Ergebnisse

Charakterisierung des Modells der milden fokalen zerebralen Ischämie

Zunächst wurde die zelluläre Schädigung nach einer 30- minutigen Okklusion der A. cerebri media (sogenannte milde Ischämie) näher charakterisiert. Es wurden das zeitliche, das topisch-anatomische sowie das zytologische Profil des Zellunterganges untersucht.

Aus den Vorarbeiten (Endres et al., 1998) war bekannt, daß in diesem Schlaganfallmodell der maximale Zelluntergang 72 Stunden nach dem Beginn der Reperfusion stattfindet. Zu späteren Zeitpunkten stellt man nämlich keine weitere Reduktion der Zahl der intakten Zellen im Ischämiebereich mehr fest (Endres et al., 1998, 2000). Davon ausgehend wurden folgende Reperfusionszeiten für weitere Experimente festgelegt: 4 ½ , 9, 18, 27, 36, 48 und 72 Stunden nach dem Beginn der Reperfusion. Für jeden Zeitpunkt wurden mindestens 4 Tiere histologisch und histochemisch aufgearbeitet. Als Marker der ischämischen Schädigung wurde die In Situ-Markierung der nukleären DNA-Fragmentation mit TUNEL-Färbung (TdT-vermittelte dUTP-Biotin- „nick end labeling“, s. Methodik 3. 2. 7) gewählt, die Doppelstrangbrüche in der DNA detektiert (Gavrieli et al., 1992). Besonders bei der Detektion des verzögerten ischämischen Zellschadens findet TUNEL-Färbung eine breite Anwendung (Li et al., 1995; Du et al., 1996; Endres et al., 1998) und wurde in vielen unabhängigen Studien kritisch evaluiert (Charriaut-Marlangue und Ben-Ari, 1995; Cervos-Navarro und Schubert, 1996; Labat-Moleur et al., 1998). Nur Zellen mit einem starken nukleären TUNEL-Signal sowie kondensiertem Chromatin wurden als TUNEL-positiv gewertet (Farbabb 1C, Insert, s. Seite 79), wohingegen Zellen mit einem schwachen zytoplasmatischen oder nukleären Signal als TUNEL-negativ interpretiert wurden. Zum Zeitpunkt von 9 Stunden ließen sich nur in wenigen Schnitten einzelne TUNEL-positive Zellen im ischämischen Striatum nachweisen (Farbabb. 1 A, s. Seite 79). Eine deutliche TUNEL-Positivität wurde zum Zeitpunkt 36 Stunden nach MCAo detektiert (Farbabb. 1 B, s. Seite 79), während die maximale Anzahl der TUNEL-positiven Zellen zum Zeitpunkt von 72 Stunden festgestellt wurde (Farbabb. 1 C, s. Seite 79). Somit handelt es sich in diesem Modell um einen verzögert ablaufenden Zelltod.

Das topisch-anatomische Ausmaß der Schädigung wurde histologisch und immunhistochemisch evaluiert. Zu diesem Zwecke wurde die immunhistochemische Färbung gegen den neuronalen Marker „microtubule-associated protein“ 2 (MAP2) zum Zeitpunkt des maximalen Zellschadens nach 72 Stunden durchgeführt. MAP2 ist ein hochmolekulares Protein, welcher als Bestandteil des Cytoskeletons in Perikarya und Dendriten intakter Neurone exprimiert wird (Bernhardt und Matus, 1984; Caceres et al, 1984). Der Verlust der Immunreaktivität gegen MAP2 blieb auf das Striatum beschränkt, während im ipsilateralen Kortex keine Reduktion des Signals zu verzeichnen war (Farbabb. 1 D, s. Seite 79). Das TUNEL-Signal wurde ebenfalls nur im Striatumdetektiert, während TUNEL-positive Zellen im Kortex nicht festgestellt werden konnten (Farbabb. 1 E, s. Seite 79). Somit liegt in diesem Modell eine selektive Schädigung des Striatums vor.

