[Seite 5↓]

3.  Patienten, Material und Methoden

3.1. Patienten

Bei den Patienten handelte es sich um zwei Gruppen zu je 4 Personen mit einer gesicherten Leberzirrhose unterschiedlicher Genese, bei denen zuvor ein TIPS wegen rezidivierender Ösophagusvarizenblutungen oder therapierefraktärem Aszites angelegt worden war.

Zum Zeitpunkt der Stoffwechselstudie befanden sich die Patienten in einer stabilen Krankheitsphase, d.h. sie wiesen innerhalb der letzten 14 Tage keine gastrointestinale Blutungen auf, und die Körpergewichtsschwankung innerhalb der letzten 7 Tage betrug weniger als 1.5 kg bei normaler Krankenhausbasiskost. Die Körpergewichtsschwankung beinhaltete nicht die Gewichtsabnahme infolge Aszitespunktion. Der Schweregrad der Zirrhose wurde nach der Child‑Pugh Klassifikation als A, B oder C eingestuft [37]. Die Transaminasenaktivitäten überschritten die Referenzwerte zum Zeitpunkt der Untersuchung nicht um mehr als das Dreifache (Tabelle 3.1).

Bei allen Patienten wurden vor der Untersuchung Hämatokrit, Hämoglobin, MCV, Thrombozyten, Leukozyten, Quick, partielle Thromboplastinzeit, Gesamteiweiß, Albumin, Elektrophorese, Cholinesterase, GOT, GPT, γGT, AP, Gesamtbilirubin, Triglyceride, Cholesterin, Harnstoff, Kreatinin, Natrium, Kalium, Calcium, Phosphat und Chlorid bestimmt.

Alle Patienten wurden über die Ziele und die Risiken der Eingriffe, die für die Durchführung der Studie notwendig waren, vom Studienbetreuer informiert. Eine Einwilligung wurde von den Patienten in schriftlicher Form eingeholt. Das Studienprotokoll entsprach den Vorschriften der Deklaration von 1975 in Helsinki und wurde von der Ethikkommission des Universitätsklinikums der Charité genehmigt.


[Seite 6↓]

Table 3.1: Patientencharakteristika

 
 
 

5-[ 15N ]-Gln Gruppe (n=4)

2-[ 15N ]-Gln Gruppe (n=4)

 
 

Alter (Jahre) Median (Range)

53.5 (41-67)

62.0 (32-64)

 

Gewicht (kg)

(MW ± SEM)

80.3 ± 6.03

90.8 ± 5.63

 

Größe (cm)

(MW ± SEM)

173.3 ± 3.4

173.5 ± 4.5

 

Ätiologie der Zirrhose

  

( ALZ/Hep C/AIH )

2 / 1 / 1

3 / 1 / 0

 

Indikation für TIPS

  
 

Rezidivierende Varizenblutung

3

2

 

therapierefraktärer Aszites

1

2

 

Child-Pugh score Median (Range)

6 (5-10)

8 (6-10)

Classifikation ( A / B / C )

3 / 0 / 1

1 / 2 / 1

 

GOT in Plasma ( U / l ) (MW ± SEM)

24.3 ± 5.7

18.3 ± 3.0

 

GPT in Plasma ( U / l ) (MW ± SEM)

27.3 ± 7.5

12.8 ± 3.5

 
 

ALZ: alkoholische Leberzirrhose, Hep C: Hepatitis C induzierte Zirrhose, AIH: Autoimmun-Hepatitis induzierte Zirrhose


[Seite 7↓]

3.2.  Material

3.2.1. Selektive Darmdekontamination (SDD)

Die selektive Darmdekontamination (SDD) wurde zur Reduktion der Keimdichte im Darmlumen und somit zur Minimierung der bakteriellen (exogenen) Ammoniogenese eingesetzt. Damit konnte die endogene intestinale Ammoniogenese noch klarer nachweisbar werden.

Es wurde über jeweils mindestens 72h vor TIPS-Angiographie eine Vierfachkombination aus Tobramicin, Colistinsulfat, Amphotericin B und Metronidazol mit in der Tabelle 3.2 dargestellten Dosierungen verabreicht.

Tabelle 3.2: Selektive Darmdekontamination (SDD) (Dosierung pro Tag)

Tobramicin

(GernebcinR)

4 x 80 mg p.o.

Colistinsulfat

(ColistinR)

4 x 100 mg p.o.

