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5.  Diskussion

In der vorliegenden Untersuchung wurde der TIPS bei Leberzirrhosepatienten als Zugang zur selektiven Blutentnahme aus den Splanchnikusgefäßen benutzt, die bisher nur auf invasivem Weg während einer Laparotomie erreicht werden konnten. Hierdurch konnte erstmals auch am Menschen der Metabolismus der Stickstoffgruppen des Glutamins im Dünndarm untersucht werden. Durch die enterale Applikation von einerseits in der Aminoposition und andererseits an der Amidoposition markiertem Glutamin konnte der Stoffwechsel sowohl über den Glutamatdehydrogenase- als auch den Glutaminaseweg untersucht werden.

5.1. Methodologie

Stabile Isotopen ermöglichen die genaue Verfolgung von Stoffwechselwegen und erlauben uns, genaue Aussagen über die Herkunft bestimmter Produkte des intermediären Stoffwechsels ohne radioaktive Belastung der Patienten zu treffen. Die quantitative Analytik der stabilen Isotopen in den Stoffwechselprodukten erfolgt beispielsweise aus Blutproben mittels Gaschromatographie / Massenspektrometrie nach entsprechender Probenaufbereitung.

Bisher war die Katheterisierung von mesenterialen Venen nur im Rahmen von tierexperimentellen Studien [45] oder elektiven abdominalen Eingriffe beim Menschen [11,13,14] möglich . Nach Anlage eines TIPS bei Patienten mit Leberzirrhose kann die Mesenterialvene selektiv katheterisiert werden, ohne die Patienten einem chirurgischen Eingriff unterziehen zu müssen [9,16]. Darüber hinaus können auf diese Weise mögliche beeinflussende Faktoren wie Anästhesie oder Traumastoffwechsel im Rahmen des elektiven abdominalen Eingriffes ausgeschlossen werden. Die vorliegende Untersuchung erfolgte an Patienten mit Leberzirrhose nach einer minimal invasiven Prozedur, entweder einer TIPS-Neuanlage oder einer TIPS-Angiographie. Die in tierexperimentellen Studien durchgeführte selektive Katheterisierung der zuführenden arteriellen Darmgefäße kann beim Menschen allenfalls intraoperativ erfolgen. Bei nicht invasiven Untersuchungen ist bis heute das Problem einer ausreichend genauen Messung des Volumenflusses noch nicht befriedigend gelöst. Dies gilt besonders für sonographische Verfahren [46,47], deren Messfehler zu einer nicht zu akzeptierenden Ungenauigkeit der Ergebnisse führt und auf [Seite 46↓]die daher in der vorliegenden Untersuchung verzichtet wurde. Darüber hinaus bestehen bei Patienten mit Leberzirrhose zusätzlich zu dem leichter zu quantifizierenden Shuntfluss durch den TIPS weitere teils auch intrahepatische Gefäßshunts, die eine Unterscheidung der effektiven Leberdurchblutung vom Shuntvolumen zusätzlich erschweren. Daher beschränkte sich die vorliegende Untersuchung auf die Messung der arterio-venösen Differenzen anstatt des Stoffumsatzes pro Zeiteinheit.

Die Berechnung der Transferrate des markierten Stickstoffes auf die verschiedenen Metabolite basiert auf einer geschätzten Plasmapoolgröße, welche abhängig von der Körpermasse, dem Alter und Geschlecht einem publizierten Nomogramm entnommen wurde [44]. Mit dieser Berechnung ist es möglich, eine Aussage über den Transfer des markierten Stickstoffes aus dem infundierten Glutamin auf die anderen nur im Blutplasma vorkommenden Metabolite zu treffen.

Bei der Interpretation der Ergebnisse ist zu berücksichtigen, dass die an Patienten mit Leberzirrhose erhobenen Befunde nicht ohne weiteres auf Gesunde übertragbar sind. Bei einer eingriffsbezogenen Letalität von ca. 1-2% für die Anlage eines TIPS verbietet sich die Untersuchung an gesunden Probanden.


