5 ERGEBNISSE

↓69

Der Bezugszeitraum für die Endoskopien war Dezember 1997 bis August 1999. Die Untersuchung des Patientenmaterials (Histopathologie, Bakterienkultur, ELISA, Immunoblots) fand im Zeitraum von Dezember 1997 bis August 2000 im Campus Virchow der Charitè der Humboldt Universität zu Berlin und im Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie, Abteilung Molekulare Biologie statt. Insgesamt wurden 334 Patienten, bei denen eine Gastroskopie durchgeführt wurde, untersucht.

Nach Begutachtung der Diagnosestellung nach Histologie, CLO und/oder H. pylori-Anzucht wurden 79 Patienten mit unterschiedlichen Krankheitsbildern ausgewählt (entweder Gastritis, Magenulkus, Duodenalulkus oder Magenkarzinom, außerdem Patienten mit Dysplasie, Metaplasie, Hyperplasie und Polypen), die nach Diagnosestellung geeignet waren und sich für eine weitreichende Anamnese sowie für weitere Untersuchungen bereit fanden.

↓70

Von jedem Patienten wurde eine Anamnese seiner aktuellen Beschwerden erhoben. Erfragt wurden Beschwerden wie Nüchternschmerz, Erbrechen, Vollegefühl, Schmerzen im Epigastrium oder retrosternal, auch in Abhängigkeit von der Körperlage, Obstipation, Diarrhoe und Flatulenz. Ebenso wurden Nikotinanamnese, Alkoholanamnese, regelmäßige Einnahme von nichtsteroidalen Antirheumatika, Kortikosteroiden, Immunsuppressiva und anderen Medikamenten, sowie Vorerkrankungen und deren diagnostische Abklärung (aus Unterlagen) eruiert.

55% dieser 79 Patienten gaben Oberbauchbeschwerden, Übelkeit, Völlegefühl und Ruktation an. Bei 60 (ca.76%) von 79 Patienten lag ein histopathologischer Befund vor. Bei 18% der Patienten war ambulant eine Helicobacter-Infektion durch CLO-Schnelltest festgestellt worden, worauf sie stationär aufgenommen wurden. Annähernd 30% der Patienten berichteten über Gastritis- oder Ulkuserkrankungen, die mehr als drei Jahre zurücklagen. Bei 12% der Patienten lagen Herz-Kreislaufleiden mit entsprechender medikamentöser Therapie vor. Bei 22% der Patienten war hausärztlich eine festgestellte allergische Erkrankung bekannt.

5.1  Diagnostik und Prävalenzen einer Helicobacter pylori-Infektion

Bei der Auswahl der Patienten für die in dieser Studie angestrebte Serum-Analyse wurden strengere diagnostische Kriterien als im klinischen Bereich üblich angelegt.

↓71

Bei den 79 Patienten wurden folgende diagnostische Assays durchgeführt: CLO-Test, H. pylori-Anzucht, Histologie und ELISA auf H. pylorispezifische Antikörper.

5.1.1  CLO-Test und Helicobacter pylori-Anzucht

Von den untersuchten 79 Patienten erwiesen sich 47 (59,5%) als CLO-positiv, 29 (36,7%) als CLO-negativ und bei 3 (3,8%) der Patienten konnte keine eindeutige Diagnose gestellt werden.

Bei 32 der 79 Patienten (40,59%) konnte eine H. pylori-Anzucht erzielt werden. Bei 38 Patienten (48,1%) war kein Wachstum zu beobachten. Bei 9 Patienten (11, 39%) lag kein Material für die mikrobiologische Untersuchung vor.

5.1.2 Histologische Untersuchungsergebnisse

↓72

Für 60 der 79 ausgewählten Patienten standen histopathologische Befunde zur Verfügung. Bei den restlichen 19 Patienten konnte kein Material für die histopathologische Untersuchung gewonnen werden.

Die histologischen Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.

Tab. 3: Anzahlen (n) und relative Häufigkeiten (%) histologisch begründeter Diagnosestellungen

Diagnose

Personen

n

%

Normalbefund

Gastritis (H. p.assoziiert)

Gastritis (unspezifisch)

Ulcus ventr./duodeni

Karzinom ventr./oesoph.

MALT-Lymphom

Gastrale Metaplasie

Gastrale Dysplasie

Gastrale Hyperplasie

Gastrale Adenome

Polypen des Magens

9

16

10

11

6

1

2

1

1

1

2

15,0

26,6

16,6

16,6

10,0

1,6

5,0

1,6

1,6

1,6

3,3

Gesamt

60

100,0

5.1.3 Ergebnisse der ELISA-Tests

↓73

Bei 46 der 79 Patienten war ausreichend Serum vorhanden, so dass zur Stützung eines H. pylori-Status ein spezieller Serum-ELISA-Test durchgeführt werden konnte.

Tabelle 4 zeigt die H. pylori-Antikörpertiter bei den klinisch untersuchten Patienten. Die hierbei festgestellten Serum-IgA- und IgG-Werte wurden auch als H. pylori-Infektions-Parameter für den H. pylori-Status in die Studie mit einbezogen.

Die Serum-IgA- und Serum-IgG-Antikörper-Titer lagen in der H. pylori-positiven Gruppe (n=24) signifikant höher im Vergleich zur H. pylori-negativen Gruppe (n=12). Unter den H. pylori-positiven Seren stellte das Serum eines Patienten (Blot Nr. 17) mit negativem Antikörper-Titer eine Ausnahme dar. Bei allen H. pylori-negativen Seren war der Antikörper-Titer negativ. Karzinompatienten zeigten unterschiedliche Serum-Antikörpertiter gegen H. pylori.

↓74

Tab. 4: ELISA -Titerergebnisse untersuchter Patienten (H. p. = H. pylori)

Serum (Blot)

Nr.

Patientenkürzel

H. p.-Status

H. p.-spez.IgG (U/ml)

H. p.-spez.IgA (U/ml)

2

8

Ka

H. p.positiv

570

hoch-pos

3

3

Ka/UH-A

nicht eindeutig

29

150

4

44

MPI

Karzinom

neg

neg

6

46

MPI

nicht eindeutig

neg

neg

7

47

MPI

nicht eindeutig

neg

neg

13

40

MPI

H. p.negativ

neg

neg

14

95

Ka

H. p.positiv

250

38

15

41

MPI

H. p.positiv

34

32

16

223

Ka

H. p.positiv

160

39

17

54

MPI

H. p.positiv

neg

neg

18

97

Ka

nicht eindeutig

neg

22

19

23

Ka

H. p.positiv

47

61

20

122

Ka

nicht eindeutig

neg

neg

28

102

Ka

H. p.positiv

900

12

31

112

Ka

H. p.positiv

17

170

33

61

MPI

nicht eindeutig

23

neg

37

184

Ka

Karzinom

pos

neg

38

22

Ka

H. p.positiv

24

neg

39

16

Ka/UH

H. p.positiv

350

180

40

143

Ka

Metaplasie

480

68

42

169

Ka

H. p.positiv

24

30

43

31

Ka

H. p.positiv

110

neg

44

119

Ka

eradiziert

81

neg

45

80

Ka

eradiziert

17

50

46

213

Ka

nicht eindeutig

neg

25

47

64

Ka

H. p.positiv

15

160

48

62

MPI

nicht eindeutig

neg

25

49

224

Ka

eradiziert

neg

28

102

28

MPI

H. p.negativ

neg

neg

103

31

MPI

H. p.negativ

neg

neg

104

42

MPI

H. p.negativ

neg

neg

106

29

MPI

H. p.negativ

neg

neg

107

33

MPI

H. p.negativ

neg

neg

109

43

MPI

H. p.negativ

neg

neg

110

45

MPI

nicht eindeutig

neg

neg

111

60

MPI

H. p.negativ

neg

neg

114

10

MPI

H. p.negativ

neg

neg

116

38

MPI

H. p.negativ

neg

neg

121

219

Ka

Karzinom

57

72

123

52

MPI

H. p.positiv

13

neg

124

59

MPI

H. p.positiv

11

11

125

20

Ka

H. p.positiv

100

31

126

202

Ka

H. p.positiv

neg

17

127

226

Ka

H. p.positiv

240

pos

128

192

Ka

H. p.positiv

230

10

129

1

MPI

H. p.positiv

neg

neg

Bei den 3 eradizierten Patienten gab es keine auffälligen Unterschiede in der Häufigkeit oder Höhe der Antikörper-Titer im Vergleich zu den übrigen Patientenseren.