Amphotericin B

(Ampho MoronalR Suspension)

4 x 500 mg p.o.

Metronidazol

(ClontR)

2 x 400 mg p.o.

3.2.2. Kathetertechnik

Eine arterielle Kanüle ( LeaderCathR , Vygon, 115/09, 20G, 8cm, 0.6-0.9mm ) wurde am Tag der Untersuchung vor der Angiographie unter den üblichen Kautelen in die linke Arteria radialis (A) plaziert.

Ernährungssonde. Am Untersuchungstag wurde vor der Angiographie eine 9F Ernährungssonde (FrekasoftR 8F, Fresenius, Oberursel) duodenal plaziert und die korrekte Sondenlage radiologisch verifiziert.

Venenkatheter. Die TIPS-Angiographie erfolgte über einen transjugulären Gefäßzugang mittels Katheterschleuse. Darüber erfolgte die Katheterisierung der Vena cava inferior bzw. der V. portae zur Messung des Drucks in der Vena cava inferior (PVCI) bzw. der V. portae (PVP) für die Bestimmung des porto-cavalen Druckgradienten (PVP - PVCI) zur Überprüfung der hämodynamischen Effizienz des TIPS und zur TIPS-Portographie.

Nach TIPS-Angiographie wurde für die wissenschaftliche Untersuchung ein mit seiner Spitze in der Vena mesenterica superior (VMS) platzierter Katheter belassen, sowie ein [Seite 8↓]zweiter in eine nicht mit dem TIPS in anatomischer Verbindung stehenden Lebervene (VH)

gelegt (Abbildung 3.1).

Abbildung 3.1: schematische Darstellung der TIPS-Anatomie und Platzierung der hepatal- und mesenterialvenösen Katheter

Unmittelbar nach der Katheterplatzierung wurde eine Antikoagulation (Heparin mit pTT-Verlängerung auf 50-70 s) zur Prophylaxe einer katheterbedingten Thrombose für die Dauer der Katheterisierung vorgenommen. Sie wurde noch im Angiographielabor durch Gabe eines Heparinbolus (5.000 - 7.500 IU i.v.) eingeleitet und auf der Station durch kontinuierliche intravenöse Gabe fortgeführt.

Nach Katheterplazierung und Verbringung des Patienten auf die Station erfolgte die Dokumentation des klinischen und hämodynamischen Zustandes des Patienten.

3.2.3. Enterale Nährlösung

Nach TIPS-Angiographie, Katheterplazierung und Dokumentation des Basalzustandes, in der Regel also 14‑16 Stunden nach der letzten Nahrungsaufnahme (postabsorptiver Zustand), wurde über eine duodenal plazierte Ernährungssonde die Nährstofflösung verabreicht (Tabelle 3.3).

Vor der kontinuierlichen duodenalen Applikation der Nährlösung mit dem Tracer wurde ein Tracerbolus von 12 µmolx kg-1 Körpergewicht (0,001765 g x kg-1 Körpergewicht) duodenal appliziert („primed continuous infusion“).


[Seite 9↓]

Der Nährlösung wurde als Tracer entweder 5-[15N] Glutamin (5.04 mM, 99 AP, Mass Trace, Inc. 3-G Gill St, Woburn MA 01801 USA) oder 2-[15N] Glutamin (5.04 mM, 99 AP, Mass Trace, Inc. 3-G Gill St, Woburn MA 01801 USA) zugesetzt und mit einer Rate von 2 ml.kg-1.h-1 appliziert. Das entsprach einer Zufuhr des jeweiligen Tracers von 12 µmol.kg-1.h-1.

Die Gabe der Nährlösung erfolgte über einen Zeitraum von 240 min mittels einer Applikationspumpe.