Um den Zelltyp der zugrundegehenden Zellen näher zu charakterisieren, wurden immunhistochemische Doppelfärbungen von TUNEL mit zellspezifischen Markern durchgeführt. Als neuronaler Marker wurde „neuron-specific nuclear protein“ (NeuN) benutzt, welches in allen adulten Neuronen nukleär exprimiert wird (Mullen et al., 1992). Als gliale Marker wurden „glial fibrillary acid protein“ (GFAP) für Astrozyten (Bignami und Dahl, 1977) und Typ III-Complement-Rezeptor MAC-1 für Mikroglia/ Makrophagen (Ho und Springer, 1982; Perry et al., 1985) verwendet. Folgende Zeitpunkte wurden untersucht: 4 ½ h, 9 h, 18 h, 36 h und 72 h nach MCAo. Während TUNEL-positive Zellen die NeuN-Immunreaktivität aufwiesen (Farbabb 2 A-C, s. Seite 79), konnten wir bis zum Zeitpunkt von 72 Stunden keine Doppelfärbung mit GFAP (Farbabb. 2 D-F, s. Seite 79) und MAC-1 (Farbabb. 2 G-I, s. Seite 79) feststellen. Somit handelt es sich in diesem Modell um einen selektiven Untergang von Neuronen, während Gliazellen den Insult weitgehend überleben.

Zwei Hauptgruppen von Neuronen können im Striatum unterschieden werden: Projektionsneurone und Interneurone. Projektionsneurone, die wegen ihres typischen morphologischen Aussehens als „medium-spiny neurons“ bezeichnet werden, bilden über 90 Prozent der neuronalen Zellpopulation aus, während Interneurone die restlichen 10 Prozent ausmachen. Striatale Interneurone werden weiterhin nach ihren Transmittern in cholinerg, somatostatinerg und GABAerg eingeteilt. Die GABAergen Interneurone werden noch weiter in Parvalbumin- und Calretinin-haltig differenziert. Um der Frage nachzugehen, welche dieser Neuronenpopulationen in unserem Modell untergehen, wurden immunhistochemische Färbungen gegen Marker der Projektionsneurone L-Enkephalin und Neurokinin Bsowie gegen Marker der Interneurone Cholin-Acetyl-Transferase (ChAT), Somatostatin, Parvalbumin und Calretininangefertigt. Es wurde eine deutliche Reduktion der Immunreaktivität gegen L-Enkephalin (Farbabb. 3 A, s. Seite 81) und Neurokinin B(Farbabb. 3 B, s. Seite 81)nachgewiesen. Die Immunreaktivität gegen Cholin-Acetyl-Transferase (Farbabb. 4 A-B, s. Seite 83), gegen Somatostatin (Farbabb. 4 C-D, s. Seite 83), gegen Parvalbumin (Farbabb. 5 A-B, s. Seite 85) sowie gegen Calretinin (Farbabb. 5 C-D, s. Seite 85) blieb zum Zeitpunkt 72 h nach der MCA-Okklusion erhalten. An benachbarten Schnitten wurden Nissl- und TUNEL-Färbungen durchgeführt, wobei ein Zelluntergang detektiert wurde. In der Nissl-Färbung wurden pyknotische Neurone (Farabb. 4 E-F, s. Seite 83), in der TUNEL-Färbung TUNEL-positive Zellen (Farbabb. 5 E-F, s. Seite 85) nachgewiesen. Auszählung der Interneurone zum Zeitpunkt 72 h nach Ischämie ergab keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der Interneurone auf der ischämischen vs. kontralateralen Seite (Tabelle 2, Abb. 6). Calretinin-haltige GABAerge Neurone wurden –wegen der zu geringen Zellzahlen (im Durchschnitt weniger als 1 Zelle pro High-Power-Field [HPF]) – nicht angegeben.

