Experimentelle Studien ließen vier prinzipielle Schadensmechanismen der fokalen zerebralen Ischämie auskristallisieren: Glutamat-vermittelte Exzitotoxizität, Periinfarkt-Depolarisationen, Entzündung und programmierter Zelltod (Dirnagl et al., 1999). Dabei tritt der neuronale Zelltod teilweise verzögert ein (Garcia et al., 1995; Du et al., 1996; Endres et al., 1998). Eine besondere Bedeutung kommt dem Konzept der Penumbra zu. Gegenwärtige Vorstellung ist, daß nach Eintreten eines zerebralen Gefässverschlusses sich eine Grenzzone (Penumbra) eines prinzipiell wiederbelebbaren Gehirngewebes ausbildet (Hossmann, 1994; Ginsberg und Pulsinelli, 1994; Fisher und Garcia, 1996). Diese Zone weist noch eine Restperfusion auf, und die Zellen damit einen Restmetabolismus. Wahrscheinlich ermöglicht gerade dieser erhaltene Metabolismus das -teilwese aberrante- Anschalten von unterschiedlichen Programmen und Kaskaden, die verzögerte Schadensmechanismen darstellen.

Viele von diesen Kaskaden, insbesondere die Aktivierung von Caspasen, übernehmen wahrscheinlich als gemeinsame Endstrecken ("downstream"-Mechanismen) die formale Exekution des zellulären Todes ("Caspase-abhängiger Zelltod" nach Moskowitz; Namura et al., 1998; Fink et al., 1998; Thornberry und Lazebnik, 1998).

Die initiierenden Vorgänge, die am Anfang des verzögerten neuronalen Zelltodes stehen, sind noch nicht ausreichend identifiziert. In jüngster Zeit häufen sich Hinweise darauf, daß nach Ischämie in vivo bzw. nach Sauersoff-Glukose-Entzug in vitro eine Aktivierung bzw. Wiederexpression von Zellzyklus-relevanten Genen stattfindet. Es scheint, als würden im Ischämiegebiet (und insbesondere im Bereich der Penumbra) ontogenetische Programme wieder angeschaltet, die man physiologischerweise in den Neuronen sonst nur während der Embryonalentwicklung findet (Cramer und Chopp, 2000). Unter diesem Aspekt erscheint die Regulation und –ggf. Dysregulation- des eukaryonten Zellzyklus, welcher in den adulten Neuronen klassischerweise als komplett sistierend angesehen wurde (Tixier-Vidal, 1994), pathophysiologisch relevant.

Der Zellzyklus wird per Konvention in 4 Phasen unterteilt: Die G1-Phase (von „gap“, Lücke), in der die Zelle sich auf die DNA-Synthese vorbereitet, die S-Phase (von „DNA-Synthese“), während der die DNA-Replikation stattfindet, die G2-Phase, in der Vorbereitungen für die Mitose getroffen werden, und die M-Phase (von „Mitose“). Nach der Mitose kann die Zelle entweder in die Ruhephase G0 übergehen oder sich terminal differenzieren. Klassischerweise wird angenommen, daß eine terminal differenzierte Zelle die Eigenschaft für immer verliert, wieder in den Zellzyklus eintreten zu können (sog. „postmitotische“ Zelle), während eine in der G0-Phase befindliche Zelle diese Fähigkeit noch beibehält. Der Zellzyklus kann prinzipiell zwischen der G1- und S-Phase und zwischen G2- und M-Phase angehalten werden („G1- und G2-arrest“), die jeweiligen Übergänge werden daher als „checkpoints“ bezeichnet. Die Entscheidung der Zelle, in die S-Phase einzutreten, findet am sog. R-Punkt („Restriktionspunkt“) statt, welcher sich spät in der G1-Phase am G1→S-Übergang befindet (Pardee, 1989; Zetterberg et al., 1995). Ist dieser Punkt überwunden, wird das Programm der DNA-Replikation angeschaltet (Abb. 1).