Tabelle 3.3: Zusammensetzung der Nährlösung

2-[15N] L-Glutamin oder 5-[15N] L-Glutamin

0.742 g

Kohlenhydrate und Fette (Super Soluble DuocalTM)

200.0 g

 

Kohlenhydrate

145.4 g

  

Höhere Saccharide

117.6 g

  

Trisacchaaride

14.6 g

  

Maltose

10.2 g

  

Glucose

3 g

 

Fette

44.6 g

  

Gesättigt

29 g

  

Einfach ungesättigt

5.4 g

  

Mehrfach ungesättigt

10.2 g

 

NaCl

8.0 g

 

Aqua pro infusione ad 840 ml

 

3.3. Durchführung

3.3.1. Zeitlicher Ablauf der Untersuchung

Die Untersuchung wurde mit der Abnahme von Blutproben aus dem arteriellen, mesenterial- und hepatalvenösen Katheter zur Dokumentation des basalen Zustandes (A, VMS, VH jeweils zum Zeitpunkt -10, -5 und 0 min) gestartet. Anschließend begann nach der Gabe des Tracerbolus die duodenale Infusion der Nährlösung und die Entnahme von Blutproben (aus A, VMS, VH) zu den Zeitpunkten 150, 195 und 240 min nach dem Beginn der Applikation der Nährlösung. Nach Abschluss der Infusion wurden der arterielle sowie der Mesenterial- und Lebervenenkatheter, die Vena jugularis Schleuse und die duodenale Sonde entfernt.


[Seite 10↓]

3.3.2.  Blutprobengewinnung

Die Blutentnahme erfolgte offen, d.h. vor der Probengewinnung wurden zunächst etwa 3 ml Flüssigkeit aus dem Katheter entnommen. Anschließend erfolgte die Entnahme der Untersuchungsproben, zuerst 1 ml EDTA Blut (1.2 ml Monovette KE, Sarstedt, 51588 Nümbrecht) für die Bestimmung der Ammoniumkonzentration und 10 ml heparinisiertes Blut (10 ml Monovette LH, Sarstedt, 51588 Nümbrecht) für die Bestimmung der [15N] Anreicherung in den Metaboliten und die Aminosäurenkonzentration. Anschließend wurde die initial entnommene 3 ml Flüssigkeit reinjiziert, um den Blutverlust zu minimieren.

Die Blutproben wurden unmittelbar nach der Abnahme auf Eis gelagert. Die EDTA-Monovette wurde unverzüglich auf Eis ins Zentrallabor der Charite zur Bestimmung der Ammoniumkonzentration transportiert. Die weitere Verarbeitung der Li-Heparinat Monovetten erfolgte im Stoffwechsellabor.

3.3.3. Blutprobenaufarbeitung

Im Stoffwechsellabor erfolgte die umgehende Zentrifugation der 10 ml Li-Heparinat Monovetten (3000 g, 5 min, 4°C). Der Plasmaüberstand wurde in Kryo-Röhrchen für die spätere Analytik als Duplikate wie folgt aufgeteilt:

Die Plasmaaliquots wurden sofort bei –80 °C eingefroren und so bis zur späteren Analytik aufbewahrt.


[Seite 11↓]

3.4.  Analytik

Die Messungen der Isotopenanreicherung und Metabolitkonzentrationen erfolgte mit der Ausnahme der Ammoniumkonzentration in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Proteinstoffwechsel (Leiterin: Dr. Cornnelia C. Metges) am Deutschen Institut für Ernährungsforschung (DIFE), Potsdam-Rehbrücke.

3.4.1. Aminosäurenkonzentrationen

Die Analytik der freien physiologischen Aminosäuren im Plasma erfolgte mittels Kationenaustausch-Chromatographie und Ninhydrin-Nachsäulenderivatisierung (TRIONE® ninhydrin reagent, Pickering Laboratories Inc., Mountain view, CA, USA) [38]. 250 µl Plasma wurde mit 25 µl 5-Sulfosalicylsäure (2 mol x l-1) deproteinisiert und zentrifugiert (4°C, 10 min, 10000 x g, Biofuge fresco, Heraeus Instruments, Osterode). Die Aufbewahrung des Überstandes erfolgte bei –80°C. 20 µl deproteinisiertes Plasma wurde zur Analyse unter Verwendung einer HPLC-Anlage (System Gold, Beckman Instruments GmbH, München) auf eine Hochleistungssäule (3 x 150 mm, Pickering Laboratories Inc.) injiziert. Die Elution der Aminosäuren erfolgte mittels Stufenelution unter Verwendung verschiedener Lithiumcitrat Puffer (Laborservice Onken, Gruendau) und einem definierten Temperaturstufenprogramm (Flußrate von 0.2 ml x min-1). Das Eluat wurde mit Ninhydrin-Reagenz (Flußrate von 0.2 ml * min-1) gemischt und in einem mit einer PEEK Kapillare (10 m, 0.25 mm i.d.) ausgestattetem Nachsäulenreaktor auf 130 °C erhitzt. Die Absorption wurde bei 570 nm gemessen. Eine Rekalibrierung der Methode erfolgte nach der Messung von jeweils 4-5 Proben unter Verwendung eines kompletten Aminosäurenstandard- gemisches zur Identifizierung und Bestimmung der Response-Faktoren für jede fragliche Aminosäure (Konzentration jeder Aminosäure - 0.3 µmol x l-1, ausgenommen Prolin - 0.6 µmol x l-1, Harnstoff - 3 µmol x l-1).