5.1.4 Auswahlkriterien zur Definition des Helicobacter pylori - Status

Für die Definition eines eindeutigen H. pylori-Status wurden in dieser Studie folgende Parameter herangezogen: Histopathologischer Befund, CLO (Urease-Schnelltest), Bakterienkultur, ELISA-Titer und H. pylori -Infektion in der Anamnese (aus Unterlagen).

↓75

Als Patienten mit negativem H. pylori-Status sind diejenigen wurden gezählt, bei denen alle genannten Parameter negativ ausfielen, als eindeutig positiv diejenigen Patienten, bei denen mindestens drei Parameter positiv waren. Patienten, die diesen Kriterien nicht entsprachen, wurden einer dritten Gruppe zugeordnet (Tabelle 5).

Von 24 H. pylori-positiven Patienten erfüllten 20 Patienten vier Parameter und
4 Patienten drei Parameter.

Tab. 5: Kriterien für die Definition des Helicobacter pylori-Status.

Eindeutig H. p.- negativ

Eindeutig H. p.- positiv

H. p.- Status nicht eindeutig

Alle diese Parameter negativ:

1. CLO-Test

3. Histologie

3. Kultur

4. ELISA

5. Keine H. p.-Infektion in der Anamnese

Mindestens drei dieser Parameter positiv:

1. CLO-Test

2. Histologie

3. Kultur

4. ELISA

5. H. p.-Infektion in der Anamnese

Weniger als drei Parameter positiv aber mit einem der folgenden histopathologischen Befunde:

Ulkus,

Dysplasie,

Metaplasie,

Lymphom,

oder Karzinom

5.1.5 Gruppeneinteilung für die Analyse der Immunoblots

↓76

Bei 55 der 79 Patienten wurden Immunoblots zur Reaktivität der Serum-Antikörper gegen H. pylori erstellt.

Unter den 55 Patienten, bei denen diese Untersuchungen durchgeführt wurden, waren nach der oben genannten Definition 24 eindeutig H. pylori-positiv und 12 eindeutig
H. pylori-negativ. 19 Patienten wiesen nicht einen eindeutigen H. pylori-Status auf.

Bei 15 der 24 eindeutig H. pylori-positiven Patienten lag entsprechend dem histopathologischen Befund eine Gastritis vor, bei 6 ein Ulcus ventriculi, sowie bei 3 ein Ulcus duodeni. Bei den 12 H. pylori-negativen Patienten lag bei 9 eine Gastritis und bei 3 ein Ulcus vor.

↓77

Von den 19 nicht eindeutig H. pylori-positiven Patienten wurde in 5 Fällen die Diagnose Karzinom und in einem die Diagnose MALT-Lymphom gestellt, in 10 Fällen die Diagnose Magen- oder Duodenalulkus mit Gastritis.

Die übrigen 3 Fälle, bei denen histologisch eine Hyperplasie/Dysplasie oder eine erfolgreiche Eradikation vorlag, wurden wegen der geringen Anzahl nicht als eigene pathologische Gruppe erfaßt.

↓78

Bei Patientenanzahlen, deren Größe eine statistische Auswertung zuließ, wurde somit folgende Gruppeneinteilung durchgeführt:

  1. Gruppeneinteilung nach H. pylori-Status:

    Gruppe 1: H. pylori-Status positiv, 24 Patienten
    Gruppe 2: H. pylori-Status negativ, 12 Patienten
    Gruppe 3: H. pylori-Status nicht eindeutig, 19 Patienten
  2. Weitere Gruppeneinteilung der 24 H. pylori-positiven Patienten nach Krankheitsbild: 15 Patienten mit Gastritis und 9 mit Ulkus
  3. 6 Karzinompatienten aus der Gruppe mit nicht eindeutigem H. pylori-Status
  4. 13 weitere, nicht eindeutig H. pylori-positive Patienten.

5.2 Analyse von zweidimensionalen Gelen und Blots

Um eine Korrelation von Antigenerkennung mit den verschiedenen Krankheitsbildern der H. pylori-Infektion herstellen zu können, wurde die Reaktivität von Serumantikörpern der Patienten gegenüber unterschiedlichen Antigene von H. pylori untersucht. Dazu wurde zunächst ein Standardgel mittels großgeltechnik (GGT) erstellt. Die H. pylori-Proteine wurden aus einem Gesamtlysat des sequenzierten H. pylori-Stammes 26695
Abbildung 3: Darstellung der analytischen zweidimensionalen Auftrennung von Helicobacter pylori 26695 (in Silberfärbung) in der Datenbank des MPI. Markierte Proteinspots sind identifizierte Antigene (Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie, Berlin).

↓79

gewonnen und mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Identifizierung der einzelnen Proteinspezies aus diesem zweidimensionalen Gelmuster erfolgte durch Vergleich von Proteinspots auf diesem Gel nach Silberfärbung mit bereits bekannten Spots, die in einer Zweidimensionalen-Datenbank des Max-Planck-Institutes, zusammengestellt wurden (Abbildung 3).

In dieser Datenbank sind inzwischen über 150 identifizierten Proteinspots von H. pylori-26695 erfaßt. Die Identifizierung dieser Proteinspots war mittels Verdau von Coomassie-Gelen und anschließender Analyse mit Hilfe von MALDI-TOF-Massenspektrometrie gelungen.

↓80

Auf dem silbergefärbten zweidimensionalen Gelmembran konnten ca. 1800 Proteinspots von H. pylori 26695 detektiert werden (Abbildung 4). Damit war eine Grundlage für den Vergleich von Proteinen, die durch Patientenseren erkannt wurden, geschaffen. Für jedes der 55 Patientenseren waren zwei Gele mittels Kleingeltechnik (KGT) erstellt und mittels Immunoblot gefärbt worden. Aufgrund der geringen Mengen an jeweils zur Verfügung stehendem Serum und der großen Anzahl an zu untersuchenden Gelen wurde der KGT gegenüber GGT der Vorzug gegeben.

Sämtliche Serumproben der 55 Patienten wurden jeweils einem IgA- und einem IgG-Immunoblot-Assay unterzogen.

Nach Inkubation der auf PVDF-Membranen geblotteten zweidimensionalen Gele aus den Seren der verschiedenen Patienten konnten 379 Proteinspots von H. pylori-26695 (PA4-Gel) auf Immunoblots detektiert werden. Diese Spots wurden in den einzelnen Immunoblots nach ihrer Intensität visuell ausgewertet.

↓81

Zur visuellen Auswertung der Immunoblots wurden diese auf eine Leuchtplatte gebracht. Zunächst werden sie im Gesamtüberblick miteinander verglichen und auffällige Unterschiede notiert. Dann erfolgte der Vergleich der Proteine Spot für Spot nach einzelnen Sektoren. Für die visuelle Auswertung der Spots waren 5 Intensitätsgrößen vorgegeben. Die Intensität eines bestimmten Spots wurde auf einer speziellen Skala von 0,5 bis 4 klassifiziert.

Außerdem wurde für jede Gruppe von Seren eine Signalfrequenz berechnet, welche das Auftreten einer Erkennung und die Intensität des Spots für einen semiquantitativen Vergleich wie er in früheren Studien (JUNGBLUT et al., 1999) definiert worden ist, berücksichtigt.