Neuronaler Typ

Ischämisches Striatum, Zellen/HPF + SEM

Kontralaterales Striatum, Zellen/HPF + SEM

Signifikanz

Cholinerg

44 + 2

40 + 7

p> 0.05 (n=3)

Somatostatinerg

41 + 3

41 + 1

p> 0.05 (n=3)

Parvalbumin-haltig

31 + 5

38 + 6

p> 0.05 (n=3)

Tabelle 2:

Abb. 6: Auszählung der Interneurone im ischämischen (weisse Balken) und kontralateralen (schwarze Balken) Striatum 72 h nach MCAo. Die Zahl der Interneurone auf der nicht-betroffenen (kontralateralen) Seite wurde gleich 100% gesetzt. Es wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt (p>0.05, n=3).

Somit handelt es sich in unserem Modell um einen selektiven Untergang der Projektionsneurone.

Aufgrund unterschiedlicher kortikaler, thalamischer sowie nigraler Afferenzen und Efferenzen können Projektionsneurone weiterhin in 2 Systeme eingeteilt werden: Matrix (85% des Gesamtvolumens des Striatums) und Striosomen („patch“, 15% des Gesamtvolumens). Striosomen können aufgrund ihres hohen Gehalts am µ-Opioid-Rezeptor immunhistochemisch dargestellt werden. Um zu prüfen, ob Projektionsneurone in Striosomen bzw. Matrix unterschiedliche Vulnerabilität gegenüber milder Ischämie aufweisen, wurden immunhistochemische Färbungen gegen µ-Opioid-Rezeptor zum Reperfusionszeitpunkt 72 h durchgeführt. Es wurde ein deutlicher Verlust der Immunreaktivität auf der ischämischen Seite detektiert (Farbabb. 3 C, Seite 81). Somit besteht kein Unterschied in der Vulnerabilität striosomaler und nicht-striosomaler Projektionsneurone.

Zusammenfassend liegt in unserem Modell ein verzögerter selektiver Zelluntergang der Projektionsneurone in der Matrix und Striosomen vor.

Expression von Zellzyklus-relevanten Proteinen im intakten adulten Maushirn
Zunächst wurde die Expression von zellzyklusaktivierenden sowie zellzyklusinhibierenden Proteinen im adulten murinen Striatum analysiert. Es wurden die Cyclin-abhängige Kinasen CDK4, CDK2, die Cycline Cyclin D1, Cyclin E, Cyclin A, Cyclin B1 sowie CDK-Inhibitoren p16^INK4a und p27^Kip1 in Hirnschnitten immunhistochemisch untersucht. Während im intakten Striatum keine Immunreaktivität für Cycline, Cyclin-abgängige Kinasen sowie p27^Kip1 festgestellt wurde, fand sich eine starke nukleäre Expression von p16^INK4aim Striatum (Farbabb. 6 A, s. Seite 87). Doppelmarkierungen mit dem neuronalen Marker NeuN, der in allen adulten Neuronen im Nukleus gefunden wird (Mullen et al, 1992), zeigten, daß alle striatalen Neurone im intakten Zustand p16^INK4aexprimieren (Farbabb. 6 A-C, s. Seite 87).

Untersuchung von Zellzyklusproteinen nach milder Ischämie Expression des CDK-Inhibitors p16^INK4a in Neuronen im ischämischen Striatum
Weiterhin wurden Veränderungen der Expression der zellzyklusrelevanten Proteine nach milder Ischämie untersucht. Die immunhistochemischen Doppelfärbungen gegen p16^INK4a und den neuronalen Marker NeuN offenbarten eine deutliche Herunterregulierung von p16^INK4ain den Neuronen im ischämischen Striatum bereits zum Zeitpunkt 9 h nach der MCA Okklussion/ Perfusion (Farbabb. 6 D-F, s. Seite 87). Allerdings könnte der Verlust der p16^INK4a –Immunreaktivität im geschädigten Striatum lediglich ein unspezifischer Ausdruck des allgemeinen Proteinverlustes im Rahmen des neuronalen Zelltodes darstellen. Um zu prüfen, ob p16^INK4a spezifisch herunterreguliert wird, wurden Doppelfärbungen von p16^INK4a mit „microtubule-associated protein“ 2 (MAP2) unternommen. MAP2 wird beim ischämischen Tod frühzeitig degradiert und gilt als ein besonders sensitiver Marker für den ischämischen zellulären Schaden (Kitagawa et al., 1989; Matesic und Lin, 1994). Tatsächlich fand der Verlust des immunhistochemischen p16^INK4a– Signals in noch MAP2-positiven Neuronen statt (Farbabb. 7 A-F, s. Seite 87), was eindeutig gegen einen unspezifischen Verlust von p16^INK4a im Rahmen einer allgemeinen Proteindegradierung spricht.

