Methoden Filamentmodell

Die Tierexperimente wurden in strenger Richtlinie zu den gültigen Tierschutzbestimmungen in Zusammenarbeit mit PD Dr. M. Endres durchgeführt (Tierversuchsantrag-Antrag Nr. G0054/99). Alle operativen Eingriffe wurden an tief anästhesierten Tieren vorgenommen. SV129 Mäuse (Taconic Farms, Germantown, USA; Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin, Berlin) wurden mit Halothan im N₂O-O₂-Gasgemisch (70 % N₂0 und 30% 0₂) anästhesiert. Die Narkose wurde mit 1.5% Halothan eingeleitet und mit 1.0 % fortgesetzt. Fokale zerebrale Ischämie wurde mit einem monofilen Nylonfaden, der mit einem Silikon-Resin-Gemisch beschichtet wurde, induziert. Der Faden wurde in die linke A. carotis interna bis zum Abgang der A. cerebri anterior am Circulus Willisiieingeführt. Auf dieser Art und Weise wurden A. cerebri media und A. choroidea anterior okkludiert. Der Faden wurde nach 30 min wieder entfernt, um eine Reperfusion des Versorgungsgebiets der A.cerebri medi und der A.choroidea anterior zu gewährleisten. Regionaler zerebraler Blutfluß wurde mittels Laser-Doppler-Flußmetrie gemessen. Dabei fiel der regionale zerebrale Blutfluß im Versorgungsgebiet der A.cerebri media auf ca. 20% des Ausgangswertes ab und erreichte den Ausganspunkt vor Okklusion innerhalb von 5 Minuten nach dem Wiederöffnen des Gefässes. Die Kerntemperatur der operierten Tiere wurde mittels eines Feedback-Temperatur-Reglers auf 36.5 + 0.5 °C gehalten.

BrdU-Applikation

5-Bromo-2’-Deoxy-Uridin (BrdU, Sigma) wurde in 1% 1M NaOH in PBS (Konzentration 20 mg/ml) aufgelöst. Zwei Verabreicherungsmethoden wurden eingesetzt: pulsatil durch tägliche intraperitoneale Injektionen (50 mg BrdU/kg Körpergewicht) und kontinuierlich durch subkutane osmotische Minipumpen (Alzet, Modell 1003D, Flußrate 1 µl/h, tägliche Gesamtdosis 24 mg/kg Körpergewicht). Die Pumpen wurden 4 Stunden vor der Implantation mit der BrdU-Lösung aufgefüllt und in einer Petrischale in der sterilen physiologischen Kochsalzlösung bei 37°C aufbewahrt. Die Pumpen wurden unmittelbar vor der vasooklussiven Operation subkutan implantiert. Alle Experimente, die in vivo-Applikation von BrdU beinhalteten, wurden im Laboratorium für neuronale Entwicklungsbiologie (Harvard Medical School, Boston, USA) durchgeführt.

Primäre neuronale Zellkultur

Alle Experimente in der Zellkultur wurden in Zusammenarbeit mit cand. med. C. F. Harms durchgeführt. Primäre kortikale neuronale Zellkulturen wurden von Wistar-Rattenembryonen (embryonaler Tag 17, E17, Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin, Berlin) gewonnen. Hierbei wurde zerebraler Kortex präpariert, inkubiert für 15 min in 0,05% Trypsin/ 0.02% EDTA (v/v) im PBS bei 36.5° und anschließend mit PBS gewaschen. Das Gewebe wurde dann im Dissoziationsmedium (modifiziertes Eagle-Medium mit 10% FKS, 10 mM HEPES, 44 mM Glukose, 100 U/ml Penicillin-Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 100 IE Insulin/l) mittels einer Pasteur-Pipette dissoziert und bei 21°C für 2 min abzentrifugiert (Beschleunigung 210 x g). Die Zellen wurden dann im Starter-Medium, welches aus dem neurobasalen Medium mit B27-Zusatz, 100 U/ml Penizillin-Streptomyzin, 0.5 mM L-Glutamin, 25 µM Glutamat besteht, redissoziert. Für pharmakologische Studien wurden die Zellen in 24-Well-Platten plaziert. Für immunzytologische Färbungen wurden die Zellen auf Plastikplättchen gesäet. Die Zelldichte betrug 200 000 Zellen/cm². Zur besseren Adhäsion der Zellen wurden sowohl Wells als auch Plastikplättchen mit Poly-L-Lysin und Kollagen G beschichtet. Zu diesem Zweck wurden sie zuerst mit Poly-L-Lysin (0,5 % w/v in PBS) bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert, mit PBS gewaschen und anschließend mit Kollagen G (0,003 % w/v im Dissoziationsmedium) für 1 Stunde bei 37°C beschichtet.

