend Inkubation 1 h bei 37°C im Brutschrank (feuchte Kammer).
  6. Nach 4x Waschen der Platte folgte die Auftragung der Substrat-Lösung (Diethanolaminpuffer pH 9, 8): 50 µl / well.
  7. Inkubation: 1 h im Dunkeln bei RT.
  8. Auftragung der Stoplösung: 50 µl / well.
  9. Messen bei 450 nm.

3.3 Zweidimensionale Gelelektrophorese und Western - Blotting

3.3.1  Zweidimensionale Gelelektrophorese

Die zewidimensionale Gelelektrophorese ist eine speziell entwickelte Methode der Gelelektrophorese, bei der sehr komplexe Proteingemische in zwei Dimensionen nach jeweils anderen Kriterien aufgetrennt werden. In der ersten Dimension erfolgt in Gelröhrchen eine isoelektrische Fokussierung in Harnstoff unter Ausnutzung der Ladungsdifferenzen. Aminosäuren, die Grundbestandteile der Proteine, tragen mindestens eine Amino-sowie eine Säuregruppe. Die erstere ist bei neutralem pH-Wert positiv, die letztere negativ geladen. Da Proteine aus Aminosäuren aufgebaut sind, besitzen auch sie eine bestimmte Ladung. Verändert sich der pH-Wert der Lösung, in der sich das Protein befindet, ändert sich auch die Nettoladung des Moleküls. Der Punkt, an dem sich die positiven und die negativen Ladungen des Proteins gerade aufheben und es nach außen hin ungeladen erscheint, wird isoelektrischer Punkt (IEP) genannt. Die Proteine sowie deren Fragmente wandern innerhalb des Gels unter der Wirkung eines elektrischen Feldes in Abhängigkeit von Ladungsanzahl und Molekülmasse unterschiedlich schnell zu den jeweiligen Polen. In der zweiten, zur ersten Dimension quer in der Gelplatte verlaufenden Trennung erfolgt eine Separation nach den Molmassen der Einzelproteine. Dabei wird der Gelstreifen auf ein sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electophoresis (SDS-PAGE)-Gel transferiert und dann eine SDS-PAGE (Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese) durchgeführt (ANDERSON et al.,1984).

↓39

Die Bindung von SDS an Proteine verhält sich proportional zu deren Molekulargewicht. Die negative Ladung des gebundenen Detergens überwiegt gegenüber der intrinsischen Ladung des Proteins (ABBAS et al.,1996). Das gebundene Dodecylsulfat bewirkt darüber hinaus auch eine Entfaltung des Proteins. Nach Auftrennung sämtlicher Disulfidbindungen, die die einzelnen Polypeptidketten verbinden, entstehen semirigide lineare Gebilde, deren Länge proportional zum Molekulargewicht ist. Die Größe eines unbekannten Proteins kann ermittelt werden, indem die Wanderungsdistanz in SDS-PAGE mit derjenigen bekannter, parallel zur Probe angeordneter Standardpräparate verglichen wird. Mit dieser Methode kann die Größe jedes Proteins zwischen etwa
5 000 und 250 000 Dalton oder höher genau bestimmt werden (ABBAS et al.,1996).

Nach der Auftrennung wird die Position der Proteine im Gel durch Färbung ermittelt. Gebräuchliche Methoden sind die Fixierung der Proteine durch denaturierende Lösungsmittel und anschließende Anfärbung mit Proteinfarbstoffen wie Coommassie-Blau oder Verwendung der fixierten Proteine als Kristallisationspunkt einer in situ-Reduktion von Silbermolekülen (“Silberfärbung”). Anschließend werden elektrophoretisch aufgetrennte Proteine vom Gel auf eine Membran transferiert, auf der sie mit immunochemischen Methoden angefärbt werden (“Westernblotting”).

Abbildung 2: Nachweis eines Proteins auf einem Gel durch Western-Blotting. Die auf einem SDS-Polyacrylamidgel getrennte Proteine werden auf eine polymere Schicht übertragen und mit einem radioaktiven Antikörper gekennzeichnet. Auf dem Autoradiogramm erscheint dann eine Bande, die dem gesuchten Protein entspricht.