↓82

Abbildung 4: Analytische Auftrennung der Proteine von H. pylori 26695 (PA4-Gel) in Silberfärbung
(IEF: Isoelektrische Fokussierung = Auftrennung nach Ladung, Mr: Molekulargewicht in Dalton)

Abbildung 5 zeigt im Vergleich die Immunoblots von zwei verschiedenen Patienten.

↓83

Abbildung 5: Vergleich der Immunoblots eines H. pylori-positiven Ulkus- (links) und eines H. pylori-negativen Gastritispatienten (rechts) in Commasie-Blue -Färbung.

Nach visueller Auswertung der Proteinspots wurde für jeden Spot dessen Intensität bei Erkennung in den jeweiligen Seren tabellarisch zusammengestellt. Dann wurden die Spots auf den Immunoblots mit den Spots auf dem Standardgel verglichen (Abb. 3) und somit die jeweils erkannten Proteine identifiziert.

5.3 Qualitative Auswertung der Immunoblots

Für jede Krankheitsgruppe wurden anhand der quantifizierten Spotstärken, d.h. der Intensitäten, deren Signalfrequenzen berechnet. Unter Signalfrequenz versteht sich die Summe der Intensitäten der Proteinspots einer Gruppe von n-Seren bezogen auf die maximal erreichbare Intensitätsstärke der Gruppe von n-Seren. Die Signalfrequenz wurde bereits in einer früheren Studie (JUNGBLUT et al., 1999) beschrieben.

↓84

Als Beispiel werden nachfolgend 4 Immunoblots von Seren eines Patienten ohne H. pylori-Infektion (Abbildung 5A) und jeweils eines Patienten mit H. pylori-assoziierter Gastritis (Abbildung 5B), H. pylori-assoziiertem Ulkus (Abbildung 5C) sowie mit Karzinom (Abbildung 5D) gezeigt.

Abbildung 5A: Eindeutig identifizierte Antigene (Proteinspots) des H. pylori-26695-Stammes, die nach Immunfärbung der 2-DE-Blots durch Seren von Patienten mit nicht H. pylori-assoziierter Gastritis erkannt wurden.
Die einzelnen Proteinspots sind durch ihre Identitätsnummer und durch vorangestellte Ziffern von 1_ bis 6_ entsprechend ihrer Position auf einer der 6 Sektoren der Blots in der 2-DE-Datenbank gekennzeichnet.

Abbildung 5B: Eindeutig identifizierte Antigene (Proteinspots) des H. pylori-26695-Stammes, die nach Immunfärbung der 2-DE-Blots durch Seren von Patienten mit H. pylori-assoziierter Gastritis erkannt wurden.
Die einzelnen Proteinspots sind durch ihre Identitätsnummer und durch vorangestellte Ziffern von 1_ bis 6_ entsprechend ihrer Position auf einer der 6 Sektoren der Blots in der 2-DE-Datenbank gekennzeichnet.

↓85

Abbildung 5C: Eindeutig identifizierte Antigene (Proteinspots) des H. pylori-26695-Stammes, die nach Immunfärbung der 2-DE-Blots durch Seren von Patienten mit Ulcus ventriculi et duodeni erkannt wurden.
Die einzelnen Proteinspots sind durch ihre Identitätsnummer und durch vorangestellte Ziffern von 1_ bis 6_ entsprechend ihrer Position auf einer der 6 Sektoren der Blots in der 2-DE-Datenbank gekennzeichnet.

Abbildung 5D: Eindeutig identifizierte Antigene (Proteinspots) des H. pylori-26695-Stammes, die nach Immunfärbung der 2-DE-Blots durch Seren von Patienten mit Magenkarzinom erkannt wurden.
Die einzelnen Proteinspots sind durch ihre Identitätsnummer gekennzeichnet Sie sind in den Identifikationsgelen und Tabellen zur schnelleren Auffindung durch die vorgestellten Buchstaben A – F für die einzelnen 6 Sektoren des Gels gekennzeichnet. In der 2 – DE – Datenbank sind die Gele aus technischen Gründen durch vorangestellte Ziffern von 1_ bis 6_ entsprechend ihrer Position auf einer der 6 Sektoren der Blots in der 2-DE-Datenbank gekennzeichnet. Daher wurde diese Nomenklatur der Sektoren 1_ bis 6_ auf den aus einer Datenbank übernommenen Abbildungen beibehalten, ist aber ganz einfach den Buchstaben A – F zuzuordnen.

In der Silberfärbung waren sieben Serienspots detektiert worden, die verschiedenen Proteinspezies des gleichen Proteins entsprechen. Diese Proteinspezies stellen Hauptantigene von H. pylori dar(Tab.7). GroEL-Protein (HP0010, Hauptspot A390)[entspricht 1_390], 50S ribosomales Protein L7/L12 (HP1199, Hauptspot E35) [entspricht 5_35] und Katalase (HP0875, Hauptspot B439 [entspricht 2_439]) reagierten mit den Seren aller vier Patienten in Abbildungen 5A-D. Urease B (HP0072, Hauptspot A343[entspricht 1_343]) reagierte sowohl mit den Seren von H. pylori-negativen als auch von Gastritis- und Ulkuspatienten, während die Spotserie von
Cag 26 (Cag A) (HP0547, Spot B126[entspricht 2_136]) nur mit Seren von Gastritis- und Ulkuspatienten reagierte (Abbildungen 5B und 5C). Die Isocitrat-Dehydrogenase (HP0027, Hauptspot B492[entspricht 2_492]) und das Putative-Neuraminyl-Lactose-Bindungs-Protein, HpaA (HP0410,Hauptspot D132[entspricht 4_132]) reagierten mit Gastritis-, Ulkus- und Krebsseren (Abbildungen 5B-D).

5.4 Quantitativer Vergleich der Immunoblots von Helicobacter pylori - positiven Patienten mit Helicobacter pylori - negativen Patienten

↓86

Um den grundlegenden Einfluß einer H. pylori-Infektion auf die Muster der Antigenerkennung zu untersuchen, wurde die Reaktivität der Seren auf den Immunoblots von 24 H. pylori-positiven und 12 H. pylori-negativen Patienten verglichen (Tabelle 6). Die Anzahl der Spots, die durch Seren von H. pylori-positiven Patienten erkannt wurde, war weit gestreut im Bereich n=7-153 (Mittelwert 52 Spots), während durch Seren von H. pylori-negativen Patienten erkannten Spots im Bereich n=3-66 lag (Mittelwert 20 Spots).

Tab. 6: Anzahl der Proteinspots, die durch Seren von H. pylori-positiven und H. pylori-negativen Patienten erkannt wurden

Immunoblots H. pylori-

positiver Patienten

Immunoblots H. pylori-

negativer Patienten

Blot-Nr.

(n=24)

Anzahl der Spots

Blot-Nr.

(n=12)

Anzahl der Spots

2

118

13

17

14

153

35

3

15

66

102

17

16

56

103

14

17

87

104

15

19

95

106

24

28

26

107

23

29

49

109

36

31

39

111

21

34

23

112

19

36

7

114

51

38

31

116

66

39

42

  

42

43

  

43

43

  

47

35

  

122

21

  

123

75

  

124

89

  

125

104

  

126

60

  

127

125

  

128

119

  

129

34

  

Insgesamt wurden in H. pylori-positiven Patientenseren 310 unterschiedliche Proteinspots (Antigene) erkannt. Hiervon wurden 116 jedoch ausschließlich in Seren von H. pylori-positiven Patienten erkannt, während 156 Spots eine höhere Signalfrequenz gegenüber den Seren von negativen und 38 Spots bei Seren von positiven und negativen Patienten die gleiche Signalfrequenz aufwiesen.

↓87

Tabelle 7 listet Spots und zugehörige Proteine auf, die durch Seren von H. pylori-positiven Patienten mit einer Signalfrequenz oberhalb einer Schwelle von 10 erkannt

Tab. 7: In H. pylori-positiven Seren (n=24) und H. pylori-negativen Seren (n=12) erkannte Antigene mit der Signalfrequenz > 10 bei den positiven. (KGT : Kleingeltechnik, GGT: Großgeltechnik, ORF: Open reading frame, Sektoren A-F in GGT entsprechen 1_5_ in der Datenbank und in den Abbildungen)

H. p.- positive Seren

(n=24)

H. p.- n e gative Seren

(n=12)

Spot Nr.