Abb. 1: Schematische Darstellung der 4 Phasen des Zellzyklus

Im Zentrum des molekularen Apparates, der den Zellzyklus reguliert, stehen 3 Typen von Molekülen: Cycline, Cyclin-abhängige Kinasen („cyclin-dependend kinases“, CDK) und CDK-Inhibitoren (CKI). Per Konvention werden in Säugerzellen Vertreter der Cyclin-Familie mit Großbuchstaben (A,B,C, etc), Moleküle aus der CDK-Familie mit Ziffern (CDK1, CDK2, etc) und CKIs nach ihrem molekularen Gewicht sowie dem Protein kodierenden Gen (p15^INK4b, p16^INK4a, etc) bezeichnet. Die phasenspezifische Interaktion dieser 3 Großfamilien ist für einen regelrechten Ablauf des Zellzyklus verantwortlich. Die Proteine der Cyclin-Familie besitzen eine ca. 100 Aminosäuren-lange Homologie, auch „cyclin box“ genannt, durch welche sie die CDKs binden und aktivieren (Denhardt, 1999; Puri et al, 1999). Die CDKs sind eine Familie von Serin-Threonin-Kinasen, die bzgl. Größe und Sequenz nahe verwandt sind. Sie werden – im Gegensatz zu Cyclinen- nahezu stets im Überschuß in der Zelle synthetisiert. In ihrer monomeren Form sind sie inaktiv. Kristallographische Untersuchungen zeigten, daß erst die Bindung der sog. PSTAIRE-Region der CDK an die „cyclin box“ des Cyclins eine Konformationsveränderung der CDK herbeiführt, in welcher ATP für die Phosphorylierung des Substrats zugänglich wird (Puri et al., 1999). Aktivierte CDKs phosphorylieren weitere Bestandteile der Zellzyklusmaschinerie und bewirken dadurch die Zellzyklusprogression.

Zwei prinzipielle Mechanismen scheinen für die phasenspezifische Aktivierung und Wirkung der CDKs verantwortlich zu sein. Zum einen werden die jeweiligen Cycline zeitlich begrenzt nur in spezifischen Abschnitten des Zellzyklus synthetisiert. Zum anderen können aktive Cyclin-CDK-Komplexe ihre Wirkung nur im Nukleus entfalten, so daß die subzelluläre Lokalisation der Cycline eine weitere Regulationsmöglichkeit des Zellzyklus darstellt (Yang und Kornbluth, 1999). Im Zytoplasma werden Cycline Ubiquitin-abhängig proteolytisch abgebaut. Auf diese Art und Weise bleiben Cycline zyklusphasenspezifisch nur kurzzeitig aktiv und können somit die Funktion der „Schrittmacher“ des Zellzyklus übernehmen. Die Eigenschaft der Cycline, nur während bestimmter Perioden des Zellzyklus transient im Nukleus der Zelle vorhanden zu sein, macht sie ebenfalls zu geeigneten zeitlichen Markern der Zellzyklusprogression (Johnson und Walker, 1999).

Wenn die Zelle aus der Ruhepase in den Zellzyklus eintritt (G0→G1), werden zuerst ein oder mehrere D-Cycline (D1, D2, D3) synthetisiert. Die Expression unterschiedlicher Subtypen der D-Cycline scheint dabei zellspezifisch zu sein (Sherr, 1993). Dabei stellen die Cyclin-abhängigen Kinasen CDK4 und CDK6 die katalytischen Partner der D-Cycline dar. Die katalytische Aktivität der D-Cyclin-CDK4/6-Komplexe wird zuerst in der mittleren G1-Phase manifest und erreicht ihr Maximum kurz vor dem G1→S-Übergang (Sherr, 1994). Die D-Cycline können direkt an das Retinoblastomprotein („protein of retinoblastoma gene“, pRb) binden, so daß sie auf diese Art und Weise die CDK4 zu ihrem Substrat „lotsen“. Das Retinoblastomprotein liegt in der ruhenden Zelle nicht phosphoryliert vor und verhindert in diesem aktiven unphosphorylierten Zustand als „Bremse des Zellzyklus“ (Cotran et al., 1995) bzw. „Wächter des Restriktionspunktes“ (Weinberg, 1995) den Übergang in die S-Phase. Das unphosphorylierte Retinoblastomprotein bindet und inaktiviert nämlich die Transkriptionsfaktoren der E2F-Familie, welche den Eintritt der Zelle in die S-Phase vermitteln (Pardee, 1989; Sherr, 1994; Black und Azizkhan-Clifford, 1999). Nach der Phosphorylierung durch CDK4 werden Transkriptionsfaktoren der E2F-Familie aus der Bindung an pRb freigesetzt und aktiv (Abb. 2, s. Seite 12).

Bei der weiteren Progression in die S-Phase am späten G1→S-Übergang wird Cyclin E exprimiert, welches CDK2 aktiviert. Die CDK2-Cyclin E-Komplexe phosphorylieren sowohl pRb (sog. „Hyperphosphorylierung“) als auch essentielle Bestandteile der DNA-Replikationsmaschinerie, wodurch sie aktiviert werden. Bereits in der S-Phase wird das Cyclin A gebildet, welches mit CDK2 und CDK1 katalytisch aktive Holoenzyme bildet. Während die CDK2-Cyclin A-Komplexe ebenfalls für die Aktivierung der DNA-Replikation zuständig sind, treiben die CDK1-Cyclin A-Komplexe die Zelle in die G2- und später in die M-Phase. Die Expression von Cyclin B1 unterstützt –durch Bildung von aktiven CDK1-Cyclin A-Komplexen- den Eintritt in die M-Phase (Johnson und Walker, 1999).