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5.2.  Stoffwechselmetabolite

Ammonium

Die signifikant höhere Ammoniumkonzentration in der Vena mesenterica superior verglichen mit der Konzentration in der Arteria radialis und Vena hepatica ist Ausdruck der intestinalen Ammoniumfreisetzung. Diese Beobachtung war seit den Pionierarbeiten von Windmüller und Spaeth aus Tierexperimenten bekannt [7,48,49] und wurde von Plauth und Mitarbeitern erstmals auch bei Patienten mit Leberzirrhose und TIPS nachgewiesen [16]. Die hohe portalvenöse Ammoniumkonzentration entstammt in den Tierexperimenten zu 50 % dem Glutaminstoffwechsel des Dünndarmes durch die Glutaminase-Reaktion, welche durch die Abspaltung der Amid-Gruppe Ammonium und Glutamat freisetzt [4]. Dieser Beitrag des Dünndarms zur Ammoniogenese erklärt das Phänomen des „ germ free paradox “, bei welchem das Auftreten von hepatischer Enzephalopathie nach portocavaler Anastomose bei keimfrei aufgezogenen Tieren beobachtet wurde [17]. Diese Ammoniogenese als Folge des intestinalen Glutaminstoffwechsels ist durch Lactulose und Neomycin nicht zu beeinflussen [10]. Die intestinale Ammoniogenese trägt durch das hohe portalvenöse Ammoniumangebot an die Leber der Aufrechterhaltung der Harnstoffsynthese bei.

In der vorliegenden Untersuchung konnte durch die höhere [15N] Anreicherung in [15N]-Ammonium nach der Applikation von 5-[15N]-Glutamin, nicht aber nach der Applikation von 2-[15N] Glutamin erstmals am Menschen nachgewiesen werden, dass die intestinal-mukosale Ammoniumproduktion nahezu ausschließlich über die Glutaminase-Reaktion verläuft. Dieses Ergebnis steht in guter Übereinstimmung mit den Daten, die in Untersuchungen an Hunden gewonnen wurden [31].

Der Dünndarm und die Niere gelten als Hauptproduzenten des Ammoniums [9]. Unter physiologischen Säure-Basen-Status spielt die Aktivität der Glutaminase in der Ammoniogenese der beiden Organe die vorrangige Rolle. Erst im azidotischen Zustand gewinnt die Aktivität der Glutamat-Dehydrogenase in der renalen Ammoniogenese an Bedeutung [26-30]. Wir konnten eine signifikant höhere Transferrate des [15N] Stickstoffes auf das [15N]-Ammonium nach der Gabe von 5-[15N]-Glutamin beobachten. Dies bestätigt, dass die intestinale Ammoniogenese unter physiologischen Säure-Basen-Status ganz überwiegend durch die Wirkung der Glutaminase bestimmt wird. Im Dünndarm lässt sich eine hohe Aktivität der Glutaminase nachweisen [23-25], dagegen beträgt die [Seite 48↓]Glutamat-Dehydrogenase Aktivität lediglich 10-20 % derjenigen in der Leber [50]. Inwieweit der Flux durch Glutamat-Dehydrogenase Reaktion im Dünndarm von Änderungen des Säure-Basen-Status verändert wird, müsste in weiteren Studien untersucht werden.

Aus der Abbildung 3.2 wird ersichtlich, dass mit dem von unserer Arbeitsgruppe entwickelten experimentellen Ansatz der Substratumsatz im gesamten Splanchnikusgebiet untersucht werden kann. Darüberhinaus war es durch die selektive Katheterisierung der V. mesenterica superior und V. hepatica möglich, auch differenziert organspezifische Substratumsätze für den Darm und die Leber zu quantifizieren. Nach der Applikation von 5-[15N] Glutamin kam es zu einer Nettoextraktion des [15N] Ammoniums im Splanchnikusgebiet.. Diese splanchnische Nettoextraktion setzt sich aus einer intestinalen Freisetzung und einer hepatischen Extraktion von [15N] Ammonium zusammen. Das von der Leber extrahierte Ammonium steht unter anderem der Harnstoff- und Glutaminsynthese zur Verfügung.