GGT

ORF

Antigene

Frequenz

Frequenz

74

A177

HP0010

60kD Hitzeschock-Protein (GroEL)

14,58

0,00

77

A194

HP0010

60kD Hitzeschock-Protein (GroEL)

31,77

13,54

80

A390

HP0010

60kD Hitzeschock-Protein (GroEL)

37,50

13,54

90

A388

HP0010

60kD Hitzeschock-Protein (GroEL)

36,98

11,46

215

A192

HP0010

60kD Hitzeschock-Protein (GroEL)

26,04

7,29

290

A119

HP0010

60kD Hitzeschock-Protein (GroEL)

17,71

1,04

70

E44

HP1199

50S ribosomales Protein L7/L12

29,69

2,08

87

E35

HP1199

50S ribosomales Protein L7/L12

60,94

27,08

140

E27

HP1199

50S ribosomales Protein L7/L12

27,60

6,25

92

A343

HP0072

Urease B

28,13

14,58

273

A325

HP0072

Urease B

23,96

11,46

301

A323

HP0072

Urease B

23,96

4,17

102

A209

HP1132

ATP-Synthase B

16,15

1,04

109

A477

HP1205

Elongationsfaktor-(EF-TU)

17,71

3,13

129

-

-

nicht identifiziert

13,54

0,00

141

-

-

nicht identifiziert

11,98

1,04

145

-

-

nicht identifiziert

10,42

0,00

147

A461

HP1293

DNA-abhängige RNA Polymerase

16,67

5,21

171

D262

HP1098

Hypothetical Protein

13,54

23,96

187

A396

-

nicht identifiziert

15,10

1,04

207

-

-

nicht identifiziert

25,52

0,00

209

-

-

nicht identifiziert

25,52

0,00

214

-

-

nicht identifiziert

19,27

3,13

238

-

-

nicht identifiziert

14,06

1,04

135

B126

HP0547

Cag 26 (Cag A)

28,65

0,00

244

B126

HP0547

Cag 26 (Cag A)

37,50

0,00

251

B126

HP0547

Cag 26 (Cag A)

36,46

0,00

259

B126

HP0547

Cag 26 (Cag A)

36,46

0,00

263

B126

HP0547

Cag 26 (Cag A)

32,81

0,00

270

B19

HP0192

Fumarat-Reduktase (Flavoprotein )

16,67

0,00

276

-

-

nicht identifiziert

28,13

2,08

294

-

-

nicht identifiziert

11,46

0,00

297

-

-

nicht identifiziert

26,04

1,04

298

-

-

nicht identifiziert

25,52

1,04

327

A424

HP0599

Hämolysin-Sekretions-Protein

26,56

2,08

339

-

-

nicht identifiziert

13,54

1,04

341

A107

HP1307

50S ribosomales Protein L5

11,46

0,00

437

D322

HP0073

Urease A

33,33

27,08

591

D321

HP0073

Urease A

19,27

4,17

527

D132

HP0410

Putative Neuraminyl-Lactose-Bindung (hpaA)

11,98

3,13

528

B488

HP0829

Inosine-5-Monophosphatase-DH

11,46

2,08

552

D132

HP0410

Putative Neuraminyl-Lactose-Bindung (hpaA)

16,67

7,29

561

D265

HP0400

Penicillin-Toleranz-Protein

12,50

1,04

562

D202

HP1564

Protein der Außenmembran

18,23

4,17

566

D314

HP1582

Pyridoxal Phosphatase (biosynth.Protein)

11,46

7,29

567

D318

HP0318

Hypothetical Protein

12,50

7,29

598

B429

HP1019

Serin-Protease HtrA

10,42

0,00

608

B437

HP0875

Katalase

23,44

1,04

622

B439

HP0875

Katalase

48,44

26,04

639

B443

-

nicht identifiziert

14,06

0,00

649

-

-

nicht identifiziert

13,02

0,00

692

B303

HP1350

Protease

29,69

8,33

694

-

-

nicht identifiziert

18,75

6,25

700

B320

HP1152

Teilchen-Protein Ffh

24,48

4,17

↓88

worden sind. In einer statistischen Analyse wurde ein Vergleich durchgeführt, um das Auftretens oder die Intensität der Erkennung aus Seren der H. pylori-positiven Gruppe mit der H. pylori-negativen Gruppe zu vergleichen. Signifikant höheres Auftreten oder eine signifikante Intensität der Erkennung (p < 0,059) sind markiert.

42 proteinarten bestehend aus 32 Antigenen wurden durch positiven Seren mit einer Signalfrequenz von über 10 erkannt (Abbildungen 5B und 5C) Die Antigene mit den höchsten Signalfrequenzen (>20), die durch Seren von H. pylori-positiven Patienten detektiert worden waren: 50S ribosomales Protein L7/L12 (HP1199, Spot 5_35), Katalase (HP0875, Spot 2_439), GroEL (HP0010, Spot 1_390), Cag 16 (HP0537, Spot 2_466), Cag 26 (HP0547, Spot 2_126), Urease A (HP0073, Spot 4_322), Urease B (HP0072, Spot 1_343), Hämolysin-Sekretions-Protein HylB (HP0599, Spot 1_424), Teilchen-Protein Ffh (HP1152, Spot 2_320) und H. p.predicted coding region (HP0231, Spot 4_226). Bis auf Cag 16 und HylB sind alle diese Antigene auf den Blots in den Abbildungen 5B und 5C gefärbt (Fenster der Sektoren 1_, 2_, 4_ und 5_ ).

In Seren von H. pylori-negativen Patienten wurden nur sieben Antigene gefunden, die eine Signalfrequenz > 10 besaßen. Am deutlichsten zu erkennen mit einer Signalfrequenz von > 20 waren das 50S ribosomale Protein L7/L12, Urease A, Katalase und das Hypothetical-Protein HP1098 (Spot 4_262). Die Färbung des 50S ribosomales Protein L7/L12 (Spot 5_35) und Katalase (Spot 2_439) ist auch in Abbildung 5A dargestellt.

↓89

Sechs identifizierte Proteine sind nur durch positive Seren erkannt worden: Die predicted coding region (HP 0231, Spot 4_226), Serin-Protease HtrA, Cag 26 (HP0547, Spot 2_126), Cag 3 (HP0552, Spot 2_443), ClpB-Protein (HP0264, Spot 1_308) und Trigger factor HP0795 (Spot A411) (Abbildungen 5B und 5C).

Bei der Isocitrat-Dehydrogenase und dem 50S ribosomalen Protein L7/L12 wurden jeweils mehrere Proteinunterarten erkannt. Zwei Proteinarten der Isocitrat-Dehydrogenase, Spot 487 (B497, 2_497) und Spot 489 (B496, 2_496) wurden nur durch positive Seren erkannt, dagegen der Hauptspot 492 (2_492) durch sowohl positive als auch negative Seren (nicht dargestellt) (Abbildungen 5B-D). Eine der Proteinarten des 50S ribosomalen Proteins L7/L12 (Spot 5_44) wurde ebenfalls nur durch positive Seren erkannt.

Sechs identifizierte Proteinarten wurden nur durch ein H. pylori-negatives Serum mit einer Intensität von 0,5 erkannt, aber in verschiedenen anderen Kombinationen nur durch H. pylori-positive Seren.

