6 DISKUSSION

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Die Bedeutung des Helicobacter pylori als wichtiger humanpathogener Erreger wird unumstritten anerkannt. In einer Vielzahl von Arbeiten wurde die enge Korrelation zwischen einer H. pylori-Besiedlung der Magenschleimhaut und der Entwicklung von chronischen Gastritiden, gastralen und duodenalen Ulzerationen, MALT (Mucosa-associated lymphoid tissue) sowie der möglichen Entstehung eines Magenkarzinoms beschrieben (ELDRIGE et al., 1984; FORMAN et al., 1991; GOODWIN et al., 1986; MARSHALL, 1986; NOMURA et al., 1991; PARSONNET et al., 1991).

In dieser Arbeit wurden bei Patienten mit den jeweils diagnostizierten gastrointestinalen Erkrankungen mittels Immunoblot (Westernblot)-Analysen die spezifischen Immunantworten gegen H. pylori untersucht. Hierbei konnte im Serum von Patienten mit H. pylori-Infektion durch Identifikation und Charakterisierung von Proteinen unterschiedlich starke Immunantworten gegen Antigene unterschiedlicher Intensitäten nachgewiesen werden.

6.1  Bedeutung der Serodiagnostik

Die serologische Diagnostik ist grundsätzlich eine Möglichkeit zur Entdeckung einer Helicobacter pylori-Infektion. Andere Optionen sind die Biopsieentnahme für die histologische Untersuchung, der Urease-Schnelltest, der 13-C-Atemtest und die Speicheldiagnostik (CHRISTIE et al., 1996). Die serologische Diagnostik soll die Anforderungen einer Screeningmethode erfüllen (BLECKER et al., 1995), um bei häufig symptomlosen Infektionen mit Helicobacter pylori eine karzinompräventive Eradikationstherapie durchzuführen (FORMAN, 1992; MALFERTHEINER et al., 1997). Auch als Kontrolluntersuchung nach einer Eradikationstherapie ist die serologische Diagnostik einsetzbar (CUTLER et al., 1996; SAFE et al., 1993). Die Zweidimensionale Gelelektrophorese-Immunoblot-Analyse erlaubte uns, in dieser Studie neue immunogene Antigene zu erkennen.

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Die Helicobacter pylori-Infektion löst nicht nur eine lokale sondern in aller Regel auch eine humorale Immunantwort aus. Daher ist die Entwicklung serologischer Nachweisverfahren auf H. pylori-Infektionen von maßgebender Bedeutung.

6.2 Bedeutung der zweidimensionalen Gelelektrophorese

Als die Methode mit dem höchsten Auflösungsvermögen der komplexer Proteingemische wurde in dieser Studie die Zweidimensionale Gelelektrophorese zur Auftrennung der Helicobacter pylori-Proteine angewendet.

Die zweidimensionale-Elektrophorese ist derzeit die einzige Technik, die eine Trennung von etwa 10 000 Proteinkomponenten ermöglicht. Bei der Nutzung dieser Methode sind allerdingst Vor- und Nachteile in Betracht zu ziehen. Die Zweidimensionale-Gelelektrophorese stellt die Kombination zweier komplementärer, hocheffizienter Trennprinzipien (IEF und SDS-PAGE) dar. Von Vorteil sind die parallele und schnelle Durchführbarkeit und die universelle Anwendungsmöglichkeit.

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Der Nachteil beziehungsweise die Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass besonders schwer lösliche Proteine nicht detektiert werden. So erhält man keine Information über Proteine mit einem isoelektrischen Punkt in extremen pH-Bereichen (< pH 2 und > pH 9). Ebenso verhält es sich mit Proteinen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5 000 Da (LOHAUS et al., 1998).

Während die lokale Immunreaktion durch eine ausgeprägte leukozytäre Durchsetzung des foveolärenen Epithels gekenntzeichnet ist, werden bei der humoralen Immunreaktion vor allem IgG- und IgA-Antikörper gegen die bakteriellen Antigene gebildet (NEWELL und STACEY, 1989). Als eine sehr genaue Antikörper-Nachweismethode gilt das Immunoblot (Westernblot) -Verfahren.