[Seite 49↓]Glutamin und Glutamat

Die oben diskutierte intestinale Ammoniumproduktion ist Folge des intestinalen Glutaminabbaus über die Glutaminase-Reaktion. Das enteral zugeführte Glutamat wird sowohl vom Menschen als auch vom Tier im Gegensatz zum Glutamin in viel höheren Raten (ca. 90 % vs 50 %) während der ersten Passage vom Splanchnikusgebiet verstoffwechselt. Der Hauptweg dieses Metabolismus stellt die Oxidation des Glutamats dar [18-22].

Der differenzierte Stoffwechsel des Glutamins in der Leber entlang der Sinusoide wurde in dem Modell von Häussinger geklärt [51]. Danach wird das Glutamin in den periportalen Zellen über die Glutaminase-Reaktion zu Glutamat und Ammonium abgebaut und in den Zellen nahe der Vena zentralis erneut aus Glutamat und Ammonium über die Glutamin-Synthase-Reaktion gebildet.

Da wir in unserer Untersuchung Stickstoff-markiertes Glutamin enteral appliziert haben, können wir nur über die metabolischen Wege des Stickstoffes, und nicht die des Kohlenstoffes treffen.

Die Abbildung 5.1 fasst den Glutaminstoffwechsel aus den tierexperimentellen Daten zusammen.


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Abbildung 5.1: Schematische Darstellung des Glutaminstoffwechsels in verschiedenen Organen

Der signifikante Unterschied in der Glutaminkonzentration zwischen den beiden Patientengruppen ist durch die Patientencharakteristika bedingt und bei einer kleinen Fallzahl wie in der vorliegenden Untersuchung trotz gleicher Einschlusskriterien nicht sicher zu vermeiden. Dieser Unterschied zeigt sich bereits im postabsorptiven Zustand und ist somit unabhängig von der Tracermarkierung. Nach der Applikation der Nährstofflösung konnte ein signifikanter Abfall der Glutaminkonzentration beobachtet werden. Dieser kommt dadurch zustande, dass die Nährlösung zusätzlich zum Tracer 145 g Kohlenhydrate enthielt, welche eine Insulin-Antwort nach sich ziehen. Unter IGF-I und Insulin kommt es bekanntermassen zu einer Hypoaminoacidämie [52].

Die signifikant höhere [15N] Anreicherung in 2+5-[15N]-Glutamin und die signifikant höhere [15N] Transferrate auf 2+5-[15N]-Glutamin nach der Applikation von 5-[15N]-Glutamin weisen auf eine Übertragung des Amid-Stickstoffes auf die Amino-Position des Glutamins hin. Hierfür spricht auch die Tatsache, dass sich die [15N] Transferrate auf das [Seite 51↓]2-[15N]-Glutamin und [15N]-Glutamat zwischen beiden Infusionsgruppen nicht unterschied. Ähnliche Beobachtungen sind aus Untersuchungen an der perfundierten Rattenleber und an Schafen beschrieben [53, 54]. Nissim und Mitarbeiter führten das Erscheinen von [15N] Stickstoff in Glutamat, Alanin und Aspartat nach der Applikation von 5-[15N]-Glutamin auf die Reversibilität der Glutamat-Dehydrogenase Reaktion zurück und bezeichneten diesen Weg als „reduktive Aminierung“.