Die Zellen wurden bei 36.5°C, 95% Luft, 5% CO₂und 95% Luftfeuchtigkeit gehalten. Das Züchtungsmedium bestand aus dem neurobasalen Medium mit B27-Zusatz, 100 U/ml Penizillin-Streptomyzin und 0.5 mM L-Glutamin. Beginnend mit dem 4. Tag in vitro, wurde ein Mediumwechsel 2 mal pro Woche durchgeführt. Dabei wurde jeweils die Hälfte des Mediums verworfen und durch frisches ersetzt. Die kortikalen Zellen reiften 10 bis 14 Tagen in vitro, ehe sie für Experimente eingesetzt wurden.

Sauerstoff-Glukose-Entzug

Unmittelbar vor dem Experiment wurde das Züchtungsmedium entfernt; die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen. Die Kulturen wurden dann für 90 min lang in der Glukose-freien Salzlösung in die „Hypoxiekammer“ mit Sauerstoffpartialdruck pO₂< 2 mmHg plaziert. Nach 90 min wurde die Glukose-freie Elektrolytenlösung mit dem Züchtungsmedium wieder ausgetauscht und die normoxischen Bedingungen (95% Luft und 5 % CO₂) wiederhergestellt. Die Kontrollkulturen wurden mit der Salzlösung, die 20 mM D-GluKose enthielt, unter normoxischen Bedingungen (95% Luft und 5 % CO₂) inkubiert. Die neuronale Schädigung wurde mittels der Messung der Freisetzung der Lactat-Dehydrogenase (LDH) ins Medium quantifiziert (Koh und Choi, 1987). Die LDH-Menge wurde dabei mittels eines kinetischen LDH-Tests bestimmt. Die Entwicklung des zellulären Schadens wurde parallel mittels der Phasenkontrastmikroskopie evaluiert. Repräsentative Mikrophotographien wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach OGD angefertigt.

Vorbehandlung der Zellkultur mit Olomoucine

Der synthetische CDK-Inhibitor Olomoucine (Alexis, Grünberg) wurde in der Konzentration 50 mM im Lösungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) aufgelöst. Olomoucine wurde 1 Stunde vor dem Sauerstoff-Glukose-Entzug für die gesamte Dauer des Experiments ins Medium hinzugefügt. Die Endkonzentration von Olomoucine im Medium betrug dabei 1, 10 und 100 µM, die Endkonzentration von DMSO betrug 0.2%. Die Vehikel-behandelten Kontrollkulturen wurden lediglich DMSO in der Endkonzentration von 0.2% ausgesetzt.

Gewebeaufarbeitung Transkardiale Fixation des Gewebes

Die Tiere wurden mit 10 % Chloralhydrat im PBS (6,25 ml/ kg Körpergewicht intraperitoneal) tief anasthesiert. Das vordere und mittlere Mediastinum wurde von ventral her eröffnet. Der rechte Vorhof wurde eröffnet, anschliessend der linke Ventrikel kanüliert. Die transkardiale Perfusion erfolgte mit Hilfe einer Pumpe (Flußrate 5 ml/min). Zuerst wurde mit ca. 5 ml kaltem PBS perfundiert, bis die aus Herzvorhof herausströmende Flüssigkeit weitgehend frei vom Blut wurde. Anschließend wurden ca. 50 ml 4 % PFA in PBS (pH-Wert 7.2- 7.4) transkardial perfundiert. Die Gehirne wurde dann nach Aufschneiden der Kalotte und Abzug der Meningen vorsichtig entnommen und noch weitere 8 Stunden in 4 % PFA bei + 4 °C postfixiert.