Von den 1800 Proteinspots, die durch Silberfärbung detektiert wurden, reagierten 379 Spots mit den getesteten Patientenseren. Unter den Proteinen, die sehr häufig durch
H. pylori-positive Seren erkannt wurden, sind 9 in dieser Studie identifiziert und 23 bereits durch vorangegangene eigene Studien und durch andere 2-DE-Analysen bestätigt (JUNGBLUT und BUMANN et al., 2000; McATEE und LIM et al., 1998).

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Einschränkungen der Detektierbarkeit bestanden hauptsächlich in der Grenze der allgemeinen und technischen Annäherung in bezug auf genetische Variationen, Affinität von Antikörpern, Übereinstimmung der Epiptopen oder membrangebundenen Antigenen und auf genaue Identifizierung von verschiedene Seren erprobte erkannte Antigene.

6.3  Helicobacter pylori-spezifische Antigene

Um in Frage kommende H. pylori-Antigene für Diagnose und Therapie zu charakterisieren, haben wir systematisch die Differenzen in den Helicobacter-2DE-Antigenerkennungsprofilen des Stammes 26695 durch Verwendung von Patientenseren mit unterschiedlichen Magenerkrankungen analysiert. Von 1800 durch Silberfärbung detektierten Proteinspots dieses Stammes reagierten 310 Spots mit H. pylori-positiven Seren. 42 Proteinspezies einschließlich 32 Proteinen konnten als Antigene mit einer Signalfrequenz >10 identifiziert werden. Von diesen 32 Proteinen, die am häufigsten durch H. pylori-positive Seren erkannt wurden, wurden 9 als neuvorkommend identifiziert, 23 wurden durch andere Studien und 2-DE-Analysen bestätigt (JUNGBLUT et al. 2000; McATEE et al.1998; KIMMEL et al. 2000).

Da H. pylori-Stämme einen hohen Grad an Variabilität zeigen, muss jeder Ansatz, Antigene für Diagnose und Vakzination zu definieren, sich mit diesem Problem befassen. Durch 2-DE-Immunoblot-Analyse werden in dieser Studie neue immunogene Antigene erkennbar. Ein weiterer Vorteil der 2-DE-Elektrophorese ist die Bewertung aller Proteinspezies nach ihrer Pathogenität und die klare Trennung von Proteinen mit hohem pI (Isoelektrischer Punkt). So wurden mehrere Antigene im basischem Bereich der Gele detektiert, wie zum Beispiel das hypothetische Protein HP0305 (pI=9,45), das Protein der Außenmembran HP1564 (pI=8,83), Cag 16 (HP0537) (pI=9,7) oder die Protease HP1350 (pI=9,45) durch mehr als die Hälfte der H. pylori-positiven Patientenseren erkannt.

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Etliche, sehr reichlich versehene Proteine des Helicobacter-Proteoms wurden durch
H. pylori-negative Seren erkannt. Für einige dieser Antigene sind korrespondierende Proteine schon von anderen Analysen bakterieller Proteome her bekannt (O`CONNOR et al. 1997; TONELLA et al. 1998). Sie können folglich als kreuzreaktive Antigene anderer bakterieller Infektionen angesehen werden: 50S ribosomales Protein L7/L12, Katalase und GroEL als Beispiele. Interessanterweise wurde eine Proteinspezies des 50S ribosomalen Proteins L7/L12 (Spot 5_44) nur durch positive Seren erkannt und stellt möglicherweise eine Veränderung nach der Übersetzungsphase des Proteins dar (wie in der Nucleotid-Sequenz in der m-RNS, in Form einer Aminosäuren-Sequenz bei der Proteinsynthese), wie für ein anderes ribosomales Protein S1 aus Salmonellen-Stämmen beschrieben wurde (ADAMS et al. 1999). Im übrigen wurden die Ureasen A und B auch durch Antikörper von H. pylori-negativen Patienten erkannt, korrellierend mit der Beobachtung von geringer Spezifität beim Helicobacter-Nachweis in diagnostischen Analysen, die rekombinante Urease enthalten (WIDMER et al. 1999). Gegenwärtig ist das Hauptproblem sowohl kommerzieller als auch wissenschaftlicher Analysen hinsichtlich des Nachweises von H. pylori die verhältnismäßig geringe Korrelation mit der Krankheit und die geringe Spezifität (JOHANSEN et al., 1995; WIDMER et al., 1999; NISHIZONO et al., 1998).