3.3.1.1  Herstellung der bei der 2D - Elektrophorese verwendeten Lösungen
(JUNGBLUT et al.,1997)

↓40

1. Dimension

1.) Ammoniumpersulfatlösung 0,8%ig

↓41

2.) WITA-IEF-Separationsgellösung

3.) WITA-IEF-Capgellösung

↓42

4.) Anodenlösung

wird frisch angesetzt:

↓43

5.) Kathodenlösung

wird frisch angesetzt:

↓44

6.) Überschichtungslösung

↓45

7.) Unterschichtungslösung

8.) WITA-Sephadex-Gellösung

↓46

9.) Inkubatioslösung

2. Puffer:

↓47

3. Lösung:

↓48

2. Dimension

1.) Ammoniumpersulfatlösung 1,28%ig (nur für WITA-Fertiggellösungen)

↓49

2.) Agarose

3.) WITA-SDS-PAGE-Gellösung

↓50

4.) Laufpuffer für die 2.Dimension wird frisch angesetzt:

↓51

5.) Fixierlösung

1. Abgemessen:

500 ml Methanol/Ethanol

100 ml Essigsäure

400 ml deionisiertem Wasser

3.3.1.2 Durchführung der 2D – Elektrophorese
(JUNGBLUT et al., 1997; KLOSE, J., 1975 )

1. Dimension

↓52

1.) Vorbereitung der Gelröhrchen:

Material / Geräte:

[vorher zurechtgelegt für einen Ansatz (8 Glasröhrchen)]

  • Gießvorrichtung und Vorratswanne für Gellösungen
  • 97 µl Separationsgellösung
  • 975 µl Capgellösung
  • 25 µl 0,8%ige Ammoniumpersulfatlösung
  • 2 Tuberkulinspritzen / 2 Hero-Injektionsnadeln
  • 2 Gilson-Pipetten (0 - 2 µl und 0 - 200 µl)
  • 8 Polypropylen (PP)-Fäden mit 1,5 mm Durchmesser
  • Glasröhrchen für Gele
  • Pumpe zur Entgasung der Gellösung / Anschlussstücke

Die Glasröhrchen wurden 25 mm vom oberen Rand mit einer zusätzlichen Hilfsmarkierung versehen. Die Glasröhrchen wurden mit dem Capgelende nach unten in die Gießvorrichtung eingespannt, so dass sie knapp oberhalb der Vorratswanne standen. PP-Fäden wurden vom oberen Ende bis zum unteren Ende durchgeschoben. Die Separationsgellösung und die Ammoniumgellösung wurden aufgetaut und die Separationsgellösung 5 Minuten lang entgast. Die Ammoniumsulfatlösung wurde zu den Capgel zugegeben. Diese wurde in die Vorratswanne eingefüllt, so dass die Enden aller Glasröhrchen in die Gellösung eintauchten. Die Gellösung wurde durch vorsichtiges Hochziehen der PP-Fäden bis zur 25 mm Markierung gezogen, dann die Gelvorratswanne entfernt und die Gellösung bis zur 13mm - Markierung hochgezogen. Nach 30minütiger Polymerisationszeit wurden die PP-Fäden herausgezogen, das Polymerisationswasser entfernt, eine Feuchtkammer angelegt. Hierzu wurde das Wasser oberhalb des Gels wurde mit einer ausgezogenen Pasteurpipette vorsichtig abgezogen. Durch Aufbringen eines großen Tropfens Aqua deion. auf die Kapillaröffnung bildete sich ein Luftpolster zwischen dem Gel und dem Wassertropfen. Die so entstandene Feuchtkammer wurde mit Parafilm fest verschlossen und Röhrchen im Gießstand umgedreht, so dass die Capgel-Seite nach oben zeigte. Die Capgellösung wurde aufgetaut und anschließend entgast. Zur Capgellösung wurde 10 µl 0,8%iger Ammoniumpersulfatlösung zugegeben. Dann erfolgte das Einfüllen der Capgellösung. Nach luftblasenfreier Überschichtung mit ca. 2 mm deionisiertem Wasser wurden die Röhrchen nach 15 Minuten mit Parafilm verschlossen und eingefroren.