Die Beziehung des p16^INK4a- Verlustes zum verzögerten neuronalen Zelltod nach milder Ischämie wurde näher charakterisiert: Hierzu wurde die p16^INK4a- Herunterregulierung und TUNEL-Positivität im ischämischen Striatum zu verschiedenen Zeitpunkten verglichen. Der Prozentsatz der MAP2-positiven Neuronen, bei denen p16^INK4a herunterreguliert war, wurde zu den Reperfusionszeitpunkten 9 h, 18 h, 48 h, 72 h sowie in sham-operierten Kontrolltieren ausgezählt. In Kontrolltieren waren alle Neurone p16^INK4a-positiv. Zum Zeitpunkt 9 h nach MCAo waren 48,0 + 8,3 % aller MAP2-positiven Zellen p16^INK4a-negativ. Die Anzahl der MAP2-positiven p16^INK4a-negativen Neurone nahm dann zu späteren Reperfusionszeitpunkten stetig ab: 23,3 + 1,8 % nach 18 h, 16,7 + 8,3 % nach 48 h. Zum Zeitpunkt 72 h wurden keine MAP2-positiven p16^INK4a-negativen Neurone festgestellt (Abb. 7 A, s. Seite 42). Zu denselben Reperfusionszeiten, zu denen die p16^INK4a-Immunreaktivität quantifiziert wurde (9 h, 18 h, 48 h und 72 h, jeweils n=3), erfolgte die Bestimmung der Anzahl der TUNEL-positiven Zellen pro mm² . Die ersten sicher nachweisbaren TUNEL-positiven Zellen erschienen zum Zeitpunkt 18 h (400 Zellen/ mm² + 48), nahmen dann zum Zeitpunkt 48 h zu (3888 Zellen/ mm² + 381) und erreichten ihr Maximum bei 72 h (5488 Zellen/ mm² + 1041) (Abb. 7 B). Zusammenfassend ging also der Verlust der p16^INK4a-Immunreaktivität der TUNEL-Positivität zeitlich unmittelbar voraus.

Abb. 7: Zeitverlauf der Herunterregulierung des CDK-Inhibitors p16^INK4a (A) und des verzögerten neuronalen Zelltodes nach 30 min MCAo (B).

A: Die Anzahl der p16 ^INK4a -negativen Neurone ist als Prozentsatz von allen MAP2-positiven Neuronen (vertikale Achse) zu unterschiedlichen Reperfusionszeitpunkten (horizontale Achse) dargestellt. In den Kontrolltieren sowie zum Zeitpunkt 72 h waren alle MAP2-positiven Zellen p16 ^INK4a -positiv. N=3; *p<0.05; ***p<0.001

B: Die Dichte der TUNEL-positiven Zellen pro µm ² (vertikale Achse) ist zu unterschiedlichen Zeitpunkten (horizontale Achse) dargestellt. Zum Zeitpunkt 9 h wurden nur unregelmäßig einzelne TUNEL-positive Zellen nachgewiesen. Bei den Kontrolltieren wurden keine TUNEL-positiven Zellen detektiert. N=3-6
Expression von Cyclins D1 im ischämischen Striatum.
Die Expression von Cyclin D1, Cyclin E, Cyclin A sowie Cyclin B1 wurde immunhistochemisch zu den Zeitpunkten 9h, 18h, 48h und 72h nach Ischämie untersucht. Im Gegensatz zu Kontrollhirnen, die keine Cyclin D1- Immunreaktivität aufwiesen, wurde in den ischämischen Hirnen zum Zeitpunkt 48 h die Expression von Cyclin D1 festgestellt. Die Doppelfärbungen mit dem nukleären neuronalen Marker NeuN bestätigten sowohl die neuronale Herkunft als auch die nukleäre Lokalisation des Signals (Farbabb. 8 A-C, s. Seite 89).
BrdU-Inkorporation in die DNA als Marker der S-Phase
5-Bromo-2’-deoxy-Uridin (BrdU) wird als ein Thymidinanalogon in die replizierende DNA eingebaut und gilt somit als ein Marker der S-Phase. Zwei unterschiedliche parenterale Applikationsmodi stehen zur Verfügung:

kontinuierliche Verabreichung von BrdU mittels einer subkutan plazierten osmotischen Minipumpe und

diskontinuierliche (pulsatile) Verabreicherung durch tägliche intraperitoneale Injektionen.

Bei der vergleichbaren täglichen Dosis ist im ersten Fall mit einem konstanten BrdU- Spiegel im Blut zu rechnen, während im zweiten Fall etwa 2-stündige BrdU-Spiegelspitzen unmittelbar nach der Injektion bei sonst sehr niedrigem Spiegel vorliegen sollten. Also besteht beim Injektionsmodus ein etwa 2-stündiges Angebot einer hohen BrdU-Konzentration, während es im Falle der Minipumpe zu einem konstanten Angebot von BrdU mit allerdings niedrigerer Konzentration kommt. Da in der Literatur kein Konsensus darüber besteht, welche dieser beiden Methoden für die Detektion des Eintritts in die S-Phase sensitiver ist, wurden beide Applikationsmethoden miteinander verglichen. Dabei wurden 4 Tiere mit einer Minipumpe (1 g/ml/ kgKörpergewicht, Flußrate 1 µl/h, tägliche Gesamtdosis 24 mg/ kg Körpergewicht) und 4 Tiere mit einmaligen täglichen Injektionen (50 mg/ kg Körpergewicht) behandelt. Die Anzahl der BrdU-positiven Zellen in ischämischen Striata 72 Stunden nach MCAo wurde als Maß für die Sensitivität der Detektion gewählt. Diese Anzahl betrug bei den mit einer Pumpe versorgten Tieren 408 + 57 Zellen/ LPF pro Low-Power-Field (LPF) und 87 + 14 Zellen bei den mit Injektionen behandelten Mäusen (Abb. 8). Es wurden also signifikant mehr Zellen in den Striata von den Tieren detektiert, welchen BrdU mittels Minipumpe appliziert wurde (p= 0.002). In Anbetracht dieser Ergebnisse wurde diese Applikationsmethode von BrdU -als in unserem Modell sensitivere Methode- für weitere Experimente gewählt.

Abb. 8: Anzahl von BrdU- positiven Zellen im ischämischen Striatum 72 h nach MCAo pro LPF (vertikale Achse) nach täglicher BrdU-Injektion (linke Säule) bzw. Applikation mit Hilfe einer miniosmotischen Pumpe (rechte Säule) . N=4, **p<0.01
Detektion von BrdU-positiven Neuronen
BrdU-Inkorporation wurde immunhistochemisch zu den Reperfusionszeiten 4 ½ , 9, 18, 27, 36, 48 und 72 Stunden nach der MCA-Okklussion analysiert. Die ersten BrdU-positiven Zellen erschienen in den von der Ischämie betroffenen Striata zum Zeitpunkt 36 h (Farbabb. 9 B, s. Seite 89). Die Zellzahl nahm zum Zeitpunkt 48 h zu und erreichte ihr Maximum bei 72 h (Farbabb. 9 C, s. Seite 89). Um die Frage zu beantworten, ob unter diesen BrdU-positiven Zellen ebenfalls Neurone vorhanden sind, wurde ischämisches Gewebe zum Reperfusionszeitpunkt 72 h elektronenmikroskopisch untersucht. Die Vibratomschnitte wurden zuerst gegen BrdU mit DAB als Chromogen immunhistologisch gefärbt. DAB wurde dann in den Nuclei der BrdU-positiven Zellen elektronenmikroskopisch detektiert werden. Es wurden BrdU-positive Zellen mit neuronaler Morphologie nachgewiesen (Farbabb. 10, s. Seite 89). Als Kriterien wurden