In der Darmmukosa ist sowohl immunhistochemisch als auch durch direkte Messungen das Enzym Glutamin-Synthase nachgewiesen worden [55, 56]. Darüber hinaus liegen Hinweise vor, dass im Darm geringe Mengen Glutamin aus Glutamat entstehen können [20]. Somit könnte auch der Darm an dem Prozeß der sogenannten „reduktiven Aminierung“ beteiligt sein. Dafür findet sich in unserer Untersuchung aber keine Bestätigung, denn die gemessenen arterio-venösen Differenzen von 2+5-[15 N]-Glutamin zeigen lediglich eine hepatische Extraktion nach der Applikation von 5-[15N]-Glutamin an. Daher ist davon auszugehen, dass die „reduktive Aminierung“ unter Bedingungen, wie sie bei den untersuchten Zirrhosepatienten vorlagen, offenbar von allenfalls untergeordneter Bedeutung ist.

Die signifikante [15N] Anreicherung in 2-[15N]-Glutamin und dessen signifikante intestinale Abgabe nach der Applikation von 2-[15N]-Glutamin ist in erster Linie mit der intakten Translokation des markierten Glutamins durch die Darmmukosa erklärbar.

Die signifikant höhere Glutamatkonzentration in der Vena hepatica stimmt mit den Daten aus der Literatur überein und zeigt die Glutamatabgabe aus der Leber an [12, 57].

Die [15N] Anreicherung in [15N]-Glutamat und die [15N] Transferrate auf das [15N]-Glutamat waren interessanterweise in beiden Gruppen nicht unterschiedlich. Dies bedeutet, dass der Amidstickstoff des Glutamins auf die Amino-Position transferiert wird und damit die oben erwähnte reduktive Aminierung bestätigt.

Aus den Daten der arterio-venösen Differenzen von [15N]-Glutamat ist zu ersehen, dass die Leber signifikante Mengen des [15N]-Glutamats extrahiert und einer erneuter Glutaminsynthese und der Synthese weiterer Aminosäuren über die Aminotransferase-Reaktionen zur Verfügung stellt.

[Seite 52↓]Alanin

Alanin ist eine nicht-essentielle Aminosäure, die zu Pyruvat transaminiert wird. Alanin ist über die reversible Transaminierung von Pyruvat sowohl ein Stickstoff-Donator als auch ein Stickstoff-Akzeptor. Neben der Skelettmuskulatur geben Darm und Niere Alanin ab, während die Leber das vorrangige Organ für die Alaninaufnahme darstellt [58-62]. Die hauptsächliche Quelle für Pyruvat als Alaninbaustein ist die Glycolyse. Die Deaminierung des Alanins liefert Stickstoff für den Harnstoffzyklus und Oxalacetat über Pyruvat für den Citratzyklus.

In unserer Untersuchung stimmt die signifikant höhere Alaninkonzentration in der Vena mesenterica superior mit den bisher bekannten Daten aus den humanen und Tierexperimenten über die intestinale Alaninabgabe überein [63-66]. Ebenso ist die signifikant niedrigere Alaninkonzentration in der Vena hepatica durch die Alaninaufnahme in der Leber zu erklären. Da unsere Infusionslösung Glucose enthielt, konnten wir nach der Applikation der Nährlösung unabhängig von der Art des Tracers und vom Ort der Blutabnahme einen signifikanten Anstieg der Alaninkonzentration beobachten. Das Pyruvat als Baustein für dieses Alanin dürfte aus der in die Nährlösung hinzugefügten Glucose stammen.

In Untersuchungen mit Kohlenstoff- und Stickstoff-markiertem Glutamin / Glutamat nach enteraler Tracerapplikation ist gut belegt, dass Glutamat während der ersten Passage durch das Splanchnikusgebiet zu ca. 90 % metabolisiert wird [18]. Das enteral zugeführte Glutamat wird im Darm zu einem Teil vollständig oxidiert und zum anderen Teil dessen Kohlenstoffgerüst in den Citratcyklus eingeschleust [67]. Die verbliebene Amino-Gruppe des Glutamats steht in beiden Fällen dem Pyruvat als Stickstoffakzeptor zur Verfügung. Durch diese Transaminierung entsteht Alanin. Dementsprechend haben wir in unserer Untersuchung nach der Applikation von 2-[15N]-Glutamin eine signifikant höhere [15N] Anreicherung in und [15N] Transferrate auf [15N]-Alanin beobachtet. Dies steht in guter Übereinstimung mit den Daten von Volman-Mitchell und Mitarbeitern, die eine Alanin-Aminotransferase Aktivität im Dünndarm der Ratte nachgewiesen haben [68].