↓53

2.) Probenauftrag:

Material / Geräte:

  • Anoden- und Kathodenlösungen
  • vorbereitete Probe (H. p.-Stamm: PA 4)
  • Sephadex-Lösung
  • Harnstoff
  • Ampholytmix
  • 5 µl Überschichtungslösung
  • deionisiertes Wasser
  • ausgezogene Pasteurpipetten
  • 2 Gilson-Pipetten (0 - 20 µl und 0 - 200 µl)
  • Multiflexspritzen
  • Fokussierungskammer

Eine mit Ethylendiamin frisch versetzte Kathodenlösung wurde in die untere Fokussierungskammer eingefüllt. Nach dem Auftauen der Sephadex-Lösung wurden 54 mg Harnstoff und 5 µl Ampholytmix zu 50 mg Sephadex-Gel gegeben und auf dem Vortex 15 Minuten kräftig geschüttelt. Die Glasröhrchen wurden mit der Capgelseite nach oben, in den Anodenteil der Kammer eingespannt, der Parafilm entfernt und die Kapillarröhrchen am Capgelende mit Kathodenlösung luftblasenfrei aufgefüllt, nachdem zuvor das Wasser entfernt worden war. Der Anodenteil wurde auf den unteren Teil der Fokussierungskammer eingesetzt, wobei die Röhrchen mit der Capgelseite in die Kathodenlösung eintauchen mussten. Der Parafilm und das Wasser wurden entfernt, anschließend die Auftragungsseite (eine Markierung) mit Filterpapierstreifen getrocknet. Die vorbereitete Probe und die Überschichtungslösung wurden aufgetaut. Nach Überschichten des Gels mit 2 mm geschütteltem Sephadex wurde die Probe luftblasenfrei aufgetragen. Die Überschichtungslösung wurde mit Multiflexsrpitzen vorsichtig auf die Probe aufgetragen, anschließend die Kapillaren luftblasenfrei mit Anodenlösung aufgefüllt.

↓54

3.) Lauf der 1. Dimension:

Materialien: - Power Supply (Spannungsbereich bis 1000 V)

Die Spannung wurde stufenweise erhöht: 100 V (60 Minute), 200 V (60 Minuten), 400 V (60 Minuten), 600 V (60 Minuten), 800 V (10 Minuten), 1000 V (5 Minuten).

↓55

4.) Inkubation der Gele und Vorbereitung für die 2. Dimension

Materialien:

  • Inkubationslösung
  • 87%iges Glycerin
  • Aqua deion.
  • kleine Petrischalen (Durchmesser: 5 cm)
  • 5 ml - Glaspipette mit Peleusball
  • Polypropylen(PP)-Fäden (Durchmesser: 1,5 mm)

Die Inkubationslösung wurde aufgetaut und 0,4 g DDT dazu gegeben. Nach Beendigung des Laufes der 1.Dimension wurde die Kathoden- und die Anodenlösung aus den Röhrchen entfernt und die Capgelseite mit 87%igem Glycerin aufgefüllt. Danach erfolgte das Einfüllen von jeweils 5 ml Inkubationslösung in die Petrischalen. Die Gele wurden mit PP-Fäden ausgestoßen. Nach genau 10minütiger Inkubation der Gele unter ständigem Schütteln bei Raumtemperatur, wurde die Inkubationslösung abgegossen und die Gele in den Petrischalen bei -700C aufbewahrt.

↓56

2. Dimension

1.) Vorbereitung der Gele

Materialien für zwei Kleingele:

  • 70%(v/v) Ethanol
  • deionisiertes Wasser / Kimwipes
  • 2 kleine und 2 große Glasplatten
  • vier Spacer (1,5 mm Dicke) / 2 Sandwich-Gestelle
  • 1 Gießstand mit Gummidichtung am unteren Ende
  • BioRad-Kammer für Kleingele inkl. Halterung mit Netzanschluss und Deckel
  • Agarose-Lösung / 18 ml Gellösung
  • 1,2 ml 1,28%iges Ammoniumpersulfat