Einfrieren von unfixierten Maushirnen

Die Tiere wurden mit Chloralhydrat tief anasthesiert und mit einer Schere dekapitiert. Die Hirne wurden rasch entnommen und in Methylbutan bei –40°C eingefroren. Bis zur weiteren Verarbeitung wurden sie bei –80°C aufbewahrt.

Schneiden und Lagerung des Gewebes

Die mit 4 % PFA transkardial fixierten Gehirne wurden am Vibratom (Technical Products, St. Louis, USA) geschnitten, wobei 40 µm dicke koronare Schnitte angefertigt wurden. Die Schnitte wurden dann ca 24 Stunden in 30%iger Glukoselösung (in PBS) kryoprotektiert und anschließend bei – 20 °C gelagert.

Die unfixiert eingefroren Gehirne („fresh frozen“) wurden am Kryostat (Microm, Heidelberg) geschnitten. 10 µm dicke koronare Sektionen wurden auf kurz vorgewärmte Objektträger (Menzel Gläser, Braunschweig)aufgenommen.

In Situ-Markierung der nukleären DNA-Fragmentation
Zur In Situ-Markierung der nukleären DNA-Brüche wurde die Methode der spezifischen Bindung der terminalen Desoxynukleotidyl-Transferase (TdT) an die 3’-OH-Bruchstellen der DNA (=„nick end“) verwendet (Gavrieli et al., 1992). TdT erkennt die 3’-OH-Enden und katalysiert eine Schablone-unabhängige Addition von Nukleotid-Triphosphaten. Als Substrat diente das Digoxigenin-konjugierte Desoxyuridin (dUTP). Die inkorporierten dUTP-Digoxenin-Komplexe wurden dann mittels eines mit einem anti-Digoxenin-Antikörper (Peroxidase- oder Fluorescein-konjugiert) nachgewiesen (s. Abb. 5).

Abb. 5:

Das kommerziell erhältliche Kit ApopTag (S 7100 und S 7110) für TdT-vermittelte dUTP-Biotin- „nick end labeling“ (TUNEL) von der Fa. Intergen (Heidelberg) wurde verwendet. Hierauf beziehen sich die Begriffe „Working soluting“, „Equilibration buffer“, „Reaction buffer“ uns „Stop solution“.
TUNEL mit 3,3’-Diaminobenzidin (DAB) als Chromagen
Gefrierschnitte wurden aus dem Gefrierfach entnommen und für 2 min bei Raumtemperatur aufgetaut. Das folgende Protokoll wurde dann verwendet:

Fixation in 1% PFA für 10 min bei Raumtemperatur

dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min im PBS

Dehydratation der Schnitte in der aufsteigenden Ethanolreihe

Entfettung in Chlorophorm für 30 min bei Raumtemperatur

Rehydratation der Schnitte in der aufsteigenden Ethanolreihe

dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min im PBS

Inkubation im „Equilibration buffer“ für 1 min bei Raumtemperatur (ca. 20 µl pro Schnitt)

Inkubation mit 15 µl “Working solution”( 4,5 µl TdT und 10,5 µl “Reaction buffer”) in einer Feuchtkammer bei 37°C für 60 min

Waschen in der “Stop solution” für 10 min

dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min im PBS

Inkubation mit HRP-konjugiertem Antikörper (12 µl pro Schnitt) in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur für 30 min

dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min im PBS

Inkubation mit 0.05% DAB/ 0.01% H₂O₂ in PBS für 3 min

Waschen in distilliertem H₂O für 5 min

dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min im PBS

TUNELmit Fluorescein als Chromogen
1)-10) wie 3. 2. 7.1

11) Inkubation mit FITC-konjugiertem Antikörper (12 µl pro Schnitt, Intergen) in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur für 30 min

12) dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min im PBS
Immunhistochemie Doppelfärbungen gegen TUNEL und Zellmarker
Es wurden Kryostatschnitte gefärbt. Die Schnitte wurden bei Raumtemperatur 10 min lang mit 4% PFA fixiert und anschliessend in PBS gewaschen. Das Protokoll der Färbung:

Inkubation mit dem primären Antikörper über Nacht bei 4°C :

primärer Antikörper

Typ

Spezies

Titer

sekundärer Antikörper

anti-NeuN

monoklonal

Maus

1:100

biotinylierter anti-Maus-IgG (hergestellt im Pferd)

anti-MAP2

monoklonal

Maus

1:1000

anti-GFAP

polyklonal

Kanninchen

1:500

biotinylierter anti-Kanninchen-IgG (hergestellt in der Ziege)

anti-MAC-1

monoklonal

Ratte

1:1000

biotinylierter anti-Ratte-IgG (hergestellt im Kanninchen)

dreimaliges Waschen in PBS jeweils 5 min

Inkubation mit dem zugehörigen sekundären Antikörper in 3%igem Serum für 1 h bei Raumtemperatur

dreimaliges Waschen in PBS jeweils 5 min

Inkubation mit dem an Texas-Red-gekoppelten Streptavidin (1:200) für
1 h bei Raumtemperatur

dreimaliges Waschen in PBS jeweils 5 min

TUNEL-Färbung mit Fluorescein als Chromogen nach dem
Protokoll 3. 2. 7. 2

dreimaliges Waschen in PBS jeweils 5 min

Eindeckeln der Schnitte mit dem Einschlußmittel ImmunoFluor
(ICN, Eschwege)

Immunhistochemie gegen verschiedene striatale Neurone
Immunhistochemische Färbungen gegen striatale Marker wurden an Vibratomschnitten der mit PFA transkardial fixierten Maushirne frei-flottierend („free-floating technique“) in 24-well-Platten durchgeführt.

Das Protokoll der Färbung:

Blockierung der endogenen Peroxidase durch 15minütige Inkubation der Schnitte in 3 % H₂0₂ in dH₂O bei Raumtemperatur

2maliges Waschen im PBS für 5 min bei Raumtemperatur

Permeabilisieren des fixierten Gewebes und Blockieren der unspezifischen Bindungen mit 5 %igem Ziegenserum/ 0.3% Triton X-100 in PBS für 30 min bei Raumtemperatur

Inkubation der Schnitte mit folgenden primären Antikörpern für 24 h bei Raumtemperatur:

primärer Antikörper

Titer

Typ/

Hergestellt in

zugehöriger sekundärer Antikörper

anti- Cholin-Azetyl-Transferase

1:1000

polyklonal/

Kaninchen

biotinylierter anti-Kaninchen IgG (hergestellt in der Ziege)

anti- Somatostatin

1:5000

anti- Calretinin

1:1000

anti-Enkephalin

1:1000

anti- µ-Opioid-Rezeptor

1:1000

anti- Substanz P

1:200

anti- Parvalbumin

1:10000

monokonal/

Maus

biotinylierter anti-Maus IgG (hergestellt im Pferd)

dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min im PBS

Inkubation im zugehörigen sekundären Antikörper (Titer 1: 500 für biotinylierten anti-Maus-IgG-Antikörper und 1: 250 für biotinylierten anti-Ziege-IgG-Antikörper) für 90 min bei Raumtemperatur

dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min im PBS

Inkubation im Avidin-Biotin-Komplex (ABC-Peroxidase-EliteKit) für 1 h bei Raumtemperatur

dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min im PBS

Entwicklung der Färbung in 0.05% 3,3’-Diaminobenzidin (DAB)/ 0.3% Ammoniumnickelsulfat/ 0.003% H₂O₂ (alles Sigma) für 3 min

Stoppen der DAB-Reaktion mit ddH₂O

dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min im PBS

Die frei-flottierend gefärbten Schnitte wurden dann mit Hilfe eines Pinsels auf die geladenen Glasobjekträger aufgetragen, für 30 min luftgetrocknet, in der aufsteigenden Alkoholreihe (70%Ethanol- 80% Ethanol- 96% Ethanol- 100% Ethanol-100% Ethanol) dehydriert und anschließend für 10 min in Rotihistol (Roth, Karlsruhe) fixiert. Die Präparate wurden dann mit dem Einschlußmittel Vitro-Clud(R.Langenbrick GmbH, Emmendigen) eingedeckelt.
Immunhistochemie gegen Zellzyklusmarker
Die am Vibratom angefertigten koronaren Schnitte wurden frei-flottierend in 24-Well-Platten gefärbt. Das Protokoll der Färbung:

Blockierung der endogenen Peroxidase durch 15minütige Inkubation der Schnitte in 3 % H₂0₂ in ddH₂0 bei Raumtemperatur

2maliges Waschen im PBS für 5 min bei Raumtemperatur

Permeabilisieren des fixierten Gewebes und Blockieren der unspezifischen Bindungen mit 5 %igem Ziegenserum/ 0.3% Triton X-100 in PBS für 30 min bei Raumtemperatur

Inkubation der Schnitte mit folgenden primären Antikörpern für 18 h bei
+ 4 °C:

primärer Antikörper

Klonalität

Hergestellt in

Titer

sekundärer Antikörper

anti-p16

polyklonal

Kaninchen

1: 250

biotinylierter anti-Kaninchen-IgG (hergestellt in der Ziege)

anti-p27

polyklonal

Kaninchen

1: 250

anti-Cyclin D1

polyklonal

Kaninchen

1: 500

anti-Cyclin E

polyklonal

Kaninchen

1: 250

anti-Cyclin A

polyklonal

Kaninchen

1: 250

anti-Cyclin B

polyklonal

Kaninchen

1: 250

anti-CDK4

polyklonal

Kaninchen

1: 500

anti-CDK2

polyklonal

Kaninchen

1: 250

dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min im PBS

Inkubation mit biotinyliertem anti-Kaninchen-IgG (1:250) für 90 min bei Raumtemperatur

dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min im PBS

Inkubation im Avidin-Biotin-Komplex (ABC-Peroxidase-EliteKit) für 1 h bei Raumtemperatur

dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min im PBS

Entwicklung der Färbung in 0.05% DAB-Lösung in 0.003% H₂O₂ (in PBS)

Stoppen der DAB-Reaktion mit ddH₂O

dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min im PBS

Doppelfärbungen gegen Zellzyklusmarker und neuronale Marker
Das Protokoll der Färbung:

1) bis 7) Siehe das Protokoll in 3. 2. 8. 3

8) Inkubation mit TexasRed-gekoppeltem Streptavidin (1:200) für 1 h bei Raumtemperatur

9) dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min im PBS

10) Inkubation mit anti-NeuN (1:100) oder anti-MAP2 (1:1000) für 18 h bei + 4°C

11) dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min im PBS

12) Inkubation mit Alexa488-gekoppeltem anti-Maus-IgG (1: 500) für 90 min bei Raumtemperatur

13) dreimaliges Waschen der Schnitte für 5 min im PBS

14) Eindeckeln mit dem ImmunoFluor-Einschlußmittel
Immunhistochemie gegen BrdU
Das Protokoll der Färbung:

Blockierung der endogenen Peroxidase durch Inkubation der Schnitte in 3 % H₂0₂ in ddH₂0 für 15 min bei Raumtemperatur

2maliges Waschen in PBS für 5 min bei Raumtemperatur

Denaturieren der DNA durch Inkubation in 2 M HCl für 60 min bei + 37°C

2maliges Waschen im PBS für 5 min bei Raumtemperatur

Inkubation mit 5 %igem Kaninchenserum/ 0.3% Triton X-100 in PBS für 30 min bei Raumtemperatur

Inkubation der Schnitte mit anti-BrdU (monoklonal, hergestellt in Ratte; Titer 1:200 in 5% Kaninchenserum in PBS) für 18 h bei + 4 ° C

dreimaliges Waschen in PBS

Inkubation mit biotinyliertem anti-Ratte-IgG (1:250) für 60 min bei Raumtemperatur

dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min im PBS

Inkubation im Avidin-Biotin-Komplex (ABC-Peroxidase-EliteKit) für 1 h bei Raumtemperatur

dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min im PBS

Reaktion mit 0.05% DAB-Lösung in 0.003% H₂O₂ (in PBS)