↓90

Die folgenden relativ deutlich erkannten Proteine wurden durch die meisten Seren erkannt: das Cag 26 Protein (Cag A), ein typisches Kennzeichen für die Untergruppe von Typ I des Helicobacter-Stammes wurde durch 14/24 positiven Seren erkannt,
H. p. predicted coding region (HP0231, Spot 4_226) und ATP-Synthase A (HP1134, Spot 1_396) wurden jeweils durch 11/24 positive Seren erkannt, die Serin-Protease (HP1019, Spot 2_429) wurde durch 9/24 und die Fumarat-Reduktase (HP0192, Spot 2_17) wurde durch 8/24 positive Seren erkannt. Das bis dahin unidentifizierte Proteinspot 5_53 wurde ebenfalls nur durch ein einziges Serum erkannt (nicht dargestellt). Verschiedene Kombinationen dieser Proteine waren auf einzelnen Blots zu erkennen: Fumarat-Reduktase (Spot 2_17), Cag 26 (Spot 2_126), Cag 3 (Spot 2_443), das 30S ribosomale Protein S5 (HP1302, Spot 6_82) und H. p. predicted coding region (HP0231, Spot 4_226) wurden auf den Blots erkannt, die durch Gastritis- und Ulcus-Serum gefärbt waren (Abbildungen 5B-C), wohingegen die Serin-Protease (Spot 2_17), 30S ribosomales Protein S5 (Spot 6_82), ATP-Synthase A (Spot 1_396), Cag 26 (Spot 2_443) durch Seren von Gastritis- oder Ulcuspatienten auf anderen Gelen erkannt wurden (nicht dargestellt).

Zusammenfassend kann man sagen, dass Antikörper durch H. pylori-positive Seren im Vergleich zur Kontrollgruppe mehr Proteinarten mit höherer Intensität in verschiedenen Mustern erkannt wurden. Einige wenige identifizierte Antigene zeigten einen sehr hohen Erkennungsgrad.

Bei 81% der Spots (126 aus 156), die sowohl bei positiven als auch bei negativen Seren auftraten, lag die Duchschnittsintensität bei den H. pylori-positiven eindeutig höher als bei den H. pylori-negativen.

↓91

Tab. 8: Die nicht mit H. pylori- negativen Seren reagierten Proteinspezies. (KGT : Kleingeltechnik,GGT: Großgeltechnik, ORF: Open reading frame, Sektoren A-F in GGT entsprechen 1_5_ in der Datenbank und in den Abbildungen)

KGT

GGT

ORF

Antigene

Freq.

H. p.-pos. Seren

Freq.

H. p.-neg. Seren

8

D226

HP0231

H. p. predicted coding region

22,92

0

74

A177

HP0010

60kD Hitzeschock-Protein (GroEL)

14,58

0

129

A308

HP0264

Clp Protein

14,00

0

135

B126

HP0547

Cag 26 (Cag A)

28,65

0

194

E44

HP1199

50S ribosomales Protein L7/ L12

5,73

0

209

A411

HP0795

Trigger-Faktor

19,00

0

341

A107

HP1307

50S ribosomales Protein S5

11,46

0

487

B497

HP0027

Isocitrat-Dehydrogenase

7,29

0

489

B496

HP0027

Isocitrat-Dehydrogenase

7,29

0

598

B429

HP1019

Serin-Protease (HtrA)

10,42

0

639

B443

HB0522

Cag 3

14,00

0

244

B126

HP0547

Cag 26 (Cag A)

37,50

0

251

B126

HP0547

Cag 26 (Cag A)

36,46

0

259

B126

HP0547

Cag 26 (Cag A)

36,98

0

5.4.1  Häufig erkannte Antigene in beiden Gruppen

Zunächst wurden Spots identifiziert, die durch die Mehrzahl der H. pylori-positiven bzw. der negativen Seren erkannt wurden.

Folgende Antigene bzw. Proteinspots waren bei 20 der 24 eindeutig H. pylori-positiven Seren zu erkennen:

↓92

Antigene, die durch 11 der eindeutig H. pylori-negativen Seren erkannt wurden, waren:

↓93

5.4.2 Durch Helicobacter pylori-negativen Seren selten erkannte Proteine

Die durch H. pylori-positive Seren häufig erkannten 15 Proteinspots waren nur bei einem der 12 eindeutig H. pylori-negativen Seren vorhanden. Diese Antigene sind in Tabelle 10 aufgeführt. Davon waren 5 nicht identifizierbar.

Tab. 9: Durch die gesamten H. pylori-negativen Seren (n=12) nur einmal erkannten Proteinspots mit Frequenzvergleich zu H. pylori-positiven .(KGT : Kleingeltechnik,GGT: Großgeltechnik, ORF: Open reading frame, Sektoren A-F in GGT entsprechen 1_5_ in der Datenbank und in den Abbildungen)

KGT

GGT

ORF

Antigen

Freq.

H. p.-pos. Seren

Freq.

H. p.-neg. Seren

270

B17

HP0192

Fumarat-Reduktase (Flavoprotein)

16,67

1,04

102

A209

HP1132

ATP-Synthase B

16,15

1,04

290

A119

HP0010

60kD Hitzeschock-Protein (GroEL)

17,71

1,04

561

D265

HP0400

Penicillin-Toleranz-Protein

12,50

1,04

293

B17

HP0192

Fumarat-Reduktase (Flavoprotein)

8,85

1,00

608

B437

HP0875

Katalase

23,44

1,04

807

A359

HP0109

DnaK Protein (HSP 70)

11,46

1,04

141

A464

-

-

11,98

1,04

187

A396

HP1134

ATP synthase alpha chain

15,10

1,04

238

E53

-

nicht identifiziert

14,06

1,04

339

B3

-

nicht identifiziert

13,54

1,04

297

-

-

nicht identifiziert

26,04

1,04

298

-

-

nicht identifiziert

25,52

1,04

5.4.3 Antigene mit höherer Frequenzstärke in Helicobacter pylori-negativen Seren

↓94

Drei Antigene waren bei den H. pylori-negativen Seren frequenzstärker aufgetreten als bei den positiven. Einen Vergleich dieser Spots und der Frequenzangaben zeigt
Tabelle 10.

Tab. 10: Spots mit größerer Frequenz bei H. pylori-negativen gegenüber H. pylori- positiven Seren
(KGT : Kleingeltechnik,GGT: Großgeltechnik, ORF: Open reading frame, Sektoren A-F in GGT entsprechen 1_5_ in der Datenbank und in den Abbildungen)

KGT

GGT

ORF

Antigene

Freq.

H. p.-pos. Seren

Freq.

H. p.-neg. Seren

171

D262

HP1098

Hypothetical-Protein

13,54

23,96

513

B66+B138

HP0027

Isocitrat-Dehydrogenase mit assoziiertem Protein

8,33

11,46

745

D327

HP1285

Conserved hypothetical protein

13,54

19,79

5.5 Qualitativer und quantitativer Vergleich der Immunoblots bei den Krankheitsgruppen Gastritis, Ulkus und Karzinom

Bei H. pylori-infizierten Patienten wurde entweder Gastritis oder Ulcus diagnosiziert. Durch Seren von Ulcuspatienten wurden mehr Proteinarten mit höherer Signalintensität erkannt als durch die meisten der Gastritispatienten. Um die Hypothese einer Korrelation zwischen Antigenerkennung und klinischen Symptomen zu testen, wurde eine statistische Analyse der Antigenmuster der Seren von 15 verschiedenen Patienten mit H. pylori-assoziierter Gastritis und von 9 Patienten mit gastralem oder duodenalem Ulkus durchgeführt. Diese Analyse hat 23 Proteinarten von 19 Proteinen mit einem signifikanten Unterschied (p < 0,05) in Bezug auf die Erkennung oder die Signalintensität aufgedeckt. Da nur 3 Patienten an duodenalem Ulkus litten, war keine weitere statistische Analyse zur Unterscheidung zwischem gastralem und duodenalem Ulkus möglich.