Wir haben sieben Proteine identifiziert, die durch Seren von Patienten mit aktiver
H. pylori-Infektion detektiert wurden: Trigger-Faktor HP0795, Clp Protein HP0264, Cag 26 (HP0547), die vorher erwähnte H. p. predicted coding region HP0231, das 30S ribosomale Protein S5 (HP1302), die Serin-Protease HtrA (HP1019) und Cag 3 (HP0522), wobei die letzten vier neue spezifisch erkannte Antigene zu sein scheinen. Diese Antigene wurden durch Seren von H. pylori-positiven Patienten in Kombination mit mindestens drei Antigenen folgender Proteine erkannt: Fumarat-Reduktase (HP0192), welches kürzlich identifiziert wurde, und ATP-Synthase A (HP1134) oder DnaK-Protein HSP 70 (HP0109), die auch in früheren Studien detektiert wurden (KIMMEL et al., 2000; McATEE et al., 1998). Alle genannten Proteine sind unter den 150 reichhaltigsten Proteinspezies von H. pylori vorhanden (JUNGBLUT et al., 2000) und mögen deshalb als sehr immunogene Faktoren bei der Entwicklung einer diagnostischen Analyse darstellen, da sie wahrscheinlich mit einer Vielzahl von
H. pylori-Stämmen reagieren können. Sie werden zur Zeit durch Verwendung einer größeren Anzahl von Patienten und zahlreicher Stämme getestet.

Offenbar liegen bei H. pylori-positiven Patienten höhere Antikörpertiter vor als bei
H. pylori-negativen. Diese Tatsache reflektiert eine statistisch höhere Erscheinung und Intensität mancher dominanten Proteinspots bei der Helicobacter-positiven Gruppe.

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Es zeigte sich, dass mehrere, sehr reichhaltige Proteine von Helicobacter-Proteomen durch H. pylori-negative Seren erkannt wurden. Manche dieser Proteine entsprechen den Proteinen anderer bakterieller Proteom-Analysen (O’CONNOR und FARRIS et al., 1997; TONELLA und WALSH et al., 1998). Mögliche kreuzreaktive Antigene anderer bakterieller Infektionen sind: 50s ribosomales Protein L77L12, Katalase und GroEL. Des weiteren wurden Urease A und B durch Antikörper von H. pylori-negativen Patienten erkannt und korrellierten mit solchen von niedriger Spezifizät der Helicobacter-Detektion in diagnostischen Assays, die Urease-Rekombinante enthielten. Es wurden sechs Proteine identifiziert, die nur durch Seren von Patienten mit aktiver H. pylori-Infektion erkannt wurden: Trigger-Faktor (HP0795), Stress-Protein ClpB (HP0364), Cag 26 (HP0547), predicted coding region (HP0231), Serin-Protease HtrA (HP1019) und Cag 3 (HP0522). Die letzten drei genannten Proteine scheinen neue spezifische Antigene für H. pylori zu sein.

Im Gegensatz zu anderen Studien konnten in dieser Arbeit die Antigene des Cag 26 ermittelt werden. Sie wurden in 11 der 24 positiven Patienten erkannt (McATEE et al., 1998; KIMMEL et al., 2000).

Die Serin-Protease (HP1019), das 50S ribosomales Protein (HP1307) und die nicht identifizierbaren Spots 129, 145, 207, 209, 294, 639 und 649 waren für Helicobacter spezifisch. Außerdem waren das Cag A, die ATPase B, die Fumarat-Reduktase, das Penicillin-Toleranz-Protein und einige nicht identifizierte Spotproteine bei den H. pylori-negativen Seren jeweils nur einmal vorhanden. Dennoch waren viele weitverbreitete Proteine bei den Helicobacter-Patienten immunogen. Um genauere Aussagen zur Helicobacter-Spezifizät einiger Antigene oder Proteinspots zu machen, bedarf es größerer Gruppen von Patientenseren.