Eine weitere wichtige Regulationsweise der CDK-Aktivität besteht in der Bindung von niedermolekularen CDK-Inhibitoren (CKIs) an den CDK-Cyclin-Komplex. Es werden 2 Familien mit jeweils biochemischen und funktionellen Homologien unterschieden: die Cip-Kip-Familie (CDK inhibitory polypeptides, Kinase inhibitory proteins), die als universelle bzw. unspezifische CDK-Inhibitoren alle CDKs der G1-Phase hemmen, und die INK4-Familie (inhibitors of CDK4), die als selektive und spezifische CDK-Inhibitoren CDK4 und CDK6 inhibieren (Vidal und Koff, 2000). Die Cip-Kip-Familie beinhaltet p21^WAF1/Cip1 (der als erstes entdeckte CKI), p27^Kip1 und p57^Kip2; zur INK-Familie gehören p15^INKb, p16^INK4a, p17^INK4c und p19^INK4d. Die Mechanismen der inhibitorischen Wirkung dieser Proteine werden zunehmend klarer. Die Andockung von p27^Kip1 an den CyclinA-CDK2-Komplex induziert eine Konformationsänderung, die u.a. die Affinität der Kinase für ATP reduziert (Puri et al., 1999). p16^INK4a scheint dagegen direkt die Aktivität von CDK4 bzw CDK6 zu inhibieren, indem es einen binären Komplex mit diesen Kinasen ohne Cyclin –und somit ohne katalytische Aktivität- bildet (Serrano et al., 1995). Es bestehen Hinweise, daß p16^INK4a die Cyclin D-Bindung kompetitiv hemmt (Puri et al., 1999). Zusätzlich kann p16^INK4a die Aktivität der Cyclin D-CDK4-Komplexe am pRb inhibieren. Unabhängig von den jeweiligen Mechanismen der CDK-Inhibition wurde sowohl für p27^Kip1 als auch p16^INK4a gezeigt, daß die alleinige Überexpression eines dieser CKIs den Zellzyklusarrest herbeiführen kann (Toyoshima und Hunter, 1994; Puri et al.,1999).

CKI sind weiterhin beteiligt am Zellzyklusausstieg, Einleitung der Zelldifferenzierung sowie Erhaltung („maintainance“) des postmitotischen Zustandes einer terminal differenzierten Zelle (Puri et al., 1999). In vitro ist die zelluläre Akkumulation von p16^INK4a mit dem Eintritt der Zelle in die Seneszenz verbunden, dem Zustand des permanenten Zellzyklusarrestes, in welchem die Zelle gegenüber mitogenen Stimuli refraktär bleibt (Huschtscha und Reddel, 1999). Umgekehrt weisen Zellkulturen mit zerebellären Körnerzellvorläufern (sog. CGP-Zellen: cerebellar granular precursors), die aus der p27-defizienten (p27-/-) Maus gewonnen wurden, im Vergleich zu p27+/+- Kulturen eine deutlich gesteigerte Proliferation mit einem späteren Ausstieg aus dem Zellzyklus auf (Miyazawa et al., 2000). In vivo wurden p16^INK4a und p27^Kip1 im Rattenzerebellum sowohl in Neuronen als auch in Gliazellen identifiziert, wobei die Anzahl der p16^INK4a- bzw. p27^Kip1-positiven Zellen zwischen dem postnatalen Tag 6 bis ins Erwachsenenalter stieg (Watanabe et al., 1998, Shambaugh et al., 2000, Miyazawa et al., 2000). Zerebella von p27 -/- -Mäusen sind signifikant zellreicher als die von p27 +/- -Mäusen, die wiederum in der Anzahl der Zellen die Zerebella des Wildtypes (p27 +/+) überragen (Miyazawa et al., 2000). Eine deutliche Zunahme der p16^INK4a-mRNA in vielen Organen in Maus einschließlich des Gehirns zwischen der 4. und 15. Woche der postnatalen Entwicklung lässt eine mögliche Beteiligung dieses CKI an Differenzierungsprozessen vermuten (Zindy et al., 1997a, 1997b). Allerdings bleiben die Regulation des Zellzyklusausstiegs und vor allem die Mechanismen, welche diesen Zustand aufrechterhalten, noch weitgehend unverstanden (Ross, 1996; Caviness et al., 1999). Insbesondere ist die funktionelle Bedeutung der Expression der CKIs im adulten Gehirn -insbesondere im Bezug auf die Aufrechterhaltung des postmitotischen Zustand- nicht ausreichend geklärt (Legrier et al., 2001) .

Eine Übersicht über die wichtigsten Zellzyklusproteine gibt die Tabelle1 (modifiziert nach Puri et al., 1999):