↓57

Die Agarose-Lösung wurde auf 70°C zur Verflüssigung erhitzt. Dann erfolgte das Abkühlen der Agarose auf 40°C, um eine Verfestigung zu vermeiden. Die Glasplatten und Spacer wurden mit 70%igem Ethanol gereinigt. Die Gellösung und das Ammoniumpersulfat wurden aufgetaut. Dann wurden die Platten in das Sandwich-Gestell eingespannt. Auf der kleineren Glasplatte wurde 6,9 cm vom Boden aus eine Markierung als Gießhilfe angebracht. Das Sandwich-Gestell wurde in den Gießstand eingespannt. 18 ml Gellösung wurden mit 1,2 ml Ammoniumpersulfatlösung so vermengt, dass sich kein Schaum bildete. Das Gel wurde gegossen (das Töpfchen mit der Gellösung wurde so an die hintere Glasplatte über der Einfüllöffnung angelegt, dass das Gel luftblasenfrei am Glas entlang in die Tasche laufen konnte. Aufgefüllt wurde bis zur Markierung). Nach dem Einfüllen der Gellösung wurde diese zur Glättung der Oberfläche und Förderung der Polymerisation mit deionisiertem Wasser überschichtet. Die Gele waren nach 60 Minuten für den Lauf der 2.Dimension bereit.

2.) Probenauftrag

Material / Geräte:

  • Filterpapier
  • Agarose-Lösung (40°C warm)
  • schmaler Spatel
  • Sandwich-Gestelle
  • Gele der 1.Dimension
  • Laufpuffer (800 ml)

↓58

Die Geloberfläche wurde mit Filterpapier vom deionisierten Wasser befreit. Die Sandwich-Gestelle wurden in die Halterung mit Netzanschluß eingespannt. (Die Schrauben zeigten dabei nach außen, die "Hörnchen" nach oben). Die Rundgele wurden auf die Geloberfläche aufgebracht: Dazu wurde das Rundgel aus der Inkubationslösung der Länge nach auf den Rand der dicken Plexiglasplatte gelegt. Dabei war darauf zu achten, dass das Rundgel möglichst nah am Rand der Einfülltasche lag. Das Rundgel ließ sich mit dem Spatel von einem Ende aus vorsichtig in die Einfülltasche gleiten. Anschließend wurde die 40°C warme Agarose mit einer Pasteur-Pipette bis zum oberen Rand der kleineren Glasplatte in die Einfülltasche luftblasenfrei gefüllt. Nach zwei Minuten war die Agarose fest. Nach Einsetzen der Halterung mit den Sandwich-Gestellen wurden außen 620 ml Luftpuffer eingefüllt, wobei Schaumbildung und Luftblasen zu vermeiden waren. In die innere Kammer wurde so viel Puffer eingefüllt, dass der rote Punkt leicht in den Puffer eintauchte.

3.) Lauf der 2.Dimension

Material / Geräte:

  • Power Supply (Arbeiten im High Range Bereich)
  • Fixierlösung

↓59

Die Spannung wurde entsprechend folgender Tabelle stufenweise erhöht:

Spannung (vorgegeben)

Zeit

(Min.)

zwei Kammern parallel (Stromstärke zur Kontrolle)

35 V

55 V

100 V

150 V

5

10

15

60

44-42 mA

66-64 mA

118-96 mA

144-100 mA

↓60

Nach dem Lauf wurden der Puffer abgegossen und die Sandwich-Gestelle aus der Halterung genommen. Die Gele konnten nun in die Fixierlösung überführt werden. Dazu wurden Handschuhe benutzt, die vorher unter Wasser abgespült wurden, um eventuell anhaftendes Talkum zu entfernen. Als Fixierlösungen dienten Mischungen aus 50% Methanol, 10% Essigsäure und 40% Wasser. Nach der Fixierung konnte die Färbung erfolgen.

3.3.2 Blotten („Westernblot“)

Theoretisches:

Beim Immunoblotting auch Western-Blotting handelt es sich um ein sehr empfindliches und spezifisches Verfahren zum Protein-Nachweis. Es verbindet die hohe Trennschärfe der Gel-Elektrophorese mit der Spezifität der Antikörper-Erkennung und der Empfindlichkeit von Enzym-Assays (LODISH et al., 1996). Das heißt, nach Trennung der Proteinantigene mit Zweidimensionaler-Gelelektrophorese (SDS-Elektrophorese) werden die getrennten Substanzen auf eine Nitrozellulose-Membran überführt (Transfer). Die Identifizierung der aufgetrennten Proteine erfolgt durch Serumantikörper und anschließend mit Enzym-markierten Antikörpern. Dadurch werden die Antigene sichtbar gemacht: Der Antikörper (Ak 1) bindet spezifisch an der Stelle des fixierten Antigens. Im letzten Schritt wird die Membran mit einem zweiten, enzymmarkierten Antikörper (Ak 2) inkubiert, der spezifisch an den ersten Antikörper bindet, durch dessen Enzymanteil die Position auf der Membran mit Hilfe einer chromogenen Reaktion sichtbar gemacht werden kann (Entwicklung).