3.4.2. Ammoniumkonzentration

Die Bestimmung der Ammoniumkonzentration erfolgte enzymatisch aus EDTA-Plasma am Roche / Hitachi 717 bei 37°C [39, 40]. 1 ml EDTA-Blut wurde unmittelbar nach der Entnahme auf 4°C Eis ins Labor transportiert und zentrifugiert. Dem gewonnenen Plasma wurde gepuffertes Substart (Triethanolaminpuffer 151 mmol x l-1 (pH 8,6), ∝- Ketoglutarat 16.6 mmol x l-1, ADP ≥ 1.2 mmol x l-1) und NADPH ≥ 458 µmol x l-1, GLDH ≥ 24.3 U x ml-1 [Seite 12↓]und gepuffertes Substrat (wie oben beschrieben) hinzugefügt. Die Reaktion findet nach der folgenden Gleichung statt:

Die Menge des während der Reaktion oxidierten NADPH entspricht der Ammonium­konzentration der Probe und kann durch die resultierende Absorptionsabnahme photometrisch gemessen werden.

3.4.3. [15N] Metabolite

Die Messung der [ 15 N] Anreicherung in den freien Plasmaaminosäuren erfolgte als N-pivaloyl-i-propyl (NPP) Aminosäuren Derivate mittels GC-C-IRMS (Gaschromatographie-Verbrennung-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie) entsprechend der Beschreibung von Metges und Petzke [33-35].

Das Isotopenverhältnis-Massenspektrometer (Delta S , Finnigan MAT, Bremen) ist über eine Verbrennungsschnittstelle (combustion interface, Finnigan MAT) an einem HP 5890 Gas-Chromatograph (Hewlett-Packard, Waldbronn) online angeschlossen (GC-C-IRMS). Die Schnittstelle besteht im wesentlichen aus einem Verbrennungsreaktor zur Oxidation organischer Moleküle, der mit Kupfer, Nickeloxid und Platin gefüllt ist (980°C), sowie aus einem Reduktionsofen, gefüllt mit elementarem Kupfer (600°C) zur Reduktion von Stickstoffoxiden zu molekularem N2. Das System ist schematisch in Abbildung 3.2 dargestellt.

Zur Derivatisierung wurden 500 µl Plasma mit 1 ml 0.1 mol x l-1 HCl angesäuert und 200-500 nmol α-Aminoadipinsäure als interner Standard hinzugefügt. Nach Auftragung der Aminosäuren auf mit Dowex AG 50W-X8 Harz (Na+ Form, 200 mesh) gefüllte individuelle Säulen erfolgte die Elution mit 2 ml 4 mol x l-1 NH4OH und 1 ml doppelt destilliertem Wasser. Ein Aliquot der Aminosäuren (3-8 µmol Gesamtaminosäuregehalt) wurde mit 1 ml Veresterungsreagenz, bestehend aus frisch vorbereitetem 1 mol x l-1 Thionylchlorid Lösung, in 2-Propanol gelöst und in mit Teflon abgedichteten Kappen verschlossenen Reaktionsgefäßen (16 x 100 mm) 60 min bei 100°C erhitzt. Das Produkt wurde unter Stickstoff bei 60°C getrocknet und in 100 µl wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Acylierung erfolgte nach Zusatz von 100µl Pivaloylchlorid und 30 minütigem Erhitzen bei 60°C. Nach Abkühlung wurden 2 ml Dichlormethan zugesetzt. Anschließend erfolgte eine Reinigung [Seite 13↓]von überschüssigem Acylierungsreagenz und sonstigen die GC-Trennung beein­flussenden Verunreinigungen durch tropfenweise Passage durch eine Silicagel-Säule (60, 200-400 mesh, 4 cm x 4 mm). Das Filtrat wurde mit einem sanften Stickstofffluß bei Raumtemperatur eingeengt und zur Probeninjektion in Ethylacetat aufgelöst.