ein zentraler Nukleus mit einem prominenten Nucleolus

zytoplasmatische Vesikel

definiert (Graham, 1997). Eine genaue Quantifizierung solcher Zellen im Sinne einer kompletten Auszählung ist methodisch nicht durchführbar (Professor Brück, Inst. für Neuropathologie, Charité, persönliche Mitteilung). Es konnte allerdings abgeschätzt werden, daß auf etwa 100 Neurone im ischämischen Striatum ein BrdU-positives Neuron entfiel.
Detektion von BrdU- und TUNEL-positiven Zellen
Zu den Reperfusionszeitpunkten 36h, 48h und 72h wurden Doppelfärbungen TUNEL mit BrdU-Immunhistochemie durchgeführt. Doppeltgefärbte Zellen, die sowohl für TUNEL als auch für BrdU positiv waren, konnten zum Zeitpunkt 72h festgestellt werden. Die Ko-Lokalisation des Signals konnte am konfokalen Mikroskop durch Schichtung in der Z-Achse in 1 µm Abständen verifiziert werden (Farbabb. 11, s. Seite 91). Die Quantifizierung solcher Zellen zeigte, daß 0.96 + 0.17 % (n=4) aller TUNEL-positiven Zellen BrdU-positiv waren. Dies zeigt, daß eine gewisse Fraktion der Zellen vor dem Zelltod in die S-Phase eingetreten ist. Wie bereits im Kapitel 4.1 demonstriert (Farbabb. 2 A-C, s. Seite 79), waren zum Zeitpunkt 72 h praktisch alle TUNEL-positive Zellen für den neuronalen Marker NeuN immunreaktiv. Es konnten keine TUNEL-positiven Zellen detektiert werden, die für gliale Marker positiv waren (Farbabb. 2 D-I, s. Seite 79). Zusammen betrachtet, implizieren diese Daten, daß TUNEL- und BrdU-doppelmarkierte Zellen Neurone sind. Die TUNEL-BrdU-doppelgefärbten Zellen sind also Neurone, die nach bzw. während ihrer DNA-Replikation untergegangen sind. Dieser Befund weist darauf hin, daß einige Neurone vor ihrem Untergang in die S-Phase des Zellzyklus eingetreten waren.

Weiterhin wurden die benachbarten Schnitte auf das Vorhandensein von NeuN-positiven mitotischen Figuren überprüft, die als Marker der M-Phase gelten (Zindy et al., 1999; Gu et al., 2000; Nowakowski und Hayes, 2001). Es konnten keine mitotischen Figuren festgestellt werden.