[Seite 53↓]Glycin, Serin

Die beiden Aminosäuren sind in ihrem Aufbau sehr ähnlich und zeigen im Stoffwechsel enge Beziehungen. Die Umwandlung von Serin in Glycin findet durch die Reaktion mit Serin-Hydroxymethyltransferase statt [69]. Dieses Enzym liegt im Dünndarm der Ratte in hoher Aktivität vor [70]. Als Nebenprodukt dieser Reaktion entsteht das 5,10 Methylentetrahydrofolat, welches unter anderem für die Synthese von Purin und Pyrimidin notwendig ist [71]. Dagegen enthält der Dünndarm der Ratte nur eine geringe Aktivität der Serin-Dehydratase und Serin-Aminotransferase [72]. Die beiden letzteren Enzymen katalysieren den reversiblen Abbau von Serin zu Pyruvat und Ammonium. Die Aufnahme von Glycin im Dünndarm dient der Synthese von Glutathion [73].

In unserer Untersuchung konnten wir übereinstimmend mit der Literatur eine signifikant höhere Glycinkonzentration in der Vena mesenterica superior als Hinweis für die intestinale Abgabe des Glycins beobachten [58,65,66,74]. Dagegen spricht die niedrigere Konzentration in der Vena hepatica für die hepatische Extraktion des Glycins. Der signifikante Glycin- und Serinkonzentrationsabfall nach der Applikation unabhängig von der Art des Tracers und dem Ort der Blutentnahme ist auch in diesem Fall auf IGF-I und Insulin als Antwort auf die zugeführten Kohlenhydrate zurückzuführen [52].

Die signifikant höhere [15-N] Anreicherung in [15-N]-Glycin und [15N]-Serin, aber auch die signifikant höhere [15N] Transferrate auf das [15N]-Glycin nach der Applikation von 2-[15N]-Glutamin sprechen für die Herkunft des [15-N] Stickstoffes in beiden Aminosäuren aus der Amino-Gruppe des Glutamins bzw. Glutamats. Da die arterio-venösen Differenzen von [15N]-Glycin und [15N]-Serin sich nicht signifikant von Null unterschieden, können wir aus unseren Daten über den Ort dieser Transaminierung keine Aussage treffen.

[Seite 54↓]Prolin

Ebenso wie bei den anderen Aminosäuren war die Prolinkonzentration nach der Applikation der Nährlösung aufgrund der Wirkung von IGF-I und Insulin signifikant abgefallen [52]. Die signifikante [15.N] Anreicherung in [15N]-Prolin und die [15N] Transferrate auf [15N]-Prolin nach der Infusion von 2-[15N]-Glutamin stehen in guter Übereinstimmung mit der beschriebenen Prolinsynthese aus Glutamat und dem Prolinabbau zu Glutamat [69,75]. Prolin wird zu ca. 38 % von den Pfortader drainierenden Organen des Schweins während der ersten Passage aufgenommen [76] und in den Enterozyten zu ca. 80-90 % in Ornithin, Citrullin und Arginin überführt [75,77]. Daher ist entgegen der früheren Auffassung anzunehmen, dass Prolin als ein intermediäres Produkt des Glutamin-/Glutamatstoffwechsels in der Darmmukosa einer höheren Metabolisierungsrate unterliegt und ein wichtiges Substrat für die Synthese von Arginin, Ornithin und Polyaminen darstellt.


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11.02.2005