Abbildung 3.2: schematische Darstellung des GC-C-IRMS

Für die GC-Trennung der NPP-Derivate wurden eine Kapillarsäule (Ultra 2,50 m x 0.32 mm i.d.) und Helium als Trägergas (1 ml x min-1) benutzt. 0.5 µl der Lösung wurden splitless injiziert (Injektortemperatur 280°C), und die Temperatur des Säulenofens wurde zunächst 1 min bei 70°C gehalten, dann mit 3°C x min-1 auf 220°C angehoben; der weitere Anstieg der Temperatur auf 300°C erfolgte mit 10°C x min-1 . Die Endtemperatur von 300°C wurde 8 min beibehalten. Eine Kalibrierung der Methode wurde während des Analysenlaufes zu definierten Zeitpunkten mittels Referenz-Stickstoffgas-Impulsen bekannter Isotopen- zusammensetzung durchgeführt.

Die Datenverarbeitung erfolgte mit ISODAT vendor ausgestatteter Software (Finnigan MAT). Die Sensitivität der Neigung für Peakanfang und Peakende wurde mit 0.2 und 0.4 mV x s-1 definiert.

Die [ 15 N] Anreicherung in Ammonium, Glutamin und Glutamat erfolgte mittels EI-GC-MS (Elektronenstoßionisation-Gaschromatograph-Massenspektrometrie, electron [Seite 14↓]ionization 70 eV) im SIM-Modus (selective ion monitoring (GC-MS, SSQ 710, Finnigan MAT, Bremen, gekoppelt mit einem Gaschromatographen Varian 3400, Varian Chromatography Systems, Walnut creek).

Die Messung der [15N] Anreicherung im Ammonium wurde als Pentaflourobenzamid­derivat durchgeführt [41]. Zur Derivatisierung wurde gekühltes Plasma zu 1 ml 50 % igem, suspendiertem Ionenaustauscherharz (Dowex AG-50-X8-Na+,K+) bei neutralem pH hinzugefügt. Die Vorbereitung des Dowex erfolgte nach Yang et al. [36]. Nach dem Absetzen des Harzes wurde der Überstand verworfen und das Dowex drei mal mit destilliertem Wasser gewaschen. Das resuspendierte Harz wurde anschließend in individuelle Säulen gefüllt (0.5 x 2.5 cm) und mit 3 ml 4 mol x l-1 NaCl in Reaktionsgefäße (16 x 100 mm) eluiert, die 2 ml 5 %iges Natriumhydrogenkarbonat zur Freisetzung des Ammoniums sowie 15 µl Pentafluorobenzoylchlorid für die Derivatisierung enthielt. Das Gemisch wurde 5 min bei Raumtemperatur gevortext und anschließend das entstandene Pentafluorobenzamin (PFBA) durch 10 minütiges Extrahieren in 5 ml Ethylacetat in die organischen Phase überführt. Nach dem Verwerfen der wässrigen Phase wurde das Ethylacetat mit 2 ml 6 %iger Phosphorsäure gemischt und 30 s gevortext sowie über Natriumsulfat getrocknet und so für die GC-MS-Analytik verwendet.

Für die GC-Trennung der Pentaflourobenzamidderivats benutzten wir eine Kapillarsäule (DBWAX, 30m, 0.318 mm i.d., 0.25 µm Filmdicke; J&W Scientific, Folsom, CA) und Helium als Trägergas (1 ml x min-1 bei 250°C). 1 µl der Lösung wurde ohne Strömungsteilung (splitless) injiziert (Injektortemperatur 280°C), und die Temperatur des Säulenofens wurde zunächst innerhalb von 2 min von 50 auf 100°C erhöht, dann innerhalb von 6 min auf 250°C angehoben. Die Endtemperatur von 250°C wurde 10 min beibehalten. Die Quellen- und Transferlinetemperatur betrug 150 bzw. 300°C. Die Retentionszeit des Ammoniumderivats betrug unter diesen Bedingungen etwa 6.4 min. Im SIM-Modus (single ion monitoring) wurde die Intensität der vorrangigen protonisierten Ionen bei m/e = 211 (unmarkiertes Ammonium) und bei m/e = 212 ([15N] Ammonium) gemessen. Die Berechnung der Anreicherung basierte auf dem tracer/tracee-Peakflächenverhältnis (212/211) unter Verwendung von Standard­lösungen mit steigendem Molverhältnis an [15N] Ammonium im Verhältnis zu unmarkiertem Ammonium im Bereich 0-10 MFE (mole fraction excess) zur Kalibrierung.