Stoppen der DAB-Reaktion mit ddH₂O

dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min im PBS

Doppelfärbungen gegen TUNEL und BrdU
Die Gefrierschnitte wurden zuerst nach dem Protokoll 3. 2. 7. 2 gefärbt. Anschließend erfolgte die Färbung gegen BrdU nach dem Protokoll 3. 2.. 8. 5 mit TexasRed als Chromogen. Im Schritt 10) wurde anstelle mit Avidin-Biotin-Komplex mit TexasRed-Streptavidin (1:500 in PBS) inkubiert.
Immunzytochemie in Zellkultur
Die Färbung der primären neuronalen Kulturen erfolgte auf den mit poly-Lysin beschichteten Plättchen, welche in 24-well-Platten (je 1 Plättchen pro well) plaziert wurden. Die Kulturen wurde sehr kurz mit PBS gewaschen und sofort mit 4% PFA für 10 min bei Raumtemperatur fixiert. Nach dreimaligem Waschen in PBS wurde nach folgendem Protokoll gefärbt:

Permeabilisieren und Blockieren der unspezifischen Bindungen mit 5 %igem Ziegenserum/ 0.3% Triton X-100 in PBS für 30 min bei Raumtemperatur

Inkubation der Plättchen mit folgenden primären Antikörpern für 1 h bei Raumtemperatur:

primärer Antikörper

Klonalität

Hergestellt in

Titer

sekundärer Antikörper

anti-p16

polyklonal

Kaninchen

1: 100

Texas-Red gekoppeltes anti-Kaninchen-IgG (hergestellt in der Ziege)

anti-p27

polyklonal

Kaninchen

1: 100

anti-Cyclin D1

polyklonal

Kaninchen

1: 100

dreimaliges Waschen je 5 min in PBS

Inkubation mit Texas-Red gekoppeltem anti-Kaninchen-IgG (1:500) für 30 min bei Raumtemperatur

dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min in PBS

Inkubation mit anti-NeuN (1:100) oder anti-MAP2 (1:1000) für 1 h bei Raumtemperatur

dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min in PBS

Inkubation mit Alexa488-gekoppeltem anti-Maus-IgG (1: 500) für 30 min bei Raumtemperatur

dreimaliges Waschen der Schnitte je 5 min in PBS

Eindeckeln mit dem Einschlußmittel Vitro-Clud

Licht- und Fluoreszenzmikroskopie
Konventionelle Licht- und Fluoreszenzmikroskopie der Gehirnschnitte wurde am Mikroskop Leica DMRA (Leica Microsystems, Heidelberg) durchgeführt. Für die Fluoreszenzmikroskopie wurde eine Quecksilberdampf-Kurzbogenlampe der Leistung 100 Watt (Osram GmbH, München) eingesetzt. Folgende Filter wurden benützt:

Filterbezeichnung

Wellenlänge des Anregungsfilters,

in nm

Wellenlänge des Sperrfilters, in nm

verwendete Chromogenen

MS2

470

522

Fluorescein (=FITC), Alexa488

MS3

546

567

TexasRed

Mikroskopie der primären neuronalen Zellkultur erfolgte am inversen Mikroskop Leica DMIL (Leica Microsystems). Alle Aufnahmen erfolgten mit der digitalen Kamera DC200 (Leica Microsystems).
Konfokale Mikroskopie
Das Bio-Rad MRC 600 konfokale Laserscan-System (Bio-Rad, Hempstead, UK) –ausgerüstet mit einem Nikon Optiphot-Mikroskop (Nikon GmbH, Düsseldorf)- wurde verwendet. Ein Argon/Krypton-Laser wurde benutzt, um die Farbstoffe Alexa-488 bzw. FITC mit einer Linie der Wellenlänge 488 nm anzuregen. Das Fluorochromogen TexasRed wurde bei der Wellenlänge 568 nm angeregt. Folgende Objektive wurden eingesetzt: Nikon 40/1.30 Ölimmersion und Leitz 63/1.30 Ölimmersion. Jedes digitalisierte Bild beinhaltete 768 x 512 Pixel. Die Bilder wurden mittels des Programms CoMOS Version 7a (Bio-Rad) aufgenommen und anschließend mit Hilfe des Software-Programms Adope Photoshop (Version 5.0, Adobe Systems, Mountain View, CA) weiter bearbeitet.
Western Blotting
Die Zellen wurden für die Western-Blot- Untersuchungen bei 4 °C 30 min lang in 130 µl RIPA Puffer lysiert (10 mM Na₂HPO4, pH 7.0, 300 mM NaCl, 0.1% w/v SDS, 1% v/ v NP40, 1% w/v Na-deoxycholate, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, und Protease/Phosphatase Inhibitoren, Boehringer Mannheim, Mannheim). Die Proteine wurden dann durch Aufkochen in Probenpuffer denaturiert (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 1% w/ v DTT, 2% w/v SDS, and 0.01% w/v Bromphenolblau) für 3 min. Proteinkonzentration der Proben wurde mit dem BCA-Assay Kit von Pierce (Rockford, IL, USA) und Kälberserum-Albumin photometrisch bestimmt. Weitere Schritte:

Die Proben wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese aufgetrennt

Die aufgetrennten Proteine im Gel wurden anschliessend auf eine Poly-Vinylidendifluorid-Membran transferiert. Der Transfer erfolgte bei 0.8 mA/cm² Stromstärke 2 Stunden lang in einem Transferpuffer

Blockierung der Membranen mit 5 % Milch für 1 Stunde bei Raumtemperatur in TBST

Inkubation mit den primären Antikörpern übernacht bei 4 °C
Die folgenden primären Antikörper wurden verwendet: anti-p16^INK4a, anti-p27^Kip1, anti-CyclinD1 (alle 0.2 mg/ml). Die gleichmässige Ladung der SDS-PAGE-Gele wurde mit anti-Aktin-Antikörper (1:2000) kontrolliert

4-maliges Waschen für 10 min. in TBST

Inkubation mit HRP-konjugierten anti-Kaninchen.IgG-Antikörper (1:5000 in 1% Milch in TBST) für 1 Stunde bei Raumtemperatur

4-maliges Waschen für 10 min. in TBST

Die spezifischen Signale wurden dann mit einem Enhanced Chemiluminescense Assay (ECL, Amersham) visualisiert und auf Röntgen-Film belichtet.

Die semiquantitative Untersuchung der spezifischen Signale auf den Röntgen-Filmen erfolgte mit der Software Scion Image, Version Beta 4.0.2 (Scion Corporation, Frederick,MD). Die Gesamtintensität der spezifischen Signalen in einem Blot wurde als 100 % gesetzt und die einzelnen Banden im Verhältnis dazu gewertet. Die Ergebnisse von mindestens 3 Experimenten wurden statistisch ausgewertet.

Histon-Kinase-Assay
Der Histon-Kinase-Assay wurden in Zusammenarbeit mit Dr. L. Hauck (Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin, Berlin) durchgeführt. Anti-CDK2-Immunkomplexe wurden 2 mal im Lyse-Puffer und anschliessend im eiskalten Kinasepufer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 1.0 DTT) gewaschen. Die Immunkomplexe wurden dann in 50 µl Kinase-Puffer mit 10 µg Lysin-reiches Histon HIIIS (Sigma) sowie 10 µCi [γ-³²P]ATP (111 MBq/mmol; NEN, Boston, USA) resuspendiert. Nach einer 60-minütigen Inkubation bei 37°C wurde die Reaktion durch Zugabe von 25 µl SDS-Puffer gestoppt. 30 µl von jeder Probewurden durch die SDS-PAGE aufgetrennt. Die Radioaktivität wurde dann mittels Phosphoimager und TINA software quantifiziert.
Elektronenmikroskopie
Die Tiere wurden transkardial mit 0.1% Glutaraldehyd/ 2 % Paraformaldehyd in PBS perfundiert. Nach einer 8-stündigen Postfixation im gleichen Fixativ bei 4°C wurden am Vibratom 60 µm dicke Schnitte angefertigt. In frei-flottierender Technik wurden dann die Schnitte gegen BrdU mit DAB als Chromogen nach dem Protokoll 3. 2. 8. 5 gefärbt. Die Schnitte wurden anschließend in 2.5% Glutaraldehyd für 30 min postfixiert und nach dem folgenden Protokoll in Resin eingebettet:

Waschen in PBS für 1 h bei Raumtemperatur

Inkubation in 1 % OsO₄ (in ddH₂O) für 45 min bei Raumtemperatur

dreimaliges Waschen in PBS für 2 min

Inkubation in 2 % Uranylazetat (in PBS) für 1 h bei –4°C

Dehydratation der Schnitte in der aufsteigenden Ethanolreihe:
70 % Ethanol für 2 min
80 % Ethanol für 2 min
96 % Ethanol für 2 min
2 x 100 % Ethanol für 5 min

Inkubation im Resin-Ethanol-Gemisch (1/3 Resin und 2/3 100% Ethanol) für 10 min bei Raumtemperatur

Inkubation im Resin-Ethanol-Gemisch (1/2 Resin und 1/2 100% Ethanol) für 30 min bei Raumtemperatur

Inkubation in Resin über Nacht bei Raumtemperatur

Inkubation in frischem Resin über Nacht bei Raumtemperatur

Die Schnitte wurden dann zwischen zwei Plastikdeckeln in einem Ofen bei +60°C für 48 Stunden aufbewahrt.

