Ziel der Arbeit war es, die Bedeutung der Zellzyklusaktivierung nach transienter fokaler Ischämie zu analysieren. Trotz mehrerer Hinweise auf die Beteiligung von Zellzyklusproteinen am neuronalen Zelltod nach unterschiedlichen Noxen in vitro und in vivo, war die Frage ungeklärt, ob die Expression von diesen Proteinen nach Ischämie einen kausalen Schadensmechanismus (Guègan et al., 1997; Sakurai et al., 1999) oder aber ein Zeichen der Regeneration (Li et al., 1997, 1998; Cramer und Chopp, 2000) darstellt. Eine wesentliche Schwierigkeit bei der Beantwortung dieser Frage liegt daran, daß die zu einem bestimmten Reperfusionszeitpunkt erhobenen Daten lediglich eine Momentaufnahme der dynamischen, z.T. parallel ablaufenden Vorgänge der De- und Regeneration darstellen. Diese Momentaufnahme erlaubt keine funktionelle Aussage bezüglich der Entscheidung „schädlich“ versus „regenerationsfördernd“. Allein die zeitliche und räumliche Beziehung der Expression der Zellzyklusmaschinerie zu Markern des neuronalen Todes kann kausal-pathogenetische Hinweise liefern. Ein wichtiger Bestandteil der vorliegenden Arbeit war also, die kausale Beziehung zwischen der Expression von Zellzyklusproteinen und neuronalem Tod nach transienter fokaler Ischämie in der Maus herauszuarbeiten.

Folgende 5 Aufgabenstellungen wurden zu Beginn der Arbeit formuliert:

1. zeitliche und räumliche Charakterisierung des neuronalen Zelltodes in unserem Modell der 30-minütigen fokalen („milden“) Ischämie;

2. Untersuchung der Expressionsmuster von Zellzyklus-relevanten Molekülen im intakten Mausstriatum;

3. Bestimmung des zeitlichen Verlaufes der neuronalen Expression von Zellzyklus-relevanten Molekülen nach 30-minütiger fokaler Ischämie;

4. Untersuchung der Zellzyklusprogression in ischämischen Neuronen, insbesondere im Hinblick auf einen möglichen Eintritt in die S-Phase;

5. Untersuchung möglicher protektiver Effekte vom synthetischen Zellzyklusinhibitor Olomoucine nach Ischämie/ Hypoxie, um die Kausalität zwischen der Zellzyklusaktivität und neuronalem Zelltod zu eruieren sowie Ansatzpunkte für interventionelle Maßnahmen aufzudecken.

Unserer Hypothese nach wird die Zellzyklusaktivität intakter adulter Neurone aktiv inhibiert. Um die Faktoren ausfindig zu machen, die diese Aktivität hemmen, wurde die Expression von zellzyklusinhibierenden CKIs im intakten Mausgehirn untersucht. Der Wegfall von inhibierenden bzw. die Neuexpression von aktivierenden Molekülen könnte dann die Wiederaktivierung des Zellzyklus erklären. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit bestand also darin, die für diese Reaktivierung zuständigen Faktoren herauszufinden.

Es wurden parallel die transiente Ischämie in vivo (30-minütige Okklusion der A. cerebri media mit Reperfusion [MCAo]) und Hypoxie in vitro (Sauerstoff-Glukose-Entzug [OGD]) als experimentelle Schlaganfallmodelle eingesetzt. Methodisch wurde die Expression von Zellzyklus-relevanten Molekülen auf der Proteinebene mittels Immunhistochemie (Immunfluoreszenz und DAB) und Western-Blotting untersucht. Die Aktivität der Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) wurde mittels Histon-Kinase-Assay radiographisch bestimmt. Die Progression in die S-Phase wurde mit Hilfe der Inkorporation des Thymidinanalogons 5-Bromo-2’-Desoxy-Uridin (BrdU) immunhistochemisch sowie elektronenmikroskopisch nachgewiesen.