↓95

Die Identifizierung folgender Proteine (Abbildungen 5B-C) zeigte eine signifikant unterschiedliche Erkennung durch Seren von Ulkuspatienten im Vergleich zu Seren von Gastritispatienten (p < 0,05): Conserved hypothetical protein (HP1285, Spot 4_327), Vorläufer-Protein Hämolysin Sekretion (HP0175, Spot 4_249), ein hypothetical Protein (HP0305, Spot 4_276), ein Teilchen-Protein (HP1152, Spot 2_320), das 50S ribosomale Protein L9 (HP0514, Spot 6_68), und das 30S ribosomales Protein S5 (HP1302, Spot 6_82), Elongationsfaktor EF-TU (HP1205, Spot 1_477), Cag 16 (HP1133, Spot 2_466), und die noch nicht identifizierte Proteinart 2_465. Zwei Proteinarten des metabolischen Enzyms Isocitrat-Dehydrogenase (Spot 2_492 und Spot 2_499) und eine des 50S ribosomalen Proteins L7/L12 (HP1199, Spot 5_44), welche beide als Reihe von Spots auf den Gelen auftraten, wurden ebenfalls öfter erkannt durch Seren von Ulcuspatienten, während andere Arten dieser Proteine keine signifikanten Unterschiede bei der Erkennung zeigten. Von den 23 Proteinarten, die signifikante Unterschiede bei der Antigenerkennung zeigten, wurden 11 signifikant öfter in Seren von Ulcuspatienten verglichen mit Gastritispatienten erkannt (p < 0,05). Acht Proteinarten zeigten eine signifikant höhere durchschnittliche Intensität (p < 0,05), und sieben erfüllten beide Kriterien. Nur wenige Antigene wie das Hydantoin-Utilisations-protein A (HP0695, Spot 2_377) oder das Putative Neuraminyl-Lactose -Bindungs-Protein HpaA (HP0410, Spots 4_121 und 4_1329) oder das 26kDa Antigen (HP1563, Spot 4_341), das als starkes Antigen bei der Helicobacter-Infektion bekannt ist, wurden weniger oft bzw. weniger intensiv durch Seren von Ulcus- verglichen mit Gastritispatienten erkannt.

Tabelle 11 zeigt die erkannte Antigenen und ihre Signalfrequenzen bezogen auf die Krankheitsgruppen Gastritis, Ulkus und Karzinom.

In folgenden Fällen wurden ähnliche Erkennungsmuster zwischen den Seren von sechs Krebspatienten und Seren von Ulcuspatienten festgestellt (Abbildungen 5C-D). Das metabolische Enzym Isocitrat-Dehydrogenase (HP0027, Hauptspot 2_492) und Fumarat-Reduktase (HP0192, Spot 2_17), ein Conserved hypothetical protein (HP1285, Spot 4_327), ein Vorläufer-Protein Hämolysin-Sekretion (HP0175, Spot 4_249) und Elongationsfaktor EF-TU (HP1205, Spot 1_477) wurden durch mehr als die Hälfte der Seren von Ulkus- und Krebspatienten erkannt (Tabellen 12, 13 und 14). Da nur sechs Krebspatienten, die keine aktive H. pylori-Infektion zeigten, getestet wurden, ist die statistische Analyse für einen Vergleich von Seren dieser Gruppe mit Seren von der Gastritis- und der Ulcusgruppe nicht sehr aussagekräftig. Einige Unterschiede sind jedoch offensichtlich. In einigen Fällen war die Intensität der Antigenerkennung durch Seren von Krebspatienten stärker im Vergleich zu Seren von Ulcuspatienten, wie für Isocitrat-Dehydrogenase Icd Spot B499 und ein noch nicht identifiziertes Protein in Verbindung mit Icd durch Lokalisation in dem Gel (Spot 2_66 und 2_138) in Abbildung 5C und 5D, und zum Beispiel auch das Hypothetical-Protein (HP0305, Spot 4_276). Zusätzlich führten sowohl die Erkennung des metabolischen Enzyms Cinnamyl-Alkohol-Dehydrogenase (HP1104, Spot 2_35) als auch des Hydantoin-Utilisations-Protein A (HP0695, Spot 2_377) zu einer weitaus höheren Signalfrequenz bei Seren von Krebspatienten im Vergleich zu Ulkus- oder Gastritispatienten. Auch ein konserviertes Hypothetical-Protein (HP1098, Spot 4_262) und das Protein aus der Außenmembran (HP1564, 4_202) wurden bei Krebspatienten mit einer höheren Signalfrequenz erkannt (Abbildung 5D).

↓96

Aufgrund der geringen Zahl der Patientenseren, die bis dahin getestet werden konnten, kann nur eine Tendenz abgeleitet werden, welche auf Antigene mögliche Antigenerkennungsmuster bei unterschiedlichen Krankheitssymptomen hinweist.

Tab. 11: Vergleich der 32 Proteine mit den höchsten Frequenzen in den einzelnen Krankheitsgruppen Gastritis, Ulkus, Karzinom (KGT : Kleingeltechnik,GGT: Großgeltechnik, ORF: Open reading frame, Sektoren A-F in GGT entsprechen 1_5_ in der Datenbank und in den Abbildungen) [G: Gastritis, U:Ulkus, Ca: Karzinom, Freq.: Frequenz]

KGT

GGT

ORF

Antigene

G-Freq.

U-Freq.

Ca-Freq.

87

E53

HP1199

50S ribosomales Protein L7/L12

55,83

69,44

37,50

622

B439

HP0875

Katalase

43,33

56,94

52,08

80

A390

HP0010

60kDHitzeschock-Protein (GroEL)

30,83

48,61

54,16

562

D202

HP1564

Protein der Außenmembran

11,67

29,17

50,00

437

D322

HP0073

Urease A

27,50

43,06

47,91

90

A388

HP0010

60kDHitzeschock-Protein (GroEL)

32,50

44,44

45,83

77

A194

HP0010

60kDHitzeschock-Protein (GroEL)

28,33

37,50

45,83

513

B66+B138

HP0027

Isocitrat-Dehydrogenase mit assoz.Protein

8,33

8,33

45,83

692

B303

HP1350

Protease

20,83

44,44

20,83

700

B320

HP1152

Teilchen-Protein Ffh

12,50

44,44

18,75

567

D318

HP0318

Hypothetical-Protein

11,67

13,89

41,66

78

D276

HP0305

Hypothetical-Protein

12,50

31,94

41,66

215

A192

HP0010

60kDHitzeschock-Protein (GroEL)

18,33

38,89

29,16

259

B126

HP0547

Cag 26 (Cag A)

38,33

34,72

6,25

301

A323

HP0072

Urease B

17,50

34,72

8,33

92

A343

HP0072

Urease B

23,33

36,11

33,33

273

A325

HP0072

Urease B

18,33

33,33

25,00

276

-

-

nicht identifiziert

25,00

33,33

20,83

552

D132

HP0410

Putative Neuraminyl-Lactose-Bindung (hpaA)

17,50

15,28

33,33

109

A477

HP1205

Elongationsfaktor (EF-TU)

9,17

31,94

22,91

140

E27

HP1199

50S ribosomales Protein L5/L12

27,50

27,78

4,16

327

A424

HP0599

Vorläufer-Protein Hämolysin-Sekretion

25,83

27,78

27,08

694

-

-

nicht identifiziert

13,33

27,78

18,75

820

B492

HP0027

Isocitrat-Dehydrogenase

7,50

4,12

29,16

290

A119

HP0010

60kD Hitzeschock-Protein (GroEL)

18,33

16,67

25,00

745

D327

HP1285

Conversed hypothetical protein

15,00

11,11

20,83

704

B465

HP1133

ATP-Synthase G

5,83

20,83

8,33

147

A461

HP1293

DNA-abhängige RNA Polymerase A

20,00

11,11

18,75

171

D262

HP1098

Hypothetical-Protein

19,17

4,17

18,75

187

A396

-

-

15,00

15,28

18,75

699

D249

HP0175

Vorläufer-Protein Hämolysin-Sekretion

4,17

18,06

8,33

803

D341

HP1563

26kDa Antigen

5,83

8,33

6,25

↓97

Tabelle 12 verzeichnet die arithmetischen Mittelwerte der Intensität der Antigenerkennung statistisch signifikanter (p < 0,05) Proteinspots in den Seren der einzelnen Krankheitsgruppen.