Die Semindünnschnitte sowie die entsprechenden elektronmikroskopischen Aufnahmen wurden freundlicherweise im neuropathologischen Laboratorium (Professor Dr. med. Brück, Institut für Neuropathologie, Charitè) angefertigt (Elektronenmikroskop: Zeiss EM10).
Zellzählprotokolle
Um die Anzahl der p16^INK4a-negativen MAP2-positiven Zellen im geschädigten Areal zu quantifizieren, wurden 4 Schnitte im Bereich der vorderen Kommissur (jeweils 80 µm entfernt) pro Tier ausgezählt. Sieben zufällig ausgewählte nicht-überlappende „High-Power“-Felder (Vergrößerung x 400) aus dem Striatum wurden pro Schnitt untersucht (n=3 für jeden Reperfusionszeitpunkt sowie für Sham-operierte Kontrolle). Alle MAP2-positiven Neurone wurden dabei ausgezählt und dann die Anzahl der p16^INK4a-negativen Zellen dieser Zellpopulation bestimmt.

Striatale TUNEL-positive Zellen wurden ebenfalls im Bereich der vorderen Kommissur in sieben zufällig ausgewählten nicht-überlappenden High-Power-Feldern bestimmt (n=3 für jeden Reperfusionszeitpunkt sowie für Sham-operierte Kontrolle). Die Zellen wurden als TUNEL-positiv klassifiziert, wenn sie ein deutliches nukleäres Signal mit kondensierten Nuklei ohne zytoplasmatische Anfärbung aufwiesen.

Die TUNEL- und BrdU-doppeltgefärbten Zellen wurden zum Reperfusionszeitpunkt 72 h nach der MCA-Okklusion (n=4) in 3 zufällig ausgewählten Hirnschnitten im Bereich der vorderen Kommissur ausgezählt, wobei 12 „High-Power“-Felder (HPF) untersucht wurden. In jedem HPF wurden alle TUNEL-positiven sowie TUNEL- und BrdU-positive Zellen ausgezählt und der prozentuelle Anteil der BrdU-positiven Zellen ermittelt.

BrdU-positive Zellen wurden in 8 Tieren (4 Tiere mit täglichen BrdU-Injektionen und 4 Tiere mit kontinuierlicher BrdU-Applikation via Mini-Pumpe) in 3 zufällig ausgewählten 800 µm x 800 µm-Feldern innerhalb des Striatums im Bereich der vorderen Kommissur bestimmt.
Statistik
Alle Daten wurden als Mittelwert + Standardfehler des Mittelwertes (SEM) angegeben. Alle in vivo-Experimente wurden an 3 bis 7 Tieren durchgeführt. Die Anzahl der Interneurone im ischämischen und intakten kontralateralen Striatum (s. Ergebnisse 4.1) sowie die Anzahl der BrdU-positiven Zellen im ischämischen Striatum bei kontinuierlicher und pulsatiler BrdU-Applikation (s. Ergebnisse 4.3.3) wurden mit Student-t-Test miteinander verglichen. Die Anzahl der p16-negativen Neurone nach 9 h, 18 h, 48 h und 72 h nach MCAo versus Sham-operierten Tieren (s. Ergebnisse 4.3.1) wurden mittels ANOVA-Test und Tukey post hoc Test verglichen. Alle in vitro-Daten wurden aus mindestens 3 unabhängigen Zellkulturexperimenten zusammengefaßt (s. Ergebnisse 4.4). Die Gruppen wurden one-way ANOVA-Test verglichen. Anschließend wurde der Tukey post hoc Test angewandt. p<0.05 wurde als statistisch signifikant angenommen.