In vitro-Experimente Expression der Zellzyklusproteine in vitro
Um die Zellzyklusaktivierung und den damit möglicherweise verbundenen neuronalen Zelltod nach einem hypoxischen Schaden weiter auf enzymatischer sowie pharmakologischer Ebene zu untersuchen, führten wir Experimente in der Zellkultur. Serum-freies Medium in der Kultur ermöglichten, den Gehalt der Gliazellen sehr niedrigzu halten (Harms et al., 2000; Lautenschlager et al., 2000), so daß Neurone studiert werden konnten. Zuerst wurde die neuronale Expression verschiedener Zellzyklus-relevanterProteine in der intakten Zellkultur immunhistochemisch und mittels Western-Blotting analysiert. Parallelzu den in vivo-Experimenten wurden immunhistochemische Färbungen an fixierten Zellkulturen gegen die CDK-Inhibitoren p16^INK4a sowie p27^Kip1, die Cycline Cyclin D1, Cyclin E, Cyclin A und Cyclin B1 und die Cyclin-abhängigen Kinasen CDK4 und CDK2 durchgeführt. Alle Färbungen wurden als Doppelfärbung mit dem neuronalen Marker NeuN vorgenommen, um den neuronalen Ursprung des Signals zu bestätigen. Dabei wurde starke nukleäre Immunreaktivität für p27^Kip1 festgestellt (Farbabb. 12 A-C, s. Seite 93), während das Signal für p16^INK4a -im Gegensatz zu den in vivo-Daten- nur schwach war. Im Einklangmit unseren in vivo-Daten konnte keine Immunreaktivität für Cyclin E, Cyclin A und Cyclin B1 erzielt werden. Die Färbung gegen Cyclin D1 ergab ein rein zytoplasmatisches Signal (Farbabb. 13 A-C, s. Seite 95). Die Expression von p27^Kip1, p16^INK4a und Cyclin D1 wurde in Western blots bestätigt (Farbabb. 15, s. Seite 97).
Schadensmodelle in vitro
Als hypoxisches Schadensparadigma wurde eine 90-minütige Sauerstoff- und Glukose-Deprivation (OGD) der primären neuronalen Zellkultur gewählt. Aus Vorarbeiten war bereits bekannt, daß der Zelluntergang 24 h nach OGD sein Maximum erreicht (Bruer et al., 1997; Harms et al., 2000). Der neuronale Zelltod wurde in der Phasenkontrast-Mikroskopie sowie durch Messung der LDH-Freisetzung evaluiert. Für immunhistochemische Färbungen wurden Zeitpunkte 2 h, 4 h, 8 h, 12 h und 24 h nach OGD, für Western bloting 2 h, 4 h, 6 h, 12 h, 24 h und 48 h gewählt.
Expression von CDK-Inhibitoren in Neuronen nach OGD
Um Veränderungen im Expressionsmuster des konstitutiv exprimierten zellzyklusinhibierenden Proteins p27^Kip1 nach 90-minutiger Sauerstoff-Glukose-Deprivation (OGD) zu analysieren, wurden immunhistochemische Doppelfärbungen gegen p27^Kip1 sowie den neuronalen Marker NeuN durchgeführt. Bereits 2 h nach OGD konnte eine deutliche Reduktion der p27^Kip1-Immunreaktivität festgestellt werden (Farbabb. 12 D-I, s. Seite 93). Um den p27^Kip1-Verlust zu bestätigen und zu quantifizieren, wurden Western Blots zu den Zeitpunkten 2h, 4h, 6h, 12h, 24h und 48h nach OGD durchgeführt. Die semiquantitative Analyse der Abbildungen der Immunblots ergab eine signifikante Reduktion der p27^Kip1-Expression zum Zeitpunkt 2h (Abnahme der Signalintensität um 34.6 + 9.0 % im Vergleich zu Kontrollkulturen, p<0.01) bzw. 4h (Abnahme um 57.2 + 6.5 %, p<0.001) (Farbabb. 15 B, s. Seite 97). Eine Abnahme des p16^INK4a-Signals wurde ebenfalls nach OGD festgestellt, wobei hier bei einer schwächeren basalen Expression eine signifikante Herunterregulierung (Reduktion um 44.9 + 9.9 %, p< 0.001) erst zum Zeitpunkt 4h nach OGD festzustellen war (Farbabb. 15 A, s. Seite 97). Die Herunterregulierung der CDK-Inhibitoren fand also bereits 2 bzw 4 h nach OGD statt und ging dem neuronalen Zelltod, der zum Zeitpunkt 24 h sein Maximum erreichte, voraus.
Expression von Cyclin D1 nach OGD
Um eine mögliche Progression in die G₁-Phase des Zellzyklus zu untersuchen, wurde die Expression und die intrazelluläre Lokalisation von Cyclin D1 immunhistochemisch und mittels Western Blotting analysiert. Cyclin D1 ist im Zytosol inaktiv und bedarf einer Translokation in den Nukleus, wo es Cyclin-abhängige Kinasen aktiviert (Yang und Kornbluth,1999). Ab dem Zeitpunkt 4 h nach OGD wurde ein nukleäres Cyclin D1-Signal in den Neuronen festgestellt (Farbabb. 13 D-F, s. Seite 95). Die Lokalisation von Cyclin D1 im Nukleus wurde am konfokalen Mikroskop durch Schichtbilder in der Ebene senkrecht zu den Zellen (z-Ebene) in 1 µm-Abständen bestätigt (Farbabb. 14 A, s. Seite 95). Die Western Blot-Analysen ergaben eine signifikante Zunahme der Cyclin D1-Menge in Zelllysaten nach OGD (p< 0.05 ab 6 h, p < 0.001 ab 12 h) (Farbabb. 14 B, s. Seite 95).
Katalytische CDK-Aktivität nach OGD
Die CDK2-Aktivierung wurde nach OGD untersucht. Die katalytische Aktivität dieser Enzyme wurde mittels eines Histonkinase-Assays gemessen. Die basale Aktivität der intakten unstimulierten Kulturen betrug 438 + 32 cpm (n=3). 12 h nach OGD stieg der Wert der Kinase-Aktivität auf 2885 + 19 cpm (= counts per minute) (n=3), was einer prozentualen Zunahme um 658,3 + 4.3 % (p< 0.05) entspricht. 24h nach OGD betrug die Aktivität 5133 + 603 cpm (n=3, Zunahme im Vergleich zur Kontrolle um 1171,0 + 137.5 %, p < 0.01). Die Vorbehandlung mit 10 µM Olomoucine konnte die Zunahme der CDK-Aktivität komplett aufheben: CDK2-Aktivität 12 h nach OGD mit Olomoucine: 980 + 240 cpm, CDK2-Aktivität 24 h nach OGD mit Oloumicine: 422 + 25 cpm (Unterschiede zur basalen Aktivität nicht signifikant (p> 0.05) (Abb. 9).