6.4  Helicobacter pylori-Antigene und Bezug zur Krankheit

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Wünschenswert wäre das Auffinden serologischer Marker, um die verschiedenen Ausprägungen gastrischer Erkrankungen indizieren zu können. Bisher ist es nicht gelungen, solche eindeutigen Marker zu bestimmen, sei es wegen der begrenzten Auflösung der ein-dimensionalen Proteinanalyse (NILSSON et al., 1997; FAULDE et al., 1992; FAULDE et al., 1993; KLAMAAS et al., 1996 und wiederholt in ZEVERING et al., 1999 ) oder aufgrund begrenzter Anzahlen von Proben (KIMMEL et al., 2000).

In unserer Studie wurde die Mehrzahl der Antigene mit größeren Intensitäten durch Seren von Ulkuspatienten erkannt worden zu sein, verglichen mit Seren von Gastritispatienten. Dies könnte auf persistierende Entzündungen sowie Gewebsschäden zurückzuführen sein, die zu erhöhter Antigenpräsentation bei der Entstehung eines Ulkus führt. Es gibt auch Antigene, die nicht nur aufgrund der allgemeinen Verstärkung der Antigenerkennung in Ulkus erkannt werden zu sein scheinen.

Bei den Krankheitsmanifestationen dominierte das Bild der H. pylori-assoziierten Gastritis, die histopathologisch bei 16, und das der unspezifischen Gastritis bei 10 von 60 Patienten diagnostiziert wurde. 10 weitere Patienten wiesen eine Ulkuskrankheit auf. Die Krankheitsgruppen gastrale Dysplasie und Metaplasie waren nur mit wenigen Patienten vertreten.

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Im Vergleich zu Gastritis waren sowohl die Anzahl der Proteinerkennung als auch deren Intensitäten bei Ulkus- und Karzinompatienten deutlich erhöht.

Neben den bereits genannten Antigenen, die auch von H. pylori-negativen Seren dieser Studie als Hypothetical-Sekretions-Protein HP1098, das Protein der Außenmembran HP1564 oder als Pyridoxal-Phosphat-Protein J HP1582 erkannt wurden, bedürfen diese Antigene der weiteren Erforschung mit Hilfe größerer Anzahlen von H. pylori-positiven und H. pylori-negativen Krebspatienten.

Der Stellenwert der Isocitrat-Dehydrogenase ist bei der Bewertung der Ergebnisse hinsichtlich der statistisch signifikanten Proteine von entscheidender Bedeutung. Die Spots 513, 812 und 820 der Isocitrat-Dehydrogenase-Gruppe traten bei der Pathologie signifikant häufiger und intensiver (d.h. frequenzstärker) bei Karzinompatienten auf. Die Spots 487 und 489 derselben Reihe sind nur bei Positivseren aufgetreten und haben eine größere Intensität, wie die übrigen Spots dieser Serie, bei den Karzinomseren. Isocitrat dient einigen Bakterien und Pflanzen der Umsetzung bei Energiebedarf.

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Die geringe Frequenz von Cag A bei Karzinompatienten dürfte auf die reduzierten Antikörpertiter zurückzuführen sein, da die zunehmende Ausdehnung einer intestinalen Metaplasie, die sich in der Übertrittsphase zu einem fortgeschrittenen Karzinom befindet, langfristig kein ideales Millieu für das Wachstum des Helicobacter pylori gewährleisten kann. Dafür spricht, dass die in dieser Studie erfaßten Karzinompatienten nicht eindeutig Helicobacter-positiv waren.

Das Neutrophil-activating protein (NapA), das in einer Studie (KIMMEL et al., 2000) das Hauptantigen darstellte, wurde in der Studie nur sehr selten erkannt.

Das 50S ribosomale Protein L5/L12 mit Spots 70 und 194 ist sehr häufig und intensiv bei Ulkuspatienten erkannt worden, obwohl es sich in der Silberfärbung von Helicobacter pylori 26695 als sehr kleiner Spot darstellte. Der Hauptspot 87 dieses Antigens kam jedoch häufig sowohl bei den H. pylori-positiven als auch H. pylori-negativen Gruppen vor. Diese Tatsache könnte auf die Präsenz spezifischer Stämme bei Ulkuspatienten hinweisen.