[Seite 15↓]

Die Messung der [15N] Anreicherung in Glutamin und Glutamat erfolgte nach Umwandlung in die tert-Butyldimethylsilyl (tBDMS) Derivate [42,43]. Die Proteine von 200 µl Plasma wurden mittels 2 ml eiskaltem Methanol ausgefällt. Nach Zentrifugation (1000 x g, 4°C, 10 min) wurde der Überstand unter N2 bei 50°C eingeengt. Die Proben wurden in 2 ml 0.1 mol x l-1 HCl gelöst und auf individuelle Kationenaustauschersäulen geladen (1 ml Dowex 50W-X8, 200-400 mesh, vorgewaschen in der folgenden Reihenfolge: mit 2 mol x l-1 HCl, Wasser, 2 mol x l-1 NaOH, Wasser und in 0.1 mol x l-1 HCl aufbewahrt). Die Elution der Aminosäuren erfolgte nach dem Waschen jeder Säule (1 ml 0.01 mol x l-1 HCl) mit 3 ml 4 mol x l-1 NH4OH in Reaktionsgefäße (16 x 100 mm) und anschließender Trocknung unter N2 bei 60°C. Nach Zusatz von 70 µl Dimethylformamid und 30 µl N-tert-Butyldimethylsilyl-N-methyl-trifluoroacetamid (MTBSTFA) wurden die Proben in den mit PTFE-abgedichteten Kappen verschlossenen Reaktionsgefäßen für 30 min bei 105°C erhitzt und nach dem Abkühlen mittels GC-MS analysiert.

Für die GC-Trennung der tBDMS-Derivate wurde eine Kapillarsäule (DB-5MS, 30m, 0.25 mm i.d., 0.25 µm Filmdicke; J&W Scientific, Folsom, CA) und Helium als Trägergas (1 ml x min-1 bei 250°C) benutzt. 1 µl der Lösung wurde ohne Strömungsteilung (splitless) injiziert (Injektortemperatur 280°C). Die Temperatur des Säulenofens wurde zunächst innerhalb von 3 min von 155 auf 1190°C erhöht, dann innerhalb von 5 min auf 220°C und schließlich innerhalb von 10 min auf 290°C angehoben. Die Endtemperatur von 290°C wurde 10 min beibehalten. Die Quellen- und Transferlinetemperatur betrug 150 bzw. 300°C. Die Retentionszeiten der Glutamat- und Glutamin-tBDMS-Derivate betrugen unter diesen Bedingungen etwa 10.7 und 16.6 min. Im SIM-Modus wurde die Intensität der vorrangigen protonisierten Ionen ([M+H+]-57) bei m/e = 432 (unmarkiertes Glutamat) und bei m/e = 433 (2-[15N] Glutamat) gemessen. Bei m/e = 258 und 259 erfolgte die Messung entsprechend für unmarkiertes Glutamin welches nur Aminostickstoff enthielt und analog dazu für 2-[15N] Glutamin. Bei m/e = 545 und 546 wurde unmarkiertes Glutamin mit Amino- und Amid-Stickstoff sowie 2-[15N] Glutamin zusammen mit 5-[15N] Glutamin gemessen. Aus der Differenz der Anreicherungen (m/e = 546 und m/e = 259) wurde die Anreicherung im Amid Stickstoff des Glutamins errechnet. Die Berechnung der Anreicherungen basierte auf den entsprechenden tracer/tracee-Peakflächenverhältnissen unter Verwendung von Standardlösungen mit steigendem Molverhältnis an 2-[15N]-, 5-[15N] Glutamin sowie 2-[15N]-Glutamat im Verhältnis zu den unmarkierten Aminosäuren im Bereich 0-10 MFE (mole fraction excess) zur Kalibrierung.