Tab. 12: Relative Häufigkeiten, Frequenzen und arithmetische Mittelwerte der Intensitäten statistisch signifikanter Proteinspots bezogen auf die Krankheitsgruppen
(KGT : Kleingeltechnik,GGT: Großgeltechnik, ORF: Open reading frame, Sektoren A-F in GGT entsprechen 1_5_ in der Datenbank und in den Abbildungen) [G: Gastritis, U:Ulkus, Ca: Karzinom, Freq.: Frequenz aMW: arithmetischer Mittelwert der Intensität]

KGT

GGT

ORF

Antigene

Häufigkeit (%)

G U C

Frequenz

G U C

aMW

G U C

459

B511

HP0294

Aliphatische Amidase

12

22

50

4,2

2,8

15

0,2

0,1

0,6

270

B19

HP0192

Fumarat-Reduktase

20

55

50

13

24

23

0,5

0,9

0,9

125

B2

HP0779

Akoniat-Hydratase 2

13

33

67

7,5

5,6

23

0,3

0,2

0,9

487

B497

HP0027

Isocitrat-Dehydrogenase

20

55

50

7,5

7,0

27

0,3

0,3

1,1

489

B496

HP0027

Isocitrat-Dehydrogenase

20

55

50

7,6

6,9

27

0,3

0,3

1,1

513

B66+B138

HP0027

Isocitrat-Dehydrogenase mit assoziiertem Protein

26

66

83

8,3

8,3

46

0,3

0,3

1,8

812

B499

HP0027

Isocitrat-Dehydrogenase

20

55

67

7,5

6,9

13

0,3

0,3

1,8

820

B499

HP0027

Isocitrat-Dehydrogenase

20

77

67

7,5

4,1

29

0,3

0,3

1,2

120

A29

HP1293

DNA-abhängige RNA-Polymerase A

0,0

0,0

33

0,0

1,4

19

0,0

0,1

0,1

70

E44

HP1199

50S ribosomales Protein L7/L12

40

77

0,0

20

46

0,0

0,8

1,8

0,0

194

E35

HP1199

50S ribosomales Protein L7/L12

33

66

16

4,2

8,3

2,1

0,2

0,3

0,1

74

A177

HP0010

60kD Hitzeschock-Protein (GroEL)

20

44

50

9,2

24

21

0,4

0,9

0,8

215

A192

HP0010

60kD Hitzeschock-Protein (GroEL)

53

88

83

18

39

29

0,7

1,6

1,8

290

A119

HP0010

60kD Hitzeschock-Protein (GroEL)

46

66

83

18

17

25

0,7

0,7

1,0

700

B320

HP1152

Teilchen-Protein Ffh

33

77

50

13

44

19

0,5

1,8

0,8

186

C84

HP0794

ATP-abhängige Protease

0,0

11

33

0,0

1,4

4,2

0,0

0,1

0,2

499

D121

HP0410

Putative Neuraminyl-Lactose-Bindung

6,0

0,0

33

0,8

0,0

6,3

0,1

0,0

0,3

704

B465

HP1133

ATP-Synthase G

40

88

17

5,8

21

8,3

0,2

0,8

0,3

523

B35

HP1104

Cinnamyl-Alkohol-Dehydrogenase

6,0

22

67

5,0

2,8

40

0,2

0,1

1,6

699

D249

HP0175

Hypothetical-Sekretions-Protein

13

66

50

4,2

18

8,3

0,2

0,7

0,3

501

-

-

nicht identifiziert

6,0

0,0

33

0,8

0,0

21

0,1

0,0

0,8

668

-

-

nicht identifiziert

6,0

22

50

0,8

2,8

8,3

0,1

0,1

0,3

78

-

-

nicht identifiziert

46

88

50

13

32

42

0,1

1,3

1,7

Die Signalfrequenz spiegelt sowohl die Häufigkeit als auch die Intensität von Spots in Kombination wider und kann zum Vergleich der Seren von H. pylori-positiven und –negativen Patienten herangezogen werden. Unter Berücksichtigung der Signifikanzberechnung zeigt die Auswertung (Tabelle 11 und Tabelle 12) folgende Ergebnisse:

↓98

  1. Signifikant häufiger bei Ulkus- gegenüber Gastritisgruppen sind die Proteinspots Fumarat Reduktase (HP0192), Akoniat-Hydratase 2 (HP0779), Proteinspots der Isocitrat-Dehydrogenase-Seriengruppe, 50S ribosomales Protein L7/L12 (HP1199), ATP-Synthase G (HP1133) und Hypothetical-Sekretions-Protein (HP0175).
  2. Der arithmetische Mittelwert der Intensität des 50S ribosomales Protein L7/L12 (HP1199, KGT Spot 70), GroEL (HP0010), Teilchen-Protein Ffh (HP1152), ATP-Synthase G (HP1133, KGT Spot 704) und Hypothetical-Sekretions-Protein (HP0175) ist größer bei Ulkus- als bei Gastritis-Seren.
  3. Der arithmetische Mittelwert der Intensität bei GroEL-KGT Spot 74 und Teilchen-Protein Ffh, ATP-Synthase G und Hypothetical-Sekretions-Protein ist größer bei Ulkusseren als bei Seren von Karzinomen.
  4. DNA-abhängige RNA-Polymerasen wurden durch Gastritis- und Ulkusseren nicht erkannt. Die ATP-abhängige Protease fehlte bei Seren der Gastritisgruppe.
  5. Die Putative Neuraminyl-Lactose-Bindung, die DNA-abhängige RNA-Polymerase und der nicht identifizierbare KGT Spot 501 wurde durch Seren der Ulkusgruppe nicht erkannt.
  6. Die Cinnamyl-Alkohol-Dehydrogenase hatte bei Karzinomseren einen höheren arithmetischen Mittelwert der Intensität gegenüber Ulkus- und Gastritisseren.

5.5.1  Antigene mit größerer Frequenzstärke in Karzinomseren

Tabelle 13 zeigt H. pylori-Antigene, die bei Karzinomseren mit größerer Frequenzstärke auftraten als bei Gastritis- und Ulkusseren. 21 der Antigene wurden nur durch Seren der Karzinompatienten erkannt, wenn auch von niedriger Frequenz.

Die übrigen 30 erkannten Antigene traten bei Gastritis- und/oder Ulkusseren ebenfalls auf, jedoch mit niedrigerer Frequenz als bei der Karzinomgruppe. Weiterhin wurde festgestellt, dass mehrere Spots eines identischen Proteins (wie Isocitrat-Dehydrogenase u.a.) mit unterschiedlicher Frequenz auftraten: So gehören alle Spots 467, 533, 820, 821 der Isocitrat-Dehydrogenase-Gruppe an, wiesen aber unterschiedliche Profile auf.

↓99

Tab. 13: H. pylori-Antigene mit größerer Frequenzstärke bei Karzinom-Seren mit Vergleich zu den Gastritis- und Ulkusgruppen
(KGT : Kleingeltechnik,GGT: Großgeltechnik, ORF: Open reading frame, Sektoren A-F in GGT entsprechen 1_5_ in der Datenbank und in den Abbildungen) [ Ca: Karzinom, G: Gastritis, U: Ulcus, Freq.: Frequenz].

KGT

GGT

ORF

Antigene

Ca-Freq.

G-Freq.

U-Freq.

94

A327

-

nicht identifiziert

2,08

0

0

97

D132

HP0410

Putative Neuraminyl-Lactose-Bindung

16,66

1,67

1,39

101

-

-

nicht identifiziert

16,66

0

0

114

-

-

nicht identifiziert

16,66

0

0

118

-

-

nicht identifiziert

16,66

0

0

120

A29

HP1293

DNA-abhängige RNA-Polymerase A

18,75

0

1,39

123

E29

?