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Die zentral intermediären metabolischen Enzyme wie Isocitrat-Dehydrogenase und Akonitat-Hydratase hatten größere Frequenzen bei Karzinompatienten als bei Patienten der anderen Krankheitsgruppen. Das ABC transportierende Iron (III) kann eine zunehmende Bedeutung hinsichtlich des Metabolismus der Tumorzelle gewinnen.

Die Superoxid-Dismutase trat, trotz der schwachen Frequenz, nur bei Karzinompatienten auf. Superoxid-Dismutasen (SOD) sind Enzyme, welche die Umwandlung zweier Superoxidradikale in Wasserstoffperoxid und molekularen Sauerstoff katalysieren. Sie sind Teil eines Schutzsystems gegenüber endogen gebildeten toxischen Sauerstoffmetaboliten (BANNISTER et al., 1987). Superoxid-Dismutase wird auch von Helicobacter pylori exprimiert (LIOR et al., 1985). Es existiert unter anderem die Expression einer FeSOD von H. pylori (EVANS et al., 1993). Ob hierbei eine gleichzeitige Assoziation mit Iron (III) vorliegt, ist nicht geklärt.

Eine signifikante Beziehung zwischen Helicobacter-pylori-Seropositivität und Magenkarzinom konnte bisher nicht nachgewiesen werden (SEIFERT, 1996). Eine Helicobacter-pylori-Infektion kann jedoch über eine chronische Gastritis mit Imunglobulinantwort zu Atrophie, intestinaler Metaplasie und zur Dysplasie als Vorstufe des Magenkarzinoms (CHO et al., 1994; CLARKSON et al., 1993). Somit besteht eine Assoziation der Helicobacter-pylori-Infektion zu einem gesteigerten Risiko eines Magenkarzinoms (ASAKA et al., 1994; FUKUDA et al., 1995; KIKUCHI et al., 1995; HUANG et al., 1998).

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Die Assoziation einer H. pylori-Infektion zur Ulkuserkrankung ist enger als jene zwischen H. pylori und Karzinom (DIXON, 1993; GORMALLY et al., 1996; TYTGAT, 1994).

6.5 Serien - Spots

Problematisch war die Antigenauswertung einiger Proteine in den Serien-Spots. Beispielsweise weist die Isositrat-Dehydrogenase mit den Spots 487, 489, 812 und 820 eine nur geringfügig unterschiedliche Signifikanz bezüglich der Frequenz der Antigenerkennung und des arithmetischen Mittelwerts der Intensität auf. Die Spots 487 und 489 hatten bei der Karzinomgruppe gleiche Frequenzen. Diese Spots sind auch bei den Ulkus- und Gastritisgruppen als annähernd gleich intensiv erkannt worden. Die Verteilung der Spots 820 und 821 dieses Antigens in den einzelnen Gruppen zeigte ebenfalls geringe Unterschiede. Die unterschiedliche Verteilung von Hauptspots für das Enzym Isocitrat-Dehydrogenase kann auf Unterschiede der Sequenzen von Proteinen zwischen Helicobacter pylori und anderen kreuzreaktiven Bakterien oder Wirtsproteinen hindeuten. In einer anderen Studie (McATEE et al., 1998) wurden zwei Proteinspots dieses Antigens mit unterschiedlicher Proteinsequenz erkannt.

6.6 Analyse der Serumpools

Die große Anzahl der Proteinspots und deren Intensitäten bei den Serumpools hängt wahrscheinlich mit der Resistenz des Helicobacter pylori zusammen. Hier spielen vermutlich auch unterschiedliche Aspekte der Eradikationstherapie (französische - oder italienische - Trippeltherapien etc.) eine Rolle.

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Die große Anzahl der Proteinspots und deren Intensitäten bei den Helicobacter-positiven Pools kann auf die Kreuzreaktivität anderer Keime zurückgeführt werden, ebenfalls wie die Tatsache, dass bei den Pools noch nicht bekannte Proteinspots aufgetreten sind.

Einige Autoren suchen unter erkannten Helicobacter-Proteinen mit definierten Serumpool-Analysen nach möglichen Vakzinekandidaten (McATEE et al., 1998).

Um mögliche Unterscheidungsmerkmale zwischen den definierten Serumpools zu analysieren, sollten möglichst viele Pools mit Seren verschiedener Folgeerkrankungen der H. pylori-Infektion untersucht werden.

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12.09.2006