[Seite 16↓]

3.5.  Datenauswertung

Die [15 N] Anreicherung in Ammonium, Glutamin, Glutamat, Alanin, Glycin, Serin und Prolin wurde sowohl in den Basalproben als auch in den Proben 150 min, 195 min und 240 min nach der Infusion gemessen. Für jede Probe ergaben sich jeweils ein Wert ohne Anreicherung (count m+0) und ein Wert mit Anreicherung (count m+1). Die Verhältnisse der Werte m+1 / m+0 ergaben die area ratio-Werte (AR-Werte). Die gemittelten AR-Werte während der Infusion wurden von den gemittelten AR-Werte vor der Infusion abgezogen, woraus die area ratio excess-Werte (ARE-Werte) resultierten. Auf deren Basis wurden die area fraction excess-Werte (AFE-Werte) in % wie folgt berechnet:

AFE = ARE / (ARE + 1) * 100

Die AFE-Werte wurden mit dem Slope-Wert der Eichgerade AFE (gemessene Werte) gegen mole fraction (MF) (berechnete Werte) unter Verwendnung von Eichlösungen des jeweiligen [15 N] Metabolits im zu erwartenden Anreicherungsbereich multipliziert. Daraus ergaben sich mole fraction excess (MFE) oder mole % excess (MPE). Die Messung der Eichgerade erfolgte messtäglich zusammen mit den Plasmaproben zur weitgehenden Eliminierung von gerätespezifischen Fehlern.

Aus den gemessenen [15 N] Anreicherungen (MPE) in Ammonium, Glutamin, Glutamat, Alanin, Glycin, Serin und Prolin wurden arterio-venöse Differenzen ermittelt. Die Differenz A – VH ergibt den Substratumsatz im Splanchnikusgebiet, A – VMS ergibt den Substratumsatz im Darm, und die Differenz VMS – VH ergibt den Substartumsatz in der Leber. Die positiven Werte verweisen auf eine Abgabe und die negativen auf eine Aufnahme der jeweiligen Substrate.

Die arterio-venösen Differenzen wurden als organspezifische Umsätze definiert und im folgenden (Abbildung 3.3) sowohl rechnerisch als auch schematisch dargestellt.


[Seite 17↓]

Abbildung 3.3: Schematische Darstellung der errechneten Stoffumsätze für den Darm (A – VMS), die Leber (VMS – VH) und des Splanchnikusgebiets (A – VH)

A – VMS = Darmumsatz
A – VH = Umsatz im Splanchnikusgebiet
VMS – VH = Leberumsatz

Die Abschätzung der Transferrate (%) des Amid- oder Amino-Stickstoffs aus dem infundierten 5-[15 N] Glutamin bzw. 2-[15 N] Glutamin in Ammonium und Aminosäuren des arteriellen Plasmas erfolgte aus dem Verhältnis zwischen der [15N] Menge (n), die in Ammonium oder Aminosäure erscheint (µmol), und der applizierten [15N] Menge (i) aus Glutamin (µmol x h-1) der Nährstofflösung (Gleichung 1).

Die [15N]-Menge (n), die in Ammonium oder Aminosäure erscheint (µmol), wurde mit der Gleichung 2 errechnet:


[Seite 18↓]

Ep ist die [15N] Anreicherung im Ammonium oder in den Aminosäuren (MPE). Cp ist die Konzentration von Ammonium oder Aminosäueren im Plasma (µmol x l-1), und V(pool) ist die Plasmapoolgröße (L). Die Bestimmung der Plasmapoolgröße erfolgte mit Hilfe eines Nomogramms unter Berücksichtigung der Körpermasse, des Alters und Geschlechts [44].

3.6. Statistik

Für die statistische Auswertung der Daten wurde ein Modell der Varianzanalyse für kreuzklassifizierte Faktoren angewendet. Als feste Faktoren wurden die Art des Tracers (2-[15N] oder 5-[15N]) und der Entnahmeort (A, VH, VMS) sowie der postabsorptive und absorptive Zustand als wiederholter Zeitfaktor und entsprechende Wechselwirkungen in das Modell aufgenommen. Als zufälliger Effekt wurde der Patient innerhalb Tracer und Entnahmeort im Modell verwendet.

Die Berechnungen erfolgten mit der Prozedur MIXED des Programmpaketes SAS© ( SAS Systems, Release 8.2, SAS Institute). Alle Tests wurden zu einem Risiko 1. Art p = 0.05 durchgeführt.

Falls signifikante Wechselwirkungen zu beobachten waren, wurde die post-hoc Test der Subklassen mit einer Tukey-Kramer Korrektur angewendet, um ein multiples Risiko 1. Art ≤ 0.05 sicherzustellen.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
11.02.2005