3.3.2.1  Durchführung(ECKERSKORN et al., 1988)

↓61

Material / Lösungen:

↓62

Ablaufschema beim Immunoblot:

  1. Auftrennung der Proteine durch Elektrophorese im SDS-Polyacrylamid-Gel.
  2. Übertragung der aufgetrennten Protein auf Nitro-zellulose-Membran. Danach wurde die Membran 25 Sekunden in Methanol gewaschen, anschließend 5 Minuten im Blotpuffer geschwenkt.
  3. Die Membran wurde mit geeigneten Verdünnungen der Antiseren (Ak 1) in Blockierungslösung unter Schütteln inkubiert (1 Stunde, RT) und zum Entfernen der überschüssigen Antikörper anschließend mit PBS-Tween 5mal 20 Min. gewaschen.
  4. Nach der Inkubation der Membran mit dem zweiten Antikörper (Ak 2), erfolgte das Waschen der Membran.
  5. Der Immunoblot wurde durch Zugabe von 100 ml Substratpuffer entwickelt und anschließend luft-getrocknet.

3.4 Färbeverfahren

3.4.1  Gelfärbeverfahren

3.4.1.1  Coommassie Brilliant Blue - Färbung

Material:

↓63

Lösungen:

(für 2 KGT-Gele)

  • Fixierungslösung: 250 ml Ethanol + 50 ml HAc +200 ml deionisiertes Wasser
  • Färbelösung: 250 ml Methanol + 50 ml HAc + 200 ml deionisiertes Wasser + 0,25 g Serva Blue R-250
  • Entfärbelösung: 25 ml Methanol + 62,5 ml HAc + 412,5 ml deionisiertes Wasser
  • Aufbewahrungslösung: HAc + 1860 ml deionisiertes Wasser

↓64

Die Gele wurden über Nacht in der Fixierungslösung vorsichtig geschwenkt. Zur Färbung wurden sie unter leichtem Schütteln für 1 h mit der Färbelösung behandelt. Um überschüssige Farbe zu entfernen, wurden die Gele in der Entfärbelösung unter leichtem Schwenken für 1 h gewaschen. Die weitere Entfärbung wurde mit der Aufbewahrunslösung für 4 h durchgeführt. In der ersten Stunde wurde die Lösung zweimal gewechselt, danach jede Stunde einmal.

Die Aufbewahrung von eingeschweißten Gelen erfolgte bei 4° C in Aufbewahrungs-lösung (ECKERSKORN et al., 1988).

3.4.1.2 Silberfärbung(HEUKESHOVEN et al., 1985)

Material:

↓65

Lösungen:

↓66

Die Gele wurden über Nacht in der Fixierlösung geschüttelt. Nach leichtem Schwenken (2h) der Gele in der Inkubationslösung wurden sie 3x je 20 Minuten in deionisiertem Wasser gewaschen. Die Färbung der Gele erfolgte unter leichtem Schütteln in der Silberlösung über 30 Minuten. Anschließend wurden die Gele mit deionisiertem Wasser 2,5 Min. lang abgespült. Schließlich erfolgte die Entwicklung der Gele unter leichtem Schütteln in der Entwicklungslösung über 5 Min. Nach Erreichen der gewünschter Färbeintensität wurden die Gele 15 Min. in die Stopp-Lösung überführt.

3.5  Auswertung von zweidimensionalen Gelen und Blots

Um die analytischen 2-DE-Gele auswerten zu können, wurden sie unmittelbar nach der Silberfärbung eingescannt.

↓67

Zur Identifizierung von Proteinen wurde ein Internet-basiertes Programm verwendet, das auf eine Proteindatenbank zugreift.

Das Programm identifiziert Proteine an Hand ihrer 'peptide mass fingerprint'-Spektren nach proteolytischer Spaltung und Massenspektrometrie.

Zur Datenbanksuche wurde neben Peptidmassen und Sequenzinformationen ein molekularer Massenbereich von 10-100 kDa und ein pI-Bereich von 3-4 für die untersuchten Proteine verwendet.

↓68


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HTML-Version erstellt am:
12.09.2006