Abb. 9: CDK2-Aktivität in der primären neuronalen Zellkultur nach 90 minutiger OGD. Anti-CDK2-Immunpräzipitate wurden mit [γ-³²P]ATP und Histon HIIIS als Substrat inkubiert. Das radioaktive Signal wurde dann mit einem Phosphoimager und TINA software quantifiziert. N=3, *p<0.01, **p<0.001 vs Kontrolle.
Pharmakologische Studien mit Olomoucine
Um die Hypothese zu prüfen, ob die CDK-Aktivierung und die damit verbundene Zellzyklusaktivität zum neuronalen Zelltod beitragen kann, wurde die Wirkung des synthetischen CDK-Inhibitors Olomoucine analysiert. Olomoucine inhibiert CDK1, CDK2 und CDK4 und blockiert dadurch die G1→S-Transition (Vesely et al., 1994; Abraham et al., 1995). Die kortikalen Kulturen wurden 1 Stunde vor OGD mit Olomoucine in den Konzentrationen 1, 10 und 100 µM vorbehandelt. Der Zellschaden wurde in der Phasenkontrastmikroskopie evaluiert und mittels LDH-Messung im Medium quantifiziert. Die Gabe von Olomoucine in der Konzentration von 10 µM und 100 µM erzielte einen signifikanten Schutz der Neurone nach OGD (Tabelle 3, Abb. 10, Farbabb. 16, s. Seite 97).

24 h nach OGD

Vehikel

1µM Olomoucine

10 µM

Olomoucine

100 µM

Olomoucine

Δ LDH (U/ ml Medium)

41,5

32,1

9,2

14,1

SEM

7,6

8,1

2,6

2,6

Signifikanz

nicht signifikant

p<0.01

p<0.05

Tabelle 3:

Abb. 10: Protektion einer primären neuronalen Zellkultur nach OGD mit dem synthetischen CDK-Inhibitor Olomoucine. Quantitative Messung des neuronalen Zellschadens mittels LDH-Konzentration im Medium 24 h nach OGD. N=3, *p<0.05, **p<0.01 vs Vehikel (Veh)