Aus der Klinik für Neurologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

DISSERTATION

Experimentelle Untersuchungen zur neuronalen Fehlregulation des Zellzyklus beim Schlaganfall

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Juri Katchanov


aus Moskau, Russische Föderation

Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. R. Haberl, München
2. Prof. Dr. med. O. Witte, Jena
3. PD Dr. med. M. Endres, Berlin

Datum der Promotion: 25.04.03

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Schlaganfall
  • 1.2  Schlaganfallmodelle
  • 1.3 Verzögerter neuronaler Zelltod nach Ischämie
  • 1.4 Zellzyklus
  • 1.5  Synthetischer Zellzyklusinhibitor Olomoucine
  • 1.6 Dysregulation des Zellzyklus als Auslöser des neuronalen Zelltodes
  • 1.7  Zellzyklusregulation und Ischämie
• 2  Herleitung der Aufgabenstellung und experimentelle Strategie
• 3  Methodik
  • 3.1 Material
    • 3.1.1 Basispuffer
    • 3.1.2 Fixativa
    • 3.1.3 Antikörper
    • 3.1.4 Sera
    • 3.1.5 Zellkultur
  • 3.2 Methoden
    • 3.2.1 Filamentmodell
    • 3.2.2 BrdU-Applikation
    • 3.2.3 Primäre neuronale Zellkultur
    • 3.2.4 Sauerstoff-Glukose-Entzug
    • 3.2.5  Vorbehandlung der Zellkultur mit Olomoucine
    • 3.2.6 Gewebeaufarbeitung
      • 3.2.6.1 Transkardiale Fixation des Gewebes
      • 3.2.6.2 Einfrieren von unfixierten Maushirnen
      • 3.2.6.3 Schneiden und Lagerung des Gewebes
    • 3.2.7 In Situ-Markierung der nukleären DNA-Fragmentation
      • 3.2.7.1 TUNEL mit 3,3’-Diaminobenzidin (DAB) als Chromagen
      • 3.2.7.2 TUNELmit Fluorescein als Chromogen
    • 3.2.8  Immunhistochemie
      • 3.2.8.1 Doppelfärbungen gegen TUNEL und Zellmarker
      • 3.2.8.2 Immunhistochemie gegen verschiedene striatale Neurone
      • 3.2.8.3 Immunhistochemie gegen Zellzyklusmarker
      • 3.2.8.4 Doppelfärbungen gegen Zellzyklusmarker und neuronale Marker
      • 3.2.8.5 Immunhistochemie gegen BrdU
      • 3.2.8.6 Doppelfärbungen gegen TUNEL und BrdU
      • 3.2.8.7 Immunzytochemie in Zellkultur
    • 3.2.9 Licht- und Fluoreszenzmikroskopie
    • 3.2.10 Konfokale Mikroskopie
    • 3.2.11 Western Blotting
    • 3.2.12 Histon-Kinase-Assay
    • 3.2.13 Elektronenmikroskopie
    • 3.2.14 Zellzählprotokolle
    • 3.2.15 Statistik
• 4  Ergebnisse
  • 4.1 Charakterisierung des Modells der milden fokalen zerebralen Ischämie
  • 4.2  Expression von Zellzyklus-relevanten Proteinen im intakten adulten Maushirn
  • 4.3 Untersuchung von Zellzyklusproteinen nach milder Ischämie
    • 4.3.1 Expression des CDK-Inhibitors p16^INK4a in Neuronen im ischämischen Striatum
    • 4.3.2  Expression von Cyclins D1 im ischämischen Striatum.
    • 4.3.3 BrdU-Inkorporation in die DNA als Marker der S-Phase
    • 4.3.4 Detektion von BrdU-positiven Neuronen
    • 4.3.5 Detektion von BrdU- und TUNEL-positiven Zellen
  • 4.4  In vitro-Experimente
    • 4.4.1 Expression der Zellzyklusproteine in vitro
    • 4.4.2 Schadensmodelle in vitro
    • 4.4.3  Expression von CDK-Inhibitoren in Neuronen nach OGD
    • 4.4.4 Expression von Cyclin D1 nach OGD
    • 4.4.5  Katalytische CDK-Aktivität nach OGD
    • 4.4.6  Pharmakologische Studien mit Olomoucine
• 5  Diskussion
  • 5.1 Zentraler Befund
  • 5.2  Einordnung des Befundes in die Biologie von postmitotischen Neuronen
  • 5.3 Einordnung des Befundes in die Pathologie des neuronalen Zelltodes
    • 5.3.1 CKI-Verlust als initiierendes Ereignis
    • 5.3.2  Nukleäre Expression von Cyclin D1 als weiterer CDK-aktivierender Schritt
    • 5.3.3 CDK-Aktivierung nach Hypoxie
    • 5.3.4  DNA-Replikation als Hinweis für Eintritt in die S-Phase
    • 5.3.5 Protektive Wirkung des Zellzyklusinhibitors Olomoucine nach Hypoxie
    • 5.3.6 Zellzyklusaktivierung als Bestandteil neuronaler Todeskaskaden
    • 5.3.7 Beteiligung aberranter Zellzyklusaktivierung bei weiteren ZNS-Erkrankungen
  • 5.4 Schlaganfall-Therapie
• 6  Zusammenfassung
• 7  Publikationen
  • 7.1 Originalarbeiten
  • 7.2 Abstracts
  • 7.3  Weitere Publikationen
• Abkürzungen
• Literaturverzeichnis
• Atlas der Farbabbildungen
• Danksagung
• LEBENSLAUF
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tabelle 1:
• Tabelle 2:
• Tabelle 3:
• Tabelle 4:

Bilder

• Abb. 1: Schematische Darstellung der 4 Phasen des Zellzyklus
• Abb. 2: Schematische Darstellung des Zellzyklus
• Abb. 3: Chemische Struktur von Olomoucine
• Abb. 4: Wirkung von Olomoucine auf den Zellzyklus
• Abb. 5:
• Abb. 6: Auszählung der Interneurone im ischämischen (weisse Balken) und kontralateralen (schwarze Balken) Striatum 72 h nach MCAo. Die Zahl der Interneurone auf der nicht-betroffenen (kontralateralen) Seite wurde gleich 100% gesetzt. Es wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt (p>0.05, n=3).
• Abb. 7: Zeitverlauf der Herunterregulierung des CDK-Inhibitors p16^INK4a (A) und des verzögerten neuronalen Zelltodes nach 30 min MCAo (B).
• Abb. 8: Anzahl von BrdU- positiven Zellen im ischämischen Striatum 72 h nach MCAo pro LPF (vertikale Achse) nach täglicher BrdU-Injektion (linke Säule) bzw. Applikation mit Hilfe einer miniosmotischen Pumpe (rechte Säule) . N=4, **p<0.01
• Abb. 9: CDK2-Aktivität in der primären neuronalen Zellkultur nach 90 minutiger OGD. Anti-CDK2-Immunpräzipitate wurden mit [γ-³² P]ATP und Histon HIIIS als Substrat inkubiert. Das radioaktive Signal wurde dann mit einem Phosphoimager und TINA software quantifiziert. N=3, *p<0.01, **p<0.001 vs Kontrolle.
• Abb. 10: Protektion einer primären neuronalen Zellkultur nach OGD mit dem synthetischen CDK-Inhibitor Olomoucine. Quantitative Messung des neuronalen Zellschadens mittels LDH-Konzentration im Medium 24 h nach OGD. N=3, *p<0.05, **p<0.01 vs Vehikel (Veh)
• Abb. 11: Hypothetisches Modell der zellulären Todeskaskade nach der ischämisch bedingten CDK-Aktivierung (In Anlehnung an Stefanis et al., 1999)