Thioredoxin

2,08

0

0

125

B2

HP0779

Akonitat-Hydratase 2

22,91

7,50

5,56

138

B2

HP0779

Akonitat-Hydratase 2

18,75

7,50

5,56

142

A461

HP1293

DNA-abhängige RNA-Polymerase A

16,66

0

0

156

-

-

nich identifiziert

16,66

0

5,56

164

A177

HP0010

60kD Hitzeschock-Protein (GroEL)

18,75

4,17

5,56

169

-

-

nicht identifiziert

12,50

5

12,05

178

A271

HP1195

Elongation-Faktor G (EF-G)

4,16

0

0

190

-

-

nicht identifiziert

2,08

0

0

191

-

-

nicht identifiziert

8,33

0

0

218

A277

?

Akonitat-Hydratase 2

16,66

0,83

0

222

-

-

nicht identifiziert

4,16

0

0

232

-

-

nicht identifiziert

2,08

0

0

304

C197

?

Superoxid-Dismutase

4,16

0

0

309

-

-

nicht identifiziert

2,08

0

0

320

B2

HP0779

Akonitat-Hydratase 2

16,66

0

0

348

-

-

nicht identifiziert

10,41

1,67

4,17

350

-

-

nicht identifiziert

27,08

10

5,56

352

B2

HP0779

Akonitat-Hydratase 2

16,66

0

0

357

-

-

nicht identifiziert

2,08

0

0

368

B2

HP0779

Akonitat-Hydratase 2

16,66

0,83

0

382

B377

HP0695

Hydantoin-Utilisations-Protein A

29,16

13,33

0

385

B377

HP0695

Hydantoin-Utilisations-Protein A

12,50

2,50

0

411

-

-

nicht identifiziert

10,41

2,50

0

430

B377

HP0695

Hydantoin-Utilisations-Protein A

2,08

0

0

467

B492

HP0027

Isocitrat-Dehydrogenase

20,83

5,83

4,17

471

-

-

nicht identifiziert

4,16

0

0

487

B497

HP0027

Isocitrat-Dehydrogenase

27,08

7,50

6,96

489

B496

HP0027

Isocitrat-Dehydrogenase

27,08

7,56

6,94

496

-

-

nicht identifiziert

14,58

5,00

2,78

500

-

-

nicht identifiziert

4,16

0

0

501

-

-

nicht identifiziert

20,83

0,83

0

513

B66+B138

?

Isocitrat-Dehydrogenase mit asoziiertem Protein

45,83

8,33

8,33

533

B210

HP0027

Isocitrat-Dehydrogenase

16,66

0

0

544

F40

?

Hypothetical hit-like Protein

2,08

0

0

552

D132

HP0410

Putative Neuraminyl-Lactose (hpaA)

33,33

17,50

15,28

562

D202

HP1164

Protein der Außenmembran

50,00

11,67

29,17

566

D314

HP1582

Pyridoxal-Phosphat-Protein

41,66

10,00

13,89

567

D262

HP0318

Hypothetical-Sekretions-Protein

41,66

10,00

13,89

585

D313

HP1562

Iron(III) ABC Transporter (Perpl, Iron-Bindung-Protein)

12,50

0,83

0

602

D313

HP1562

Iron(III) ABC Transporter (Perpl. Iron-Bindung-Protein)

20,83

4,17

4,17

670

D200

?

Carbonic-Anhydrase

16,66

0,83

0

711

F68

HP0514

50S ribosomales Protein L9

16,66

0,83

1,39

820

B492

HP0027

Isocitrat-Dehydrogenase

29,16

7,50

9,72

821

B499

HP0027

Isocitrat-Dehydrogenase

20,83

7,50

4,12

5.5.2 Statistisch auffälligste Antigene bezüglich der Frequenzstärke

Es wurden 8 Spots detektiert und identifiziert, die sich aus der Isocitrat-Dehydrogenase herleiten. Bei der Analyse dieser Spots waren die Blotnummern KGT 487 und KGT 489[entsprechend 2_497 und 2_496 in der Datenbank] in jeder Hinsicht auffällig (Tabelle 14). Sie waren nur bei H. pylori-Positiven vertreten, in der Karzinomgruppe besonders frequenzstark, dagegen in der Ulkus- und der Gastritisgruppe nur schwach zu erkennen.

Tab. 14: Statistisch signifikanteste Spots mit Frequenzangaben in verschiedenen Krankheitsgruppen
(KGT : Kleingeltechnik,GGT: Großgeltechnik, ORF: Open reading frame, Sektoren A-F in GGT entsprechen 1_5_ in der Datenbank und in den Abbildungen) [ Freq.: Frequenz, H. p.: H. pylori, pos.: positiv, neg.: negativ, G: Gastritis, U: Ulkus, Ca: Karzinom].

KGT

GGT

ORF

Antigene

Freq
H. p.-pos. Seren

Freq
H. p.-neg. Seren

G-Freq.

U-Freq.

Ca-Freq.

487

B497

HP0027

Isocitrat-Dehydrogenase

7,29

0

7,50

6,94

27,08

489

B496

HP0027

Isocitrat-Dehydrogenase

7,29

0

7,50

6,94

27,08

5.6 Untersuchungen von Serumpools

↓100

Aus mehreren gleichen Gruppenseren wurden 10 Pools zusammengestellt und geblottet. Hierzu wurden erstens drei Serumpools jeweils aus bis zu fünf Seren von H. pylori-positiven, H. pylori-negativen und eradizierten Seren gemischt und geblottet. Zweitens wurden sechs nicht ähnliche Mischseren hergestellt, ebenfalls geblotet und auf neue Antigene überprüft. Zweck dieses Tests war, einen Vergleich zwischen Seren ähnlicher Herkunft sowie die Aussagekraft von Blots aus Pool- gegenüber Einzelseeren zu überprüfen.

Einige Proteine wurden selten, aber mit starker Intensität durch Pools und die Einzelseren erkannt. Der nicht identifizierbare Spot 142 war zweimal in den Pools und einmal in der Karzinomgruppe vertreten. Der noch nicht identifizierte Spot 156 war in den Pools zweimal, durch Ulkus- und Karzinomseren je einmal erkennbar. Der ebenfalls nicht identifizierte Spot 173 fand sich zweimal bei Gastritis und einmal bei Ulkus. Der Elongationsfaktor (EF-Tu) und das Succinyl-CoA: 3-ketoacid-Coenzym A (Transferase A) waren bei Gastritis, Ulkus und Karzinom zu erkennen.

Tabelle 15 zeigt mit Poolbezeichnung und Blotnummern die Herkunfteigenschaften der Pools, die Anzahlen der gebloteten Seren (n) und die Anzahlen der erkannten Spots (n).

↓101

Tab. 15: Die geblotteten Pools und ihre Eigenschaften

Poolbezeichnung (Blots)

Herkunftsgruppe

Anzahl der Seren (n)

Anzahl der Spots (n)

8 Pool 0

Mischserum

2

43

9 Pool 1

Mischserum

4

19

10 Pool 2

H. pylori-negativ

5

18

11 Pool 3

H. pylori-positiv

3

148

12 Pool 4

H. pylori eradiziert

2

38

22 Pool 4A

Mischserum

4

128

23 Pool 5

Mischserum

3

109

25 Pool 6

H. pylori-eradiziert

9

125

26 Pool 7

Mischserum

5

65

27 Pool 8

Mischserum

3

69

Die durch Serumpools erkannten Proteinspots waren zu 72% auch bei den Blots der Einzelseren existent. Es konnten auch einige neue Spots detektiert, aber nicht identifiziert werden. Sowohl bei den Mischseren als auch bei Helicobacter-eradizierten Seren waren 75% der Proteinspots äußerst frequenzstark. Dagegen zeigten in Übereinstimmung mit den Ergebnissen H. pylori-negativer Einzelseren die auf mehreren Blots durch H. pylori-negative Poolseren erkannten Proteinspots nur schwache Frequenzintensitäten.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
12.09.2006